Слитый белок, содержащий домен bh3 белка

013469 Настоящее изобретение относится к слитым белкам, включающим по меньшей мере один первый компонент (I), который содержит транспортирующую последовательность, и по меньшей мере один второй компонент (II), который содержит полноразмерную или частичную последовательность домена BH3 белка "BH3-только", где слитый белок содержит D-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие слитые белки, а также к применению указанных слитых белков. Клетки многоклеточных организмов являются представителями высокоорганизованного сообщества. Количество клеток в этом сообществе строго регулируется не только путем контроля скорости деления клеток, но также и путем контроля скорости гибели клеток. Если определенные клетки оказываются более не нужными, то они самоуничтожаются путем активации внутриклеточной программы гибели. Этот важный процесс называют апоптозом. Апоптоз называют также запрограммированной гибелью клеток, и он запускается каскадом белков. Изменения, например мутации участвующих в этом процессе белков, которые препятствуют этой нормальной запрограммированной гибели клеток, играют существенную роль во многих заболеваниях, прежде всего раковых заболеваниях. Таким образом, рост раковых клеток часто обусловлен нарушением контроля гибели клеток. Более того, устойчивость к апоптозу является основной характерной особенностью злокачественных клеток, которая позволяет им размножаться и выживать. Зависящий от митохондрий путь апоптоза регулируется семейством белков Bcl-2. Bcl-2, Bcl-xL, Bak и многие другие представители семейства Bcl-2 имеют состоящий из аминокислот гидрофобный участок вблизи их карбоксиконца, который связывает ("заякоривает") их с внешней митохондриальной мембраной. В отличие от этого другие представители семейства Bcl-2, такие как Bid, Bim и Bad, не имеют таких связывающихся с мембраной доменов, но они направляются к митохондриям в ответ на определенные стимулы. Еще одна группа белков имеет связывающийся с мембраной домен, но он спрятан в теле белка до тех пор, пока отсутствуют стимулы для его презентации (например, Bax). Семейство белков Bcl-2 сохранилось в ходе эволюции многоклеточных организмов, его гомологи обнаружены у позвоночных и беспозвоночных видов животных. Некоторые типы вирусов животных также несут в своих геномах гены семейства Bcl-2, включая вирусы герпеса простого, участвующие в раковых заболеваниях, такие как вирус Эпштейна-Барра (EBV) и вирус герпеса саркомы Капоши(KSHV). Как проапоптозные, так и антиапоптозные белки семейства Bcl-2 подверглись изменениям в направлении трансдифференцировки. Относительное соотношение анти- и проапоптозных белков семейства Bcl-2 определяет в конечном итоге чувствительность или устойчивость клеток к различным апоптозным стимулам, включая уменьшение уровней факторов роста, гипоксию, радиацию, противораковые лекарственные средства, оксиданты и избыточное количество Ca2+. В процессе апоптоза белки семейства Bcl-2 прежде всего регулируют (стимулируют или ингибируют) высвобождение белков, таких как цитохром c, Smac/DIABLO, индуцирующий апоптоз фактор, HtrA2 и эндонуклеаза G, из митохондрий. Определенные белки семейства Bcl-2 (проапоптозные представители) являются главными регуляторами передачи сигнала о запрограммированной гибели клеток, а также исполнителями сигналов о гибели в митохондрии. В целом, семейство Bcl-2 состоит из проапоптозных представителей, запускающих высвобождение митохондриальных белков, и антиапоптозных представителей, ингибирующих высвобождение митохондриальных белков. Кроме того, семейство можно разделить на три основных подкласса: (а), (б) и (в). Подклассы (а) и (б), по-видимому, имеют структуру, сходную со структурой порообразующих доменов бактериальных токсинов, таких как колицины и дифтерийный токсин. Эти белки, напоминающие спиральные белки пор, включают как антиапоптозные белки(подкласс (а, так и содержащие несколько доменов проапоптозные белки (подкласс (б. Представители антиапоптозных белков (а), например Bcl-2 и Bcl-xL, являются консервативными по всем четырем гомологичным доменам (BH) Bcl-2 (BH1-4, также называемые "мультидоменными антиапоптозными белками"). Некоторые представители проапоптозных белков (б), например Bax и Bak, имеют гомологичные последовательности доменов BH1-3 (BH1-3, также называемые "мультидоменными проапоптозными белками"). В отличие от этого некоторые проапоптозные представители подкласса (в), например Bid,Noxa, Puma, Bik, Bim, Bad, Bmf, DP5/Hrk и Bok, имеют гомологичные последовательности только одного домена, а именно -спирального домена BH3 (называемые "белками BH3-только"). Домен BH3, как правило, состоит из амфипатической -спирали, имеющей длину примерно 15-20 аминокислот, как правило 16 аминокислот. Белки "BH3-только" (подкласс (в действуют в качестве афферентных эффекторов различных проапоптозных и антиапоптозных сигналов (Hunt А. et al., Science 293, 2001, p. 1784-1785). Все белки "BH3 только" обладают способностью связываться с антиапоптозными белками семейства Bcl-2 и оказывать антагонистическое действие на их функцию (Hunt А. et al., выше). Их домен BH3 встраивается в гидрофобную "щель" на поверхности антиапоптозных белков, таких как Bcl-xL. Они передают многочисленные сигналы гибели в митохондрию путем взаимодействия с антиапоптозными белками семейства Bcl-2 и индуцируют апоптоз с помощью механизма, который требует наличия по меньшей мере одного из мультидоменных проапоптозных белков Bax или Bak семейства Bcl-2. Кроме того, некоторые, но не все-1 013469 белки "BH3-только" обладают способностью связываться с мультидоменными проапоптозными представителями Bax или Bak. Например, белок "BH3-только" Bid может сам стимулировать проапоптозную сборку и функциюBax и Bak, в то время как другие белки "BH3-только" не функционируют сами по себе. С использованием коротких пептидов, представляющих собой -спиральный домен BH3 белка "BH3-только" Bid, было установлено, что такие "Bid-пептиды" способны индуцировать олигомеризацию Bax и Bak с высвобождением цитохрома с. Это свойство присуще белку "BH3-только" Bim (Korsmeyer S.J. et al., Cell Death Differ 7, 2000, p. 1166-1173). В целом, Bid связывается с (мультидоменными) проапоптозными Bax и Bak, а также с (мультидоменными) антиапоптозными Bcl-2 и Bcl-xL и обладает способностью непосредственно активировать Bax и Bak. В противоположность этому у пептидов, представляющих собой домены BH3 белков "BH3-только"Bad или Bik, отсутствует способность непосредственно активировать Bax и Bak, но сохраняется способность связываться с антиапоптозными белками семейства Bcl-2 (Letai А. et al., Cancer Cell 2, 2002, p. 183192). Это продемонстрировано также в другом исследовании с использованием пептидов, полученных из домена BH3 белка "BH3-только" Bad, который стимулирует активность Bax только в присутствии Bcl-xL"активирует" проапоптозные белки Bax и Bak, в то время как "Bad-подобный" домен BH3 "сенсибилизирует" проапоптозные белки Bax и Bak, оккупируя карман антиапоптозных представителей семейства Bcl2. В целом, домены BH3 белков "BH3-только" представляют собой два класса "рабочих" соединений,которые инициируют гибель клеток с помощью определяемых генетическими факторами путей(Letai А. et al., Cancer Cell 2, 2002, p. 183-192). Как описано выше, характеристики белков "BH3-только" были изучены в различных исследованиях, в которых были проанализированы их функция и механизм действия. Результаты свидетельствуют о том, что домены BH3 указанных белков могут эффективно индуцировать апоптоз клеток с высоким уровнем экспрессии антиапоптозных представителей семейства Bcl-2 путем запуска высвобождения активных мультидоменных проапоптозных белков из указанных антиапоптозных белков. Таким образом, домены BH3 белков "BH3-только" представляют собой перспективный объект и эффективный инструмент для лечения различных заболеваний, обусловленных нарушенным контролем запрограммированной гибели клеток. Однако существующий уровень техники не позволяет найти путь осуществления непосредственной транспортировки указанных белков или их доменов BH3 соответственно в требуемое место в организме или клетке. Одной из основных проблем является повышение способности проникать через внутреннюю мембрану клеток. В некоторых исследованиях описан первый подход на основе трансдукции полиаргинина (Wang et al., Cancer Res. 60, 2000, p. 1498-1502; Holinger etal., J. Biol. Chem. 274, 1999, p. 13298-13304). Однако различные амфипатические -спиральные пептиды,прежде всего катионные пептиды, могут притягиваться к несущим отрицательный заряд мембранам,включая митохондриальные мембраны, где они могут неспецифически разрушать липидный матрикс и мембранную барьерную функцию (Matsuzaki, Biochem. Soc. Trans. 29, 2001, p. 598-601; Ellerby et al., Nat.Med. 5, 1999, p. 1032-1038). При применении другого подхода с использованием конструкции ANTBH3BAD, объединяющей антенпедии (ANT) в качестве интернализующего фрагмента и их доменBH3 BAD, обнаружена токсичность. Однако токсичность не коррелировала с Bcl-2 (Vieira et al.,Oncogene 21, 2002, p. 1963-1977; Schimmer et al., Cell Death Differ. 8, 2001, p. 725-733). Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать систему, позволяющую непосредственно транспортировать домен BH3 белка "BH3-только" в требуемое место в организме. В изобретении предлагается слитый белок, включающий по меньшей мере один первый компонент(I), который содержит транспортирующую последовательность, и по меньшей мере один второй компонент (II), который содержит частичную или полноразмерную последовательность домена BH3 белка"BH3-только", где слитый белок содержит в своем компоненте (I) и необязательно в компоненте (II)D-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке (его называют также "ретроинвертированным" белком или "ретроинвертированным" слитым белком). Понятие "ретроинвертированный" относится к изомеру линейного пептида, в котором направление обычной или нативнойL-аминокислотной последовательности изменено на обратный и инвертирована хиральность каждого аминокислотного остатка (вследствие хиральности D-аминокислот в отличие от встречающихся в естественных условиях L-аминокислот). Подразумевается, что понятия "слитый белок" и "белок", предлагаемый в изобретении, имеют такое же значение. Ретроинвертированные слитые белки, предлагаемые в изобретении, можно конструировать, например, путем синтеза обратной аминокислотной последовательности по отношению к соответствующей нативной L-аминокислотной последовательности. В D-ретроинвертированных энантиомерных (слитых) белках положения карбонильных и аминогрупп в-2 013469 каждой простой амидной связи инвертированы, гарантируя тем самым, что положения групп боковых цепей на каждом -атоме углерода сохраняются по отношению к обычным L-аминокислотным пептидным последовательностям. Ретроинвертированные слитые белки, предлагаемые в изобретении, обладают рядом полезных свойств. Например, они более эффективно проникают в клетки, являются более стабильными (прежде всего, in vivo) и обладают меньшей иммуногенностью по сравнению с соответствующими L-аминокислотными слитыми белками. Поскольку встречающиеся в естественных условиях белки содержат L-аминокислоты, почти все расщепляющие ферменты типа протеаз или пептидаз расщепляют пептидные связи между смежными L-аминокислотами. Следовательно, белки, состоящие изD-энантиомерных аминокислот в ретроинвертированной форме, более устойчивы по отношению к протеолитическому расщеплению. Очевидно, что время удерживания в клетке слитых белков, предлагаемых в изобретении, повышается по сравнению с их обычными неинвертированными L-аминокислотными аналогами. Компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, служит в качестве носителя или транспортирующей последовательности. "Транспортирующая последовательность или последовательностьноситель" (в качестве компонента слитого белка, предлагаемого в изобретении) представляет собой любую аминокислотную последовательность, которая направляет слитый белок или компонент (II) слитого белка соответственно в цитоплазму клетки или даже в конкретное место назначения (область-мишень) в клетке. Транспортирующая последовательность может, например, направлять слитый белок в требуемое место внутри клетки, например в ядро, рибосому, эндоплазматический ретикулум, лизосому или пероксисому. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующая последовательность слитого белка, предлагаемого в изобретении, направляет слитый белок в определенное место в клетке. В целом, транспортирующая последовательность может направлять слитый белок,предлагаемый в изобретении, через плазматическую мембрану, например, из внеклеточного окружения через плазматическую мембрану в цитоплазму, повышая тем самым включение слитого белка или его лекарственного компонента (II) (транспортируемый компонент) соответственно, прежде всего, путем повышения его способности проникать в клетку или путем увеличения времени его удерживания в клетке. В целом, функционально эффективный компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении,который содержит транспортирующую последовательность, представляет собой аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере 4 (смежные) D-аминокислоты. Функционально эффективные аминокислоты, содержащиеся в компоненте (I), должны обладать выраженными основными свойствами. Предпочтительно функционально эффективные аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 96% основных аминокислот, предпочтительно аргинина и/или лизина. Функционально эффективные компоненты (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, предпочтительно содержат аминокислотную последовательность, состоящую из 4-50 D-аминокислот, более предпочтительно из 4-40 D-аминокислот, еще более предпочтительно из 4-30 D-аминокислот, еще более предпочтительно из от 4 до примерно 20 D-аминокислот и наиболее предпочтительно из от 4 до примерно 10 D-аминокислот. Предпочтительно транспортирующую последовательность, предлагаемую в изобретении, можно получать, например, из известной последовательности, которая обладает способностью к транслокации через мембрану. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующая последовательность слитого белка, предлагаемого в изобретении, представляет собой D-энантиомерную аминокислотную последовательность, расположенную в ретроинвертированном порядке по отношению к белку ТАТ вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). ТАТ представляет собой вирусный белок, необходимый для цикла заражения ВИЧ. Этот белок описан, например, в WO 94/04686, US 5804604 иUS 5674980, каждый из указанных документов включен в настоящее описание в качестве ссылки. Компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, связывают с компонентом (II), где компонент (I) содержит некоторые из или все 86 аминокислот полноразмерной последовательности Tat, но в своей ретроинвертированной D-форме. В частности, можно применять функционально эффективный компонент(I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, который имеет менее 86 аминокислот и который еще обладает при этом усиленной способностью проникать в клетки и необязательно несет дополнительную информацию о локализации для проникновения в ядро клетки. Сегменты последовательности Tat, ответственные за обеспечение проникновения и включения в клетки, можно определять с помощью известных методов (см., например, Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 1989, p. 7397-7401). Предпочтительно компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит основную область ТАТ (аминокислоты 48-57 или 49-57 соответственно) и не содержит богатую цистеином область ТАТ (аминокислоты 22-36), а также кодируемую экзоном 2 карбоксиконцевую область (аминокислоты 73-86) встречающегося в естественных условиях белка ТАТ. В качестве компонента (I) или части компонента (I) слитого белка,предлагаемого в изобретении, можно применять расположенную в обратном порядке основную областьTat (AK 57-48 или 57-49), состоящую из D-аминокислот. Последовательности, содержащие или пред-3 013469 ставляющие собой расположенную в обратном порядке основную область Tat, обозначены в настоящем описании как последовательности D-Tat. Таким образом, предпочтительный функционально эффективный компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит последовательность D-TAT, напримерNH2-RRRQRRKKRG-COOH или NH2-RRRQRRKKR-COOH (обе представляют собой ретроинвертированные последовательности указанной выше встречающейся в естественных условиях основной области ТАТ) или содержит варианты последовательности, соответствующие общей формуле последовательности D-TAT NH2-XXXAXXXXX-COOH, в которой "X" обозначает аминокислоты аргинин или лизин и"А" обозначает любую неосновную аминокислоту. Предпочтительно "А" находится в положении 4 указанной выше общей формулы. Однако в альтернативном варианте "А" может располагаться в любом положении внутри последовательности, т.е. в положении 2, 3, 5, 6, 7 или 8 вместо положения 4. Кроме того,вышеуказанную формулу можно модифицировать интродукцией дополнительных неосновных остатков путем замены от одного до четырех основных остатков общей формулы неосновными остатками. В соответствии с вышеизложенным последовательности компонента (I) состоят исключительно изD-аминокислот для того, чтобы иметь такую же структурную схему боковых цепей, что и соответствующие неинвертированные последовательности, состоящие из L-аминокислот. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент (I) содержит транспортирующие последовательности, содержащие аминокислоты, представленные на фиг. 1A или 1 Б. В другом варианте осуществления изобретения функционально эффективные компоненты (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержат "родовую" аминокислотную последовательность,которая имеет одну из следующих формул: NH2-AmXAoXAn-COOH, NH2-AmXXXAn-COOH,NH2-AmXXAXAn-COOH, NH2-AmXAXXAn-COOH или NH2-XAAX-COOH, в которых "X" обозначает аминокислоту аргинин или лизин; "А" обозначает любую неосновную аминокислоту; "m" обозначает целое число от 0 до 14; "n" обозначает независимо от m целое число от 0 до 14 и "o" обозначает независимо от m и n целое число от 0 до 5. Следует отметить, что представленные указанными выше общими формулами транспортирующие последовательности, предлагаемые в изобретении, состоят исключительно из D-энантиомерных аминокислот. Конкретные примеры функционально эффективных компонентов (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержат или могут состоять из следующих последовательностей, обладающих выраженными основными свойствами:NH2-KTRR-COOH, NH2-RLKR-COOH, NH2-KPRR-COOH, NH2-KRFQR-COOH, NH2-GRIRR-COOH,NH2-NIGRRRN-COOH,NH2-RAGRNGR-COOH,NH2-RPRR-СООН,NH2-GKRRG-COOH,NH2-KRRE-COOH, NH2-RQKRGGS-COOH, NH2-RKSR-COOH, NH2-RGSRR-COOH, NH2-RRQK-COOH,NH2-RARKG-COOH,NH2-RGRK-COOH,NH2-RRRLS-COOH,NH2-RPRRLSP-COOH,NH2-RGRKY-COOH,NH2-RPKRGMG-COOH,NH2-GVRRR-COOH,NH2-GYKKVGFSR-COOH,NH2-KFSRLSK-COOH,NH2-RRVR-COOH,NH2-RRSRP-COOH,NH2-RRRM-COOH,NH2-KSMALTRKGGY-COOH, NH2-RSRRG-COOH, NH2-KMNPLPY-COOH. Следует отметить, что указанные выше транспортирующие последовательности, предлагаемые в изобретении, состоят исключительно из D-энантиомерных аминокислот. Компонент (I) может содержать только одну (т.е. непрерывную) основную, обладающую способностью к транслокации через клеточную мембрану (транслоцирующую) последовательность(D-ретроинвертированная форма), аналогичную соответствующей (встречающейся в естественных условиях) транслоцирующей последовательности, например указанной выше последовательности Tat. В альтернативном варианте компонент (I) может содержать две или большее количество аминокислотных последовательностей в ретроинвертированном порядке, которые соответствуют одинаковым или различным транслоцирующим последовательностям с выраженными основными свойствами. Эти ретроинвертированные D-формы транслоцирующих мотивов синтезируют на основе встречающегося(ихся) в естественных условиях белка(ов) с использованием D-аминокислот и изменяя порядок их аминокислотной последовательности на обратный. Другими словами, слитый белок, предлагаемый в изобретении, может содержать, например, в компоненте (I) комбинацию двух или большего количества транслоцирующих последовательностей, которые все синтезированы в виде ретроинвертированной D-формы последовательностей. Как правило, такая комбинация транслоцирующих мотивов не присутствует ни в одной из встречающихся в естественных условиях последовательностей белка (в виде L-формы). Эти две или большее количество транслоцирующих последовательностей компонента (I) могут быть связаны друг с другом с помощью линкерной последовательности или без нее. Если целесообразно использовать линкерную последовательность, то ее длина предпочтительно составляет от 2 до 20 аминокислот. Как указано выше, компонент (I) может содержать (один или большее количество)D-энантиомерных аминокислотных транслоцирующих мотивов (в ретроинвертированном порядке по сравнению с нативной последовательностью), которые получают на основе его соответствующего встречающегося в естественных условиях аналога, имеющего L-форму. В альтернативном варианте компонент(I) может содержать D-аминокислотные ряды (в ретроинвертированном порядке) имеющих L-форму последовательностей, которые последовательно модифицируют по сравнению с встречающимися в естест-4 013469 венных условиях последовательностями белка (обозначаемыми в настоящем описании также как "производные"). Эти производные компонента (I) (которые присутствуют в ретроинвертированной D-форме,иными словами, производное D-формы представляет собой аналог производного L-формы), как правило,обладают свойствами носителя, т.е. активностью в отношении включения в клетку (или даже предпочтительно в ядро клетки), которая практически аналогична активности соответствующего встречающегося в естественных условиях белка, даже если их последовательности не идентичны встречающимся в естественных условиях последовательностям белка. Кроме того, к слитому белку, предлагаемому в изобретении, в частности к компоненту (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, или в конечном итоге - к любому другому компоненту можно добавлять фрагменты сахаров и/или липидов, например холестерина или других липидов, для того, чтобы еще более усиливать растворимость слитого белка в мембране, например добавлять их к одному или обоим концам компонента (I) для обеспечения локальной липофильности на одном или обоих концах. В альтернативном варианте или дополнительно фрагменты сахаров или липидов можно связывать сD-аминокислотными боковыми цепями, в частности боковыми цепями, имеющими гидроксильные и аминогруппы. Компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, должен сохранять такие функции, как свою способность проникать в клетку и/или свою способность удерживаться внутри клетки. Однако с помощью модификаций, интродуцируемых в компонент (I), можно добавлять другие функции. Так, компонент (I) можно модифицировать, например, для того, чтобы эффективно направлять слитый белок,предлагаемый в изобретении, в конкретную область-мишень внутри клетки. В соответствии с этим компонент (I) модифицируют так, чтобы придавать конкретную внутриклеточную локализацию компоненту(I) без потери его повышенной способности проникать в клетку. Как правило, в компонент (I) можно интродуцировать направляющую последовательность для направленного переноса слитого белка, предлагаемого в изобретении, в конкретные клеточные компартменты (например, эндоплазматический ретикулум, митохондрию, аппарат с неизвестной функцией (gloom apparatus), лизосомные пузырьки). С другой стороны, можно добавлять специфические последовательности, которые обеспечивают цитоплазматическую локализацию слитого белка, предлагаемого в изобретении. Например, компонент (I) может содержать по меньшей мере одну дополнительную последовательность, которая связывается с одной или большим количеством цитоплазматических(ой) структур(ой), для того, чтобы удерживать слитый белок,предлагаемый в изобретении, в цитоплазме. В альтернативном варианте изменения основной области,которая, как полагают, является важной для ядерной локализации (см., например, Dang и Lee, J. Biol.Chem. 264, 1989, p. 18019-18023; Hauber et al., J. Virol. 63, 1989, p. 1181-1187; Ruben et al., J. Virol. 63,1989, p. 1-8), могут приводить к цитоплазматической локализации или частичной цитоплазматической локализации компонента (I) и, следовательно, слитого белка, предлагаемого в изобретении. Таким образом, компонент (I) может содержать измененные сигналы ядерной локализации, которые приводят к цитоплазматической локализации слитого белка, предлагаемого в изобретении. Как описано выше, белки "BH3-только" являются представителями семейства Bcl-2, обладающими способностью регулировать апоптоз путем взаимодействия с другими представителями семейства Bcl-2. Компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую одну или большее количество частичных или полноразмерных последовательность(ей) домена BH3 белка "BH3-только" (классифицированных как подкласс белков семействаBcl-2). Компонент (II) либо может содержать D-ретроинвертированную форму встречающейся в естественных условиях (полноразмерной или частичной) последовательности домена BH3, тем самым гарантируется, что его D-аминокислотные боковые цепи имеют такое же положение, как и в нативной последовательности, состоящей полностью из L-аминокислот, либо в альтернативном варианте может содержать нативную, состоящую полностью из L-аминокислот последовательность, оба варианта обладают способностью индуцировать апоптоз либо путем взаимодействия по меньшей мере с одним белком семействаBcl-2, либо путем активации или сенсибилизации по меньшей мере одного проапоптозного представителя семейства Bcl-2. Если компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит частичную последовательность домена BH3, она должна иметь (для того чтобы обладать функциональной эффективностью) по меньшей мере 4 (смежные) D- или L-аминокислоты либо в нативном, либо в ретроинвертированном порядке (отражающем соответствующий фрагмент, состоящий по меньшей мере из 4 L-аминокислот домена BH3 белка "BH3-только"). В предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент(II) содержит исключительно D-аминокислоты. Предпочтительные функционально эффективные компоненты (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержат полноразмерную или частичную последовательность домена BH3, состоящую из D-аминокислот в ретроинвертированном порядке, которая содержит от 4 до 20 D-аминокислот, более предпочтительно от 4 до 18 D-аминокислот, более предпочтительно от 4 до 15 D-аминокислот, еще более предпочтительно от 4 до 13 D-аминокислот, более предпочтительно от 4 до примерно 10 D-аминокислот и еще более предпочтительно от 4 до 8 D-аминокислот. Если в качестве компонента (II) или части компонента (II) используют частичные последовательности домена BH3, то они должны сохранять функциональную активность, следует ожидать, что, среди проче-5 013469 го, они должны сохранять свою проапоптозную активность. Их функциональную активность можно тестировать с помощью пригодных методов анализа, например с помощью анализов связывания (связывания компонента II слитого белка, предлагаемого в изобретении, или самого слитого белка, предлагаемого в изобретении, с его нативным партнером по связыванию) или путем анализа его проапоптозной активности с помощью анализа апоптоза. Предпочтительно компонент (II) содержит частичную или полноразмерную последовательность домена BH3 белка "BH3-только", выбранного из группы, включающей Bid, Bad, Noxa, Puma, Bim, Bik,Bmf, DP5/Hrk и Bok либо в их нативной L-форме, либо в их ретроинвертированной D-форме. Последовательности BH3 (полноразмерные или частичные) можно выбирать, например, из последовательностей любого белка "BH3-только" млекопитающих, в частности из человеческих изоформ. Таким образом,компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2 А-2 Д или 2 Е (либо в ее нативной форме, состоящей из L-аминокислот,как показано на фиг. 2 А-2 Е, либо в ее ретроинвертированной D-форме (состоящей из D-аминокислот),это означает, что последовательности, представленные на фиг. 2 А-2 Е, должны быть инвертированы так,чтобы концы поменялись местами: нативный С-конец становится N-концом инвертированной формы и нативный N-конец становится С-концом инвертированной формы). Компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, может содержать фрагменты нативной полноразмерной последовательности белка "BH3-только" (в его либо L-, либо D-форме), например фрагменты, состоящие по меньшей мере из 50, предпочтительно менее чем из 40 и еще более предпочтительно менее чем из 30 аминокислот. Эти фрагменты нативных последовательностей, как правило, содержат полностью или, по меньшей мере,частично последовательность домена BH3 (по меньшей мере 7 аминокислот последовательности доменаBH3). Последовательность компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, может содержать одну или большее количество частичных или полноразмерных последовательностей домена BH3 белков"BH3-только" либо в ее/их нативной L-аминокислотной форме, либо в ее/их инвертированной форме,состоящей из D-аминокислот. Если компонент (II) состоит из L-аминокислот, его можно синтезировать либо с помощью методов рекомбинации, известных специалистам в данной области, либо с помощью методов пептидного синтеза, например твердофазного синтеза. После этого L-аминокислотную последовательность компонента (II) подвергают сочетанию (на второй стадии) с D-аминокислотной последовательностью компонента (I). В альтернативном варианте с помощью химического синтеза можно синтезировать непосредственно (без использования второй стадии сочетания) слитый белок, предлагаемый в изобретении, который содержит D-аминокислоты в своем компоненте (I) и L-аминокислоты в своем компоненте (II). Однако, если компонент (II) содержит также D-аминокислоты, слитый белок синтезируют химическим путем (согласно таким же методам, которые применяют при синтезе Lаминокислотных последовательностей) с использованием D-энантиомерных аминокислот в ретроинвертированном порядке для того, чтобы инвертировать встречающуюся в естественных условиях частичную или полноразмерную последовательность домена BH3 и, например, встречающуюся в естественных условиях транспортирующую последовательность, например встречающуюся в естественных условиях основную последовательность Tat. Аминокислотную последовательность встречающихся в естественных условиях белков "BH3 только" или их фрагментов, содержащих домен BH3, и, соответственно, их ретроинвертированных аналогов, состоящих из D-энантиомерных аминокислот, представляющих часть компонента (II), можно модифицировать, например, путем добавления, делеции и/или замены по меньшей мере одной аминокислоты встречающегося в естественных условиях белка с получением модифицированных ненативных последовательностей. Модификации, прежде всего консервативные модификации, могут требоваться, например, для модификации связывающих свойств компонента (II) или модификации его стабильности,например увеличения или уменьшения его стабильности. Компонент (II) с модифицированной исходной последовательностью (по сравнению с встречающимися в естественных условиях последовательностями домена BH3 или белка "BH3-только") можно получать с помощью тех же методов, которые применяют для синтеза немодифицированных L- или D-аминокислотных последовательностей. Слитые белки, предлагаемые в изобретении, состоят, по меньшей мере, из компонента (I) и компонента (II). Более того, слитый белок, предлагаемый в изобретении, может содержать дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д. Эти необязательные дополнительные компоненты могут придавать дополнительные функции слитому белку, предлагаемому в изобретении. По меньшей мере один дополнительный компонент может представлять собой аминокислоту, олигопептид или полипептид или низкомолекулярное органическое химическое соединение и может быть связан со слитым белком, предлагаемым в изобретении, в приемлемом положении, например на N-конце, С-конце или во внутреннем положении с боковыми аминокислотными цепями. Дополнительные компоненты (например, НА, HSV-Tag,His6) могут делать слитый белок более пригодным для очистки и/или выделения. Затем по окончании процесса производства при необходимости можно удалять участвовавшего в слиянии партнера из слитого белка, предлагаемого в изобретении (например, с помощью протеолитического расщепления или других методов, известных в данной области). В альтернативном варианте с молекулой, предлагаемой в изо-6 013469 бретении, можно сливать дополнительные транспортирующие последовательности, предназначенные для обеспечения переноса в конкретные клеточные компартменты, или другие функциональные последовательности либо в виде дополнительного компонента, либо путем встраивания в компонент (I) или(II). Предпочтительно дополнительный компонент (например, компонент (III позволяет слитому белку,предлагаемому в изобретении, специфически связываться с определенным типом клеток, например иммуноцитами, гепатоцитами, прежде всего опухолевыми клетками органа, например лимфоцитами, нейронами и т.д. Эта специфичность обеспечивается путем слияния лигандов (например, лигандов для внеклеточных фрагментов мембранных белков типа рецепторов или антител к внеклеточным фрагментам мембранных белков, маркеров опухолевых клеток), которые связываются с этими клеточными маркерами, со слитым белком, предлагаемым в изобретении. В результате этого слитый белок, предлагаемый в изобретении, можно избирательно направлять в определенные клетки или ткани животного, подлежащего лечению. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в слитый белок, предлагаемый в изобретении, можно встраивать более одной, предпочтительно две или три идентичные или различные частичные или полноразмерные последовательности домена BH3 либо в виде части компонента (II), либо в виде дополнительного компонента (например, (III. В частности, частичные или полноразмерные последовательности домена BH3 различных белков "BH3-только" можно объединять со слитым белком,предлагаемым в изобретении, например Bid и Bad, Bim и Bad, Bik и Bad, Puma и Bad, Noxa и Bad, Bmf иPuma, Bim и Bmf, Bim и DP5/Hrk, Bim и Bok, Puma и Noxa, Puma и Bmf, Puma и DP5/Hrk, Puma и Bok,Noxa и Bmf, Noxa и DP5/Hrk и Noxa и Bok. Если более чем один слитый белок, предлагаемый в изобретении, содержит более чем один домен BH3, то предпочтительно слитый белок, предлагаемый в изобретении, содержит (частичный или полноразмерный) домен BH3 "Bid"-подобного и "Bad"-подобного белка"BH3-только". Как правило, если в слитом белке, предлагаемом в изобретении, присутствует более чем один домен BH3, то они оба или все находятся либо в ретроинвертированной D-форме, либо в обычной нативной L-форме. В альтернативном варианте слитый белок, предлагаемый в изобретении, может объединять домены BH3, имеющие D- и L-формы. Следовательно, слитый белок, предлагаемый в изобретении, как правило, имеет длину по меньшей мере от 12 до примерно 200 аминокислот или более (в зависимости от дополнительных частей и/или длины компонента (II, предпочтительно от 12 до примерно 150 аминокислот, более предпочтительно примерно от 20 до примерно 100 аминокислот, еще более предпочтительно примерно от 20 до примерно 75 аминокислот, еще более предпочтительно примерно от 20 до примерно 50 аминокислот. Если компонент (II) состоит из L-аминокислот, слитый белок, предлагаемый в изобретении, предпочтительно имеет последовательность, представленную на фиг. 3 А-3 Д или 3 Е. В альтернативном варианте слитый белок может иметь транспортирующую последовательность (содержащуюся в компоненте (I, представленную на этих чертежах, и фрагмент (содержащийся в компоненте (I, состоящий, как правило, менее чем из 50 смежных аминокислот полноразмерных последовательностей белка "BH3-только", представленных на этих чертежах, фрагмент, содержащий по меньшей мере часть последовательности домена BH3 белка"BH3-только". В другом варианте осуществления изобретения последовательности каждого компонента(II), представленные на этих чертежах, могут состоять из D-аминокислот и располагаться в обратном порядке в результате изменения порядка расположения концов, что приводит к образованию содержащих только D-аминокислоты ретроинвертированных последовательностей компонента (II). В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один первый компонент (I) и по меньшей мере один второй компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, связывают ковалентной связью. Понятие "ковалентная связь" относится к стабильной химической связи между двумя атомами, образующейся в результате объединения одной или большего количества пар электронов. Дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д., как указано выше, если они присутствуют,также могут быть связаны ковалентной связью либо с компонентом (I), либо с компонентом (II). В целом, компонент (I) и компонент (II) можно сочетать с помощью линкера или непосредственно(без линкера), например с помощью амидной связи, образованной между N- и С-концами соответственно аминокислот компонентов (I) и (II). С-концевую аминокислоту компонента (I) можно связывать сN-концевой аминокислотой компонента (II) или N-концевую аминокислоту компонента (I) можно связывать с С-концевой аминокислотой компонента (II). Так, слитые белки, предлагаемые в изобретении, могут иметь, например, С- или N-концевую транспортирующую последовательность (компонент (I в зависимости от того, какой конец компонента (I) ковалентно связан с компонентом (II), причем между компонентом (I), например последовательностью, содержащей последовательность D-TAT, и компонентом(II), представляющим собой компонент, содержащий частичную или полноразмерную последовательность домена BH3, можно добавлять линкер. Указанные выше дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д., если они присутствуют, можно сочетать аналогичным образом с компонентом (I) и/или компонентом (II) или необязательно друг с другом. Можно использовать также линкерные последовательности для слияния слитого белка, предлагае-7 013469 мого в изобретении, по меньшей мере с одним другим фрагментом/фрагментами, как описано ниже. Необязательные компоненты (III), (IV) и т.д. можно связывать со слитым белком, предлагаемым в изобретении, через боковые цепи их D-аминокислот или их можно присоединять к любому концу компонента(I) или (II). Связь через боковые цепи предпочтительно осуществляют с помощью амино- или гидроксильных групп боковых цепей, например с помощью сложного или простого эфира. Следует отметить,что согласно изобретению все аминокислоты (любого из компонентов (I), (II), (III), (IV), (V) и т.д.) представляют собой D-энантиомерные аминокислоты, которые соответствуют своим встречающимся в естественных условиях аналогам, будучи связанными в ретроинвертированном порядке. Если используют линкерные последовательности для слияния компонентов (I) и (II) или для слияния другого компонента, например (III) с компонентом (I) и/или (II), то линкерные последовательности предпочтительно представляют собой гибкую последовательность, состоящую из 5-50 остатков, более предпочтительно из 5-15 остатков. В предпочтительном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность (последовательность, состоящая либо полностью из D-, либо полностью изL-аминокислот) содержит по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 40% и еще более предпочтительно по меньшей мере 50% остатков Gly. Специалист в данной области легко может выбрать и создать соответствующие линкерные последовательности. Компонент (I) и компонент (II) можно связывать также путем химического сочетания любым пригодным методом, известным в данной области. Однако следует обращать внимание на то, что многие известные методы химического перекрестного сшивания являются неспецифическими, т.е. они не направляют точку сшивания в конкретный сайт транспортируемого белка (или полипептида) или транспортируемого фрагмента. Так, неспецифические перекрестно сшивающие агенты в случае их использования могут "атаковать" функциональные сайты или стерически блокировать активные сайты, приводя к тому,что слитые белки становятся биологически неактивными. Указанные выше дополнительные компоненты(III), (IV), (V) и т.д., если они присутствуют, можно подвергать аналогичным методом сочетанию друг с другом или с компонентом (I) и/или (II). Специфичность сочетания можно повышать путем непосредственного химического сочетания с функциональной группой, встречающейся только один раз или лишь небольшое количество раз в одном или обоих белках/пептидах/полипептидах, которые требуется перекрестно сшить. Примером является цистеин, который представляет собой единственную аминокислоту, содержащую тиольную группу, и который во многих белках встречается лишь небольшое количество раз. Также, например, если белок/пептид/полипептид не содержит остатков лизина, то перекрестно сшивающий реагент, обладающий специфичностью в отношении первичных аминов, будет обладать избирательным действием в отношении аминоконца указанного белка/пептида/полипептида. Однако для успешного применения этого подхода с целью повышения специфичности сочетания необходимо, чтобы белок/пептид/полипептид имели достаточно редко встречающиеся и реакционноспособные остатки в областях молекулы, которые можно изменять без потери биологической активности молекулы. Остатки цистеина можно заменять, если они встречаются в таких частях последовательности белка/пептида/полипептида, где в противном случае их участие в реакции перекрестного сшивания может влиять на биологическую активность. Если остаток цистеина заменяют, то, как правило, желательно минимизировать образующиеся изменения складчатости белка (или полипептида). Изменения складчатости компонента (I) минимальны, когда замена является химически и стерически близкой цистеину. Таким образом, для замены цистеина предпочтительно использовать серии. Однако когда встраивают остаток цистеина, то предпочтительно встраивание осуществляют на N- или С-конце или вблизи него. Для таких модификаций аминокислотной последовательности можно применять общепринятые методы независимо от того, получали ли рассматриваемый белок/пептид/полипептид химическим синтезом или путем экспрессии рекомбинантной ДНК. Сочетание двух составных частей, например сочетание D-формы компонента (I) с L-формой компонента (II), можно осуществлять посредством связующего или конъюгирующего агента. Существует несколько агентов для межмолекулярного перекрестного сшивания, которые можно использовать, см.,например, Means и Feeney, Chemical Modification of Proteins, изд-во Holden-Day, 1974, p. 39-43. К этим реагентам относятся, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (СПДП) илиN,N'-(1,3-фенилен)-бис-малеимид; N,N'-этилен-бис-(йодацетамид) или другой аналогичный реагент,имеющий 6-11 углеродных метиленовых мостиков; и 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. К другим перекрестно сшивающим реагентам, пригодным для этой цели, относятся: р,р'-дифтор-m,m'-динитрофенилсульфон; диметиладипимидат; фенол-1,4-дисульфонилхлорид; гексаметилендиизоцианат или диизотиоцианат, или азофенил-парадиизоцианат; глутаровый альдегид и дис-диазобензидин. Перекрестно сшивающие реагенты могут быть гомобифункциональными, т.е. иметь две функциональные группы,участвующие в одной и той же реакции. Предпочтительным гомобифункциональным перекрестно сшивающим реагентом является бис-малеимидогексан (БМГ). БМГ содержит две малеимидные функциональные группы, которые специфически взаимодействуют с содержащими сульфгидрил соединениями в мягких условиях (рН 6,5-7,7). Две малеимидные группы соединены углеводородной цепью. Таким образом, БМГ можно применять для необратимого перекрестного сшивания белков (или полипептидов), ко-8 013469 торые содержат остатки цистеина. Перекрестно сшивающие реагенты могут быть также гетеробифункциональными. Гетеробифункциональные перекрестно сшивающие реагенты имеют две различные функциональные группы, например реактивную аминогруппу и реактивную тиольную группу, которые должны перекрестно сшивать два белка, имеющих свободные амины и тиолы соответственно. Примерами гетеробифункциональных перекрестно сшивающих агентов являются сукцинимидил-4-(N(СМЦК),сложный метамалеимидобензоил-Nмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат гидроксисукцинимидиловый эфир (МБС) и сукцинимид-4-(парамалеимидофенил)бутират (СМФБ), представляющий собой аналог МБС с удлиненной цепью. Сукцинимидильная группа этих перекрестно сшивающих линкеров взаимодействует с первичным амином и реактивная тиольная группа малеимида образует ковалентную связь с тиольной группой остатка цистеина. Поскольку перекрестно сшивающие реагенты часто обладают низкой растворимостью в воде, к перекрестно сшивающему реагенту можно добавлять гидрофильный фрагмент, такой как сульфонатная группа, для повышения растворимости в воде. Сульфо-МБС и сульфо-СМЦК являются примерами перекрестно сшивающих реагентов, модифицированных с целью повышения растворимости в воде. Многие перекрестно сшивающие реагенты приводят к образованию конъюгата, который практически не расщепляется в условиях клеточного окружения. Поэтому некоторые перекрестно сшивающие реагенты содержат ковалентную связь, такую как дисульфид,которая расщепляется в условиях клеточного окружения. Например, реагент Траута, дитио-бис(сукцинимидилпропионат) (ДСП) и N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (СПДП) представляют собой широко известные расщепляемые перекрестно сшивающие линкеры. Использование расщепляемого перекрестно сшивающего реагента позволяет транспортируемому фрагменту отделяться от транспортирующего полипептида после введения в клетку-мишень. Для этой цели можно применять также прямую дисульфидную связь. Химическое перекрестное сшивание можно осуществлять также с использованием спейсерных плечей. Спейсерные плечи обеспечивают внутримолекулярную гибкость или регулируют внутримолекулярные расстояния между конъюгированными молекулами и тем самым могут помогать сохранять биологическую активность. Спейсерное плечо может представлять собой фрагмент белка (или полипептида), который содержит спейсерные аминокислоты, например пролин. В альтернативном варианте спейсерное плечо может представлять собой часть перекрестно сшивающего реагента, такого как "СПДП с длинной цепью" (фирма Pierce Chem. Co., Рокфорд, шт. Иллинойс, каталожный номер 21651 Н). В продаже имеются многочисленные перекрестно сшивающие реагенты, включая перечисленные выше. Подробные инструкции по их применению легко можно получить от коммерческих поставщиков. Общие сведения о перекрестном сшивании белков и получении конъюгатов приведены у Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, изд-во CRC Press (1991). Под объем настоящего изобретения подпадают также слитые белки, которые сходны с нативными функциональными последовательностями, или их аналоги, имеющие D-форму, но которые имеют модифицированную последовательность. Эти модифицированные варианты обозначают как "производные", и они также представляют собой слитые белки, предлагаемые в изобретении. "Производное" может представлять собой производное компонента (I) и/или компонента (II), а также компонента (III), компонентаL-последовательности или ее соответствующей ретроинвертированной D-формы. Следует отметить, что слитый белок, который получают из нативной L-последовательности (или ее аналога, имеющегоD-форму) путем замены одной или большего количества L- или D-аминокислот в одном или большем количестве сайтов аминокислотной последовательности, делеции одной или большего количества L- илиD-аминокислот либо на любом одном, либо на обоих концах аминокислотной последовательности, предлагаемой в изобретении, или в одном или большем количестве сайтов аминокислотной последовательности, или инсерции одной или большего количества аминокислот в одном или большем количестве сайтов аминокислотной последовательности, предлагаемой в изобретении, должен сохранять свою характерную для него активность. Предпочтительно, замена аминокислот(ы) представляет собой консервативную замену. Консервативные замены, как правило, представляют собой замены в пределах следующих классов: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серии и треонин; лизин и аргинин и фенилаланин и тирозин. Так, предпочтительными группами консервативных замен являются аспартат-глутамат; аспарагин-глутамин; валин-лейцин-изолейцин; аланин-валин; фенилаланин-тирозин и лизин-аргинин. С помощью таких изменений последовательности компонента (I) и/или (II) (а также компонента (III), (IV), (V), если они присутствуют) можно модифицировать, например повышать стабильность и/или эффективность слитых белков, предлагаемых в изобретении. Слитые белки, предлагаемые в изобретении, которые модифицированы по сравнению с их нативной L-формой (или ее аналогом, имеющим D-форму; как L-, так и D-форму, соответствующие нативной последовательности, обозначают также как "родительские последовательности"), должны сохранять гомологию, например последовательности, функции и антигенного свойства или другой функции, с белком, имеющим соответствующую родительскую последовательность. Наиболее предпочтительно, чтобы производные транспортирующей последовательности, будучи включенными в компонент (I), сохраняли функциональную способность (сохраняли свои характеристики как фрагмента, обладающего способностью проникать в клетку), в то время как производные нативной (частичной или полноразмерной) после-9 013469 довательности домена BH3, будучи включенными в компонент (II), сохраняли свои проапоптозные свойства. Такие слитые белки, предлагаемые в изобретении, полученные из нативной родительской последовательности, обладают измененными свойствами, которые могут оказаться в определенном отношении более предпочтительными по сравнению со свойствами родительской последовательности (например,могут иметь более высокое оптимальное значение рН, более высокую термостойкость и т.д.). Следует понимать, что, например, фрагмент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, может либо соответствовать ретроинвертированной D-форме аналога нативной L-формы, либо соответствовать производному ретроинвертированной D-формы (аналогу нативной L-формы), полученному в результате интродукции модификации(й) в последовательность. Производные нативных D- или L-форм последовательностей (образующие слитые белки, предлагаемые в изобретении), как правило, практически идентичны нативным аминокислотным последовательностям, например представленным в настоящем описании на фиг. 2 А-2 Е последовательностям компонента (II). Особенно предпочтительными являются аминокислотные последовательности, идентичные по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% указанным последовательностям. Идентичность последовательностей можно оценивать, например, с помощью программ анализа последовательностей (пакет программ анализа последовательностей Группы компьютерной генетики, Биотехнологический центр Университета Висконсина (Sequence AnalysisUniversity Avenue, Мэдисон, шт. Висконсин 53705) с использованием соответствующих, задаваемых по умолчанию параметров. Получение нативных последовательностей белка, состоящих из L-аминокислот, с помощью методов рекомбинации или трансляции in vitro хорошо известно и его можно осуществлять согласно стандартным методам, хорошо известным специалисту в данной области (см., например, Sambrook J.,Maniatis Т., 1989, выше). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения можно применять методы рекомбинации для получения определенных компонентов слитого белка, предлагаемого в изобретении, например компонента (II), если он содержит нативные последовательности L-формы, предлагаемые в изобретении, или их производные. Затем на отдельной стадии эту L-форму компонента (II) связывают с D-формой компонента (I) согласно описанному выше методу. В целом, получение компонента слитого белка, предлагаемого в изобретении, методами рекомбинации осуществляют либо путем отбора требуемой нативной последовательности ДНК, либо путем модификации нативной последовательности ДНК, трансформации этой последовательностью ДНК пригодного хозяина и экспрессии (модифицированной) последовательности ДНК с образованием требуемой последовательности белка. Выделение требуемой последовательности белка можно проводить с помощью стандартных методов, включающих выделение клеток (хозяев) из среды путем центрифугирования или фильтрации, при необходимости после разрушения клеток, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли,например сульфата аммония, последующей очистки с использованием различных хроматографических методов, например ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, или аналогичных применяемых в данной области методов (см., например, Sambrook J., Maniatis T., 1989, выше). Более подробно, методы рекомбинации включают трансформацию пригодной клетки-хозяина нуклеиновой кислотой или вектором, предлагаемыми в настоящем описании, которые кодируют L-форму,например компонента (II) слитого белка, и культивирование полученного рекомбинантного микроорганизма, предпочтительно E.coli, в условиях, пригодных для роста клетки-хозяина и экспрессии нуклеиновой кислоты, например, в присутствии индуктора, пригодных сред, дополненных соответствующими солями, факторами роста, антибиотиками, питательными добавками и т.д., в которых происходят экспрессия нуклеиновой кислоты и продуцирование кодируемого слитого белка. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту нативной L-формы компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, определяет нуклеотидную последовательность, которая содержит (помимо других последовательностей) одну или большее количество нуклеотидных последовательностей, например, находящихся в L-форме компонента (II). В результате трансформации вектором соответствующей клетки-хозяина можно осуществлять экспрессию указанной нуклеиновой кислоты. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации пригодного хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или может в соответствующих условиях интегрироваться в сам геном. Предпочтительными векторами, предлагаемыми в изобретении, являются E.coli XL-Blue MRF и плазмида pBK-CMV. Вышеупомянутое понятие "другие последовательности" вектора относится к следующему: в целом,пригодный вектор содержит сайт инициации репликации, например Ori p, colEl Ori, последовательности,которые позволяют осуществлять экспрессию встроенной нуклеиновой кислоты (транскрибированной и/или транслированной), и/или селектируемый генетический маркер, включающий, например, ген, кодирующий флуоресцентный белок типа зеленого флуоресцентного протеина (GFP), гены, которые придают устойчивость к антибиотикам, такие как ген р-лактамазы из Tn3, ген, придающий устойчивость к канамицину, из Tn903 или ген, придающий устойчивость к хлорамфениколу, из Tn9.- 10013469 Понятие "плазмида" обозначает внехромосомный, как правило, самореплицирующийся генетический элемент. Плазмиды, как правило, обозначают прописной буквой "P", перед которой и/или после которой следуют буквы и цифры. Исходные плазмиды, указанные в настоящем описании, либо имеются в продаже, являются общедоступными, либо их можно конструировать из пригодных плазмид согласно опубликованным методам. Кроме того, специалисту в данной области известны плазмиды, эквивалентные плазмидам, указанным в описании. Исходную плазмиду, применяемую для получения вектора,предлагаемого в настоящем изобретении, можно выделять, например, из соответствующего штамма Е.coli, содержащего указанные плазмиды, с помощью стандартных методов, таких как выделение ДНК с помощью хлорида цезия. Понятие "пригодный вектор" относится также к (рекомбинантному) клонирующему ДНК вектору, а также к (рекомбинантному) экспрессионному вектору. Клонирующий ДНК вектор относится к автономно реплицирующемуся агенту, включая (но не ограничиваясь ими) плазмиды и фаги, содержащие молекулу ДНК, к которой присоединены одна или большее количество дополнительных нуклеиновых кислот,например, компонента (II) слитого белка в его нативной L-форме. Экспрессионный вектор относится к любой рекомбинантной конструкции клонирующего ДНК вектора, который содержит предназначенную для экспрессии нуклеотидную последовательность, функционально связанную с соответствующей контролирующей последовательностью, которая обладает способностью осуществлять экспрессию и контролировать транскрипцию встроенной нуклеиновой кислоты в пригодном хозяине. Такие плазмиды можно также легко модифицировать с получением экспрессионных векторов, которые продуцируют требуемую последовательность в различных организмах, включая, например, Е.coli, Sf9 (в качестве хозяина для бакуловируса), Spodoptera и Saccharomyces. В литературе описаны методы конструирования экспрессионных векторов AV12 и трансформации клеток-хозяев с помощью AV12. US 4992373, включенный в настоящее описание в качестве ссылки, представляет собой один из многочисленных документов, в котором описаны указанные методы."Функционально связанный" означает, что нуклеотидная последовательность связана с контролирующей последовательностью так, что может осуществляться экспрессия (например, транскрипция и/или трансляция) нуклеотидной последовательности. "Транскрипция" обозначает процесс, при котором информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности ДНК, переносится в комплементарную последовательность РНК."Контролирующие последовательности" хорошо известны в данной области и их выбирают для осуществления экспрессии нуклеиновой кислоты L-формы слитого белка, предлагаемого в изобретении,и для контроля транскрипции. Такие контролирующие последовательности включают (но не ограничиваясь ими) сигнал полиаденилирования, промотор (например, встречающийся в естественных условиях или синтетический промотор) или энхансер для осуществления транскрипции, необязательно операторную последовательность для контроля транскрипции, локус-контролирующую область или молчащий элемент для осуществления тканеспецифической транскрипции, последовательность, кодирующую пригодные сайты связывания рибосомы на мРНК, последовательность, обладающую способностью стабилизировать мРНК, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. Эти контролирующие последовательности можно модифицировать, например, путем делеции, добавления,инсерции или замены одной или большего количества нуклеиновых кислот, сохраняя при этом их контролирующую функцию. В данной области хорошо известны другие пригодные контролирующие последовательности, которые описаны, например, Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, изд-во Academic Press, Сан-Диего, шт. Калифорния, 1990. Известно очень большое количество разнообразных промоторов для различных организмов. Например, предпочтительным промотором для векторов, которые применяют в Bacillus subtilis, является промотор AprE; предпочтительным промотором, который применяют в Е.coli, является промотор T7/Lac,предпочтительным промотором, который применяют в Saccharomyces cerevisiae, является PGK1, предпочтительным промотором, который применяют в Aspergillus niger, является glaA, а предпочтительным промотором, который применяют в Trichoderma reesei (reesei), является cbhI. Промоторы, которые можно применять в прокариотических хозяевах, включают бета-лактамазную (вектор pGX2907 (ATCC 39344),содержащий репликон и ген бета-лактамазы) и лактозную промоторные системы (Chang et al., Nature(Лондон), 275, 1978, p. 615; Goeddel et al., Nature (Лондон), 281, 1979, p. 544), щелочно-фосфатазную,триптофановую (trp) промоторную систему (вектор pATH1 (ATCC 37695), сконструированный с целью облегчения экспрессии открытой рамки считывания в виде слитого белка trpE, находящегося под контролем промотора trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac (который можно выделять из плазмиды pDR540, ATCC-37282). Однако специалист в данной области может связывать и другие функциональные бактериальные промоторы, нуклеотидные последовательности которых широко известны, с ДНК, кодирующей требуемую последовательность белка, например, компонента (II) слитого белка,предлагаемого в изобретении, в его L-формах с использованием линкеров или адаптеров для создания любых необходимых сайтов рестрикции. Промоторы, применяемые в бактериальных системах, должны содержать также последовательность Шайна-Дальгарно, функционально связанную с ДНК, кодирующей требуемую последовательность белка, предназначенного для использования в качестве (части) слитого- 11013469 белка, предлагаемого в изобретении. Пригодные экспрессионные векторы могут состоять, например, из сегментов хромосомных, нехромосомных и синтетических последовательностей ДНК, таких как различные известные производные или фрагменты ОВ 40 (SV40), и известных бактериальных плазмид, например плазмид из Е. coli, включаяcolE1, pBK, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 и их производные, плазмид с широким спектром хозяев, например RP4, ДНКовых фагов, например многочисленных производных фага лямбда, например NM989, и других ДНКовых фагов, например М 13, и нитчатых содержащих одноцепочечную ДНК фагов, плазмид на основе дрожжей, векторов, которые можно применять в эукариотических клетках, таких как векторы,пригодные для применения в клетках животных, и векторов, полученных на основе комбинаций плазмид и ДНКовых фагов, таких как плазмиды, модифицированные с целью использования ДНКовых фагов или других контролирующих экспрессию последовательностей. Методы экспрессии с использованием указанных выше экспрессионных векторов хорошо известны в данной области и описаны в целом, например, Sambrook J., Maniatis Т., 1989, выше. Пригодные "клетки" или "клетки-хозяева", содержащие вышеуказанные вектор или нуклеиновую кислоту, например L-формы компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, обладают способностью функционировать в качестве хозяина и экспрессионного носителя последовательности, предназначенной для экспрессии. Клетка-хозяин может представлять собой, например, прокариотическую,эукариотическую или археоклетку. Клетки-хозяева, содержащие (например, в результате трансформации, трансфекции или трансдукции) описанные выше вектор или нуклеиновую кислоту, включают (но не ограничиваясь ими) бактериальные клетки (например, R.marinus, E.coli, Streptomyces, Pseudomonas,Bacillus, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium), клетки грибов, включая дрожжи (например,Saccharomycies cerevisie, Pichia pastoris), и плесневые грибы (например, Aspergillus sp.), клетки насекомых (например, Sf9) или клетки млекопитающих (например, COS, CHO). Предпочтительно клеткихозяева представляют собой клетки Е.coli. В целом, клетку-хозяина можно отбирать на основе модуляции экспрессии встроенных последовательностей, представляющих интерес, или модификации или процессирования экспрессируемых белков, кодируемых последовательностями определенным требуемым образом. Таким образом, можно отбирать соответствующие клетки или клеточные линии или системы хозяина, обеспечивающие осуществление требуемой модификации и процессирования чужеродного белка. Например, экспрессию белка в бактериальной системе можно использовать для получения негликозилированного корового белка, в то время как экспрессия в клетках млекопитающих обеспечивает "нативное" гликозилирование гетерологичного белка. Эукариотические клетки-хозяева применяются не только в качестве эукариотических клетокхозяев. Разнообразные эукариотические клетки-хозяева можно получать, например, из депозитариев,таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), и их можно применять с описанными выше векторами. Выбор конкретной клетки-хозяина в определенной степени зависит от конкретного применяемого экспрессионного вектора. К эукариотическим клеткам-хозяевам относятся клетки млекопитающих, а также клетки дрожжей. Несовершенный гриб Saccharomyces cerevisiae представляет собой наиболее широко применяемый эукариотический микроорганизм, хотя обычно можно применять многие другие штаммы. Для экспрессии в Saccharomyces sp., как правило, применяют, например, плазмиду YRp7(ATCC-40053) (см., например, Stinchcomb L. et al., Nature, 282, 1979, p. 39; Kingsman J. et al., Gene, 7,1979, p. 141; S. Tschemper et al., Gene, 10, 1980, p. 157). Эта плазмида уже содержит ген trp, который представляет собой селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, у которого отсутствует способность расти в присутствии триптофана. Приемлемые промоторные последовательности, которые можно использовать с дрожжевыми клетками-хозяевами, включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы (присутствующие в плазмиде pAP12BD(ATCC 53231) и описанные в US 4935350, выданном 19 июня 1990 г., который включен в настоящее описание в качестве ссылки) или других гликолитических ферментов, таких как енолаза (присутствующая в плазмиде pAC1 (ATCC 39532, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (полученная из плазмидыpHcGAPC1 (ATCC 57090, 57091, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6 фосфат-изомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа, а также гены алкогольдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы Zymomonasmobilis (US 5000000, выданный 19 марта 1991 г., который включен в настоящее описание в качестве ссылки). Другими промоторами из дрожжей, представляющими собой индуцибельные промоторы, обладающие дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что их транскрипцию можно контролировать путем изменения условий роста, являются промоторные области алкогольдегидрогеназы 2,изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина (присутствующего в плазмидном векторе pCL28XhoLHBPV (ATCC 39475) и описанном вUS 4840896, который включен в настоящее описание в качестве ссылки), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы (например, GAL1, присутствующий в плазмиде pRY121 (ATCC 37658. Вместе с промоторами из дрожжей предпочтительно используют энхансеры из дрожжей, такие как UAS Gal из Saccharomyces cerevisiae (присутствующий в сочетании с промотором CYC1 в плазмиде YEpsec-hIlbeta, ATCC 67024).- 12013469 Указанный выше вектор можно интродуцировать в клетку-хозяина любым пригодным методом(например, путем трансформации, электропорации, трансфекции с использованием хлорида кальция,хлорида рубидия, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана или других субстанций, бомбардировки микрочастицами, липофекции, инфекции или трансдукции). Трансформация обозначает встраивание ДНК в организм таким образом, чтобы ДНК могла реплицироваться либо в качестве внехромосомного элемента,либо в результате интеграции в хромосому. Методы трансформации бактериальных и эукариотических хозяев хорошо известны в данной области. Обзор многочисленных методов, таких как инъекция в ядро,слияние с протопластом или обработка кальцием, приведен у Sambrook J., Maniatis Т., 1989, выше. Трансфекция относится к встраиванию вектора в клетку-хозяина независимо от того, происходит ли в действительности экспрессия каких-либо кодирующих последовательностей или нет. Как правило, трансфекция признается успешной в том случае, когда в клетке-хозяине обнаруживают какие-либо признаки наличия или функционирования рассматриваемого вектора. В другом варианте осуществления настоящего изобретения компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, соответствует не нативной L-форме или ее производному, а ретроинвертированной D-форме последовательности, состоящей из D-аминокислот, расположенных в обратном порядке. Эти последовательности D-формы компонента (II) (а также последовательность D-формы компонента(I, как правило, нельзя изменять методами рекомбинации, и их предпочтительно синтезируют методом пептидного синтеза, например твердофазного синтеза с использованием D-аминокислот вместоL-аминокислот для получения D-аминокислотной последовательности. Однако следует отметить, что для осуществления синтеза порядок расположения аминокислот должен быть изменен на обратный (по сравнению с аналогом, имеющим L-форму). Соответственно все аминокислотные последовательности, предлагаемые в изобретении (как последовательности D-, так и L-формы), можно конструировать химическими методами, хорошо известными в данной области, включая твердофазный синтез белков или методы рекомбинации. Оба метода описаны вUS 4617149, полное содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. Принципы твердофазного химического синтеза слитых белков хорошо известны в данной области и описаны, например, Dugas Н. и Penney С, Bioorganic Chemistry, 1981, p. 54-92. Например, белки и пептиды можно синтезировать с помощью твердофазного метода с использованием пептидного синтезатора типа AppliedBiosystems 430A (поступающего в продажу от фирмы Applied Biosystems, Фостер Сити, шт. Калифорния) и циклов синтеза, разработанных фирмой Applied Biosystems. Защищенные аминокислоты, такие как защищенные трет-бутоксикарбонилом аминокислоты, и другие реагенты поступают в продажу от многих торговых фирм-поставщиков химической продукции. Для получения С-концевых карбоксамидов исходные параметилбензгидриламиновые смолы подвергают последовательной химической обработке с использованием трет-бутоксикарбонила согласно протоколам двойного азосочетания. Для получения С-концевых кислот применяют соответствующую пиридин-2-альдоксимметиодидную смолу. Аспарагин,глутамин и аргинин подвергают сочетанию с использованием предварительно полученных сложных гидроксибензотриазоловых эфиров. Для защиты боковых цепей можно применять следующие группы: Arg,тозил; Asp, циклогексил; Glu, циклогексил; Ser, бензил; Thr, бензил; Tyr, 4-бромкарбобензоксигруппу. Удаление трет-бутоксикарбонильного фрагмента (удаление защитных групп) можно осуществлять с помощью трифторуксусной кислоты (ТФК) в метиленхлориде. После завершения синтеза можно удалять защитные группы у белков или пептидов и отщеплять их от смолы с помощью безводного фтористого водорода, содержащего 10% метакрезола. Отщепление защитных(ой) групп(ы) от боковых цепей и отщепление (слитого) белка от смолы осуществляют при 0 С или ниже, предпочтительно при -20 С в течение 30 мин, а затем в течение 30 мин при 0 С. После удаления фтористого водорода (слитый) белок/смолу промывают простым эфиром и (слитый) белок экстрагируют ледяной уксусной кислотой и затем лиофилизируют. Очистку осуществляют с помощью гель-фильтрации на Sephadex G-10 (фирмаL-аминокислот или D-аминокислот, синтезируют согласно такому же общему методу. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, предлагаемый в изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель. Эта фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболеваний, которые, по меньшей мере, частично обусловлены изменениями (например, вследствие мутаций) нормальной запрограммированной гибели клеток (апоптоза). Такие изменения, в частности, предупреждают (полностью или частично) нормальную запрограммированную гибель клеток (апоптоз). Предпочтительно эти заболевания включают, например, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, гистиоцитную лимфому, различные типы рака головного мозга (например, глиобластомы), яичника, мочеполового тракта, ободочной кишки, печени, колоректального тракта, поджелудочной железы,молочной железы, предстательной железы, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный рак легкого, и/или рак кожи, например меланому или немеланомный рак кожи, включая базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак, а также псориаз, синдром Бехчета, пузырьчатку обыкновенную.- 13013469 Понятие "фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель" в контексте изобретения относится к нетоксичному носителю, адъюванту или наполнителю, который не нарушает фармакологическую активность слитого белка, с которым его включают в состав препаративной формы. Фармацевтически приемлемые носители, адъюванты или наполнители, которые можно применять в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваясь ими) ионообменники,окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферы, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, вторичный кислый фосфат натрия, вторичный кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, субстанции на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин. Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить парентеральным или непарентеральным (например, оральным) путем. В контексте настоящего описания понятие "парентеральный" включает методы подкожной, внутривенной, внутримышечной, интраартикулярной, внутрисуставной, надчревной, внутриоболочечной, внутрипеченочной, внутриочаговой и внутричерепной инъекции или инфузии. Предпочтительно фармацевтические композиции вводят орально, внутрибрюшинно или внутривенно. Стерильные инъецируемые формы фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой водные или маслянистые суспензии. Эти суспензии можно приготавливать согласно методам, известным в данной области, с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может представлять собой также стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. В число приемлемых наполнителей и растворителей, которые можно применять, входят вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно применяют стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно применять любое успокаивающее нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для приготовления инъецируемых лекарственных средств можно применять жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицериды, а также природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, прежде всего в виде их полиоксиэтилированных производных. Эти масляные растворы или суспензии могут содержать также разбавитель, представляющий собой спирт с длинной цепью, или диспергирующий агент, такой как карбоксиметилцеллюлоза, или аналогичные диспергирующие агенты, обычно применяемые при приготовлении фармацевтически приемлемых форм лекарственного средства, включая эмульсии и суспензии. Для целей приготовления препаративных форм можно использовать также другие обычно применяемые поверхностно-активные вещества, такие как агенты типа Твин, Спан или другие эмульгаторы или вещества, повышающие биологическую доступность, которые обычно применяют при приготовлении фармацевтически приемлемых твердых, жидких или иных форм лекарственного средства. При оральном введении фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении,можно вводить в виде любой приемлемой для орального введения форме лекарственного средства,включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для орального применения обычно используемые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсул пригодными разбавителями являются лактоза и сухой кукурузный крахмал. Если для орального применения требуются водные суспензии, то действующее вещество объединяют с эмульгаторами и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять также определенные подслащивающие вещества, корригенты или красители. Кроме того, для контроля продолжительности действия можно применять стандартные фармацевтические методы. Такие формы известны в данной области и включают препараты с контролируемым высвобождением и могут включать соответствующие макромолекулы, например полимеры, сложные полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон,этиленвинилацетат, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу или сульфат протамина. Для контроля высвобождения можно регулировать концентрацию макромолекул, а также методы включения в композицию. Кроме того, агент можно встраивать в частицы полимерных материалов, таких как сложные полиэфиры, полиаминокислоты, гидрогели, поли(молочная кислота) или этиленвинилацетатные сополимеры. Помимо обеспечения встраивания эти агенты можно использовать также для удерживания соединения в микрокапсулах. Другие формы введения представляют собой, например, введение с помощью ингаляционного спрея, местное, ректальное, назальное, буккальное, вагинальное введение или введение с помощью имплантированного резервуара, некоторые из которых описаны ниже более подробно. Так, фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в форме суппозиториев для ректального введения. Их можно приготавливать путем смешения агента с- 14013469 пригодным, не вызывающим раздражение эксципиентом, который находится в твердом состоянии при комнатной температуре, но становится жидким при температуре прямой кишки и, следовательно, расплавляется в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают кокосовое масло, пчелиный воск и полиэтиленгликоли. Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также местно, особенно в том случае, когда мишень для лечения включает области или органы, легко доступные для местной обработки, в частности при заболеваниях глаза, кожи или нижнего отдела кишечного тракта. Для каждой из этих областей или органов можно легко приготавливать пригодные препаративные формы для местного применения. Местное введение в нижний отдел кишечного тракта можно осуществлять с помощью препаративной формы в виде ректального суппозитория (см. выше) или пригодной препаративной формы, вводимой с помощью клизмы. Можно использовать также трансдермальные бляшки для местного применения. Для местных применений можно приготавливать фармацевтические композиции в виде пригодных мазей, содержащих действующий компонент, суспендированный или растворенный в одном или большем количестве носителей. Носители для местного применения слитых белков, предлагаемых в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваясь ими) минеральное масло,вазелиновое масло, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, производное полиоксипропилена,эмульгирующий воск и воду. В альтернативном варианте фармацевтические композиции можно приготавливать в виде пригодного лосьона или крема, содержащего активные слитые белки, суспендированные или растворенные в одном или большем количестве фармацевтически приемлемых носителей. Пригодные носители включают (но не ограничиваясь ими) минеральное масло, сорбитанмоностеарат, полисорбат 60, воск на основе сложных цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду. Для применения в офтальмологии фармацевтические композиции можно приготавливать в виде мелкодисперсных суспензий в изотоническом стерильном соляном растворе с отрегулированым значением рН или предпочтительно в виде растворов в изотоническом стерильном соляном растворе с отрегулированым значением рН, либо содержащих консервант, такой как бензалконийхлорид, либо без него. В альтернативном варианте для применения в офтальмологии фармацевтические композиции можно включать в состав мази, такой как вазелин. Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить также с помощью назального аэрозоля или путем ингаляции. Такие фармацевтические композиции приготавливают согласно методам, хорошо известным в области получения фармацевтических препаративных форм, и их можно приготавливать в виде растворов в солевом растворе с применением бензилового спирта или других приемлемых консервантов, усилителей абсорбции для повышения биологической доступности, фторурглеродов и/или других обычно применяемых солюбилизаторов или диспергирующих агентов. Наиболее предпочтительно фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде препаративных форм для орального введения. Количество слитого(ых) белка(ов), предлагаемого(ых) в настоящем изобретении, которое можно объединять с носителями, адъювантами и наполнителями для приготовления фармацевтической композиции в виде однократной стандартной дозы лекарственного средства, должно варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, конкретного пути введения. Предпочтительно фармацевтические композиции следует включать в препаративные формы таким образом, чтобы пациенту с помощью таких композиций можно было вводить дозу, составляющую от 0,01 до 100 мг ингибитора/кг веса тела/день. Предпочтительные дозы составляют от 0,1 до 5 мг/кг веса тела/день, еще более предпочтительны дозы, составляющие от 1 до 5 мг/кг веса тела/день. Капсулы. Капсулы приготавливают путем внесения в каждую, состоящую из двух частей твердую желатиновую капсульную оболочку по 100 мг порошкообразного действующего вещества, 175 мг лактозы, 24 мг талька и 6 мг стеарата магния. Мягкие желатиновые капсулы. Приготавливают смесь действующего вещества с соевым маслом и инъецируют с помощью поршневого насоса в желатин, получая мягкие желатиновые капсулы, содержащие по 100 мг действующего вещества. Затем капсулы промывают и сушат. Таблетки. Таблетки приготавливают с помощью стандартных методов так, чтобы стандартная доза содержала 100 мг действующего вещества, 0,2 мг коллоидного диоксида кремния, 5 мг стеарата магния, 275 мг микрокристаллической целлюлозы, 11 мг кукурузного крахмала и 98,8 мг лактозы. Для улучшения вкусовых качеств или замедления абсорбции можно наносить соответствующие покрытия. Инъецируемое лекарственное средство. Парентеральную композицию, пригодную для введения путем инъекции, приготавливают путем перемешивания 1,5 мас.% действующих веществ в 10 об.% пропиленгликоля и воде. Раствору придают изотоничность с помощью хлорида натрия и стерилизуют.- 15013469 Суспензия. Водную суспензию для орального введения приготавливают таким образом, чтобы в каждых 5 мл содержалось по 100 мг тонкоизмельченного действующего вещества, 200 мг натрийкарбоксиметилцеллюлозы, 5 мг бензоата натрия, 1,0 г раствора сорбита U.S.Р. и 0,025 мл ванилина. Следует отметить, что конкретная доза и схема введения лекарственного средства для каждого конкретного пациента должна зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого слитого белка, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств и решения лечащего врача и серьезности конкретного заболевания, подлежащего лечению. Количество слитого белка, предлагаемого в настоящем изобретении, в фармацевтической композиции также должно зависеть от конкретного слитого белка, входящего в композицию. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению слитого белка, предлагаемого в изобретении, для лечения или приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики заболеваний или терапевтическим методам лечения состояний, обусловленных нарушением апоптоза, рака, например лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, гистиоцитной лимфомы, различных типов рака головного мозга (глиобластомы), яичника, мочеполового тракта,ободочной кишки, печени, колоректального тракта, поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный рак легкого, и/или рака кожи, например меланомы или немеланомного рака кожи,включая базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак, а также псориаза, синдрома Бехчета, пузырьчатки обыкновенной. Приведенные ниже чертежи и примеры служат для иллюстрации изобретения и не ограничивают объем изобретения. Все документы, процитированные в настоящем описании, полностью включены в него в качестве ссылки. Описание чертежей На чертежах показано: фиг. 1 А - аминокислотная последовательность основной области белка Tat в ее ретроинвертированной D-форме. Таким образом, все приведенные аминокислоты представляют собой D-энантиомерные аминокислоты. Последовательность, представленная на фиг. 1 А, является примером последовательности D-TAT(SEQ ID NO:2), соответствующая описанию фиг. 1 А; фиг. 2 А - нативная L-аминокислотная последовательность Bid (вариант транскрипта 1,SEQ ID NO:3), человеческая изоформа; фиг. 2 Б - нативная L-аминокислотная последовательность Bad (SEQ ID NO:4); человеческая изоформа; домен BH3 подчеркнут. Домен BH3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом; фиг. 2 В - нативная L-аминокислотная последовательность Noxa (SEQ ID NO:5), человеческая изоформа; фиг. 2 Г - нативная L-аминокислотная последовательность Puma (SEQ ID NO:6), человеческая изоформа; фиг. 2 Д - нативная L-аминокислотная последовательность Bim (вариант транскрипта 1,SEQ ID NO:7), человеческая изоформа; фиг. 2 Е - нативная L-аминокислотная последовательность Bik (SEQ ID NO:8); человеческая изоформа; домен BH3 подчеркнут. Домен BH3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом; фиг. 3 А - аминокислотная последовательность D-TAT-Bid (вариант транскрипта 1, SEQ ID NO:9) пример слитого белка, предлагаемого в изобретении, где полноразмерная последовательность Bid (согласно изобретению компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении) представлена в ее нативной L-форме (также как и последовательности белка "BH3-только" на приведенных ниже фиг. 3 Б-3 Е),а компонент (I) - в его инвертированной форме, состоящей из D-аминокислот (D-Tat). Для того чтобы изобразить слитый белок, предлагаемый в изобретении, в виде ретроинвертированной, содержащей только D-аминокислоты последовательности, компонент (II) должен быть инвертирован; фиг. 3 Б - аминокислотная последовательность D-TAT-Bad (SEQ ID NO:10); домен BH3 подчеркнут. Домен BH3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом; фиг. 3 В - аминокислотная последовательность D-TAT-Noxa (SEQ ID NO:11); фиг. 3 Г - аминокислотная последовательность D-TAT-Puma (SEQ ID NO:12):- 16013469 фиг. 3 Д - аминокислотная последовательность D-TAT-Bim (вариант транскрипта 1, (SEQ ID NO:13); фиг. 3 Е - аминокислотная последовательность D-TAT-Bik (SEQ ID NO:14); домен BH3 подчеркнут. Домен BH3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом; фиг. - 4 А - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bik (Bik BH3); фиг. 4 Б - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bad (Bad BH3); фиг. 4 В - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bid (Bid BH3); фиг. 4 Г - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bmf(BmfBH3); фиг. 4 Д - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 DP5/Hrk (DP5/Hrk BH3); фиг. 4 Е - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bim (Bim BH3); фиг. 4 Ж - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Noxa (Noxa BH3); фиг. 4 З - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 PUMA (PUMA BH3); фиг. 4 И - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bax (Bax BH3); фиг. 4 К - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bak (Bak BH3); фиг. 4 Л - нативная L-аминокислотная последовательность домена BH3 Bok (Bok BH3); фиг. 5 - график, иллюстрирующий результаты исследований индуцируемой BH3 гибели клеток клеточной линии HeLa. Применявшиеся слитые пептиды, предлагаемые в изобретении, содержали в качестве первого компонента (I) транспортирующую последовательность D-TAT и в качестве второго компонента (II) последовательности домена BH3 белков "BH3-только" Bim, Bok, Bax, DP5 [Hrk], Bid, Noxa, PUMA и Bak соответственно (как указано на фиг. 5). Слитые пептиды инкубировали в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ с клетками линии HeLa в культуральной среде в течение 24 ч. Контроль содержал клетки линииHeLa без обработки, т.е. без инкубации со слитыми пептидами, предлагаемыми в изобретении. Контроль инкубировали также с клетками линии РТС-3 в культуральной среде в течение 24 ч. Апоптозные клетки подсчитывали с использованием окрашивания Hoechst/PI (Bonny et al., J. Biol. Chem., 275, 2000, p. 1646616472). Уровень апоптозных клеток в процентах представлен на фиг. 5 по оси ординат в виде "% гибели клеток". Как видно из фиг. 5, для слитых пептидов, содержащих Bim, Bok или Bax, получены наилучшие результаты, т.е. наиболее высокие уровни гибели клеток, составляющие примерно 98 и 68%, за ними следует слитый пептид, содержащий PUMA (уровень гибели клеток примерно 23%). Следует отметить,что использование слитого пептида, содержащего Bim, дало лучший результат, т.е. уровень гибели клеток составлял примерно 98% при концентрации пептида 50 мкМ, в то время как слитые пептиды, содержащие Bok или Bax, вызывали указанные уровни гибели клеток, составлявшие примерно 98 и примерно 68% при концентрации пептида 100 мкМ; фиг. 6 - график, иллюстрирующий результаты исследований индуцируемой BH3 гибели клеток клеточной линии ТС-3. Применявшиеся слитые пептиды, предлагаемые в изобретении, содержали в качестве первого компонента (I) транспортирующую последовательность D-TAT и в качестве второго компонента (II) последовательности домена BH3 белков "BH3-только" Puma, Noxa, Bak Bim, Bok, Bax и DP-5 соответственно(как указано на фиг. 6). Слитые пептиды инкубировали в концентрациях 1 мкМ и 10 мкМ соответственно(обозначены как " Puma 1" для концентрации 1 мкМ и "Puma 10" для концентрации 10 мкМ и т.д.) с клетками линии ТС-3 в культуральной среде в течение 24 ч. Один образец содержал транспортирующую последовательность L-Tat в концентрации 10 мкМ. Другой образец содержал субстанцию тапсигаргин для контроля токсичности. Контроль содержал клетки линии ТС-3 без обработки, т.е. без инкубации со слитыми пептидами, предлагаемыми в изобретении. Образец, содержащий L-Tat, и контроль инкубировали также с клетками линии ТС-3 в культуральной среде в течение 24 ч. Апоптозные клетки подсчитывали с использованием окрашивания Hoechst/PI (см. выше). Уровень апоптозных клеток в процентах представлен на фиг. 5 по оси ординат в виде "% гибели клеток". Как видно из фиг. 6, для слитых пептидов, содержащих Bim, Bok в концентрациях 10 мкМ, получены наилучшие результаты, т.е. наиболее высокие уровни гибели клеток, составлявшие примерно 99 и примерно 86% соответственно, за ними следуют слитые пептиды, содержащие Noxa и Bax в концентрациях 10 мкМ (гибель клеток составляла примерно 52 и примерно 43% соответственно). Окрашивание Hoechst/PI, указанное на фиг. 5 и 6, проводили согласно методу, описанному Bonny С. et al., IB1 reduces cytokine-induced apoptosis of insulin-secreting cells, J. Biol. Chem., 275, 2000, p. 1646616472. Обе линии клеток, HeLa (линия человеческих клеток рака шейки матки), фиг. 5, и TC-3 (линия секретирующих инсулин клеток) (Efrat S. et al., Beta-cell lines derived from transgenic mice expressing a- 17013469 фиг. 7 - результаты, полученные с использованием слитых пептидов, предлагаемых в изобретении,которые содержали только D-аминокислоты (D-BH3-D-Tat из Bid, Bax и Bad). Последовательности домена BH3, состоящие из D аминокислот, соответствовали последовательностям, представленным на фиг. 4, но аминокислотная последовательность была инвертирована. Для всех вариантов, включая Cis-P1, использовали концентрацию 10 мкМ. Инкубацию клеток HeLa (верхний ряд) и С 33 А (нижний ряд) осуществляли в течение 48 ч. Применяли следующие условия: приготавливали среду RPMI-1640, дополненную 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл стрептомицина,100 ед./мл пенициллина, 1 ммоль/л пирувата натрия и 2 ммоль/л глутамина. Окрашивание осуществляли с использованием красителей Hoechst и йодида пропидия (PI) (см. выше) (1 мкг/мл каждого в течение 5 мин, после чего вручную осуществляли подсчет клеток с помощью флуоресцентного микроскопа или фотографировали). В этом анализе живые клетки окрашиваются в синий цвет, погибшие окрашиваются в темно-красный цвет (темный). Отчетливо видно, что все слитые пептиды, предлагаемые в изобретении,которые содержали только D-аминокислоты, вызывали апоптоз клеток. Перечень последовательностей