Химерные рекомбинантные антигены тохорlasma gondii

013349 Область изобретения Описанное здесь изобретение относится к технической области получения диагностических средств, не применяемых непосредственно в организме животного или человека. Изобретение также относится к соединениям, способам их получения, способам их использования и композициям, содержащим их, которые пригодны для промышленного применения в фармацевтической и диагностической области, в частности, для обнаружения и диагностики инфекций Toxoplasma gondii, а также для лечения и предотвращения упомянутых инфекций. Предпосылки изобретения Ранняя диагностика является приоритетом и крайне желанной целью во всех областях применения лекарственных средств, в частности, потому, что она способствует существенному улучшению жизни пациента и, в то же время, экономии средств, затрачиваемых системами здравоохранения или самими пациентами. В частном случае описанного здесь изобретения, ранняя диагностика является диагностикой потенциальной или существующей инфекции Toxoplasma gondii у беременных женщин, с особой заботой о здоровье плода, а также у инфицированных субъектов, особенно с ослабленным иммунитетом.Toxoplasma gondii является облигатным внутриклеточным паразитом, заражающим все клетки млекопитающих, включая клетки человека (McCabe и Remington, N. Engl. J. Med. 1988, 318-313-5). Морфологически паразит имеет три различные формы инфекции: тахизоит (неполовая), брадизоит (в тканевых цистах, неполовая) и спорозоит (в ооцистах, половое размножение). Передача обычно происходит при употреблении в пищу недоваренного мяса, содержащего тканевые цисты, или овощей, загрязненных ооцистами, распространяемыми кошками. Инфекция у человека является обычно бессимптомной и самоизлечивающейся у иммунокомпетентных хозяев. Напротив, у субъектов с ослабленным иммунитетом(особенно у тех, кто страдает от СПИДа), токсоплазмоз является тяжелой оппортунистической инфекцией, способной приводить к возникновению энцефалита с очень серьезными последствиями (Luft, B.J.,Remington J.S., 1992, Clin. Infect. Dis. 15, 211-22). Более того, получение первичной инфекции во время беременности может приводить к самопроизвольным абортам или к тяжелому заболеванию плода у млекопитающих. Для всестороннего обзора проблемы токсоплазмоза читателя отсылают к специальной медицинской литературе. Диагноз инфекции Т. gondii ставят посредством выделения микроорганизма из крови или жидкостей организма, определения паразита в тканях, обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей с помощью PCR, или обнаружения специфических иммуноглобулинов против Т. gondii, вырабатываемых хозяином в ответ на инфекцию (Beaman et al., 1995 Principles and Practice of Infectious Diseases 4th Ed., Churchill Livingstone Inc., New York, 2455-75; Remington J.S. et al. 1995, Infectious Diseases ofthe Fetus and Newborn Infant, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 140-267). Основными проблемами для клиницистов являются диагностика первичных инфекций Т. gondii у беременных женщин и диагностика врожденной инфекции у новорожденных/детей. В обоих случаях, для того, чтобы провести соответствующую терапию своевременно и избежать возможного вреда для плода и новорожденных/детей, очень важно установить, получила ли беременная женщина паразитарную инфекцию до или после зачатия. Кроме того, важно определять, когда имела место вертикальная передача от матери к плоду. Наконец, для клинического ухода за новорожденными/детьми есть насущная потребность в чувствительном способе диагностики, позволяющем различать на ранних этапах жизни инфицированных и неинфицированных младенцев, рожденных от матерей с первичным токсоплазмозом в период беременности. Сероконверсию во время беременности и диагностику врожденной инфекции у новорожденных обычно проводят, пытаясь выявить присутствие различных классов иммуноглобулинов противToxoplasma (IgG, IgM, IgA, авидность IgG) и сравнить иммунологические профили матери и ее ребенка. Однако доступные коммерческие аналитические наборы не обеспечивают достаточной чувствительности и специфичности для точной диагностики инфекции у всех пациентов. Поэтому наличие специфических,чувствительных и инновационных диагностических реагентов крайне желательно. Антигены Т. gondii известны и доступны уже давно, прежде всего как антигенные смеси, полученные различными способами (FR 2226468 Merieux; SU 533376, Veterinary Research Institute; JP 54044016,Nihon Toketsu Kanso), затем как последующие выделения чистых антигенов (ЕР 0082745, Mrieux; ЕР 0301961 INSERM, Pasteur; WO 89/5658, Transgene) и их характеристика, как белков, так и соответствующих им генов (WO 89/08700, U. Leland, Dartmouth Coll.; US 4877726, Res. Inst. Palo Alto; WO 89/12683,INSERM, Pasteur; EP 0391319, Mochida Pharm.; IT 1196817, CNR; EP 0431541, Behringwerke; WO 92/01067, CNRS; WO 92/02624, U. Flinders; WO 92/11366, Innogenetics, Smithkline Beecham; US 5215917,Res. Inst. Palo Alto; WO 92/25689, FR 2702491, INSERM, Pasteur; WO 96/02654, bioMerieux, Transgene; EP 0710724 Akzo; EP 0724016, bioMeriux; EP 0751147, Behringwerke; US 5633139, Res. Inst. Palo Alto; WO 97/27300, Innogenetics; US 5665542, US 5686575, Res. Inst. Palo Alto; WO 99/32633, Heska; JP 11225783,Yano; WO 99/61906, Abbott; WO 99/66043, Smithkline Beecham; JP 2000300278, Yano; WO 00/164243, Virsol), и, наконец, выделение и характеристика антигенных участков генных продуктов Toxoplasma (WO 03/080839, Kenton S.r.l.).-1 013349 В результате многочисленных исследований обнаружены различные антигенные белки Т. gondii, и их генетические последовательности также определены. Среди наиболее интересных белков как для диагностических, так и для терапевтических целей, в форме вакцин, следует упомянуть: микронимные белки (WO 03/080839, Kenton S.r.l.; Beghetto et al., TheJournal of Infectious Diseases, 2005, 191:637-645; Beghetto et al., International Journal for Parasitology, 2003,33:163-173); поверхностные антигены SAG1 (или p30) 89/08700, Stanford University; WO 89/12683 Pasteur,INSERM; WO 94/17813, WO 96/02654, Transgene, bioMeriux; EP 0724016, WO 99/61906, US 5962654,Haming et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, May 1996, 355-357) и SAG2 (или Р 22) (Parmley et al., 1992, J. Clin. MicrobioL 30, 1127-33); белки плотных гранул GRA1 (или Р 24) (ЕР 0301961, Pasteur, INSERM; WO 89/05658, Transgene, Cesbron-Delauw, et al., 1989 P.N.A.S. USA 86, 7537-41), GRA2Biol. Chem. 277, 17544-47): антигены роптри ROP1 (или Р 66) (US 5976553, U. Leland; EP 0431541, Innogenetics) и ROP2 (или Р 54) (Shanva et al., J. Immunol., 131, 377-83). Как описано в вышеуказанных ссылках, антигены получали с помощью методик рекомбинантных кДНК в экспрессирующих векторах. Например, для антигена SAG1, в WO 98/08700, используют известные экспрессирующие векторы в фаге лямбда-gt11. В WO 98/12683 используют тот же фаг и трансфекты Е. coli с патентованной плазмидой, или получая специальную экспрессирующую кассету, как представлено в WO 96/02654. В ЕР 0724016 описано как получают мимеотопы, используя комбинаторные экспрессирующие библиотеки пептидов. В ЕР 0301961 описывают, как получать экскретируемыесекретируемые антигены с молекулярными весами в диапазоне от 20 до 185 кДа. В WO 89/05658 описывают белок, содержащий эпитопы 24 кДа белка, узнаваемые антителами, вырабатываемыми против экскретируемых-секретируемых антигенов Toxoplasma; этот белок получают трансфекцией клеток экспрессирующими векторами. В WO 03/080839 описывают способ, основанный на технологии фагового дисплея, для распознавания антигенных фрагментов белков Т. gondii и их применения в качестве диагностических и иммуногенных веществ. Антиген Р 28 (GRA2) описывают в US 5633139, и способ его получения также представляет собой экспрессию в фаге лямбда-gt11. Антиген Р 32 (GRA6) описывают в патенте FR 2702491, антиген ROP1 (P66) - в патенте США 5976553, Р 35 (или GRA8) - в ЕР 0431541, WO 99/57295 иYang et al. (Parasitol. Res., 2004, 92: 58-64) описывают химерный белок, содержащий SAG1 и SAG2,а также его использование для выработки иммунитета против Т. gondii у мышей. В китайском патенте 11 94991 С описывают рекомбинантный слитый белок, содержащий два антигена токсоплазмы (GRA6 и p30). Не приводят данных, свидетельствующих о том, что анализы на основе данного рекомбинантного слитого белка обладают требуемой чувствительностью в тестах на IgG и IgM. В течение последних десяти лет сообщали об использовании в некоторых исследованиях рекомбинантных антигенов для серологической диагностики инфекции Т. gondii. Однако, даже имея перспективу, ни один из анализов, основанных на рекомбинантных антигенах, не обладал всеми характеристиками,необходимыми для того, чтобы заменить тахизоитный антиген в тестах на IgG и IgM, что свидетельствует о необходимости дальнейшей работы, прежде чем иммунный анализ с применением рекомбинантных продуктов станет возможно использовать для клинических целей. Таким образом, главной целью исследований в данной области является усовершенствование выполнения иммуноферментных анализов на основе рекомбинантных продуктов, таким образом, усовершенствуя, например, раннюю диагностику врожденного токсоплазмоза у новорожденных/детей. Сущность изобретения В настоящее время обнаружено, что сочетание антигенных участков белков Toxoplasma gondii, в форме рекомбинантных слитых продуктов, сохраняет антигенные свойства отдельных антигенных фрагментов. Соответствующие химерные белки, полученные подобным образом, можно использовать для диагностических и терапевтических целей. Применение указанных химерных антигенов в качестве диагностических веществ и соответствующие диагностические средства, содержащие их, например, в форме реагентов для иммуноферментного анализа или наборов, составляют следующий объект настоящего изобретения. Другим объектом настоящего изобретения являются генетические последовательности, кодирующие вышеуказанные химерные антигены, их использование в качестве лекарственных средств, в частности, для предотвращения и лечения инфекции Toxoplasma gondii, например, в качестве генной терапии. Настоящее изобретение также относится к генетическим последовательностям, которые гибридизуются с последовательностями вышеуказанных химерных антигенов в строгих условиях гибридизации. Другим объектом настоящего изобретения является использование химерных антигенов в качестве лекарственных средств, в частности, в форме вакцин, которые применяют для предотвращения и лечения инфекции. Вакцины по настоящему изобретению пригодны для использования в отношении человека и животных (в частности, свиньи, кошки, овцы).-2 013349 Эти и другие объекты будут подробно проиллюстрированы ниже, также посредством примеров и фигур. Подробное описание изобретения Главной целью настоящего изобретения является, следовательно, предоставление рекомбинантных химерных антигенов, полученных посредством слияния различных антигенных участков генных продуктов Toxoplasma gondii, и использование полученных таким образом рекомбинантных белков для создания селективных диагностических и терапевтических средств. Основными преимуществами настоящего изобретения над другими типами антигенов или антигенных фрагментов, известными из литературных источников, приведенных выше, являются следующие, и они очевидны, когда данные антигены используют в диагностических иммунных анализах с образцами сыворотки для обнаружения инфекции. В отношении использования цельного антигена Toxoplasma gondii, полученного из паразита в виде лизированного цельно-клеточного экстракта, химерные рекомбинантные антигены имеют то преимущество, что позволяют избежать неспецифических реакций вследствие наличия другого небелкового материала, и обеспечивают лучшую воспроизводимость. Кроме того, некоторые природные белковые антигены паразита нерастворимы и, следовательно, слабо представлены в коммерческих аналитических наборах, где используют лизированный цельно-клеточный экстракт Т. gondii. В отношении использования одиночных антигенных участков или одиночных антигенных фрагментов (как описано в WO 03/080839), рекомбинантные химерные антигены имеют то преимущество,что повышают чувствительность анализов, в которых их используют. Другими словами, их использование уменьшает или сводит на нет получение ложноотрицательных ответов. А) В отношении использования смеси или набора одиночных антигенных участков (как также предусмотрено в WO 03/080839), имеется по меньшей мере два преимущества. С точки зрения промышленного применения и производства, гораздо легче производить одиночную созданную конструкцию, содержащую три или более антигенных участков, чем производить отдельно каждый одиночный фрагмент,а затем соединять их экономичным и воспроизводимым способом. Во-вторых, как уже упоминалось ранее, применение химерных рекомбинантных антигенов по изобретению повышает чувствительность анализов. Эти и другие преимущества продемонстрированы в разделе примеров. В частности, настоящее изобретение относится к химерному рекомбинантному антигену, содержащему в слитой форме по меньшей мере три различных антигенных участка Toxoplasma gondii, где указанные антигенные участки являются В-клеточными эпитопами, которые связывают специфические антитела к Toxoplasma gondii. Предпочтительно, специфические антитела к Toxoplasma gondii выделяют из сывороток субъектов, инфицированных Toxoplasma gondii. Более детально, настоящее изобретение относится к химерному антигену, где три различных антигенных участка обладают аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36,SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42. Предпочтительными последовательностями в вышеуказанной группе являются SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12. Например, химерный антиген по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQID NO: 28 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32. Химерные антигены по настоящему изобретению можно получить известными способами. Слияния могут быть прямыми (С-конец одной аминокислотной последовательности связывают с N-концом другой простой ковалентной связью) или можно использовать гибкий линкерный домен, такой как шарнирный участок IgG человека, или полипептидные линкеры, состоящие из небольших аминокислот, таких как глицин, серин, треонин или аланин, различной длины и в виде различных сочетаний. Например, линкер может представлять собой полиглициновый повтор, прерываемый через определенный интервал серином или треонином. Предпочтительно, линкер состоит из трех остатков глицина и двух остатков серина, образуя аминокислотную последовательность Ser-Gly-Gly-Gly-Ser (линкер SGGGS). Кроме того, химерные антигены по изобретению можно снабдить His-His-His-His-His-His (His6),что позволит проводить быструю очистку металло-хелатной хроматографией, и/или эпитопами, антитела к которым доступны, что позволит обнаруживать их в биоанализах с помощью вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, или устранения/блокирования активности. Другим объектом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный антиген, как определено выше. По предпочтительному варианту осуществления изобретения подобная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере три различных нуклеотидных последовательности, выбранные из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11. По более предпочтительному варианту осуществления,подобная нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 27, или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 29, или нуклеотидную последовательность SEQID NO: 31. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с любой последовательностью, описанной выше, в строгих условиях гибридизации, а также соответствующий химерный рекомбинантный антиген, кодируемый подобной гибридизованной нуклеотидной последовательностью. Химерные антигены по настоящему изобретению можно получать клонированием и экспрессией в прокариотической или эукариотической системе экспрессии, с использованием подходящих экспрессирующих векторов. Можно использовать любой способ, известный в данной области. Например, молекулы ДНК, кодирующие антигены по изобретению, встраивают в полученные соответствующим образом экспрессирующие векторы способами, хорошо известными в данной области(смотрите Sambrook et al., 1989). Подобные векторы являются другим объектом настоящего изобретения. Для того, чтобы быть способным экспрессировать нужный белок (в данном случае химерные антигены), экспрессирующий вектор должен содержать также специфические нуклеотидные последовательности, содержащие транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, связанные с ДНК,кодирующей нужный белок, таким образом, чтобы происходила экспрессия гена и продукция белка. Вопервых, чтобы ген транскрибировался, перед ним должен находиться промотор, узнаваемый РНКполимеразой, с которым полимераза связывается и, таким образом, запускает процесс транскрипции. Используют разнообразные подобные промоторы, различающиеся по эффективности (сильные и слабые промоторы). Для эукариотических хозяев можно использовать различные транскипционные и трансляционные регуляторные последовательности, в зависимости от природы хозяина. Их источником могут служить вирусы, такие как аденовирус, вирус бычьей папилломы, обезьяний вирус и тому подобное, где регуляторные сигналы связаны с определенным геном, имеющим высокий уровень экспрессии. Примерами служат ТК промотор вируса герпеса, ранний промотор SV40, промотор гена ga14 дрожжей и так далее. Можно выбрать регуляторные сигналы инициации транскрипции, дающие возможность подавления или активации, так что экспрессию генов можно регулировать. Все это множество является следующим объектом настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие химерные антигены по изобретению, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, что комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодирует слитый белок. Подобные комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты включены в варианты осуществления данного изобретения. Например, их можно присоединять к ДНК, кодирующей белок, который делает возможной очистку химерного антигена всего в одну стадию с помощью аффинной хроматографии. Таким объединенным/слитым белком может являться, к примеру, глутатионсульфотрансфераза (GST) для получения слитых продуктов на карбокси-конце белка GST. Соответствующие рекомбинантные белки, экспрессируемые в цитоплазме трансформированных клеток Е. coli, можно очищать аффинной хроматографией с использованием смолы глутатион-сефарозы. Молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерную молекулу по изобретению, вводят в вектор(ы), имеющий операбельно связанные транскрипционные и трансляционные регуляторные сигналы, который способен встраивать нужную генетическую последовательность в клетку-хозяина. Клетки, устойчиво трансформированные введенной ДНК, можно отбирать, вводя также один или больше маркеров, позволяющих отбирать клетки-хозяева, которые содержат экспрессирующий вектор. Маркер также способен обеспечивать фототрофией ауксотрофного хозяина, биоцидной устойчивостью, например, к антибиотикам, или тяжелым металлам, таким как медь, или тому подобное. Ген маркера селекции можно либо напрямую соединять с генетическими последовательностями ДНК,которые будут экспрессированы, либо вводить в ту же самую клетку посредством со-трансфекции. Могут также понадобиться дополнительные элементы для оптимального синтеза белков по изобретению. Важные факторы при отборе конкретной плазмиды или вирусного вектора включают: легкость, с которой реципиентные клетки, содержащие вектор, можно распознать и отобрать среди тех реципиентных клеток, которые не содержат вектор; число копий вектора, которое желательно иметь в конкретном хозяине; и желательно ли иметь возможность переносить вектор между клетками-хозяевами разных видов. Когда вектор(ы) или последовательность ДНК, содержащие конструкцию(и) получены для экспрессии, конструкцию(и) ДНК можно вводить в соответствующую клетку-хозяин любым из множества подходящих способов: трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, кальций-фосфатной преципитацией, прямой микроинъекцией и так далее. Клетки-хозяева могут быть прокариотами или эукариотами. Примером эукариотических хозяев являются клетки млекопитающих, таких как человек, обезьяна, мышь, и клетки яичника китайского хомячка (СНО). Экспрессия в данных клетках-хозяевах обеспечивает пост-трансляционные модификации белковых молекул, включая правильную укладку или гликозилирование в нужных участках. Дрожжевые клетки также способны выполнять посттрансляционные пептидные модификации, включая гликозилирование. Существует ряд стратегий для рекомбинантной ДНК с использованием сильных промоторных последовательностей и большого числа плазмидных копий, которые могут быть использованы для полу-4 013349 чения нужных белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидерные последовательности на клонированных генных продуктах млекопитающих и секретируют пептиды, имеющие лидерные последовательности (то есть пре-пептиды). Примером прокариотических хозяев являются бактерии, такие как Escherichia coli. После введения вектора(ов), клетки-хозяева растят на селективной среде, которая обеспечивает отбор для роста клеток, содержащих вектор. Экспрессия клонированной генетической последовательности(ей) приводит к продукции нужных белков. Очистку рекомбинантных антигенов проводят любым из способов, известных для этих целей, то есть любым общепринятым способом, включая экстракцию, преципитацию, хроматографию, электрофорез и тому подобное. Способ дальнейшей очистки, который предпочтительно можно использовать для очистки антигенов по изобретению, является аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител, которые связывают нужный белок и которые получают и иммобилизуют на гелевой матрице, содержащейся внутри колонки. Смешанные препараты, содержащие рекомбинантный белок,пропускают через колонку. Антигены связываются на колонке за счет специфических антител, тогда как примеси проходят сквозь нее. После промывки антиген элюируют с геля посредством изменения рН или ионной силы. Другим аспектом настоящего изобретения является способ для рекомбинантной продукции химерного антигена, как описано выше, включающий в себя культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором, содержащим нуклеотидную последовательность по изобретению, и выделение нужного продукта. Следующим объектом настоящего изобретения является молекула ДНК, содержащая последовательность ДНК, кодирующую вышеуказанный слитый белок, а также нуклеотидные последовательности по существу те же самые. Нуклеотидные последовательности по существу те же самые включают все другие последовательности нуклеиновой кислоты, которые в силу вырожденности генетического кода также кодируют данную аминокислотную последовательность. Другим объектом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в дополнение к нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный антиген по изобретению, в очень строгих или умеренно строгих условиях, до тех пор, пока полученный антиген сохраняет ту же биологическую активность, то есть способность связывать антитела против паразита. Термин гибридизация, как используют здесь, относится к соединению двух молекул нуклеиновой кислоты между собой водородной связью. Обычно, одну молекулу прикрепляют к твердой подложке, а другая находится в растворе свободно. Затем можно создать контакт между двумя молекулами в условиях, способствующих образованию водородной связи. Факторы, влияющие на эту связь, включают: тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание; вещества, препятствующие неспецифическому прикреплению молекул из жидкой фазы к твердой подложке (реактив Денхардта или BLOTTO); концентрацию молекул; использование соединений, увеличивающих степень связывания молекул (сульфат декстрана или полиэтиленгликоль); и строгость условий промывки после гибридизации. Строгость условий зависит от температуры во время эксперимента гибридизации, молярности моновалентных катионов и процентного содержания формамида в растворе гибридизации. Чтобы определить степень строгости применительно к любому данному набору условий, сначала используют уравнение Meinkoth et al. (1984) для определения стабильности гибридов 100% идентичности, выраженной как температура плавления Tm гибридов ДНК-ДНК: Tm=81,5 С+16,6 (LogM)+0,41 (% GC)-0,61 (% форм)500/L, где М - молярность моновалентных катионов, % GC - процентное содержание нуклеотидов G и С в ДНК, % форм - процентное содержание формамида в гибридизационном растворе и L - длина гибрида в парах оснований. При понижении Tm на каждый 1 С от величины, рассчитанной для гибрида 100% идентичности, количество допустимых неправильных сочетаний увеличивается приблизительно на 1%. Таким образом, если Tm, используемая для любого данного эксперимента гибридизации при определенных концентрациях соли и формамида, на 10 С ниже Tm, рассчитанной для 100% гибрида согласно уравнению Meinkoth, гибридизация произойдет, даже если число неверных сочетаний достигнет примерно 10%. Как используют здесь, очень строгие условия - это те, которые допускают до примерно 15% расхождения последовательностей, тогда как умеренно строгие условия - это те, которые допускают до примерно 20% расхождения последовательностей. Без ограничений, в примерах очень строгих (на 12-15 С ниже рассчитанной Tm для гибрида) и умеренно строгих (на 15-20 С ниже рассчитанной Tm для гибрида) условий используют раствор для промывки 2SSC (стандартный солевой цитрат) и 0,5% SDS при соответствующей температуре ниже рассчитанной Tm для гибрида. Конечная строгость условий определяется главным образом условиями промывки, особенно если использованные условия гибридизации были такими, которые позволяют образовывать менее стабильные гибриды наряду со стабильными гибридами. Более строгие условия отмывки затем позволяют удалять менее стабильные гибриды. Общепринятыми условиями гибридизации, которые можно использовать в сочетании с очень строгими и умеренно строгими условиями промывки, описанными выше, является гибридизация в растворе 6SSC (или-5 013349 6SSPE), 5 реактива Денхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре примерно от 20 до 25 С ниже Tm. При использовании смешанных проб предпочтительно использовать тетраметиламмонийхлорид (ТМАС) вместо SSC (Ausubel, 1987-1998). Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает аналоги ДНК и РНК, такие как те, что содержат модифицированные каркасы. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению также включают антисмысловые молекулы, которые частично комплиментарны молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антигены по настоящему изобретению, и поэтому гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). Подобные антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, можно получать для того, чтобы распознать, специфически связать и предотвратить транскрипцию намеченой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, как известно каждому, кто знаком с базовым уровнем технологии в данной области (смотрите, например, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10,435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56,560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6,3073 (1979);Cooneyetal., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991. По терминологии, используемой здесь, композиция, содержащая соединение [X], является в основном свободной от примесей [здесь, Y], когда по меньшей мере 85% по весу от общего количестваX+Y в композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по меньшей мере около 90% по весу от общего количества X+Y в композиции, более предпочтительно по меньшей мере около 95, 98 или даже 99% по весу. Другой аспект изобретения относится к применению химерных антигенов, описанных выше, в качестве лекарственных средств. В частности, одним из основных объектов изобретения является применение химерных антигенов в качестве активных ингредиентов для получения лекарственных средств для предотвращения или лечения инфекций Toxoplasma gondii. В случае генной терапии, другим объектом изобретения является применение нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены по изобретению, в качестве лекарственных средств, в частности,для получения лекарственных средств, используемых для лечения и предотвращения инфекцийToxoplasma gondii. Фармацевтические композиции должны предпочтительно содержать терапевтически эффективное количество химерных антигенов по изобретению или соответствующих нуклеотидных последовательностей. Химерные антигены по изобретению могут таким образом действовать как вакцины для предотвращения или лечения инфекции Toxoplasma gondii. Что касается терапевтического применения, где получение лекарственных средств или вакцин находится в рамках общих знаний, для дальнейших справок читателя вновь отсылают к патентной литературе, цитированной в настоящем описании, а также, в частности, к Beghetto et al., The Journal of InfectiousDiseases, 2005, 191:637-645. Термин терапевтически эффективное количество, как используют здесь, относится к количеству терапевтического вещества, необходимого, чтобы лечить, облегчать или предотвращать намеченое заболевание или состояние, или проявлять заметный терапевтический или профилактический эффект. Для любого соединения терапевтически эффективную дозу можно первоначально оценить либо с помощью тестов на культурах клеток, например, опухолевых клеток, либо используя животные модели, обычно мышей, кроликов, собак или свиней. Животную модель можно также использовать для определения подходящего диапазона концентраций и способа введения. Подобную информацию затем можно использовать для определения полезных доз и способов введения человеку. Точное эффективное количество для человека зависит от тяжести заболевания, общего состояния здоровья субъекта, возраста, веса и половой принадлежности субъекта, диеты, времени и частоты введения, сочетания(й) лекарственных средств, чувствительности реакций и толерантности/ответа на терапию. Данное количество можно определить обычным экспериментальным путем, и оно находится в сфере компетенции клиницистов. Как правило, эффективная доза составляет от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции можно вводить пациенту отдельно или можно вводить в сочетании с другими веществами, лекарственными средствами или гормонами. Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель для введения терапевтического вещества. Подобные носители включают антитела и другие полипептиды,гены и другие терапевтические средства, такие как липосомы, при условии, что сам носитель не вызывает выработку антител, вредных для индивида, получающего композицию, и может быть введен без чрезмерных токсических последствий. Подходящими носителями могут являться большие, медленно преобразующиеся в процессе обмена веществ макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Здесь можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и тому подобное; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Подробное обсуждение-6 013349 фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co., N. J.1991). Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поддерживающие рН вещества и тому подобное, могут присутствовать в подобных композициях. Такие носители позволяют получать фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и тому подобное, для принятия внутрь пациентом. Полученные композиции по изобретению можно вводить непосредственно субъекту. Субъектами лечения могут быть животные; в частности, можно лечить людей. Фармацевтические композиции, используемые в данном изобретении, можно вводить любым количеством способов, включая, но не ограничиваясь следующими: перорально, внутривенно, внутримышечно, внутриартериально, в мозговое вещество, в полость позвоночного канала, внутрижелудочково, аппликациями через кожу или через дерму (например, смотрите WO 98/20734), подкожно, внутрибрюшинно, через нос, через кишечник, локально, под язык, внутривагинально, или ректально. Можно также использовать генные инжекторы или безыгольные шприцы для введения фармацевтических композиций по изобретению. Обычно терапевтические композиции можно получать в форме инъекций, либо как жидкие растворы или суспензии; можно также получать твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Прямую доставку композиций обычно выполняют посредством инъекций, подкожно, внутрибрюшенно, внутривенно или внутримышечно, или доставляют во внутритканевое пространство. Композиции можно также вводить в очаг повреждения. Система доз лечения может являться схемой единичной дозы и схемой множественных доз. Способ лечения млекопитающего, страдающего от инфекции Toxoplasma gondii, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества вакцины, как описано выше, является одним из аспектов настоящего изобретения. Следующим объектом настоящего изобретения является использование химерных антигенов, как описано выше, в качестве активных веществ для диагностики инфекцийToxoplasma gondii, особенно для диагностики времени заражения. Наборы реагентов для диагностики инфекции Toxoplasma gondii, содержащие по меньшей мере один химерный антиген соответственно, являются частью настоящего изобретения. Подобные наборы можно использовать для диагностики острой и/или хронической инфекции Toxoplasma gondii. Химерный антиген по изобретению можно использовать практически в любом формате анализа,который использует известный антиген для обнаружения антител. Общим свойством всех данных анализов является то, что антиген контактирует с компонентом организма, предположительно содержащим антитела, в условиях, которые позволяют антигену связать любое подобное антитело, присутствующее в данном компоненте. Подобными условиями обычно являются физиологическая температура, рН и ионная сила при использовании избытка антигена. Инкубация антигена с образцом сопровождается определением иммунных комплексов, содержащих антиген. Схема иммуноанализов может сильно варьировать, и множество форматов известно в этой области. В протоколах можно использовать, например, твердые подложки или иммунопреципитацию. Большинство анализов включают использование меченого антитела или полипептида; метки могут являться, например, ферментативными, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или молекулами красителя. Также известны анализы, усиливающие сигналы от иммунных комплексов; примерами которых являются анализы с применением биотина и авидина, и ферментно-меченные и опосредованные иммуноанализы, такие как анализы ELISA. Иммуноанализ может быть, без ограничений, в гетерогенном или в гомогенном формате, а также стандартного или конкурентного типа. В гетерогенном формате полипептид обычно связывают с твердой матрицей или подложкой для ускорения отделения образца от полипептида после инкубации. Примерами твердых подложек, которые можно использовать, являются нитроцеллюлоза (например,в форме мембраны или микротитровальной лунки), поливинилхлорид (например, в листах или микротитровальных лунках), полистирольный латекс (например, в гранулах или микротитровальных планшетах), поливинилидинфторид (известный как Immulon), диазотированная бумага, нейлоновые мембраны, активированные гранулы и гранулы с белком А. Например, микротитровальные планшеты DynatechImmulon1 или Immulon2 или 0,25-дюймовые полистирольные гранулы (Precision Plastic Ball) можно использовать в гетерогенном формате. Твердую подложку, содержащую антигенные полипептиды,обычно промывают после отделения ее от тестируемого образца, и до определения связанных антител. Как стандартный, так и конкурентный форматы известны в данной области. В гомогенном формате тестируемый образец инкубируют с сочетанием антигенов в растворе. Например, это может происходить в условиях, при которых любые образующиеся комплексы антигенантитело будут выпадать в осадок. Как стандартный, так и конкурентный форматы для указанных анализов известны в данной области. В стандартном формате количество антител, образующих комплекс антитело-антиген, контролиру-7 013349 ется напрямую. Это можно осуществить, определяя, свяжутся ли меченые антиксеногенные (например,античеловеческие) антитела, которые узнают эпитоп на антителах к Toxoplasma gondii, в результате образования комплекса. В конкурентном формате количество антител в образце устанавливают, контролируя конкурентное влияние на связывание известного количества меченых антител (или другого конкурирующего лиганда) в комплексе. Образованные комплексы, содержащие антитело к Toxoplasma gondii (или, в случае конкурентных анализов, определенное количество конкурирующего антитела), определяют любым из ряда известных методов, в зависимости от формата. Например, немечеые антитела в комплексе можно определить, используя конъюгат антиксеногенного Ig в комплексе с меткой (например, ферментной меткой). В формате анализа иммунопреципитации или агглютинации взаимодействие между химерными антигенами и антителом приводит к образованию сети, которая выпадает в осадок из раствора или суспензии и образует видимый слой или пленку преципитата. Если в тестируемом образце не присутствует антитело к Toxoplasma gondii, видимый преципитат не образуется. Химерные антигены по изобретению обычно комплектуют в виде набора реагентов для использования в подобных иммуноанализах. Набор обычно содержит в отдельных контейнерах сочетание антигенов (либо предварительно связанных с твердой матрицей, либо свободных, вместе с реактивами для привязывания их к матрице), препараты контрольного антитела (положительный и/или отрицательный), мечеое антитело, когда формат анализа требует такового и образующие сигнал реактивы (например, ферментный субстрат), если метка сама не является источником сигнала. Инструкции (например, письменные, печатные, на видеокассете, CD-ROM, и так далее) для проведения анализа обычно включают в состав набора. Диагностические наборы, которые являются объектом настоящего изобретения, следовательно, известны специалистам в данной области. В качестве примера, читателя отсылают к патентной литературе,цитированной выше, к списку которой можно добавить US 6265176, WO 01/63283 и WO 03/080839 в качестве дополнительной литературы. Далее изобретение будет проиллюстрировано более подробно посредством примеров и фигур. Описание чертежей Фиг. 1. Плазмидная карта бактериального экспрессирующего вектора pGEX-SN. Фиг. 2. Схематическое изображение химерных антигенов. Последовательности ДНК клонов Тх-2.а, Тх-1.16, Тх-4.18, Тх-15.11, Тх-1.11 и Тх-11.b, кодирующие,соответственно, белковые фрагменты генов Т. gondii MIC2, MIC3, SAG1, GRA3, GRA7 и М 2 АР, были использованы для получения слитых белков GST-EC2, GST-EC3 и GST-EC4. Фиг. 3. Экспрессия химерных антигенов Т. gondii в клетках Е. coli. Анализ в SDS-PAGE очищенных слитых белков GST-EC2, GST-EC3 и GST-EC4. Рекомбинантные белки подвергали электрофорезу (0,003 мг/дорожку) в 12% полиакриламидном геле. MB, маркеры молекулярного веса. Фиг. 4. Биохимическая характеристика химерных антигенов. Анализ ВЭЖХ очищенного GST-EC2 гель-фильтрацией на колонке с TSK G4000 SW-XL. Примеры В табл. 1 представлены, в качестве примеров, последовательности ДНК, использованные для получения рекомбинантных химерных антигенов Toxoplasma gondii. Последовательность Тх-15.11 представляет собой фрагмент гена GRA3 (Bermudes et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1994, 68:247-257). Указанный клон обладает аминокислотной последовательностью и его применение в химерных антигенах охвачено настоящим изобретением. Последовательность Тх-1.11 представляет собой фрагмент антигена GRA7 (Bonhomme et al., J. Histochem. Cytochem., 1998, 46:1411-1421). Указанный клон обладает аминокислотной последовательностью и его применение в химерных антигенах охвачено настоящим изобретением. Последовательность Тх-1.16 представляет собой фрагмент гена MIC3 (Garcia-Rguet et al., CellularMicrobiol., 2000, 2:353-364). Указанный клон обладает аминокислотной последовательностью и его применение в химерных антигенах охвачено настоящим изобретением. Последовательность Тх-4.18 представляет собой фрагмент антигена SAG1 (Burg et al., J. Immunol.,1988, 141:3584-3591). Указанный клон обладает аминокислотной последовательностью и его применение в химерных антигенах охвачено настоящим изобретением. Последовательность Тх-2.а представляет собой фрагмент гена MIC2 (Wan et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1997, 84:203-214). Указанный клон обладает аминокислотной последовательностью и его применение в химерных антигенах охвачено настоящим изобретением. Последовательность Тх-11.b представляет собой особый фрагмент гена М 2 АР (Rabenau et al., Mol.Microbiol., 2001, 41:537-547). Указанный клон обладает аминокислотной последовательностью и его применение в химерных антигенах охвачено настоящим изобретением. Получение химерных антигенов. Белковый продукт ЕС 2 является химерной молекулой, содержащей последовательности ДНК Тх 2.а, Тх-1.16 и Тх-4.18.SEQ ID 9 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-2.а, используя олигонуклеотиды K551 (5'-GGACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCC-3') и K553 (5'-CATCCAGTCCTGCTACCGCCACCAGACCAGACGCCACATCCAGC-3'). Олигонуклеотид K553 содержит последовательность, кодирующую линкер SGGGS, который соединяет последовательности Тх-2.а и Тх-1.16. Условия PCR были: 30" при 94 С, 30" при 50 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов.SEQ ID 5 использовали как матрицу для ДНК клона Тх-1.16, используя олигонуклеотиды K552 (5'GTGGCGTCTGGTCTGGTGGCGGTAGCAGGACTGGATGTCATGCC-3') и K555 (5'-TGACGACCGAGCTACCGCCACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATG-3'). Олигонуклеотид K555 содержит последовательность, кодирующую линкер SGGGS, который соединяет последовательности Тх-1.16 и Тх-4.18. Условия PCR были: 30" при 94 С, 30" при 50 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов.SEQ ID 7 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-4.18, используя олигонуклеотиды K554 (5'-ATGCGATAACTCTGGTGGCGGTAGCTCGGTCGTCAATAATGTCGC-3') и K556 (5'CCGCGGCCGCTAGCCGATTTTGCTGACCCTG-3'). Условия PCR были: 30" при 94 С, 30" при 50 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов. Продукты PCR очищали с помощью "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, США). 25 нг продуктов амплификации ДНК SEQ ID 9 и SEQ ID 5 смешивали вместе и использовали как матрицы в реакции PCR, используя олигонуклеотиды K551 и K555. Условия PCR были: 30" при 94 С, 30" при 50 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов. 25 нг полученных продуктов амплификации ДНК очищали с помощью "Qiagen PurificationKit" (Qiagen, CA, США), а затем смешивали с 25 нг продукта амплификации ДНК SEQ ID 4. В завершение,смесь ДНК использовали как матрицу для амплификации ДНК, используя олигонуклеотиды K551 и K556,следуя условиям PCR: 30" при 94 С, 30" при 50 С и 90" при 72 С в течение 20 циклов. Белковый продукт ЕС 3 является химерной молекулой, содержащей последовательности ДНК Тх 15.11, Тх-1.11 и Тх-11.b.SEQ ID 1 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-15.11, используя олигонуклеотиды K563 (5'-GGACTAGTCGGCTGGCTGCCTTGGGAGGCCTTG-3') и K565 (5'-GCCGCGGTAGCACTACCGCCACCAGACAAACCAGGGCGATCTGTG-3'). Олигонуклеотид K565 содержит последовательность, кодирующую линкер SGGGS, который соединяет последовательности Тх-15.11 и Тх-1.11. Протокол PCR был: 30" при 94 С, 30" при 48 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов.SEQ ID 3 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-1.11, используя олигонуклеотиды K564 (5'-GCCCTGGTTTGTCTGGTGGCGGTAGTGCTACCGCGGCCACCGCG-3') и K567 (5'CCGGTTCGTTACTACCGCCACCAGAGAAATGAACTTCTTCTTGTTC-3'). Олигонуклеотид K567 содержит последовательность, кодирующую линкер SGGGS, который соединяет последовательности Тх 1.11 и Тх-11.b. Протокол PCR был: 30" при 94 С, 30" при 48 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов.SEQ ID 11 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-11.b, используя олигонуклеотиды K566 (5'-GAAGTTCATTTCTCTGGTGGCGGTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAG-3') и K568 (5'CCGCGGCCGCAGATTCAGACTCAGACGGAC-3'). Протокол PCR был: 30" при 94 С, 30" при 45 С и 60" при 72 С в течение 20 циклов. Продукты PCR очищали с помощью "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, США). 25 нг продуктов амплификации ДНК SEQ ID 1 и SEQ ID 3 смешивали вместе и использовали как матрицы в реакцииPCR, используя олигонуклеотиды K563 и K567. Протокол PCR был: 30" при 94 С, 30" при 45 С и 60" при 72 С в течение 30 циклов. 25 нг полученных продуктов амплификации ДНК очищали, а затем смешивали с 25 нг продукта амплификации ДНК SEQ ID 11. В завершение, смесь ДНК использовали как матрицу для амплификации ДНК, используя олигонуклеотиды K563 и K568, следуя условиям PCR: 30" при 94 С, 30" при 45 С и 180" при 72 С в течение 30 циклов. Белковый продукт ЕС 4 является химерной молекулой, содержащей последовательности ДНК Тх 2.а, Тх-1.16 и Тх-11.b.SEQ ID 9 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-2.а, используя олигонуклеотиды K551 и K553.SEQ ID 5 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-1.16, используя олигонуклеотиды K552 и K572 (5'-CGTTACTACCGCCACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATGA-3'). Олигонуклеотид K572 содержит последовательность, кодирующую линкер SGGGS, который соединяет последовательности Тх-1.16 и Тх-11.b.SEQ ID 11 использовали как матрицу для амплификации ДНК клона Тх-11.b, используя олигонуклеотиды K571 (5'-TAACTCTGGTGGCGGTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAGC-3') и K568. Продукты PCR очищали с помощью "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, США). 25 нг продуктов амплификации ДНК SEQ ID 9 и SEQ ID 5 смешивали вместе и использовали как матрицы в реакцииPCR, используя олигонуклеотиды K551 и K572. 25 нг полученных продуктов амплификации ДНК очищали, а затем смешивали с 25 нг продукта амплификации ДНК SEQ ID 11. В завершение, смесь ДНК использовали как матрицу для амплификации ДНК, используя олигонуклеотиды K551 и K568. УсловияPCR для получения ЕС 4 были такими же, как те, что использовали для конструкций ЕС 2 и EC3. В следующей далее табл. 2 представлены, в качестве примеров, последовательности ДНК химерных антигенов ЕС 2, EC3 и ЕС 4: Химерный белок ЕС 2 обладает аминокислотной последовательностью и его применение в качестве рекомбинантного антигена, содержащего множественные белковые фрагменты Toxoplasma gondii, охвачено настоящим изобретением. Химерный белок EC3 обладает аминокислотной последовательностью и его применение в качестве рекомбинантного антигена, содержащего множественные белковые фрагменты Toxoplasma gondii, охвачено настоящим изобретением. Химерный белок ЕС 4 обладает аминокислотной последовательностью и его применение в качестве рекомбинантного антигена, содержащего множественные белковые фрагменты Toxoplasma gondii, охвачено настоящим изобретением.- 13013349 Получение ДНК-содержащих векторов, направляющих экспрессию химерных антигенов как слитых с GST продуктов в цитоплазме клеток Е. Coli. Фрагменты ДНК, кодирующие химерные белки ЕС 2, EC3 и ЕС 4 клонировали как слитые с белком глутатионсульфотрансферазой (GST) продукты и экспрессировали как растворимые белки в цитоплазме бактериальных клеток для определения их специфичности и избирательности. Последовательности ДНК ЕС 2, EC3 и ЕС 4 (SEQ ID 27, 29 и 31, соответственно) расщепляли рестрикционными ферментами Spel иNotI. Расщепленную ДНК клонировали в вектор pGEX-SN (Minenkova et al., International Journal of Cancer, 2003, 106:534-44), который предварительно расщепляли эндонуклеазами SpeI и NotI, для получения слитых продуктов по карбоксиконцу белка GST. Полученные плазмиды использовали для трансформации компетентных клеток E.coli, следуя стандартным протоколам (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Биохимическая характеристика рекомбинантных химерных антигенов. Рекомбинантные белки GST-EC2, GST-EC3 и GST-EC4 экспрессировали в цитоплазме трансформированных клеток Е. coli и очищали аффинной хроматографией с использованием смолы глутатионсефарозы (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), следуя инструкциям изготовителя. Степень чистоты и концентрацию белка оценивали с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и анализа Bradford, соответственно. Аффинно очищенные рекомбинантные продукты диализовали против PBS, разводили до концентрации 1 мг/мл с помощью PBS и хранили при-20 С до использования. Выходы очищенных продуктов составляли 8 мг/л бактериальной культуры, 5 мг/л и 4 мг/л для химерных антигенов GST-EC2, GST-EC3 и GST-EC4, соответственно. Впоследствии рекомбинантные белки анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). С этой целью проводили гель-фильтрацию на колонке для ВЭЖХ с TSK G4000 SW-XL, впрыскивая по 30 мкл каждого образца (концентрация белка 2 мг/мл) в колонку при скорости потока 1 мл/мин (подвижная фаза: KH2PO4 0,05 M; NaCl 0,3 М рН 7,0). Результаты ВЭЖХ анализа свидетельствовали о том, что химерные антигены GST-EC2, GST-EC3 и GST-EC4 очищены как гомогенные продукты в форме димеров(смотрите фиг. 4, где в качестве примера приведен ВЭЖХ анализ GST-EC2), с молекулярным весом 110,4, 152,6 и 130 кДа (Да, дальтон). Высокомолекулярные белковые агрегаты отсутствовали во всех очищенных белковых препаратах. Иммунореактивность химерных рекомбинантных антигенов с IgG антителами из сывороток индивидов, инфицированных Т. gondii: IgG Rec-ELISA. Анализ ELISA слитых с GST продуктов проводили, нанося на многолуночные планшеты Maxisorp(Nunc) одиночные антигенные фрагменты или химерные белки в концентрации 5 мкг/мл в буфере для сенсибилизации поверхности (50 мМ NaHCO3, рН 9,6). После инкубации в течение ночи при 4 С, планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С с блокирующим буфером (5% обезжиренное сухое молоко,0,05% Tween-20 в PBS), а затем инкубировали в течение 1 ч при 37 С с сыворотками сероположительных и сероотрицательных в отношении Т. gondii индивидов, разведенными 1:200 блокирующим раствором. Планшеты тщательно промывали 0,05% Tween-20 в PBS и затем в каждую лунку добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к IgG человека (1 мг/мл; Sigma-Aldrich, США), разведенные 1:10000 блокирующим раствором. В заключение, инкубированием планшетов с хромогенным субстратом тетраметилбензидином (ТМВ; Sigma-Aldrich, США) выявляли ферментативную активность. Результаты записывали как разницу между поглощением (оптическая плотность, OD) при 450 и 620 нм, определяемым с помощью автоматического планшет-ридера для ELISA (Labsystem Multiskan, Финляндия). Для каждого образца сыворотки анализ троекратно повторяли и вычисляли средние значения. Следующая далее табл. 3 иллюстрирует IgG-реактивность одиночных антигенных фрагментов и химерных антигенов ЕС 2, EC3 и ЕС 4, экспрессированных как слитые с GST белки, при использовании сывороток от 36 (Т 1-Т 36) Т. gondii-сероположительных и 27 (N1-N27) Т. gondii-сероотрицательных человек. Приведены уровни специфических IgG к Toxoplasma, рассчитанные в международных единицах(ME) с использованием коммерческого набора для анализа (VIDAS system, bioMeriux, Marcy-l'Etoile,Франция). Для каждого GST-слитого продукта малозначимую величину определяли как среднее плюс двойное стандартное отклонение показаний оптической плотности, полученных для сывороток, отрицательных по IgG к Toxoplasma. Нормальный шрифт, ODмалозначимой величины; жирный шрифт,ODмалозначимой величины. Числовое значение, представленное в каждой ячейке, рассчитывали как отношение OD пробы к малозначимой величине для соответствующего антигена (н/о, не определено). Значения, большие чем 1, указывают на положительный ответ. Из табл. 3 с очевидностью следует, что некоторые сыворотки, являющиеся положительными, дают отрицательный результат при использовании одиночных антигенных фрагментов, тогда как они дают положительный результат (безошибочно) при использовании химерных антигенов по настоящему изобретению. Обратите внимание, что числовые значения концентраций IgG, полученные с помощью стандартного анализа, нельзя сравнивать с другими, так как они рассчитаны исходя из международного стандарта, который нельзя использовать для других анализов. В следующей далее табл. 4 суммированы результаты анализов ELISA на основе рекомбинантных белков с использованием образцов сыворотки сероположительных и сероотрицательных в отношении Т.gondii людей. В каждой колонке приведено число и соответствующие значения процентного содержания реактивных сывороток. Из табл. 4 с очевидностью следует, что чувствительность анализа (смотрите 2 ю колонку с данными о наличии ложноотрицательных результатов) повышается при использовании химерных антигенов по изобретению. Это повышение очевидно в сравнении с использованием как одиночных антигенных фрагментов, так и с использованием наборов или смесей (смесь-Тх-1.16/Тх-4.18/Тх-2.а,смесь-Тх-1.16/Тх-4.18/Тх-2.а, смесь-Тх-1.16/Тх-2.а/Тх-11.b) различных одиночных антигенных фрагментов. Иммунореактивность одиночных антигенных доменов внутри химерных рекомбинантных антигенов с IgG антителами сывороток индивидов, инфицированных Т. gondii. Для подтверждения того, что химерные антигены сохраняют иммунореактивность одиночных антигенных фрагментов, использованных для их получения, сыворотки людей, специфически реагирующие в анализах ELISA с одиночными антигенными фрагментами, адсорбировали с помощью различных сочетаний одиночных антигенов, а затем анализировали с использованием химерных белков. С этой целью,определенные сочетания антигенных фрагментов, экспрессированные как GST-слитые продукты, наносили на многолуночные планшеты Maxisorb (Nunc) в концентрации 10 мкг/мл в буфере для сенсибилизации поверхности (50 мМ NaHCO3, pH 9,6), а затем инкубировали в течение ночи при 4 С. Планшеты тщательно промывали, а затем инкубировали в течение 30 мин при 37 С с образцами сыворотки (20 мкл/лунку) в блокирующем растворе (5% обезжиренное сухое молоко, 0,05% Tween-20 в PBS). Сыворотки, истощенные по специфическим к фрагментам антителам, отбирали из каждой лунки, добавляли в новую лунку, инкубировали в течение 30 мин, и подобную процедуру повторяли более 6 раз. Образцы,истощенные по специфическим антителам против одиночных или множественных антигенных фрагментов, в заключение, анализировали ELISA на химерных антигенах. С этой целью, химерные антигены ЕС 2, EC3 и ЕС 4, как GST-слитые продукты, наносили в течение ночи при 4 С на многолуночные планшеты Maxisorb в концентрации 5 мкг/мл. Покрытые планшеты блокировали и затем инкубировали в течение 1 ч при 37 С с истощенными по антителам человеческими сыворотками, разведенными 1:100 блокирующим раствором. Планшеты тщательно промывали и затем в каждую лунку добавляли конъюгированные со щелочной фосфатазой антитела к IgG человека (Sigma-Aldrich, США), разведенные 1:7500 блокирующим раствором. В завершение, хромогенным субстратом п-нитрофенилфосфатом (SigmaAldrich, США) выявляли ферментативную активность. Результаты записывали как разницу между поглощением при 450 и 620 нм, определяемым с помощью автоматического планшет-ридера для ELISA(Labsystem Multiskan, Финляндия). Для каждого образца анализ дважды повторяли и вычисляли средние значения. Биохимическая модификация химерных антигенов ЕС 2 и EC3. Для анализа иммунореактивности химерных антигенов ЕС 2 и EC3 со специфическими IgM антителами к Toxoplasma в сыворотках пациентов рекомбинантные белки были химически модифицированы биотинилированием. Для этого очищенные GST-EC2 и GST-EC3, разведенные до концентрации 1 мг/мл в PBS, инкубировали в присутствии пятикратного молярного избытка сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо)гексаноата (Sulfo-NHS-LC-Biotin от Pierce, США) в течение 3 ч на льду. Затем белки диализовали в течение ночи против PBS для удаления избытка реагентов непрореагировавшего и гидролизованного биотина. Уровни включения биотина в химерные антигены определяли с помощью набора "EZ BiotinQuantitation Kit" (Pierce, США), и они составили 1,4 остатка биотина/молекулу для GST-EC2 и 1,3 остатка биотина/молекулу для GST-EC3. В завершение, меченные биотином продукты разводили до концентрации 0,5 мг/мл и хранили при -20 С до использования. Иммунореактивность меченных биотином ЕС 2 и EC3 со специфическими IgM антителами кToxoplasma: IgM Rec-ELISA. Для изучения иммунореактивности рекомбинантных антигенов со специфическими иммуноглобулинами М к Toxoplasma применяли двойной сэндвич-иммуноферметный анализ (IgM Rec-ELISA). На- 16013349 планшеты Maxisorb (Nunc, США) наносили антитела к IgM человека (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 10 мкг/мл в буфере для сенсибилизации поверхности (50 мМ NaHCO3, рН 9,6). Планшеты блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином в PBS (блокирующий раствор) в течение 1 ч при 37 С, а затем инкубировали в течение 1 ч при 37 С с образцами сыворотки в блокирующем растворе. Планшеты промывали и затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с меченными биотином GSTслитыми белками, разведенными в блокирующем растворе. После тщательной промывки планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Pierce, США) в концентрации 1 мкг/мл в блокирующем растворе. В завершение, ферментативную активность выявляли инкубированием планшетов в течение 30 мин при комнатной температуре с субстратом тетраметилбензидином (Sigma-Aldrich, США). Результаты записывали как разницу между поглощением при 450 и 620 нм, определяемым с помощью автоматического планшет-ридера для ELISA(Labsystem Multiskan, Финляндия). Для каждого образца анализ дважды повторяли и вычисляли средние значения. Термостабильность меченных биотином химерных антигенов. Для определения термостабильности меченных биотином GST-ЕС 2 и GST-EC3 рекомбинантные продукты разводили до концентрации 5 мкг/мл в коммерческом буфере "Stabilzyme" (SurModics, США) и хранили при +4 С до использования. После различных временных интервалов (вплоть до 80 дней) иммунореактивность рекомбинантных белков оценивали посредством анализа IgM Rec-ELISA и полученные результаты сравнивали с таковыми для соответствующих продуктов, которые хранили замороженными при -20 С. Анализ IgM Rec-ELISA проводили как описано выше, используя меченные биотином антигены GST-EC2 и GST-EC3 в конечной концентрации 500 нг/мл в блокирующем растворе (3% БСА в PBS) и человеческие сыворотки, разведенные 1:100 блокирующим раствором. Для каждого образца анализ дважды повторяли и вычисляли средние значения. Значения ID50, рассчитанные как предельный срок, когда измеряли 50% от специфической к токсоплазме IgM-иммунореактивности, составили 189 дней и 97 дней для GST-EC2 и GST-EC3, соответственно. Данные наблюдения ясно свидетельствуют, что химерные антигены по изобретению стабильны в разбавленных растворах в течение длительного времени, что является основополагающим требованием для коммерческого применения рекомбинантного продукта. Расширенная экспертиза IgM Rec-ELISA. Меченные биотином химерные антигены GST-EC2 и GST-EC3 анализировали с IgM-антителами в сыворотках индивидов, инфицированных Т. gondii, и результаты анализов IgM Rec-ELISA сравнивали с таковыми, полученными с помощью коммерческих наборов на основе лизированного, цельно-клеточного антигена Toxoplasma (VIDAS system от bioMerieux, Франция; ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS от DiaSorin,Италия). Для этой цели анализировали образцы сыворотки женщин, которые приобрели первичный токсоплазмоз в период беременности, и были направлены для постнатального наблюдения в Центре перинатальной инфекции области Campania, Италия. Наборы для анализа IgG и IgM bioMerieux VIDAS Toxo использовали, чтобы отобрать три группы образцов сыворотки для оценки качества работы IgM RecELISA для токсоплазмы. Группу А (n=22) составляли образцы, отрицательные по специфическим IgM иIgG-антителам к Т. gondii, как показали анализы с помощью наборов VIDAS Toxo IgM и IgG. Группу В(n=18) составляли образцы с серологическим профилем, соответствующим хронической инфекции (присутствие специфических IgG-антител к Т. gondii и отсутствие специфических IgM-антител к Т. gondii,как показали анализы с помощью наборов VIDAS Toxo IgM и IgG, соответственно). Группу С (n=50) составляли образцы с серологическим профилем, соответствующим острой инфекции (присутствие специфических IgM и IgG-антител к Т. gondii, как показали анализы с помощью наборов VIDAS Toxo IgM иIgG). IgM Rec-ELISA проводили как описано выше, и для каждого образца сыворотки анализ проводили дважды и вычисляли средние величины. Следующая далее табл. 5 иллюстрирует IgM-реактивность меченных биотином химерных антигенов GST-EC2 и GST-EC3, в сравнении с результатами, полученными с помощью коммерческих наборов (VIDAS и ETI-TOXO-K), при использовании сывороток из группы А(А 1-А 22), группы В (В 1-В 18) и группы С (С 1-С 50). Также приводятся уровни специфических IgG кToxoplasma, рассчитанные в международных единицах (ME). Для каждого меченного биотином GSTслитого продукта малозначимую величину определяли как среднее плюс двойное стандартное отклонение показаний оптической плотности, полученных для сывороток, отрицательных по специфическимIgM к Т. gondii (группы А и В, n=40). Малозначимые величины для VIDAS IgM, ETI-TOXOK-M ReversePLUS, GST-EC2 и GST-EC3 составили 0,650, 0,500, 0,343 и 0,378 соответственно. Напечатанные жирным шрифтом величины указывают на положительный ответ.- 18013349 В следующей далее табл. 6 приведены функциональные характеристики коммерческих наборов (VIDAS IgM и ETI-TOXOK-M Reverse PLUS) в сравнении с результатами, полученными с меченными биотином химерными антигенами ЕС 2 и EC3 (IgM Rec-ELISA). Из табл. 6 ясно следует, что и специфичность, и положительные прогностические значения анализов (смотрите 3 ю колонку с данными о наличии ложноположительных результатов) достигают максимума (100%) при использовании химерных антигенов по изобретению. В отношении чувствительности и согласованности, как коммерческий тест ETITOXOK-M на основе лизированного цельно-клеточного антигена Toxoplasma, так и IgM rec-ELISA с химерным антигеном ЕС 2 имеют идентичные функциональные характеристики, при этом обе величины очень близки к 100%. Таблица 6 ППВ - положительная прогностическая величина, ОПВ отрицательная прогностическая величина. В заключение была исследована иммунореактивность меченных биотином антигенов GST-EC2 иGST-EC3 с IgM-антителами в сыворотках детей с врожденным токсоплазмозом. В ретроспективном исследовании были проанализированы сыворотки 30 детей от матерей с первичной инфекцией Т. gondii в период беременности. Двадцать детей имели врожденный токсоплазмоз и десять были неинфицированы,о чем свидетельствовало наличие или исчезновение специфических IgG-антител к Toxoplasma после 12 месяцев жизни, соответственно. В группе инфицированных пациентов срок беременности, на котором произошло заражение матери, составлял второй триместр у 6 матерей и третий триместр у 14 матерей. 30 образцов сыворотки инфицированных и неинфицированных детей анализировали с помощью IgM RecELISA и сравнивали с результатами, полученными с использованием коммерческих наборов для анализа на основе цельно-клеточного антигена Toxoplasma (ELFA-IgM и ETI-TOXOK-M Reverse PLUS). Специфические уровни IgG к Toxoplasma находились в пределах от 28 до 1147 ME/мл для сывороток инфицированных детей и от 19 до 170 МЕ/мл для сывороток неинфицированных субъектов. Для каждого GSTслитого продукта малозначимую величину определяли как среднее плюс 2SD от значений оптической плотности, полученных для сыворотки неинфицированных детей. В табл. 7 суммированы результаты анализов IgM Rec-ELISA индивидуальных сывороток инфицированных детей. В общей сложности, число IgM-реактивных сывороток составляло от 70% (14/20) до 50% (10/20) при использовании антигеновGST-EC2 и GST-EC3, соответственно. Напротив, только 7 из 20 инфицированных детей (35%) имели положительные результаты при использовании наборов для анализа ELFA-IgM или ETI-TOXOK-M. Среди неинфицированных детей ни одна из сывороток не реагировала с антигенами GST-EC2 и GST-EC3 вIgM Rec-ELISA и не дала положительного результата при использовании коммерческих наборов. В заключение, данные результаты свидетельствуют, что использование рекомбинантных химерных антигенов является эффективным для распознавания инфицированных Т. gondii от неинфицированных индивидов, имея сравнимые или даже лучшие функциональные характеристики по сравнению с использованием цельно-клеточного тахизоитного антигена, и может лечь в основу стандартизированного коммерческого набора реактивов для серодиагностики токсоплазмоза.- 19013349 Таблица 7. Реактивность специфичных IgM к Toxoplasma из образцов сыворотки 30 детей, рожденных от матерей с первичной инфекцией Т. gondii, приобретенной в период беременности Пояснения к табл. 7 а Образцы сыворотки инфицированных Т. gondii (T1-T20) или неинфицированных детей (N1-N10) анализировали с помощью IgM Rec-ELISA анализов с антигенами GST-EC2 и GST-EC3 или коммерческих наборов (ELFA-IgM и ETI-TOXO-M).b Тяжесть клинического проявления: Т - тяжелое; Л - легкое; Суб - субклиническое. с Значения малозначимых величин для аналитических наборов ELFA-IgM и ETI-TOXO-М составляли 0,65 и 0,41, как указано изготовителями, соответственно. Жирный шрифт, значениямалозначимой величины.d Значения малозначимых величин для IgM Rec-ELISA с использованием антигенов GST-EC2 и