Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство

013563 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к клеткам, продуцирующим молекулы антител, применимые при различных заболеваниях, фрагменты антител и слитые белки с Fc-областями антител или подобным,способу получения композиции антител с использованием таких клеток, композиции антител и ее применению. Уровень техники Так как антитела обладают высокой активностью связывания, специфичностью связывания и высокой устойчивостью в крови, предпринимаются попытки их применения для диагностики, профилактики и лечения различных болезней у людей [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss,Inc., Chapter 2.1 (1995)]. Также предпринимаются попытки получения гуманизированных антител, таких как человеческие химерные антитела или человеческие антитела с привитым гипервариабельным участком (называемым далее в описании "CDR"), из антител, полученных от животных, но не человека, используя методы генетической рекомбинации. Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, в котором его вариабельная область (называемая далее в описании "V-областью") образуется от антитела животного, но не человека, а его константная область (называемая далее в описании "Собластью") образуется от человеческого антитела. Человеческое CDR-привитое антитело представляет собой антитело, в котором CDR человеческого антитела заменена на CDR антитела, полученного от животного, но не человека. Показано, что среди антител, полученных от млекопитающих, присутствуют пять классов антител,а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Антитела класса человеческого IgG используют, главным образом,для диагностики, профилактики и лечения различных болезней человека, поскольку они обладают функциональными характеристиками, такими как длительное время полужизни в крови, различными эффекторными функциями и т.п. [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1(1995)]. Человеческие антитела класса IgG далее подразделяются на следующие 4 подкласса: IgG1, IgG2,IgG3 и IgG4. До настоящего времени проводится большое число исследований по антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активности (далее называемой "ADCC-активностью") и комплементзависимой цитотоксической активности (далее называемой "CDC-активностью") как эффекторным функциям антител класса IgG, и сообщается, что среди антител класса человеческого IgG подклассIgG1 имеет наивысшую ADCC-активность и CDC-активность [Chemical Immunology, 65, 88 (1997)]. В свете изложенного выше большинство противоопухолевых гуманизированных антител, включая коммерчески доступные ритуксан и герцептин, требующих высоких эффекторных функций для проявления своего действия, являются антителами подкласса человеческого IgG1. Проявление ADCC-активности и CDC-активности антител подкласса человеческого IgG1 требует связывания Fc-области антитела с рецептором антитела, существующим на поверхности эффекторной клетки, такой как киллерная клетка, натуральная киллерная клетка, активированный макрофаг или подобная клетка (называемая далее "FcR"), и связываются различные компоненты комплемента. Что касается связывания, предполагается, что важными являются некоторые аминокислотные остатки в шарнирной области и второй домен С-области (называемый далее "С 2-доменом") антитела [Eur. J. Immunology,23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)] и что связывание цепи сахаров с С 2-доменом [Chemical Immunology, 65, 88 (1997)] также является важным. Что касается углеводной цепи, то Boyad et al. проверили влияние углеводной цепи на ADCCактивность и CDC-активность, обрабатывая человеческие CDR-привитые антитела CAMPATH-1H (подкласс человеческого IgG1), продуцированные клетками яичника китайского хомячка (клетки CHO) или клетками миеломы мыши NS0 (клетки NS0), различными ферментами, гидролизующими сахара, и сообщили, что удаление салициловой кислоты нередуцирующего конца не оказывает влияния на обе активности, но на одну CDC-активность влияет дополнительное удаление галактозного остатка, и активность снижается примерно на 50%, и что полное удаление углеводной цепи вызывает исчезновение обеих активностей [Molecular Immunology, 32, 1311 (1995)]. Lifely et al. также анализировали углеводные цепи,связанные с CDR-привитыми антителами CAMPATH-1H (подкласс человеческого IgG1), продуцированными клетками CHO, клетками NS0 или клетками миеломы крысы YO, измеряли их ADCC-активность и сообщили, что CAMPATH-1H, продуцированные клетками YO, показывают наивысшую ADCCактивность, причем приходят к мысли, что для такой активности важен N-ацетилглюкозамин (далее называемый в данном описании также "GlcNAc") в позиции посередине [Glycobiology, 5, 813 (1995); WO 99/54342]. Такие сообщения показывают, что строение углеводной цепи играет важную роль в эффекторных функциях человеческих антител подкласса IgG1 и что возможно получение антител с более высокой эффекторной функцией путем изменения строения углеводной цепи. Однако в действительности структуры углеводных цепей разнообразные и сложные и нельзя сказать, что идентифицирована структура, действительно важная для эффекторной функции. Углеводные цепи гликопротеинов на основании формы связывания с белковой группой грубо подразделяют на два типа, а именно углеводные цепи, которые связываются с аспарагином (углеводные цепи, присоединенные через N-гликозидные связи), и углеводные цепи, которые связываются с другими-1 013563 аминокислотами, такими как серин, треонин (углеводные цепи, присоединенные через O-гликозидные связи). Углеводные цепи, присоединенные через N-гликозидные связи, имеют различное строение [Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu ShuppanCenter), edited by Reiko Takahashi (1989)], но известно, что они имеют обычную основную коровую структуру, показанную приведенной далее структурной формулой (I) Конец углеводной цепи, который связывается с аспарагином, называют редуцирующим концом, а противоположный - нередуцирующим концом. Известно, что углеводная цепь, присоединяемая через Nгликозидную связь, относится к чисто выраженному маннозному типу, в котором только манноза связывается с нередуцирующим концом коровой структуры; комплексному типу, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеется по меньшей мере одна боковая цепь галактозо-Nацетилглюкозамина (называемого далее "Gal-GlcNAc"), и сторона нередуцирующего конца Gal-GlcNAc имеет структуру сиаловой кислоты, "срединного" N-ацетилглюкозамина или подобную структуру; гибридному типу, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеются ветвления как чисто маннозного типа, так и комплексного типа; и т.п. В Fc-области антитела типа IgG присутствуют два сайта связывания углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. В сывороточном IgG к сайту связывания углеводной цепи, как правило, присоединяется цепь сахаров комплексного типа со множеством ветвлений, в которой содержание сиаловой кислоты или "срединного" N-ацетилглюкозамина низкое. Известно, что существуют различные точки зрения на присоединение галактозы к нередуцирующему концу углеводной цепи комплексного типа и присоединение фукозы к N-ацетилглюкозамину на редуцирующем конце [Biochemistry, 36, 130(1997)]. Предполагается, что такая структура углеводной цепи определяется генами углеводной цепи, а именно геном гликозилтрансферазы, синтезирующей углеводную цепь, и геном гликолитического фермента, гидролизующего углеводную цепь. Синтез углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, описывается ниже. Гликопротеины модифицируются углеводной цепью в просвете эндоплазматического ретикулума(далее называемого "ER"). Во время стадии биосинтеза углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, относительно большая углеводная цепь переносится к полипептидной цепи, которая наращивается в просвете ER. При трансформации углеводная цепь сначала присоединяется последовательно к фосфатным группам длинноцепного липидного носителя, содержащего примерно 20 изопреновых звеньев, который называют долихолфосфатом (далее в данном описании также называетсяGlcNAc-P-P-Dol, и затем переносится еще один GlcNAc с образованием GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol. Затем переносятся пять манноз (далее манноза также называется "Man") с образованием посредством этого(Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol, и затем переносятся четыре Man и три глюкозы (далее глюкоза также называется "Glc"). Таким образом, формируется предшественник углеводной цепи (Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2-P-PDol, называемый коровым олигосахаридом. Предшественник углеводной цепи, содержащий 14 сахаров,переносится как масса к полипептиду с последовательностью аспарагин-Х-серин или аспарагин-Хтреонин в просвете ER. При реакции высвобождается долихолфосфат (P-P-Dol), связанный с коровым олигосахаридом, но снова становится долихолфосфатом при гидролизе пирофосфатазой и возвращается в цикл. "Подгонка" углеводной цепи начинается сразу же после присодинения углеводной цепи к полипептиду. Т.е. удаляются 3 Glc и 1 или 2 Man на ER и известно, что к удалению имеют отношение -1,2 глюкозидаза I, -1,3-глюкозидаза II и -1,2-маннозидаза. Гликопротеин, подвергшийся подгонке на ER, переносится к комплексу Гольджи и модифицируется различным образом. В цис-части комплекса Гольджи присутствуют N-ацетилглюкозаминфосфотрансфераза, имеющая отношение к присоединению маннозафосфата, N-ацетилглюкозамин-1 фосфодиэфирN-ацетилглюкозаминидаза и -маннозидаза I и снижают число остатков Man до 5. В средней части комплекса Гольджи присутствуют N-ацетилглюкозаминтрансфераза I (GnTI), имеющая отношение к присоединению первого внешнего GlcNAc присоединяемой через N-гликозидную связь углеводной цепи комплексного типа, -маннозидаза II, имеющая отношение к удалению 2 Man, Nацетилглюкозаминтрансфераза II (GnTII), имеющая отношение к присоединению второго GlcNAc с внешней стороны, и -1,6-фукозилтрансфераза, имеющая отношение к присоединению фукозы к редуцирующему концу N-ацетилглюкозамина. В транс-части комплекса Гольджи присутствует галактозотрансфераза, имеющая отношение к присоединению сиаловой кислоты, такой как N-2 013563 ацетилнейраминовая кислота, или подобной кислоты. Известно, что присоединенная через Nгликозидную связь углеводная цепь формируется за счет активностей таких различных ферментов. Вообще, большинство гуманизированных антител, для которых рассматривается применение в лекарственных средствах, получают с использованием методов генной рекомбинации, и их получают с использованием в качестве клеток-хозяев клеток CHO, происходящих из тканей яичника китайского хомячка. Но, как описано выше, так как строение углеводной цепи играет весьма важную роль в эффекторной функции антител, и наблюдаются различия в структуре углеводной цепи гликопротеинов, экспрессированных клетками-хозяевами, желательна разработка клетки-хозяина, которую можно использовать для продукции антител с более высокой эффекторной функцией. Для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи полученного гликопротеина, предприняты попытки использовать различные способы, такие как 1) применение ингибитора против фермента,имеющего отношение к модификации углеводной цепи, 2) отбор мутанта, 3) введение гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, и подобные способы. Конкретные примеры приводятся ниже. Примерами ингибитора против фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи,являются туникамицин, селективно ингибирующий образование GlcNAc-P-P-Dol, что является первой стадией образования корового олигосахарида, являющегося предшественником присоединенной через Nгликозидную связь углеводной цепи, кастаноспермин и N-метил-1-дезоксинойиримицин, представляющие собой ингибиторы гликозидазы I, бромкондулит, являющийся ингибитором гликозидазы II, 1 дезоксинойиримицин и 1,4-диокси-1,4-имино-D-маннит, являющиеся ингибиторами маннозидазы I,свайнсонин, являющийся ингибитором маннозидазы II, и подобные соединения. Примерами ингибиторов, специфических для гликозилтрансферазы, являются дезоксипроизводные субстратов против Nацетилглюкозаминтрансферазы V (GnTV), и подобные соединения [Glycobiology Series 2 - Destiny of(1993)]. Также известно, что 1-дезоксинойиримицин ингибирует синтез углеводной цепи комплексного типа и повышает соотношение углеводных цепей чисто маннозного типа и гибридного типа. Действительно, сообщается, что изменили структуру углеводной цепи IgG, и изменились свойства, такие как антигенсвязывающая активность и подобные, когда в среду добавили ингибиторы [Molecular Immunol., 26,1113 (1989)]. Мутанты в связи с активностью фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи,главным образом отбирают и получают в виде лектинневосприимчивой клеточной линии. Например,мутанты клеток CHO с различными структурами углеводной цепи получают как лектинневосприимчивую клеточную линию с использованием такого лектина, как WGA (агглютинин зерна пшеницы, полученный из T. vulgaris), ConA (конканавалин А, полученный из С. ensiformis), RIC (токсин, полученный изGenet., 12, 51 (1986)]. Примером модификации структуры углеводной цепи продукта, полученного введением в клеткухозяина гена фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, является сообщение о том, что белок, в котором к нередуцирующему концу углеводной цепи присоединено некоторое количество сиаловой кислоты, можно получить путем введения крысиной -галактозид 2,6 сиалилтрансферазы в клетку CHO [J. Biol. Chem., 261, 13848 (1989)]. Также подтверждается, что Н-антиген (Fuc1-2Gal1-), в котором фукоза (называемая далее также"Fuc") присоединена к нередуцирующему концу углеводной цепи, экспрессируется путем введения человеческой -галактозид-2 фукозилтрансферазы в мышиную L-клетку [Science, 252, 1668 (1991)]. Кроме того, на основывании знаний о том, что присоединение расположенного посередине Nацетилглюкозамина углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, важно для ADCCактивности, Umana et al. получили клетки CHO, экспрессирующие -1,4-N-ацетилглюкозаминтрансферазу III (GnTIII), и сравнили их с родительской клеточной линией на экспрессию GnTIII. Подтвердилось, что экспрессии GnTIII не отмечается в родительской клеточной линии клеток CHO[J. Biol. Chem., 261, 13370 (1984)] и что антитела, экспрессированные с использованием полученных экспрессирующих GnTIII клеток CHO, имеют ADCC-активность в 16 раз более высокую, чем антитела, экспрессированные с использованием родительской клеточной линии [Glycobiology, 5, 813 (1995);WO 99/54342]. В то же время Umana et al. также получили клетки CHO, в которые введена -1,4-Nацетилглюкозаминтрансфераза V (GnTV), и сообщили, что избыточная экспрессия GnTIII или GnTV показывает токсичность для клеток CHO. Описание изобретения Таким образом, для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи гликопротеина, который получают, предпринята попытка регулирования активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи в клетке-хозяине, но в действительности структуры углеводных цепей разнообразные и сложные, и определение физиологических ролей углеводных цепей может быть недоста-3 013563 точным, так что испытания и ошибки повторяются. В частности, хотя понемногу обнаруживается, что на эффекторную функцию антител в значительной степени влияет структура углеводной цепи, действительно важная структура углеводной цепи пока не конкретизирована. Соответственно, для разработки лечебных средств ожидается идентификация углеводной цепи, влияющей на эффекторную функцию антител, и разработка клетки-хозяина, к которой можно добавлять такую углеводную цепь. Целью настоящего изобретения является клетка-хозяин, которая продуцирует композицию антител и может регулировать структуру углеводной цепи, связанной с молекулой антитела, клетка, которая может продуцировать композицию антител с высокой ADCC-активностью, способ получения композиции антител с использованием таких клеток, и композиция антител, полученная таким способом получения. Настоящее изобретение относится к изложенному далее в разделах (1)-(14).(1) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство, содержащие ген, кодирующий молекулу антитела, и продуцирующие композицию антител со сложными углеводными цепями,присоединенными через N-гликозидные связи к Fc-области, где в композиции среди всех углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидные связи к Fc-области,доля цепей, в которых фукоза по первому положению не связана посредством -связи с Nацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, составляет 20% или более,причем указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии,а геном животного или его потомства модифицирован таким образом, что активность фермента, ответственного за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, и/или активность фермента,ответственного за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством -связи с N-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, уменьшена.(2) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1), в котором нокаутирован ген, кодирующий фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, и/или ген, кодирующий фермент, ответственный за модификацию углеводных цепей,в которых фукоза по первому положению связана посредством -связи с N-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь.(3) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1) или (2), в котором фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, включающей:(4) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (3), где GMD представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:65;(b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:65, и кодирующую белок, обладающий GMD-активностью.(5) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (3), где Fx представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:(а) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:48;(b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:48, и кодирующую белок, обладающий Fx-активностью.(6) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (3), где GFPP представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:51;(b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:51, и кодирующую белок, обладающий GFPP-активностью.(7) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1) или (2), где фермент, ответственный за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством -связи с N-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, представляет собой -1,6 фукозилтрансферазу.(8) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (7), где -1,6 фукозилтрансфераза кодируется ДНК, выбранной из группы, включающей:(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1;(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2;(d) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и кодирующую белок, обладающий -1,6-фукозилтрансферазной активностью.(9) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1)-(8), где трансгенное животное, не являющееся человеком, представляет собой животное, выбранное из группы, включающей крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, мышей, крыс, домашнюю птицу, обезьян и кроликов.(10) Способ получения композиции антител со сложными углеводными цепями, присоединенными через N-гликозидные связи к Fc-области, где в композиции среди всех углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидные связи к Fc-области, доля цепей, в которых фукоза по первому положению не связана посредством -связи с N-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, составляет 20% или более, причем указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии, который предусматривает выращивание трансгенного животного по согласно (1)(9), получение из выращенного животного или растения ткани или биологической жидкости, содержащей указанную композицию антител, и выделение композиции антител из полученной ткани или биологической жидкости.(11) Способ согласно (10), где молекула антитела принадлежит классу IgG.(12) Композиция антител, полученная с использованием способа согласно (10) или (11).(13) Лекарственное средство, обладающее высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, содержащее в качестве активного ингредиента композицию антител согласно (12).(14) Лекарственное средство согласно (13), где лекарственное средство является диагностическим лекарственным средством, профилактическим лекарственным средством или лечебным лекарственным средством против болезней, связанных с опухолями, болезней, связанных с аллергией, болезней, связанных с воспалением, аутоиммунных заболеваний, болезней органов кровообращения, болезней, связанных с вирусными инфекциями, или болезней, связанных с бактериальными инфекциями. Клетка CHO ткани яичника китайского хомячка, в которую согласно настоящему изобретению введен ген, кодирующий молекулу антитела, может представлять собой любую клетку CHO до тех пор, пока она является клеткой CHO, полученной из ткани яичника китайского хомячка, в которую введен ген, кодирующий молекулу антитела, продуцирующую композицию антител, содержащих сложные углеводные цепи, присоединенные через N-гликозидную связь, связанные с Fc-областью молекулы антитела, где среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидную связь, связанных с Fcобластью, в композиции доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более. В настоящем изобретении молекула антитела является любой молекулой до тех пор, пока она содержит Fc-область антитела. Примерами являются антитело, фрагмент антитела, слитый белок, содержащий Fc-область, и т.п. Антитело представляет собой белок, продуцируемый в живом организме путем иммунной реакции как результат экзогенной стимуляции антигена, и обладает активностью специфического связывания с антигеном. Примерами антител являются антитела, секретируемые гибридомными клетками, полученными из клеток селезенки животного, иммунизированного антигеном; антитела, полученные методом генетической рекомбинации, а именно антитела, полученные введением в клетку-хозяина экспрессирующего вектора антитела со встроенным геном антитела; и т.п. Конкретными примерами являются антитела, продуцируемые гибридомами, гуманизированные антитела, человеческие антитела и т.п. Гибридома представляет собой клетку, полученную слиянием В-клетки, полученной иммунизацией антигеном млекопитающего, но не человека, и миелоидной клетки, полученной от мыши, или подобной клетки, которая может продуцировать моноклональные антитела с нужной антигенной специфичностью. Примерами гуманизированного антитела являются человеческое химерное антитело, человеческое антитело с привитым CDR и т.п. Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела (называемую далее "HV" или "VH", причем тяжелая цепь является "Н-цепью") и вариабельную область легкой цепи антитела (называемую далее "LV" или "VL", причем легкая цепь является "L-цепью"), обе от животного, но не человека, константную область тяжелой цепи человеческого антитела (также называемую далее "CH") и константную область легкой цепи человеческого антитела(также называемую далее "CL"). В качестве животного, но не человека, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик или подобное, до тех пор, пока от него можно получить гибридому. Человеческое химерное антитело можно получить, получая кДНК, кодирующие VH и VL, из гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, встраивая их в экспрессирующий вектор для клетки-хозяина, имеющей гены, кодирующие CH человеческого антитела и CL человеческого антитела, чтобы посредством этого сконструировать экспрессирующий вектор человеческого химерного антитела, и-5 013563 затем вводя вектор в клетку-хозяина для экспрессии антител. В качестве CH человеческого химерного антитела можно использовать любую CH до тех пор, пока она принадлежит к человеческому иммуноглобулину (обозначаемому далее "hIg"). Ho предпочтительныCH, принадлежащие к классу MgG, и можно использовать любой подкласс, принадлежащий к классуMgG, такой как MgG1, MgG2, MgG3 и MgG4. Также в качестве CL человеческого химерного антитела можно использовать любую CL до тех пор, пока она принадлежит к классу hIg, и также можно использовать CL, принадлежащие к классуили классу . Человеческое антитело с привитым CDR представляет собой антитело, в котором аминокислотные последовательности CDR VH и VL антитела, полученного от животного, но не человека, привиты в соответствующих позициях VH и VL человеческого антитела. Человеческое антитело с привитым CDR можно получить путем конструирования кДНК, кодирующих V-области, в которых CDR VH и VL антитела, полученного от животного, но не человека, привиты в CDR VH и VL человеческого антитела, встраивания их в экспрессирующий вектор для клеткихозяина, имеющей гены, кодирующие CH человеческого антитела и CL человеческого антитела, чтобы посредством этого сконструировать экспрессирующий вектор человеческого CDR-привитого антитела, и последующего введения вектора в клетку-хозяина для эксперссии человеческих CDR-привитых антител. В качестве CH человеческого антитела с привитым CDR можно использовать любую CH до тех пор,пока она принадлежит к классу hIg, но предпочтительны CH класса hIgG, и можно использовать любой подкласс, принадлежащий к классу hIgG, такой как hIgG1, hIgG2, hIgG3 и hIgG4. Также в качестве CL человеческого CDR-привитого антитела можно использовать любую CL до тех пор, пока она принадлежит к классу hIg, и также можно использовать CL, принадлежащие к классуили классу . Человеческое антитело по происхождению является природным антителом, существующим в организме человека, но к нему также относятся антитела, полученные из фаговой библиотеки человеческих антител, человеческие антитела, продуцируемые трансгенным животным, и человеческие антитела, продуцируемые трансгенным растением, которые получают, основываясь на последних достижениях генной инженерии, клеточной инженерии и развитии методов инженерии. Что касается антител, существующих в организме человека, то можно культивировать лимфоциты,способные продуцировать антитела, путем выделения лимфоцитов периферийной крови человека, иммортализации их путем заражения вирусом EB или подобным и последующего клонирования, и можно выделить антитела из культуры в чистом виде. Фаговая библиотека человеческих антител представляет собой библиотеку, в которой фрагменты антител, такие как Fab, одноцепочечные антитела и подобные экспрессируются на поверхности фага путем встраивания гена, кодирующего антитело, полученное из В-клетки человека, в фаговый ген. Фаги,экспрессирующие фрагменты антител с нужной антигенсвязывающей активностью, можно выделить из библиотеки, используя их активность в отношении связывания с антигениммобилизованным субстратом в качестве маркера. Затем методами генной инженерии фрагмент антитела можно превратить в молекулу человеческого антитела, содержащую две полные Н-цепи и две полные L-цепи. Трансгенное животное, не являющееся человеком, продуцирующее человеческие антитела, представляет собой животное, в клетки которого введен ген человеческого антитела. Конкретно, трансгенное животное, продуцирующее человеческие антитела, можно получить путем введения гена человеческого антитела в клетки ES мыши, трансплантированием клеток ES в эмбрион на ранней стадии развития другой мыши и последующего его выращивания. Трансгенное животное также можно получить путем введения гена человеческого химерного антитела в оплодотворенную яйцеклетку и выращивания ее. Что касается способа получения человеческих антител от трансгенного животного, продуцирующего человеческие антитела, то человеческие антитела можно получать и накапливать в культуре посредством получения продуцирующих человеческие антитела гибридом методом получения гибридом, осуществляемым, как правило, на млекопитающих, не являющихся людьми, и последующего их культивирования. Примеры трансгенных не являющихся людьми животных являются крупный рогатый скот, овцы,козы, свиньи, лошади, мыши, крысы, домашняя птица, обезьяны, кролики и т.п. В настоящем изобретении также предпочтительно, что антитело представляет собой антитело, узнающее связанный с опухолью антиген, антитело, узнающее антиген, связанный с аллергией или воспалением, антитело, узнающее антиген, связанный с аутоиммунным заболеванием, или антитело, узнающее антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, и предпочтительно человеческое антитело, принадлежащее к классу IgG. Фрагмент антитела представляет собой фрагмент, содержащий Fc-область антитела. Примерами фрагмента антитела являются мономер Н-цепи, димер Н-цепи и т.п. Слитый белок, содержащий Fc-область, представляет собой композицию, в которой антитело, содержащее Fc-область антитела или фрагмент антитела, слито с белком, таким как фермент, цитокин или подобный белок. В настоящем изобретении примером углеводной цепи, связывающейся с Fc-областью молекулы антитела, является углеводная цепь, присоединенная через N-гликозидную связь. Примерами углеводной-6 013563 цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, является цепь комплексного типа, в которой со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеется одно или несколько параллельных ветвлений галактозо-N-ацетилглюкозамина (называемого далее "Gal-GlcNAc"), и со стороны нередуцирующего конца Gal-GlcNAc имеется такая структура, как сиаловая кислота, расположенный посередине Nацетилглюкозамин или подобная структура. В одном из вариантов антитела Fc-область имеет позиции, с которыми связывается углеводная цепь, присоединенная через N-гликозидную связь, что будет описано далее. Соответственно, связываются две углеводные цепи на одну молекулу антитела. Так как углеводная цепь, присоединенная через Nгликозидную связь, связывающаяся с антителом, включает любую углеводную цепь, имеющую коровую структуру, представленную структурной формулой (I), возможен ряд комбинаций углеводных цепей для двух углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидную связь, которые связываются с молекулой антитела. Соответственно, идентичность веществ можно установить с точки зрения углеводной структуры, связанной с Fc-областью. В настоящем изобретении композиция, содержащая молекулы антитела, имеющего в Fc-области сложные углеводные цепи, присоединенные через N-гликозидные связи (называемая далее "композиция антител настоящего изобретения"), может содержать антитела с одной и той же структурой углеводной цепи или антитела с разными структурами углеводных цепей до тех пор, пока от композиции получают эффект настоящего изобретения. В настоящем изобретении доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Nацетилглюкозамином на редуцирующем конце углеводной цепи, среди всех сложных углеводных цепей,присоединенных через N-гликозидные связи, соединенных с Fc-областью, содержащихся в композиции антител, представляет собой отношение числа углеводных цепей, в которых фукоза не связана с Nацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, к общему числу сложных углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидные связи, соединенных с Fc-областью, содержащихся в композиции. В настоящем изобретении углеводная цепь, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, представляет собой углеводную цепь, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином через -связь на редуцирующем конце углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примером является сложная углеводная цепь, присоединенная через N-гликозидную связь, в которой положение 1 фукозы не связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина. Композиция антител показывает высокую ADCC-активность, когда доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидные связи, соединяющихся с Fcобластью, содержащихся в композиции антител настоящего изобретения, составляет предпочтительно 20% или более, предпочтительнее 25% или более, еще предпочтительнее 30% или более, более предпочтительно 40% или более и наиболее предпочтительно 50% или более. Когда концентрация антител снижается, снижается ADCC-активность, но высокую ADCC-активность можно получить даже в том случае,когда концентрация антител низкая, до тех пор, пока доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более. Долю углеводной цепи, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, содержащейся в композиции, которая содержит молекулу антитела, имеющую в Fc-области сложные углеводные цепи, присоединенные через N-гликозидные связи, можно определить,высвобождая углеводную цепь из молекулы антитела с использованием известного способа, такого как гидразинолиз, ферментативное расщепление или подобный способ [Biochemical Experimentation Methods 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), edited by Reiko Takahashi (1989)], помечая флуоресцентной меткой или радиоизотопом высвобожденную углеводную цепь и затем выделяя помеченную углеводную цепь хроматографией. Высвобожденную углеводную цепь также можно установить, анализируя ее методом HPAED-PAD [J. Liq. Chromatogr., 6, 1557 (1983)]. В настоящем изобретении клетка CHO, полученная из ткани яичников китайского хомячка, включает любую клетку, которая представляет собой клеточную линию, полученную из ткани яичников китайского хомячка (Cricetulus griseus). Примерами являются клетки CHO,описанные в таких публикациях, как Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900); и т.п. Кроме того, в качестве примеров можно также назвать CHO-K1(Американская коллекция типовых культур), и коммерчески доступные CHO-S (Life Technologies, кат.11619) или клеточные сублинии, полученные адаптацией клеток с использованием различных сред. В настоящем изобретении фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, может представлять собой любой фермент до тех пор, пока он представляет-7 013563 собой фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, как источник поставки фукозы для углеводной цепи. Фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, представляет собой фермент, влияющий на синтез внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы. Внутриклеточный углеводонуклеотид GDP-фукоза поставляется каскадом реакций синтеза de novo или каскадом реакций "реутилизационного" синтеза. Таким образом, все ферменты, имеющие отношение к таким каскадам реакций синтеза, относятся к ферментам, имеющим отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы. Примерами фермента, имеющего отношение к каскаду реакций синтеза de novo внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, являются GDP-маннозо-4,6-дегидратаза (далее называемая "GMD"),GDP-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимеразо-4,6-редуктаза (далее называемая "Fx") и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к каскаду реакций "реутилизационного" синтеза внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, являются GDP-бета-L-фукозопирофосфорилаза (далее называемая "GFPP"), фукокиназа и подобные ферменты. К ферментам, влияющим на синтез внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, также относятся фермент, влияющий на активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, и фермент, влияющий на структуру веществ как субстратов фермента. В настоящем изобретении примерами GMD являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (b):(d) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:71, и обладающий GMD-активностью;(e) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:71, и обладающий GMDактивностью, и подобные белки. Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность GMD, являются ДНК,содержащая нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:65, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQID NO:65, и кодирующая аминокислотную последовательность с GMD-активностью. В настоящем изобретении примерами Fx являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (b):(d) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:72, и обладающий Fx-активностью;(e) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:72, и обладающий Fxактивностью, и подобные белки. Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность Fx, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:48, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ IDNO:48, и кодирующая аминокислотную последовательность с Fx-активностью. В настоящем изобретении примерами GFPP являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (b):(d) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:73, и обладающий GFPP-активностью;(e) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:73, и обладающий GFPPактивностью, и подобные белки. Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность GFPP, являются ДНК,-8 013563 содержащая нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:51, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQID NO:51, и кодирующая аминокислотную последовательность с Fx-активностью. В настоящем изобретении ферментом, имеющим отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы через -связь связано с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, является любой фермент до тех пор, пока он представляет собой фермент, имеющий отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Ферментом, имеющим отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, называют фермент, влияющий на реакцию связывания положения 1 фукозы через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь. Примерами фермента, имеющего отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются -1,6-фукозилтрансфераза, -L-фукозидаза и подобные ферменты. Примерами также являются фермент, влияющий на активность фермента, имеющего отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, и фермент,влияющий на структуру веществ как субстратов фермента. В настоящем изобретении примером -1,6-фукозилтрансферазы является белок, кодированный ДНК, выбранной из числа приведенных далее (а), (b), (с) или (d):(g) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:23, и обладающий -1,6-фукозилтрансферазной активностью;(h) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:24, и обладающий -1,6-фукозилтрансферазной активностью;(i) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:23, и обладающий -1,6 фукозилтрансферазной активностью;(j) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:24, и обладающий -1,6 фукозилтрансферазной активностью, и подобные белки. Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность 1,6-фукозилтрансферазы, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 или 2, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 или 2, и кодирующая аминокислотную последовательность с 1,6 фукозилтрансферазной активностью. В настоящем изобретении ДНК, которая гибридизирует в строгих условиях, получают, например,таким способом, как гибридизация колоний, гибридизация в бляшках или Саузерн-блоттинг, с использованием в качестве зонда ДНК, такой как ДНК с нуклеотидной последовательностью, представленнойSEQ ID NO:1, 2, 48, 51 или 65, или ее частичного фрагмента, и конкретно включает ДНК, которую можно идентифицировать путем осуществления гибридизации при 65 С в присутствии 0,7-1,0 M хлорида натрия с использованием фильтра, на котором иммобилизуют колоние- или бляшкообразованные фрагменты ДНК, с последующим промыванием фильтра при 65 С с использованием раствора 0,1-2SSC (причем композиция раствора 1SSC содержит 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия). Гибридизацию можно осуществить согласно способам, описанным, например, в Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (далее данная публикация упоминается как "MolecularCloning, Second Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, 1987-1997 (далее данная публикация упоминается как "Current Protocols in Molecular Biology"); DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995); и т.п. Примерами ДНК, способной к гибридизации, являются ДНК, имеющие по меньшей мере 60% или большую, предпочтительно 70% или большую, предпочтительнее 80% или большую, еще предпочтительнее 90% или большую, более предпочтительно 95% или большую и наиболее предпочтительно 98% или большую гомологию с нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, 2, 48, 51 или 65. В настоящем изобретении белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:23, 24, 71, 72 или 73, и обладающий -1,6 фукозилтрансферазную активностью, GMD-активностью, Fx-активностью или GFPP-активностью, можно получить, например, путем введения сайт-направленной мутации в ДНК, кодирующую белок, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:1, 2, 65, 48 или 51, соответственно, с использованием сайт-направленного мутагенеза, описанного, например, в Molecular Cloning,Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985); и т.п. Число удаленных, замененных, встроенных и/или добавленных аминокислот равно единице или большему числу, и оно конкретно не лимитируется, но является числом аминокислот, которые можно удалить, заменить или добавить известным методом, таким как сайтнаправленный мутагенез, например, оно составляет от 1 до нескольких десятков, предпочтительно 1-20,предпочтительнее 1-10 и наиболее предпочтительно 1-5. Также, в настоящем изобретении для того, чтобы сохранилась -1,6-фукозилтрансферазная активность, GMD-активность, Fx-активность или GFPP-активность белка, он имеет по меньшей мере 80% или большую, предпочтительно 85% или большую, предпочтительнее 90% или большую, еще предпочтительнее 95% или большую, более предпочтительно 97% или большую и наиболее предпочтительно 99% или большую гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:23, 24,71, 72 или 73, вычисленную с использованием аналитической программы, такой как BLAST [J. Mol. Biol.,215, 403 (1990)], FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)] или подобной программы. Примерами клеток CHO настоящего изобретения являются клетки, в которых ферментативная активность уменьшена или устранена. Клетки, в которых ферментативная активность уменьшена или устранена, включают клетки, в которых уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, где положение 1 фукозы через -связь связано с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. В качестве способа получения таких клеток можно использовать любой метод до тех пор, пока с его помощью можно уменьшить или устранить ферментативную активность, представляющую интерес. Примерами метода уменьшения или устранения ферментативной активности являются:(a) метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент,(b) метод введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент,(c) метод введения мутации в фермент,(d) метод ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент,(e) метод отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему углеводную цепь, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, и подобные методы. В данном случае лектинневосприимчивую клеточную линию можно получить культивированием клеточной линии в среде, содержащей предварительно установленную концентрацию лектина, и последующим отбором клеточной линии, которая приобретает такое свойство, что степень ее выживания становится выше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно в 3 раза и предпочтительнее в 5 раз или более,чем у родительской клеточной линии, со статистической значимостью. Такую линию также можно получить путем культивирования клеточной линии в среде, содержащей лектин, и последующего отбора клеточной линии, которую можно культивировать при определенной степени выживания, например степени выживания 80%, при концентрации лектина выше по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно в 5 раз,предпочтительнее в 10 раз и наиболее предпочтительно в 20 раз или более, чем в случае родительской клеточной линии. В качестве лектина, узнающего структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно использовать любой лектин, узнающий углеводную цепь. Примерами являются лектин Lens culinaris LCA (лентилагглютинин, полученный из Lens culinaris), лектин гороха PSA (лектин гороха, полученный из Pisum sativum), лектин кормовых бобов VFA(агглютинин, полученный из Vicia faba), лектин Aleuria aurantia AAL (лектин, полученный из Aleuria aurantia) и т.п. Клетки CHO настоящего изобретения могут продуцировать композицию антител с более высокойADCC-активностью, чем у композиции антител, продуцированной родительской линией CHO перед применением способа уменьшения или устранения ферментативной активности, представляющей интерес. Также клетки CHO настоящего изобретения могут продуцировать композицию антител с более высокой ADCC-активностью, чем ADCC-активность композиции антител, в которой среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через N-гликозидные связи, соединяющихся с Fc-областью, содержащихся в композиции антител настоящего изобретения, доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет менее 20%. Примером родительской клеточной линии, используемой в настоящем изобретении, являются клетки, в которых не снижена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Конкретно,используют клетки, не обработанные с целью снижения или устранения активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активности фермента,имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. В настоящем изобретении ADCC-активность является цитотоксической активностью, при которой антитело, связанное с антигеном клеточной поверхности опухолевой клетки в живом организме, активирует эффекторную клетку через Fc-рецептор, существующий в Fc-области антитела, и поверхность эффекторной клетки, и посредством этого блокирует опухолевую клетку и т.п. [Monoclonal Antibodies:Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 2.1 (1955)]. Примерами эффекторной клетки являются киллерная клетка, природная киллерная клетка, активированный макрофаг и подобные клетки. Настоящее изобретение также относится к клетке, в которой методом генной инженерии уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь (далее называемой "клетка-хозяин настоящего изобретения"). Клетка-хозяин настоящего изобретения полезна в качестве клетки-хозяина для продукции композиции антител с высокой ADCC-активностью. Клетка-хозяин настоящего изобретения может представлять собой любую клетку до тех пор, пока она может экспрессировать молекулу антитела. Примерами являются дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого, растительная клетка и т.п. Примерами таких клеток являются клетки, которые будут рассматриваться далее в разделе 3. Среди животных клеток предпочтительными примерами являются клетки CHO, полученные из ткани яичника китайского хомячка, клетки клеточной линии миеломы крысы YB2/3HL.Р 2.G11.16Ag20, клетки клеточной линии миеломы мыши NS0, мышиные миелоидные клетки SP2/0-Ag14, клетки BHK, полученные из ткани почек сирийского хомячка, продуцирующие антитела гибридомные клетки, клетки клеточной линии лейкоза человека Namalwa, эмбриональные стволовые клетки, оплодотворенные яйцеклетки и т.п. Ниже настоящее изобретение описано подробнее. 1. Получение клетки-хозяина настоящего изобретения. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить методами, описанными далее.(1) Метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить с использованием метода прерывания гена, имея целью фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, являются GMD, Fx, GFPP, фукокиназа и подобные белки. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи,в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются -1,6 фукозилтрансфераза, -L-фукозидаза и т.п. Ген, используемый в данном случае, включает ДНК и РНК. Способ прерывания гена может представлять собой любой способ до тех пор, пока он может привести к прерыванию гена фермента-мишени. Примерами являются антисмысловой способ, рибосомный способ, способ гомологических рекомбинаций, способ RDO, способ RNAi, способ с использованием рет- 11013563 ровирусов, способ с использованием транспозонов и подобные способы. Ниже способы описываются конкретно.(а) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения антисмысловым способом или рибосомным способом. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить рибосомным способом, описанным в CellTechnology, 13, 255 (1994); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1886 (1999), или подобным способом, например, имея целью фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Получают кДНК или геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь. Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК или геномной ДНК. На основе определенной последовательности ДНК задают соответствующую длину антисмысловой генной или рибосомной конструкции, содержащей часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, часть ее нетранслируемой области или интрон. Для того чтобы экспрессировать антисмысловой ген или рибосому в клетке, получают рекомбинантный вектор, вводя фрагмент или полноразмерную полученную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора. Получают трансформант путем введения рекомбинантного вектора в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить отбором трансформанта на основании структуры углеводной цепи гликопротеина на клеточной мембране или структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела. В качестве клетки-хозяина, используемой для получения клетки-хозяина настоящего изобретения,можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она имеет ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или который можно интегрировать в хромосому, содержащий промотор в такой позиции, что создаваемые антисмысловой ген или рибосому можно переносить. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3. Что касается способа введения гена в различные клетки-хозяева, то можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, описанные далее в разделе 3. Описанный далее способ может служить примером способа отбора трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Способ отбора трансформанта Примерами способа отбора клеток, в которых уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются биохимические способы или методы генной инженерии, описанные в New Biochemical Experimentation Series 3 - Saccharides I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), ed- 12013563Taniguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa and Kazuyuki Sugawara (1996); Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; и подобные способы. Примеры биохимических способов включают способ, при котором ферментативную активность оценивают с использованием ферментспецифического субстрата и т.п. Примерами методов генной инженерии являются анализ методом Нозерн-блоттинга, RT-PCR и подобные, при которых измеряют количество мРНК гена, кодирующего фермент. Примерами способа отбора трансформанта на основании структуры углеводной цепи гликопротеина на клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основании структуры углеводной цепи продуцируемых молекул антител являются способы, которые будут описаны далее в разделах 5 и 6. Примером способа получения кДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи сахаров, присоединенной черезN-гликозидную связь, является способ, описанный далее. Получение кДНК Получают полную РНК или мРНК из ткани или клеток человека или животного, не являющегося человеком. Из полученных полных РНК или мРНК получают библиотеку кДНК. Получают вырожденные праймеры на основе аминокислотной последовательности фермента,имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента,имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, или методом ПЦР (PCR) с использованием в качестве матрицы полученной бибилиотеки кДНК получают фрагмент гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь. ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно получить путем скрининга библиотеки кДНК с использованием полученного фрагмента гена в качестве зонда. Что касается мРНК человеческих или отличных от человеческих ткани или клетки, то можно использовать коммерчески доступный продукт (например, произведенный Clontech), или ее можно получить из тканей или клеток человека или животного, не являющегося человеком, как в примерах. Примеры способа получения полной РНК из тканей или клеток человека или животного, не являющегося человеком, включают способ с гуанидинтиоцианатом и трифторацетатом церия [Metods in Enzymology, 154, 3(1987)], кислотный способ с гуанидинтиоцианатом, фенолом и хлороформом (AGPC) [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, 9, 1937 (19 91)] и подобные способы. Также примерами способа получения мРНК из полной РНК, например, РНК поли(A)+, является колоночный способ с олиго(dT), иммобилизованным на целлюлозе (Molecular Cloning, Second Edition), и подобные способы. Кроме того, мРНК можно получить с использованием набора, такого как набор Fast Track mRNAIsolation (производимый Invitrogen), набор Quick Prep mRNA Purification (производимый Pharmacia), или подобного набора. Из полученной мРНК тканей или клеток человека или животного, не являющегося человеком, получают библиотеку кДНК. Примерами способа получения библиотек кДНК являются способы, описанные в Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); и подобные способы, или способы с использованием коммерчески доступных наборов, таких как набор Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (производимыйLife Technologies), набор ZAP-cDNA Synthesis (производимый STRATAGENE), и подобные наборы. В качестве клонирующего вектора для применения при получении библиотеки кДНК можно использовать любой вектор, такой как фаговый вектор, плазмидный вектор или подобный, до тех пор, пока он может автономно реплицироваться в Escherichia coli K12. Примерами являются ZAP Express [производимый STRATAGENE, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] и подобные векторы. В качестве микроорганизма-хозяина можно использовать любой микроорганизм, но предпочтительно используют Escherichia coli. Примерами являются Escherichia coli XL1-Blue MRF' [производимая[Gene, 38, 275 (1985)] и т.п. Библиотеку кДНК можно использовать как таковую при последующих анализах и для того, чтобы получить полноразмерную кДНК настолько рационально, насколько возможно, путем уменьшения доли неполной кДНК, и библиотеку кДНК, полученную с использованием олигокэпового метода, разработанного Sugano et al. [Gene, 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 (1997); Protein, Nucleic Acid and Protein, 41, 603Gene Libraries (Yodo-sha) (1994)], можно использовать в описанном далее анализе. Получают вырожденные праймеры для 5'-концевых и 3'-концевых нуклеотидных последовательностей, предполагаемых для кодирования аминокислотной последовательности, на основе аминокислотной последовательности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотидаGDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, и ДНК амплифицируют ПЦР[PCR Protocols, Academic Press (1990)] с использованием полученной библиотеки кДНК в качестве матрицы, и получают фрагмент гена, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Можно подтвердить, что полученный фрагмент гена представляет собой ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент,имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи сахаров, присоединенной через N-гликозидную связь, способом, используемым, как правило, для анализа нуклеотидов, такого как дидезокси-способ Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 5463 (1977)], с помощью анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК ABIPRISM 377(производимый PE Biosystem), или подобного устройства. ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно получить, осуществляя гибридизацию колоний или гибридизацию в бляшках (Molecular Cloning, Second Edition) для кДНК или библиотеки кДНК, синтезированных из мРНК, содержащейся в тканях или клетках человека или животного, не являющегося человеком, с использованием фрагмента гена в качестве ДНК-зонда. Также ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно получить, осуществляя скрининг методом ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК или библиотеки кДНК,синтезированных из мРНК, содержащейся в тканях или клетках человека или животного, не являющегося человеком, и с использованием праймеров, используемых для получения фрагмента гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Нуклеотидную последовательность полученной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, анализируют от ее конца и определяют способом, используемым, как правило, для анализа нуклеотидов, таким как дидезокси-способ Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)], с помощью анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК ABIPRISM 377 (производимый PE Biosystem), или подобного устройства. Ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотидаGDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в слож- 14013563 ной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, также можно определить из генов в базах данных путем поиска в таких базах данных нуклеотидных последовательностей, как GenBank,EMBL, DDBJ, и подобных, с использованием поисковой программы, такой как BLAST, на основе определенной нуклеотидной последовательности кДНК. Примерами нуклеотидной последовательности гена, полученного таким способом, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:48, 51 или 65. Примерами нуклеотидной последовательности гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи,в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:1 или 2. Также кДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно получить методом химического синтеза с помощью синтезатора ДНК, такого как синтезатор ДНК модели 392, производимый Perkin Elmer, или подобного синтезатора, с использованием фосфорамидитного способа, на основании определенной нуклеотидной последовательности ДНК. В качестве примера способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, приводится способ, описанный ниже. Получение геномной ДНК Примеры способа получения геномной ДНК включают известные способы, описанные в MolecularCloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; и подобные. Кроме того, геномную ДНК,кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, также можно выделить с использованием такого набора, как Genome DNA Library Screening System (производимого Genome Systems), наборовUniversal Genome Walker (производимых CLONTECH) или подобных наборов. Примерами нуклеотидной последовательности полученной таким способом геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы,являются нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:67 или 70. Примером нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, является нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:3. Кроме того, клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить без использования экспрессирующего вектора путем непосредственного введения в клетку-хозяина антисмыслового олигонуклеотида или рибосомы, которые создаются на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Антисмысловой олигонуклеотид или рибосому можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК. Конкретно, их можно получить на основе сведений о последовательности олигонуклеотида с соответствующей последовательностью из 5-150 оснований, предпочтительно 5-60 оснований и предпочтительнее 10-40 оснований, из числа нуклеотидных последовательностей кДНК и геномной ДНК, кодирующих фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, путем синтеза олигонуклеотида, соответствующего последовательности, комплементарной олигонуклеотиду (антисмысловому олигонуклеотиду) или рибосоме, соответствующей последовательности олигонуклеотида. Примерами олигонуклеотида являются олиго-РНК и производные олигонуклеотидов (называемые далее в данном описании "производными олигонуклеотидов"). Примерами производных олигонуклеотидов являются производные олигонуклеотидов, в которых фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращается в фосфоротиоатную связь, производное олигонуклеотида, в котором фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращается в N3'-Р 5'- 15013563 фосфоамидатную связь, производное олигонуклеотида, в котором рибоза и фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращаются в связь пептид-нуклеиновая кислота, производное олигонуклеотида, в котором урацил в олигонуклеотиде замещается С-5-пропинилурацилом, производное олигонуклеотида, в котором урацил в олигонуклеотиде замещается С-5-тиазолурацилом, производное олигонуклеотида, в котором цитозин в олигонуклеотиде замещается С-5-пропинилцитозином, производное олигонуклеотида, в котором цитозин в олигонуклеотиде замещается цитозином, модифицированным феноксазином, производное олигонуклеотида, в котором рибоза в олигонуклеотиде замещается 2'-О-пропилрибозой, и производное олигонуклеотида, в котором рибоза в олигонуклеотиде замещается 2'-метоксиэтоксирибозой [Cell(b) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения методом гомологичных рекомбинаций. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить путем модификации гена-мишени в хромосоме методом гомологичных рекомбинаций с использованием в качестве гена-мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы,или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Ген-мишень в хромосоме можно модифицировать, используя способ, описанный в Manipulating theMouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (далее в описании упоминается как "Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual"); Gene Targeting, APractical Approach, IRL Press of Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995) (далее в описании упоминается как "Preparation of Mutant Mice using ES Cells"); или подобный способ, например следующий. Получают геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. На основе нуклеотидной последовательности геномной ДНК получают вектор-мишень для гомологичной рекомбинации гена-мишени, который модифицируют (например, структурного гена фермента,имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента,имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, или гена промотора). Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением полученного вектора-мишени в клетку-хозяина и отбором клеток, в которых произошла рекомбинация между геном-мишенью и вектором-мишенью. В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она имеет ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. Примеры способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, включают способы, описанные при получении геномной ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы. Примерами нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:67 или 70. Примером нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, является нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:3. Вектор-мишень для использования при гомологичной рекомбинации гена-мишени можно получить согласно способу, описанному в Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press of Oxford University Press(1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995), или подобным способом. Вектор-мишень можно использовать или по типу замещения, или по типу встраивания. Для того чтобы ввести вектор-мишень в различные клетки-хозяева, можно использовать способы- 16013563 введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3. Примерами способа эффективного отбора гомологичного рекомбинанта являются такие способы,как положительный отбор, промоторный отбор, отрицательный отбор или отбор по поли-А, описанные вTargeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995), или подобные способы. Примерами способа отбора из отобранных клеточных линий гомологичного рекомбинанта, представляющего интерес, являются способ гибридизации по Саузерну для геномной ДНК (Molecular Cloning, Second Edition),ПЦР [PCR Protocols, Academic Press (1990)] и подобные способы.(с) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом RDO. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить способом RDO (РНК-ДНКолигонуклеотид), имея целью ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, например, следующим образом. Получают кДНК или геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь. Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК или геномной ДНК. На основании определенной последовательности ДНК создают и синтезируют конструкцию RDO соответствующей длины, содержащую часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, или часть ее нетранслируемой области или интрон. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением синтезированной RDO в клетку-хозяина и последующим отбором трансформанта, в котором произошла мутация в ферменте-мишени,а именно ферменте, имеющем отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы,или ферменте, имеющем отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. Примерами способа введения RDO в различные клетки-хозяева являются способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3. Примеры способа получения ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, включают способы, описанные при получении ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы. Примеры способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, включают способы, описанные при получении геномной ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы. Нуклеотидную последовательность ДНК можно определить, расщепляя ее соответствующими рестрикционными ферментами, клонируя фрагменты в плазмиду, такую как pBluescript SK(-) (производимую Stratagene), или подобную, подвергая клоны реакции, обычно используемой в качестве способа анализа нуклеотидной последовательности, такой как в дидезокси-способе [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,5463 (1977)], Sanger et al., или подобному взаимодействию, и затем анализируя клоны с использованием автоматического анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК A.L.F.RDO можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК. Примерами способа отбора клеток, в которых за счет введения ROD в клетки-хозяева произошла мутация в гене, кодирующем фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются способы прямого обнаружения мутаций в хромосомных генах, описанные в Molecular Cloning, Second Edition, CurrentProtocols in Molecular Biology, и подобные способы; способы, описанные в разделе 1(1)(а) для отбора трансформанта через оценку активности введенного фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь; способ отбора трансформанта с использованием углеводной структуры гликопротеина на клеточной мембране, который будет описан далее в разделе 1(5); и способ отбора трансформанта на основе углеводной структуры полученной молекулы антитела, который будет описан далее в разделе 5 или 6, и подобные способы. Конструкцию ROD можно создать согласно способам, описанным в Science, 273, 1386 (1996); Nature Medicine, 4, 285 (1998); Hepatology, 25, 1462 (1997); Gene Therapy, 5, 1960 (1999); J. Mol. Med., 75,829 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8774 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8768 (1999); Nuc.(d) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом RNAi. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить способом RNAi (интерференции РНК),имея целью ген фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, например, следующим образом. Получают кДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК. На основе определенной последовательности ДНК создают генную конструкцию RNAi соответствующей длины, содержащую кодирующую часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, или часть ее нетранслируемой области. Для того чтобы в клетке экспрессировался ген RNAi, получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент или полноразмерную полученную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора. Получают трансформант, вводя рекомбинантный вектор в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы,или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране или продуцируемой молекуле антитела. В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине, или который можно интегрировать в хромосому, и содержащий промотор в такой позиции, что создаваемый ген RNAi можно переносить. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.- 18013563 Что касается способа введения гена в различные клетки-хозяева, то можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, описанные далее в разделе 3. Примерами способа отбора трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6. Примеры способа получения ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, включают способы, описанные при получении ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы. Кроме того, клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить без использования экспрессирующего вектора непосредственным введением гена RNAi, созданного на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Ген RNAi можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК. Конструкцию гена RNAi можно создать согласно способам, описанным в Nature, 391, 806 (1998);(e) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом с использованием транспозонов. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить, вызывая мутацию с использованием системы транспозонов, описанной в Nature Genet., 25, 35 (2000), или подобной системы, с последующим отбором мутанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина продуцируемой молекулы антитела или в клеточной мембране. Система транспозонов представляет собой систему, в которую вводят мутацию случайным встраиванием в хромосому экзогенного гена, где экзогенный ген, расположенный между транспозонами, обычно используют в качестве вектора для индуцирования мутации, и в то же время в клетку вводят вектор,экспрессирующий транспозазу, для случайного встраивания гена в хромосому. Можно использовать любую транспозазу до тех пор, пока она подходит для последовательности используемого транспозона. В качестве экзогенного гена можно использовать любой ген до тех пор, пока он может индуцировать мутацию в ДНК клетки-хозяина. В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. Для введения гена в различные клетки-хозяева можно использовать способ введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев,которые будут описаны далее в разделе 3. Примерами способа отбора мутанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а). Примерами способа отбора мутанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбо- 19013563 ра мутанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы,которые будут описаны далее в разделе 5 или 6.(2) Способ введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить, имея целью ген, кодирующий фермент,имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент,имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, с использованием метода введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, являются GMD, Fx, GFPP, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются -1,6-фукозилтрансфераза, -Lфукозидаза и подобные ферменты. Ферменты катализируют специфические реакции со специфичностью к субстрату, и доминантотрицательные мутанты ферментов можно получить, разрушая активный центр ферментов, катализирующих каталитическую активность со специфичностью к субстрату. Способ получения доминантотрицательного мутанта конкретно описывается ниже с выбором среди мишеней-ферментов GMD. В результате анализа трехмерной структуры GMD, полученного из E. coli, показано, что 4 аминокислоты (треонин в позиции 133, глутаминовая кислота в позиции 135, тирозин в позиции 157 и лизин в позиции 161) важны для ферментативной активности (Structure, 8, 2, 2000). Иными словами, когда получали мутантов заменой 4 аминокислот на другие аминокислоты на основании информации о трехмерной структуре, ферментативная активность всех мутантов существенно понижалась. С другой стороны, изменения способности GMD связываться с коферментом GMD NADP и его субстратом GDP-маннозой в мутантах едва отмечались. Соответственно, доминантотрицательный мутант можно получить, заменяя 4 аминокислоты, регулирующие ферментативную активность GMD. Например, в GMD (SEQ ID NO:65),полученном из клеток CHO, доминантотрицательный мутант можно получить, заменяя треонин в позиции 155, глутаминовую кислоту в позиции 157, тирозин в позиции 179 и лизин в позиции 183 на другие аминокислоты, сравнивая гомологию и предсказывая трехмерную структуру с использованием информации об аминокислотной последовательности, основанной на результатах для GMD, полученного из E.coli. Так, ген, в который введена замена аминокислоты, можно получить методом сайт-направленного мутагенеза, описанным в Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, или подобным методом. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить согласно способу, описанному в Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, или подобному способу, с использованием полученного гена доминантотрицательного мутанта фермента-мишени, например, следующим образом. Получают ген, кодирующий доминантотрицательный мутант (называемый далее "геном доминантотрицательного мутанта") фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. На основе полученной полноразмерной ДНК гена доминантотрицательного мутанта получают, при необходимости, фрагмент ДНК соответствующей длины, содержащий часть, кодирующую белок. Получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент ДНК или полноразмерную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора. Получают трансформант, вводя рекомбинантный вектор в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина продуцируемой молекулы антитела или в клеточной мембране. В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.- 20013563 В качестве экспрессирующего вектора можно использовать вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или может интегрироваться в хромосому и содержит промотор в позиции,где можно осуществить транскрипцию ДНК, кодирующей доминантотрицательный мутант, представляющий интерес. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3. Для введения гена в различные клетки-хозяева можно использовать способ введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3. Примерами способа отбора трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6.(3) Способ введения мутации в фермент. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением мутации в ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, и последующим отбором клеточной линии, представляющий интерес, в которой произошла мутация в ферменте. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотидаGDP-фукозы, являются GMD, Fx, GFPP, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента,имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются -1,6-фукозилтрансфераза, -L-фукозидаза и подобные ферменты. Примерами способа являются 1) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном,или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, 2) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на структуре углеводной цепи продуцированной молекулы антитела, и 3) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на структуре углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране. В качестве индуцирующей мутацию обработки можно использовать любую обработку до тех пор,пока она может вызывать точечную мутацию или делецию или мутацию со сдвигом рамки в ДНК клеток родительской клеточной линии. Примерами являются обработка этилнитрозомочевиной, нитрозогуанидином, бензопиреном или акридиновым пигментом и обработка излучением. В качестве мутагенов также можно использовать различные алкилирующие агенты и канцерогены. Примерами способа, позволяющего мутагену воздействовать на клетки, являются способы, описанные в Tissue Culture Techniques, 3rd edition (Asakura Shoten),edited by Japanese Tissue Culture Association (1996), Nature Genet., 24, 314 (2000), и подобные способы. Примерами спонтанно образующихся мутантов являются мутанты, спонтанно образованные непрерывным субкультивированием в обычных условиях культивирования клеток без применения специальной обработки, вызывающей мутации. Примерами способа измерения активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а). Примерами способа выяснения структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6. Примерами способа выяснения структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе (5).(4) Способ ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент.- 21013563 Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить ингибированием транскрипции и/или трансляции гена-мишени методом антисмысловой РНК/ДНК [Bioscience and Industry, 50, 322 (1992);Biotechnology, 10, 152 (1992); Cell Engeneering, 16, 1463 (1997)], методом тройной спирали [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)] или подобным методом, с использованием в качестве мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотидаGDP-фукозы, являются GMD, Fx, GFPP, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента,имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, являются -1,6-фукозилтрансфераза, -L-фукозидаза и подобные ферменты.(5) Способ отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить с использованием способа отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами способа отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, являются способы, описанные в Somatic Cell Mol. Genet., 12, 51 (1986), и подобные способы. В качестве лектина можно использовать любой лектин до тех пор, пока он представляет собой лектин, узнающий структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. Примерами являются лектин Lens culinaris LCA (лентилагглютинин,полученный из Lens culinaris), лектин гороха PSA (лектин гороха, полученный из Pisum sativum), лектин кормовых бобов VFA (агглютинин, полученный из Vicia faba), лектин Aleuria aurantia AAL (лектин, полученный из Aleuria aurantia) и т.п. Конкретно, клеточную линию, невосприимчивую к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно отобрать путем культивирования клеток в течение 1 суток-2 недель, предпочтительно от 1 суток до 1 недели, с использованием среды, содержащей лектин в концентрации от 1 мкг/мл до 1 мг/мл, субкультивирования выживших клеток или пикирования колонии и переноса их в сосуд для культивирования клеток и последующего непрерывного культивирования с использованием лектинсодержащей среды. Примером клеточной линии, полученной таким способом, является CHO/CCR4-LCA Nega-13 (FERM ВР-7756), полученная в примере 14(2), описанном далее. 2. Получение трансгенного, не являющегося человеком животного или растения либо их потомств по настоящему изобретению. Трансгенное, не являющееся человеком животное или растение либо их потомства по настоящему изобретению представляют собой трансгенное, не являющееся человеком животное или растение либо их потомства, в которых геномный ген модифицирован таким образом, что можно регулировать активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи молекулы антитела, и их можно получить согласно способу, подобному способу в разделе 1, с использованием в качестве мишени гена,кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDPфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь. В трансгенном животном, не являющемся человеком, можно получить эмбриональные стволовые клетки настоящего изобретения, в которых регулируется активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, применяя способ, подобный способу раздела 1, к эмбриональным стволовым клеткам предназначенного для этого животного, не являющегося человеком, такого как крупный рогатый скот, овца, коза, свинья, лошадь, мышь, крыса, домашняя птица, обезьяна, кролик, или подобного- 22013563 животного. Конкретно, получают клон мутантов, в котором ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, инактивирован или заменен любой последовательностью известным методом гомологичной рекомбинации [например, описанным в Nature, 326, 6110, 295 (1987); Cell, 51, 3, 503 (1987); или подобным]. С использованием полученного клона мутантов методом инъекции химер в бластоцисту оплодотворенной яйцеклетки животного или методом агрегации химер можно получить химерную особь,содержащую клон эмбриональных стволовых клеток и обычные клетки. Химерную особь скрещивают с обычной особью, так что можно получить трасгенное, не являющееся человеком животное, у которого во всех клетках организма уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь. Также можно получить оплодотворенную яйцеклетку настоящего изобретения, в которой уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи,в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, применяя способ, подобный способу раздела 1, к оплодотворенной яйцеклетке представляющего интерес животного,не являющегося человеком, такого как крупный рогатый скот, овца, коза, свинья, лошадь, мышь, крыса,домашняя птица, обезьяна, кролик, или подобного животного. Трансгенное, не являющееся человеком животное, у которого уменьшена активность фермента,имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, можно получить путем трансплантации полученной оплодотворенной яйцеклетки в яйцевод или матку псевдобеременной самки с использованием способа трансплантации эмбрионов, описанного в Manipulating Mouse Embryo, Second Edition, или подобного способа, с последующим рождением животным детенышей. В трансгенном растении каллюс настоящего изобретения, в котором активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через-связь с положением 6 N-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи,присоединенной через N-гликозидную связь, можно получить, применяя способ, подобный способу,описанному в разделе 1, к каллюсу или клеткам растения, представляющего интерес. Трансгенное растение, в котором уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида GDP-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через -связь с положением 6 Nацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Nгликозидную связь, можно получить культивированием полученного каллюса с использованием среды,содержащей ауксин и цитокинин, и редифференцировать его согласно известному способу [Tissue Culture, 20 (1994); Tissue Culture, 21, (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)]. 3. Способ получения композиции антител. Композицию антител можно получить экспрессированием ее в клетках-хозяевах способом, описанным в Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; Antibodies, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (публикация далее упоминается как "Antibodies"); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (публикация далее упоминается как "Monoclonal Antibodies"); и Antibody Engeneering, A Practice Approach, IRL Press at Oxford UniversityPress (публикация далее упоминается как "Antibody Engeneering"), например, следующим образом. Получают полноразмерную кДНК, кодирующую молекулу антитела, и получают фрагмент ДНК соответствующей длины, содержащий часть, кодирующую молекулу антитела. Получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент ДНК или полноразмерную кДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора. Трансформант, продуцирующий молекулы антител, можно получить, вводя рекомбинантный вектор в клетки-хозяева, подходящие для экспрессирующего вектора. В качестве клетки-хозяина можно использовать любую дрожжевую клетку, животную клетку, клетку насекомого, растительную клетку или подобную, до тех пор, пока она может экспрессировать ген,представляющий интерес.- 23013563 Клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого, растительная клетка или подобная, в которую методом генной инженерии введен фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, присоединенной через N-гликозидную связь, связанную с Fc-областью молекулы антитела, также можно использовать в качестве клетки-хозяина. В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или может интегрироваться в хромосому и содержит промотор в такой позиции,что можно переносить ДНК, кодирующую молекулу антитела. Из ткани или клеток человека или животного, не являющегося человеком, можно получить кДНК с использованием, например, зонда-праймера, специфического для молекулы антитела, представляющей интерес, согласно способам, описанным при получении ДНК в разделе 1(1)(а). Когда в качестве клетки-хозяина используют дрожжевую клетку, примерами экспрессирующего вектора являются YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) и подобные векторы. Можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в дрожжах. Примерами являются промотор гена гликолитического метаболического пути, такой как ген гексозокиназы, и т.п., промотор РН 05, промотор PGK, промотор GAP, промотор ADH, промотор gal 1, промоторgal 10, промотор белков теплового шока, промотор MF 1, промотор CUP 1 и подобные. Примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, принадлежащие к роду Saccharomyces, родуSchwanniomyces alluvius и т.п. В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в дрожжи. Примерами являются электропорация [Methods in Enzymology, 194, 182 (1990)], сферопластовый способ [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], литийацетатный способ [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], способ, описанный в Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978), и подобные способы. Когда в качестве клетки-хозяина используют животную клетку, примерами экспрессирующего вектора являются pcDNAI, pcDM8 (доступные от Funakoshi), pAGE107 [опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 22979/91; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 227075/90), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (производимый Invitrogen), pREP4 (производимый Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210 и подобные векторы. Можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в животной клетке. Примерами являются промотор IE (немедленно-раннего) гена цитомегаловируса (CMV), ранний промотор SV40, промотор ретровируса, промотор металлотионеина, промотор теплового шока, промоторSR и т.п. Также вместе с промотором можно использовать энхансер IE гена CMV человека. Примерами клетки-хозяина являются клетки человека, такие как клетки Namalwa, клетки обезьяны,такие как клетки COS, клетки китайского хомячка, такие как клетки CHO или НВТ 5637 (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 299/88), клетки миеломы крысы, клетки миеломы мыши,клетки, полученные из почек сирийского хомячка, эмбриональные стволовые клетки, оплодотворенные яйцеклетки и т.п. В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в животную клетку. Примерами являются электропорация [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], кальцийфосфатный способ (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 227075/90), способ липофекции [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], инъекционный способ [Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual], способ с использованием инжектора частиц (генная пушка) (патент Японии 2606856, патент Японии 2517813), DEAE-декстрановый способ[Biomanual Series 4 - Gene Transfer and Expression Analysis (Yodo-sha), edited by Takashi Yokota and Kenichi Arai (1994)], способ с вирусным вектором (Manipulating Mouse Embryo, Second Edition) и подобные способы. Когда в качестве клетки-хозяина используют клетку насекомого, белок можно экспрессировать способом, описанным в Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988), или подобным способом. Иными словами, белок можно экспрессировать путем одновременного введения в клетку насекомого вектора, вводящего рекомбинантный ген, и бакуловируса, получить в супернатанте культуры клеток насекомого рекомбинантный вирус и затем инфицировать клетку насекомого рекомбинантным вирусом. Примерами вводящего ген вектора, используемого в таком способе, являются pVL1392, pVL1393,pBlueBacIII (все производятся Invitrogen) и подобные векторы. Примерами бакуловируса являются вирус ядерного полиэдроза Autographa californica, которым заражено насекомое семейства Barathra.- 24013563 Примерами клеток насекомого являются ооциты Sf19 и Sf21 Spodoptera frugiperda [Current Protocolsin Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company,New York (1992)], ооциты High 5 Trichoplusia ni (производимые Invitrogen) и подобные клетки. Примерами способа одновременного введения вектора, вводящего рекомбинантный ген, и бакуловируса для получения рекомбинантного вируса являются кальцийфосфатный способ (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 227075/90), способ липофекции [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413 (1987)] и подобные способы. Когда в качестве клетки-хозяина используют растительную клетку, примерами экспрессирующего вектора являются Ti-плазмида, вирус табачной мозаики и подобные векторы. В качестве промотора можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в растительной клетке. Примерами являются промотор 35S вируса мозаики цветной капусты(CaMV), промотор актина 1 риса и подобные промоторы. Примерами клеток-хозяев являются клетки таких растений, как табак, картофель, томат, морковь,соя, рапс, люцерна, рис, пшеница, ячмень и т.д., и подобные клетки. В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в растительную клетку. Примерами являются способ с использованием Agrobacterium (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 140885/84, опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 70080/85, WO 94/00977), электропорация (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 251887/85), способ с использованием инжектора частиц (генная пушка) (патент Японии 2606856, патент Японии 2517813) и подобные способы. В качестве способа экспрессии гена, выделение продукции, экспрессию слитого белка Fc-области с другим белком и т.п. можно осуществлять согласно способу, описанному в Molecular Cloning, SecondEdition, или подобным способом, в дополнение к способу прямой экспрессии. Когда ген экспрессируется бактерией, дрожжами, животной клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой, в которые введен ген, имеющий отношение к синтезу углеводной цепи, можно получить молекулу антитела, к которой с помощью введенного гена добавлена углеводная цепь. Композицию антител можно получить культивированием полученного трансформанта в среде для продукции и накопления молекул антител в культуре и последующим выделением их из полученной культуры. Способ культивирования трансформанта с использованием среды можно осуществить согласно общему способу, который используют для культивирования клеток-хозяев. Средой для культивирования полученного трансформанта с использованием в качестве клетокхозяев прокариот, таких как Escherichia coli и т.п., или эукариот, таких как дрожжевые клетки и т.п., может быть или природная среда, или синтетическая среда до тех пор, пока она содержит вещества, такие как источник углерода, источник азота, неорганические соли и т.п., которые могут ассимилироваться организмом, и в ней может эффективно осуществляться культивирование трансформанта. В качестве источника углерода можно использовать источники, которые могут усваиваться организмом. Примерами являются углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, содержащая их меласса,крахмал, гидролизат крахмала и т.п.; органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота и т.п.; спирты, такие как этанол, пропанол и т.п.; и подобные вещества. Примерами источника азота являются аммиак, аммониевые соли неорганических кислот или органических кислот, такие как хлорид аммония, сульфат аммония, ацетат аммония, фосфат аммония и т.п.; другие азотсодержащие соединения; пептон; мясной экстракт; дрожжевой экстракт; кукурузный настой; гидролизат казеина; соевая мука; гидролизат соевой муки; различные ферментированные клетки и их гидролизаты и подобные источники. Примерами неорганических веществ являются дигидрофосфат калия, дикалийгидрофосфат, фосфат магния, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, сульфат меди, карбонат кальция и подобные вещества. Культивирование обычно осуществляют в аэробных условиях, таких как при культивировании при встряхивании, глубинном культивировании при аэрации с перемешиванием или подобных условиях. Температура культивирования составляет предпочтительно 15-40C и время культивирования, как правило, составляет от 16 ч до 7 суток. Во время культивирования поддерживают рН на уровне 3,0-9,0. Регулируют рН с использованием неорганической или органической кислоты, раствора щелочи, мочевины,карбоната кальция, аммиака или подобных веществ. При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как ампициллин, тетрациклин или подобный. Когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием в качестве промотора индуцируемого промотора, в среду при необходимости можно добавлять индуктор. Например, когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием lac-промотора, в среду можно добавить изопропилD-тиогалактопиранозид, а когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием trp-промотора, в среду можно добавить индолакриловую кислоту.- 25013563 Когда культивируют трансформант, полученный с использованием в качестве клеток-хозяев животных клеток, примерами среды являются обычно используемые среда RPMI 1640 [The Journal of theAmerican Medical Association, 199, 519 (1967)], среда Игла MEM [Science, 122, 501 (1952)], модифицированная по Дульбекко среда MEM [Virology, 8, 396 (1959)], среда 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] и среда Уиттена [Developmental Engeneering Experimentation Manual - Preparation of Transgenic Mice (Koda-sha), edited by M. Katshuki (1987)], среды, в которые добавлена фетальная телячья сыворотка, и подобные среды. Культивирование, как правило, осуществляют при рН 6-8 и 30-40C в течение 1-7 суток в присутствии 5% СО 2. При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как канамицин, пенициллин или подобный. Примерами среды для применения при культивировании трансформанта, полученного с использованием в качестве клеток-хозяев клеток насекомых, являются обычно используемые среда TNM-FH(производимая Pharmingen), среда Sf-900 II SFM (производимая Life Technologies), ExCell 400 и ExCell 405 (обе производятся JRH Biosciences), среда Грейса для клеток насекомых [Nature, 195, 788 (1962)] и подобные среды. Культивирование, как правило, осуществляют при рН среды 6-7 и 25-30C в течение 1-5 суток. Кроме того, если в данном случае требуется, в среду во время культивирования можно добавить антибиотики, такие как гентамицин. Трансформант, полученный с использованием в качестве клеток-хозяев растительных клеток, можно культивировать как клетки или путем дифференциации их в клетках или органе растения. Примерами среды для культивирования трансформанта являются обычно используемые среда Murashige и Skoog(MS) и среда Уайта, среды, в которые добавлены растительные гормоны, такие как ауксин, цитокинин и т.п., и подобные среды. Культивирование, как правило, осуществляют при рН 5-9 и 20-40C в течение 3-60 суток. При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как канамицин, гигромицин или подобный. Соответственно, композицию антител можно получить культивированием трансформанта, полученного из микроорганизма, животных клеток или растительных клеток, содержащих рекомбинантный вектор, в который встроена ДНК, кодирующая молекулу антитела, согласно общему способу культивирования, посредством которого получают и накапливают композицию антител, и последующим выделением композиции антител из культуры. В качестве способа экспрессии гена выделение продукции, экспрессию слитого белка и т.п. можно осуществить согласно способу, описанному в Molecular Cloning, Second Edition, в добавление к способу прямой экспрессии. Примерами способа получения композиции антител являются способ внутриклеточной экспрессии в клетках-хозяевах, способ внеклеточной секреции от клеток-хозяев и способ получения на внешней оболочке мембраны клеток-хозяев. Способ можно выбрать, заменяя используемую клетку-хозяина или структуру получаемой композиции антител. Когда композицию антител настоящего изобретения получают в клетках-хозяевах или на внешней оболочке мембраны клеток-хозяев, ее можно положительно секретировать вне клеток согласно способу(1989), Gene Develop., 4, 1288 (1990)], способам, описанным в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии 336963/93 и в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии 823021/94, и подобным способом. Иными словами, молекулы антитела, представляющие интерес, можно секретировать из клетокхозяев вне клеток, встраивая ДНК, кодирующую молекулу антитела, и ДНК, кодирующую сигнальный пептид, подходящий для экспрессии молекулы антитела, в экспрессирующий вектор с использованием метода генетической рекомбинации, вводя экспрессирующий вектор в клетки-хозяева с последующей экспрессией молекул антитела. Также продуцируемое количество можно увеличить согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии 227075/90, с использованием системы амплификации гена, использующей ген дигидрофолатредуктазы. Кроме того, композицию антител также можно получить с использованием отдельного животного с введенным геном (трансгенного животного, не являющегося человеком) или отдельного растения (трансгенного растения), сконструированного редифференциацией животной или растительной клетки, в которую введен ген. Когда трансформант представляет собой отдельное животное или отдельное растение, композицию антител можно получить согласно общему способу его выращивания или культивирования для продукции и накапливания посредством этого композиции антител с последующим выделением композиции антител из отдельного животного или растения. Примером способа получения композиции антител с использованием животной особи является способ, при котором композицию антител, представляющую интерес, получают в животном, созданном пу- 26013563 тем введения гена согласно известному способу [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996);Bio/Technology, 9, 830 (1991)]. В случае животной особи композицию антител можно получить, выращивая трансгенное животное,не являющееся человеком, в которое введена ДНК, кодирующая молекулу антитела, для продуцирования и накапливания посредством этого композиции антител в животном, с последующим выделением композиции антител из животного. Примерами "места" в организме животного, где продуцируется и накапливается композиция, являются молоко (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 309192/88) и яйца животного. В качестве промотора, используемого в таком случае, можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в организме животного. Предпочтительными примерами являются специфические промоторы клеток молочной железы, такие как промотор-казеина, промотор -казеина, промотор -лактоглобулина, промотор кислого белка молочной сыворотки и подобные промоторы. Примером способа получения композиции антител с использованием отдельного растения является способ, при котором композицию антител получают, культивируя трансгенное растение, в которое известным способом введена ДНК, кодирующая молекулу антитела [Tissue Culture, 20 (1994); Tissue Culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], для продуцирования и накапливания композиции антител в растении, и извлекая затем композицию антител из растения. Что касается очистки композиции антител, продуцированной трансформантом, в который введен ген, кодирующий молекулу антитела, например, когда композиция антител экспрессируется внутри клетки в растворенном состоянии, то клетки после культивирования извлекают центрифугированием,суспендируют в водном буферном растворе и затем разрушают с использованием ультразвукового генератора, пресса Френча, гомогенизатора Manton Gaulin, dynomill или подобного устройства, и получают бесклеточный экстракт. Очищенный продукт композиции антител можно получить из супернатанта, полученного центрифугированием бесклеточного экстракта, используя общие методы выделения ферментов в чистом виде, такие как экстракция растворителями; высаливание; обессоливание с помощью сульфата аммония и т.п.; осаждение органическим растворителем; анионообменная хроматография с использованием такой смолы, как диэтиламиноэтилсефароза (DEAE-сефароза), DIAION НРА-75 (производимаяMitsubishi Chemical), и т.п.; катионообменная хроматография с использованием такой смолы, как Sсефароза FF (производимая Pharmacia), и т.п.; гидрофобная хроматография с использованием такой смолы, как бутилсефароза, фенилсефароза и т.п.; гель-фильтрация с использованием молекулярных сит; аффинная хроматография; хроматофокусирование; электрофорез, такой как изоэлектрическое фокусирование, и т.п.; и подобные методы, которые можно использовать одни или в комбинации. Также, когда композиция антител экспрессируется внутри клеток путем образования нерастворимых включений, клетки извлекают, разрушают и центрифугируют теми же способами, и нерастворимую массу композиции антител извлекают в виде осажденной фракции. Выделенную нерастворимую массу композиции антител солюбилизируют с использованием агента, денатурирующего белки. Композицию антител переводят в нормальную трехмерную структуру, растворяя или диализуя солюбилизированный раствор, и затем получают очищенную композицию антител тем же способом выделения в чистом виде. Когда композиция антител секретируется вне клеток, композицию антител или их производные можно выделить из культурального супернатанта. Иными словами, культуру обрабатывают таким методом, как центрифугирование, или подобным методом, и получают растворимую фракцию, и очищенный препарат композиции антител можно получить из растворимой фракции тем же способом выделения в чистом виде. Примеры полученной таким образом композиции антител включают в себя антитело, фрагмент антитела, слитый белок, содержащий Fc-фрагмент антитела и т.п. В качестве примера получения композиции антител ниже подробно описывается способ получения композиции гуманизированных антител, но композиции других антител также можно получать способом, подобным описанному.(1) Конструирование вектора для экспрессии гуманизированных антител. Вектор для экспрессии гуманизированных антител представляет собой экспрессирующий вектор для животной клетки, в который встроены гены, кодирующие С-области тяжелой цепи (H-цепи) и легкой цепи (L-цепи) человеческого антитела, который можно сконструировать клонированием каждого из генов, кодирующих С-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела, в экспрессирующий вектор для животной клетки. С-области человеческого антитела могут представлять собой Н-цепь и L-цепь любого человеческого антитела. Примерами являются С-область, принадлежащая к подклассу IgG1 в Н-цепи человеческого антитела (называемая далее "hC1"), С-область, принадлежащая к классув L-цепи человеческого антитела (называемая далее "hC"), и подобные С-области. В качестве генов, кодирующих С-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела, можно использовать хромосомную ДНК, содержащую экзон и интрон, или также можно использовать кДНК. В качестве экспрессирующего вектора для животной клетки можно использовать любой вектор доd2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990)] и подобные векторы. Примерами промотора и энхансера в экспрессирующем векторе для животной клетки являются ранний промотор и энхансер SV40 [J. Biochem., 101,1307 (1987)], промотор LTR вируса лейкоза Молони мыши [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)], промотор Н-цепи иммуноглобулина [Cell, 41, 479 (1985)] и энхансер [Cell, 33, 717 (1983)] и т.п. Экспрессирующий вектор гуманизированного антитела может быть или типа, в котором гены, кодирующие Н-цепь и L-цепь антитела, существуют на отдельных векторах, или типа, в котором оба гена существуют на одном и том же векторе (тандемный тип). Что касается легкости конструирования экспрессирующего вектора гуманизированных антител, легкости введения в животные клетки и баланса между количествами экспрессии H- и L-цепей антитела в животных клетках, более предпочтителен тандемный тип экспрессирующего вектора гуманизированного антитела [J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]. Сконструированный экспрессирующий вектор гуманизированных антител можно использовать для экспрессии в животных клетках человеческих химерных антител и человеческих CDR-привитых антител.(2) Получение кДНК, кодирующей V-область антитела, полученного от животного, не являющегося человеком. кДНК, кодирующую V-области Н-цепи и L-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, такого как мышиное антитело, можно получить следующим образом. Синтезируют кДНК, экстрагируя мРНК из гибридомных клеток, продуцирующих представляющие интерес мышиные антитела. Синтезированную кДНК клонируют в вектор, такой как фаг или плазмида, и получают библиотеку кДНК. Каждые рекомбинантный фаг или рекомбинантную плазмиду, содержащие кДНК, кодирующую V-область Н-цепи, и рекомбинантный фаг или рекомбинантную плазмиду, содержащие кДНК, кодирующую V-область L-цепи, выделяют из библиотеки с использованием части Собласти или части V-области существующего мышиного антитела в качестве зонда. Определяют полные нуклеотидные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи представляющего интерес мышиного антитела на рекомбинантном фаге или рекомбинантной плазмиде, и из нуклеотидных последовательностей расшифровывают полные аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи. В качестве животного, но не человека, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик, или подобное животное до тех пор, пока в нем можно получить гибридомные клетки. Примерами способа получения полной РНК из гибридомных клеток являются способ с гуанидинтиоцианатом и трифторацетатом цезия [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)] и подобные способы, и примерами способа получения мРНК из полной РНК являются колоночный способ с олиго(dT), иммобилизованным на целлюлозе (Molecular Cloning, Second Edition), и подобные способы. Кроме того, примерами набора для получения мРНК из гибридомных клеток являются набор Fast Track mRNA Isolation(производимый Invitrogen), набор Quick Prep mRNA Purification (производимый Pharmacia) и подобные наборы. Примерами способа синтеза кДНК и получения библиотеки кДНК являются обычные способы (Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34), способы с использованием коммерчески доступных наборов, таких как SUPERSCRIPT, Plasmid System for cDNASynthesis and Plasmid Cloning (производимые GIBCO BRL) или набор ZAP-cDNA Synthesis (производимый Stratagene), и подобные наборы. При получении библиотеки кДНК вектор, в который в качестве матрицы встраивают кДНК, синтезированную с использованием мРНК, экстрагированной из гибридомных клеток, может представлять собой любой вектор до тех пор, пока можно встроить кДНК. Примерами являются ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], zapII (производимый[Gene, 33, 103 (1985)], и подобные векторы. В качестве Escherichia coli, в которую вводят библиотеку кДНК, сконструированную из фагового или плазмидного вектора, можно использовать любую Escherichia coli до тех пор, пока можно вводить,экспрессировать и поддерживать библиотеку кДНК. Примерами являются XL1-Blue MRF' [Strategies, 5,81 (1992)], С 600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088 и Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol.,166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], JM105 [Gene, 38, 275 (1985)], и т.п. В качестве способа отбора из библиотеки кДНК клона кДНК, кодирующей V-области Н-цепи и Lцепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, можно использовать гибридизацию колоний или гибридизацию в бляшках с использованием зонда, меченного изотопом или флуоресцентной меткой (Molecular Cloning, Second Edition). Кодирующую V-области Н-цепи и L-цепи кДНК также можно получить, получая праймеры и осуществляя полимеразную цепную реакцию (далее называемую "ПЦР", Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)- 28013563 с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной из мРНК, или библиотеки кДНК. Нуклеотидные последовательности кДНК можно определить, расщепляя отобранные кДНК соответствущими рестрикционными ферментами, клонируя фрагменты в плазмиду, такую как pBluescriptSK(-) (производимую Stratagene) или подобную, осуществляя взаимодействие обычно используемого способа анализа нуклеотидных последовательностей, такое как в дидезокси-способе [Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 74, 5463 (1977)], Sanger et al., или подобное взаимодействие, и затем анализируя клоны с использованием автоматического анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК A.L.F. (производимый Pharmacia), или подобное устройство. Кодируют или нет полученные кДНК полные аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи антитела, содержащего секреторную сигнальную последовательность, можно подтвердить, расшифровывая полные аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи из определенных нуклеотидных последовательностей и сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями V-областей Н-цепей и L-цепей известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Services (1991)].(3) Анализ аминокислотной последовательности V-области антитела, полученного от животного, не являющегося человеком. Что касается полных аминокислотных последовательностей V-областей Н-цепи и L-цепи антитела,содержащего секреторную сигнальную последовательность, то можно установить длину секреторной сигнальной последовательности и N-концевых аминокислотных последовательностей, и также можно найти подгруппы, к которым они принадлежат, сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями V-областей Н-цепей и L-цепей известных антител [Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, US Dep. Health and Human Services (1991)]. Кроме того, также можно найти аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи каждого CDR, сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями V-областей Н-цепей и L-цепей известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)].(4) Конструирование вектора для экспрессии человеческих химерных антител. Вектор для экспрессии человеческих химерных антител можно сконструировать путем клонирования кДНК, кодирующих V-области Н-цепи и L-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела, в векторе для экспрессии гуманизированных антител, сконструированном в разделе 3(1). Например, вектор для экспрессии человеческих химерных антител можно сконструировать, соединяя каждую из кДНК,кодирующих V-области Н-цепи и L-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, с синтетической ДНК, содержащей нуклеотидные последовательности в 3'-концах V-областей Нцепи и L-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, и нуклеотидными последовательностями в 5'-концах С-областей H-цепи и L-цепи человеческого антитела, и имеющей также в обоих концах последовательность, узнаваемую соответствующим рестрикционным ферментом, и клонируя их перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела, содержащимися в сконструированном векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1).(5) Конструирование кДНК, кодирующей V-область человеческого антитела с привитым CDR. кДНК, кодирующие V-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела с привитым CDR, можно получить следующим образом. Сначала отбирают аминокислотные последовательности каркасных участков (называемых далее "FR") V-областей Н-цепи и L-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком. В качестве аминокислотных последовательностей FR V-областей H-цепи и Lцепи человеческого антитела можно использовать любые аминокислотные последовательности до тех пор, пока они получены из человеческого антитела. Примерами являются аминокислотные последовательности FR V-областей Н-цепи и L-цепи человеческих антител, зарегистрированные в базе данных,такой как Protein Data Bank, и т.п., аминокислотные последовательности, обычные в каждой подгруппеDep. Health and Human Services (1991)], и подобные аминокислотные последовательности. Но для того,чтобы получить человеческое антитело с привитым CDR, обладающее сильной активностью, предпочтительно отобрать аминокислотную последовательность с максимально возможной гомологией (по меньшей мере 60% или большей) с аминокислотными последовательностями V-областей Н-цепи и L-цепи антитела, представляющего интерес, полученного от животного, не являющегося человеком. Затем аминокислотные последовательности CDR V-областей H-цепи и L-цепи антитела, представляющего интерес, полученного от животного, не являющегося человеком, прививают к отобранным аминокислотным последовательностям V-областей Н-цепи и L-цепи человеческого антитела для создания аминокислотных последовательностей V-областей Н-цепи и L-цепи человеческого антитела с привитымCDR. Созданные аминокислотные последовательности превращают в последовательности ДНК, учитывая частоту применения кодона, обнаруженного в нуклеотидных последовательностях генов антитела[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)], и создают последовательности ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи человеческого антитела с привитым CDR. На основе созданных последовательностей ДНК синтезируют- 29013563 некоторые синтетические фрагменты ДНК длиной примерно в 100 оснований, и осуществляют ПЦР с использованием их. В таком случае предпочтительно создавать 6 синтетических ДНК в каждой Н-цепи иL-цепи с точки зрения эффективности реакции ПЦР и длин ДНК, которые можно синтезировать. Также их можно легко клонировать в вектор для экспрессии гуманизированных человеческих антител, сконструированный в разделе 3(1), вводя последовательности для узнавания соответствующей рестриктазой в 5'-концы синтетической ДНК, присутствующие на обоих концах. После ПЦР амплифицированный продукт клонируют в плазмиду, такую как pBluescript SK(-) (производимую Stratagene) или подобную, и определяют нуклеотидные последовательности способом, описанным в разделе 3(2), и посредством этого получают плазмиду с последовательностями ДНК, кодирующими аминокислотные последовательности V-областей Н-цепи и L-цепи нужного человеческого антитела с привитым CDR.(6) Конструирование вектора для экспрессии человеческих антител с привитыми CDR. Вектор для экспрессии человеческих антител с привитыми CDR можно сконструировать, клонируя кДНК, кодирующие V-области H-цепи и L-цепи человеческого антитела с привитым CDR, сконструированные в разделе 3(5), перед генами, кодирующими C-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела в векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1). Например, вектор для экспрессии человеческих антител с привитыми CDR можно сконструировать, вводя последовательности узнавания соответствующей рестриктазой в 5'-концы обоих концов фрагмента синтетической ДНК из числа фрагментов синтетической ДНК, используемых при осуществлении ПЦР в разделе 3(5) для конструирования V-областей Н-цепи и L-цепи человеческого антитела с привитым CDR, с тем, чтобы клонировать их перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и L-цепи человеческого антитела в векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1), таким образом, что они могут экспрессироваться в подходящей форме.(7) Устойчивое продуцирование гуманизированных антител. Трансформант, способный устойчиво продуцировать человеческие химерные антитела и человеческие антитела с привитыми CDR (те и другие далее называются "гуманизированными антителами"),можно получить, вводя векторы для экспрессии гуманизированных антител, описанные в разделах 3(4) и(6), в соответствующие животные клетки. Примерами способа введения вектора для экспрессии гуманизированных антител в животную клетку являются электропорация [опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] и подобные способы. В качестве животной клетки, в которую вводят вектор для экспрессии гуманизированных антител,можно использовать любую клетку до тех пор, пока она представляет собой животную клетку, которая может продуцировать гуманизированные антитела. Примерами являются клетки миеломы мыши, такие как клетка NS0 и клетка SP2/0, клетки яичников китайского хомячка, такие как клетка CHO/dhfr- и клетка CHO/DG44, клетки миеломы крысы, такие как клетка YB2/0 и клетка IR983F, клетки BHK, полученные из почек сирийского хомячка, клетки миеломы человека, такие как клетка Namalwa, и подобные клетки, и предпочтительны клетки яичников китайского хомячка CHO/DG44, клетки миеломы крысы YB2/0 и клетки-хозяева настоящего изобретения, описанные в разделе 5. После введения вектора для экспрессии гуманизированных антител трансформант, способный устойчиво продуцировать гуманизированные антитела, можно отобрать, используя среду для культивирования животных клеток, содержащую такое вещество, как сульфат G418 (называемый далее "G418"; производится SIGMA), и подобные вещества, согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии 257891/90. Примерами среды для культивирования животных клеток являются среда RPMI (производимая Nissui Pharmaceutical), среда GIT (производимая Nihon Pharmaceutical), среда EX-CELL 302 (производимая JRH), среда IMDM (производимая GIBCO BRL), среда Hibridoma-SFM (производимая GIBCO BRL), среды, полученные добавлением к указанным средам различных добавок, таких как сыворотка плода коровы (называемая далее "FBS"), и подобные среды. Гуманизированные антитела можно получать и накапливать в культуральном супернатанте, культивируя полученный трансформант в среде. Уровень экспрессии и антигенсвязывающую активность гуманизированных антител в культуральном супернатанте можно определить таким способом, как твердофазный иммуноферментный анализ [далее называемый "ELISA"; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor(1996)], или подобными способами. Также можно повысить уровень экспрессии гуманизированных антител трансформантом, используя систему амплификации генов DHFR согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии 257891/90. Гуманизированные антитела можно очистить от культурального супернатанта с использованием колонки для протеина А [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14(1998), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]. Кроме того, можно также использовать способы очистки, обычно применяемые для очистки белков. Например, очистку можно осуществить, сочетая гель-фильтрацию, ионнобменную хроматографию и ультрафильтрацию. Молекулярную массу Н-цепи, L-цепи или молекулы антитела в целом очищенных гуманизированных