Rage – слитые белки и способы их применения
Номер патента: 12586
Опубликовано: 30.10.2009
Авторы: Вебстер Джеффри К., Стерн Дэвид М., Тянь Йе Э., Мджалли Аднан М.М., Шмидт Анн Мари, Янь Ши Ду, Ротлейн Роберт
Формула / Реферат
1. Слитый белок, содержащий полипептид RAGE, связанный на его карбоксиконце с аминоконцом не-RAGE-полипептида, где полипептид RAGE является фрагментом человеческого sRAGE, где последовательность человеческого sRAGE приведена в SEQ ID NO: 5 или 6, и где последовательность указанного фрагмента содержит на своем аминоконце SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 9 или 10; и где не-RAGE-полипептид содержит домен CH2 или домен CH3 человеческого IgG.
2. Слитый белок по п.1, где аминокислотная последовательность человеческого sRAGE приведена в SEQ ID NO: 5.
3. Слитый белок по п.1, где аминокислотная последовательность человеческого sRAGE приведена в SEQ ID NO: 6.
4. Слитый белок по п.2, где последовательность фрагмента содержит на своем аминоконце SEQ ID NO: 9.
5. Слитый белок по п.3, где последовательность фрагмента содержит на своем аминоконце SEQ ID NO: 10.
6. Слитый белок по п.1, где аминокислотная последовательность фрагмента человеческого sRAGE приведена в SEQ ID NO: 7, в SEQ ID NO: 8, в SEQ ID NO: 13, в SEQ ID NO: 14, в SEQ ID NO: 15, в SEQ ID NO: 16, в SEQ ID NO: 17, в SEQ ID NO: 18, в SEQ ID NO: 19 или в SEQ ID NO: 20.
7. Слитый белок по любому из пп.1-6, содержащий как домен CH2, так и домен CH3 человеческого IgG.
8. Слитый белок по п.7, содержащий Fc-фрагмент человеческого IgG.
9. Слитый белок по любому из пп.1-8, где человеческий иммуноглобулин IgG представляет собой человеческий IgG1.
10. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, содержащий полипептид RAGE, связанный на его карбоксиконце с аминоконцом не-RAGE-полипептида, где полипептид RAGE является фрагментом человеческого sRAGE, где последовательность человеческого sRAGE приведена в SEQ ID NO: 5 или 6, и где последовательность фрагмента содержит на своем аминоконце SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 9 или 10; и где не-RAGE-полипептид содержит домен CH2 или домен CH3 человеческого IgG.
11. Нуклеиновая кислота по п.10, где аминоконцевая последовательность фрагмента человеческого sRAGE приведена в любой из последовательностей SEQ ID NO: 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
12. Нуклеиновая кислота по п.11, где последовательность нуклеиновой кислоты фрагмента sRAGE приведена в любой из последовательностей SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 29.
13. Нуклеиновая кислота по любому из пп.10-12, содержащая как домен CH2, так и домен CH3 человеческого IgG.
14. Нуклеиновая кислота по п.13, содержащая Fc-фрагмент человеческого IgG.
15. Нуклеиновая кислота по любому из пп.10-14, где человеческий IgG представляет собой человеческий IgG1.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество RAGE-слитого белка по любому из пп.1-9 в фармацевтически приемлемом носителе.
17. Композиция по п.16, составленная в виде инъекционного раствора или в виде стерильного лиофилизированного порошка.
18. Применение слитого белка по любому из пп.1-9 для изготовления лекарственного средства для лечения опосредованного RAGE нарушения у субъекта.
19. Применение по п.18, согласно которому лекарственное средство предназначено для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.
20. Применение по п.18, согласно которому опосредованным RAGE нарушением является симптом диабета или симптом поздних осложнений диабета.
21. Применение по п.20, согласно которому симптомом диабета или симптомом поздних осложнений диабета является диабетическая нефропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая язва стопы, сердечно-сосудистое осложнение или диабетическая невропатия.
22. Применение по п.18, согласно которому опосредованным RAGE нарушением является амилоидоз, болезнь Альцгеймера, рак, воспаление или почечная недостаточность.
23. Применение по п.22, согласно которому воспалением является воспаление, ассоциированное с аутоиммунитетом, воспалительным заболеванием кишечника, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, гипоксией, инсультом, сердечным приступом, геморрагическим шоком, сепсисом, трансплантацией органа или заживлением ран.
Текст
012586 Перекресная ссылка на родственные заявки В настоящей заявке заявлен приоритет, согласно Разделу 35 Кодекса законов США 119(2), по предварительной заявке на патент США с регистрационным номером 60/598362, поданной 3 августа 2004 года. Описание предварительной заявки на патент США 60/598362 включено здесь в качестве ссылки в полном объеме. Область техники, к которой относится данное изобретение Данное изобретение относится к регуляции Рецептора для Продвинутых Гликозилированных Конечных продуктов (RAGE, Receptor for Advanced Glycated Endproducts). Более конкретно, данное изобретение относится к слитым белкам, содержащим полипептид RAGE, способам получения таких слитых белков и применению таких белков для лечения нарушений на основе RAGE. Уровень техники Инкубирование белков или липидов с альдозными сахарами приводит к неферментативному гликозилированию и окислению аминогрупп на белках с образованием аддуктов Амадори. Со временем эти аддукты подвергаются дополнительным перегруппировкам, дегидратациям и сшиванию с другими белками, с образованием комплексов, известных как Продвинутые Конечные Продукты Гликозилирования(AGE). Факторы, которые стимулируют образование AGE, включают в себя замедленное обновление белка (например, как при амилоидозе), накопление макромолекул с высоким содержанием лизина и высокие уровни глюкозы в крови (например, как при диабете) (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761,(1995. Предполагалось, что AGE участвуют в различных нарушениях, в том числе осложнениях, ассоциированных с диабетом и нормальным старением.AGE обнаруживают специфическое и насыщаемое связывание с рецепторами клеточной поверхности на моноцитах, макрофагах, эндотелиальных клетках микроциркуляторных сосудов, клетках гладких мышц, мезангиальных клетках и нейронах. Рецептор для Продвинутых Гликозилированных Конечных Продуктов (RAGE) является членом семейства молекул супергенов иммуноглобулинов. Внеклеточный (N-концевой) домен RAGE включает в себя три района иммуноглобулинового типа: один домен V (вариабельного) типа, за которым следуют два домена С (константного) типа (Neeper et al.,J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96194 (1997. Единственный трансмембранный (прошивающий мембрану) домен и короткий, высокозаряженный цитозольный хвост следуют за внеклеточным доменом. N-концевой, внеклеточный домен может быть выделен протеолизомRAGE или молекулярно-биологическими подходами для генерирования растворимого RAGE (sRAGE),содержащего V- и С-домены.RAGE экспрессируется на множественных типах клеток, включая лейкоциты, нейроны, микроглиальные клетки и эндотелий сосудов (например, Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995. Увеличенные уровни RAGE обнаружены также в стареющих тканях (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457468 (1997 и в диабетической сетчатке, сосудистой сети и почке (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004(1994. Кроме AGE другие соединения могут связываться с RAGE и модулировать RAGE. RAGE связывается со множественными фракционно и структурно различающимися лигандами, включая амилоид бета(А), сывороточный амилоид A (SAA), Продвинутые Конечные Продукты Гликозилирования (AGE),S100 (провоспалительный член семейства кальгранулинов), карбоксиметиллизин (CML), амфотерин иCD11b/CD18 (Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect.,6:1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005); Scmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949955 (2001); Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003. Было показано, что связывание лигандов, таких как AGE, S100/кальгранулин, -амилоид, CML (Nкарбоксиметиллизин) и амфотерин, с RAGE модифицирует экспрессию различных генов. Эти взаимодействия могут затем инициировать механизмы трансдукции сигнала, включая активацию р 38, p21ras,МАР-киназ, фосфорилирования Erk1-2 и активацию транскрипционного медиатора передачи воспалительного сигнала, NF-В (Yen et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001. Например, во многих типах клеток взаимодействие между RAGE и его лигандами может генерировать окислительный стресс, который тем самым приводит к активации чувствительного к свободным радикалам фактора транскрипции NF-B и активации NF-B-регулируемых генов, таких как цитокины IL-1 и TNF-. Кроме того, экспрессияRAGE отрицательно регулируется посредством NF-B и обнаруживает повышенную экспрессию в участках воспаления или окислительного стресса (Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000. Таким образом, восходящая и часто вредная спираль может возбуждаться петлей положительной обратной связи, инициированной связыванием лиганда. Активация RAGE в различных тканях и органах может приводить к ряду патофизиологических последствий. Предполагалось, что RAGE участвует в ряде состояний, включающих в себя: острое и хроническое воспаление (Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999, развитие поздних диабетических осложнений, таких как увеличенная проницаемость сосудов (Wautier et al., J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995, нефропатияcal Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996 и ретинопатия (Hammes et al., Diabetologia, 42:603607 (1999. Предполагалось, что RAGE участвует также в болезни Альцгеймера (Yan et al., Nature,382:685-691 (1996 и опухолевой инвазии и метастазировании (Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000. Несмотря на широкую экспрессию RAGE и его явную плейотропную роль во множественных различных моделях заболеваний, RAGE, по-видимому, не играет важной роли в нормальном развитии. Например, мыши с нокаутом RAGE не имеют очевидного аномального фенотипа, что предполагает, чтоRAGE может играть роль в патологии заболеваний, когда хронически стимулируемое ингибированиеRAGE, по-видимому, не способствует какому-либо нежелательному острому фенотипу (Liliensiek et al., J.Clin. Invest., 113:1641-50 (2004. Противодействие связыванию физиологических лигандов с RAGE может отрицательно регулировать патофизиологические изменения, вызываемые избыточными концентрациями AGE и других лигандов RAGE. Посредством уменьшения связывания эндогенных лигандов с RAGE, симптомы, ассоциированные с RAGE-опосредованными нарушениями, могут быть уменьшены. Растворимый RAGE (sRAGE) способен эффективно противодействовать связыванию лигандов RAGE с RAGE. Однако sRAGE может иметь полупериод существования при введении in vivo, который может быть слишком коротким, чтобы быть терапевтически полезным, для одного или нескольких нарушений. Таким образом, существует потребность в развитии соединений, которые противодействуют связыванию AGE и других физиологических лигандов с рецептором RAGE, причем такие соединения должны иметь желаемый фармакокинетический профиль. Сущность изобретения Варианты осуществления данного изобретения содержат RAGE-слитые белки и способы применения таких белков. Данное изобретение может быть осуществлено различными путями. Варианты осуществления данного изобретения могут содержать слитый белок, содержащий полипептид RAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок содержит сайт связывания лиганда RAGE. Этот слитый белок может дополнительно содержать полипептид RAGE,непосредственно связанный с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или часть этогоCH2-домена. Данное изобретение содержит также способ получения RAGE-слитого белка. В одном варианте осуществления этот способ предусматривает связывание полипептида RAGE со вторым, не-RAGEполипептидом. В одном варианте осуществления полипептид RAGE содержит лигандсвязывающий сайтRAGE. Этот способ может предусматривать связывание полипептида RAGE непосредственно с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или часть этого CH2-домена. В других вариантах осуществления данное изобретение может содержать способы и композиции для лечения RAGE-опосредованного нарушения в субъекте. Этот способ может предусматривать введение слитого белка данного изобретения субъекту. Эта композиция может содержать RAGE-слитый белок данного изобретения в фармацевтически приемлемом носителе. Имеются различные преимущества, которые могут быть связаны с конкретными вариантами осуществления данного изобретения. В одном варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть метаболически стабильными при введении субъекту. Слитые белки данного изобретения могут также проявлять высокоаффинное связывание в отношении лигандов RAGE. В некоторых вариантах осуществления слитые белки данного изобретения связываются с лигандами RAGE с аффинностями в высоком наномолярном - низком микромолярном диапазоне. Посредством связывания с высокой аффинностью с физиологическими лигандами RAGE слитые белки данного изобретения могут быть использованы для уменьшения интенсивности RAGE-опосредованных заболеваний. Слитые белки данного изобретения могут быть также обеспечены в форме белка или форме нуклеиновой кислоты. В одном варианте-примере слитый белок может вводиться системно и оставаться в сосудистой сети для потенциального лечения сосудистых заболеваний, частично опосредуемых RAGE. В другом варианте-примере слитый белок может вводиться локально для лечения заболеваний, в которых лиганды RAGE способствуют патологии заболевания. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, может доставляться в определенный участок с использованием подходящего носителя, такого как вирус или голая ДНК, где транзиторная локальная экспрессия может локально ингибировать взаимодействие между лигандами и рецепторами RAGE. Таким образом, введение может быть транзиторным (например, когда вводят этот слитый белок) или более перманентным по характеру(например, когда слитый белок вводят в виде рекомбинантной ДНК). Имеются дополнительные признаки этого изобретения, которые будут описаны далее. Должно быть понятно, что данное изобретение не ограничивается в его применении подробностями, представленными в следующей формуле изобретения, описании и фигурах. Данное изобретение может иметь другие варианты осуществления и практиковаться или выполняться различными путями. Краткое описание фигур Различные признаки, аспекты и преимущества данного изобретения станут более очевидными со ссылкой на следующие фигуры. Фиг. 1 показывает различные последовательности RAGE в соответствии с дополнительными вари-2 012586 антами данного изобретения: Панель A, SEQ ID NO:1, аминокислотная последовательность для RAGE человека; и SEQ ID NO:2, аминокислотная последовательность для RAGE человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-22; Панель В, SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность дляRAGE человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23; Панель С, SEQ ID NO:4, аминокислотная последовательность sRAGE человека; SEQ ID NO:5, аминокислотная последовательность дляsRAGE человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-22, и SEQ ID NO:6, аминокислотная последовательность sRAGE человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23; Панель D,SEQ ID NO:7, аминокислотная последовательность, содержащая V-домен RAGE человека; SEQ ID NO:8,альтернативная аминокислотная последовательность, содержащая V-домен RAGE человека; SEQ IDNO:9, N-концевой фрагмент V-домена RAGE человека; SEQ ID NO:10, альтернативный N-концевой фрагмент V-домена RAGE человека; SEQ ID NO:11, аминокислотная последовательность для аминокислот 124-221 RAGE человека; SEQ ID NO:12, аминокислотная последовательность для аминокислот 227317 RAGE человека; SEQ ID NO:13, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-123 RAGE человека; Панель Е, SEQ ID NO:14, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-123 RAGE человека; SEQ ID NO:15, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-136 RAGE человека;SEQ ID NO:16, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-136 RAGE человека; SEQ IDNO:17, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-226 RAGE человека; SEQ ID NO:18,аминокислотная последовательность для аминокислот 24-226 RAGE человека; Панель F, SEQ ID NO:19,аминокислотная последовательность для аминокислот 23-251 RAGE человека; SEQ ID NO:20, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-251 RAGE человека; SEQ ID NO:21, междоменный линкер RAGE; SEQ ID NO:22, второй междоменный линкер RAGE; SEQ ID NO:23, третий междоменный линкер RAGE; SEQ ID NO:24, четвертый междоменный линкер RAGE; Панель G, SEQ ID NO:25, ДНК,кодирующая аминокислоты 1-118 RAGE человека; SEQ ID NO:26, ДНК, кодирующая аминокислоты 1123 RAGE человека; и SEQ ID NO:27, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-136 RAGE человека; Панель Н, SEQ ID NO:28, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-230 RAGE человека; и SEQ ID NO:29, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-251 RAGE человека; Панель I, SEQ ID NO:38, частичная аминокислотная последовательность для доменов CH2 и CH3 IgG человека; SEQ ID NO:39, ДНК, кодирующая часть доменовCH2 и CH3 IgG человека; SEQ ID NO:40, аминокислотная последовательность для доменов CH2 и CH3 IgG человека; Панель J, SEQ ID NO:41, ДНК, кодирующая домены CH2 и CH3 IgG человека; SEQ ID NO:42,аминокислотная последовательность для домена CH2 IgG человека; SEQ ID NO: 43, аминокислотная последовательность для домена CH3 IgG человека; и SEQ ID NO:44, пятый междоменный линкер RAGE. Фиг. 2 показывает ДНК-последовательность (SEQ ID NO:30) кодирующего района RAGE-слитого белка (ТТР-4000) в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Кодирующая последовательность 1-753, выделенная жирным шрифтом, кодирует N-концевую последовательность белка RAGE, тогда как последовательность 754-1386 кодирует последовательность белка Fc IgG (1) человека. Фиг. 3 показывает ДНК-последовательность (SEQ ID NO:31) кодирующего района другого RAGEслитого белка (ТТР-3000) в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Кодирующая последовательность 1-408, выделенная жирным шрифтом, кодирует N-концевую последовательность белка RAGE, тогда как последовательность 409-1041 кодирует последовательность белка Fc IgG(1) человека. Фиг. 4 показывает аминокислотные последовательности, SEQ ID NO:32 (ТТР-4000), SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34, которые, каждая, кодируют RAGE-слитый белок из четырех доменов в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения. Последовательность RAGE выделена жирным шрифтом. Фиг. 5 показывает аминокислотные последовательности, SEQ ID NO:35 (ТТР-3000), SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:37, которые, каждая, кодируют RAGE-слитый белок из трех доменов в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения. Последовательность RAGE выделена жирным шрифтом. Фиг. 6, Панель А, показывает сравнение доменов белков в RAGE человека и Fc-белке Ig гамма-1 человека, и точки расщепления, использованные для получения ТТР-3000 (в положении 136) и ТТР-4000(в положении 251) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения; и панель В показывает структуру доменов для ТТР-3000 и ТТР-4000 в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения. Фиг. 7 показывает результаты анализа связывания in vitro для sRAGE и RAGE-слитых белков ТТР 4000 (ТТ 4) и ТТР-3000 (TT3) с амилоидом-бета (А-бета), S100b (S100) и амфотерином (Ampho), в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Фиг. 8 показывает результаты анализа связывания in vitro для RAGE-слитого белка ТТР-4000 (ТТ 4)("Протеин") с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим в себя только реагенты иммунодетектирования ("Только комплекс"), и противодействие такому связыванию посредством антагониста RAGE ("лиганда RAGE") в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобре-3 012586 тения. Фиг. 9 показывает результаты анализа связывания in vitro для RAGE-слитого белка ТТР-3000 (TT3)("Протеин") с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим в себя только реагенты иммунодетектирования ("Только комплекс"), и противодействие такому связыванию посредством антагониста RAGE ("лиганда RAGE") в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Фиг. 10 показывает результаты анализа на основе клеток, измеряющего ингибирование S100bRAGE-индуцированного продуцирования TNF- RAGE-слитыми белками ТТР-3000 (TT3) и ТТР-4000(ТТ 4) и sRAGE в соответствии с одним вариантом данного изобретения. Фиг. 11 показывает фармакокинетический профиль для RAGE-слитого белка ТТР-4000 в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения, в котором каждая кривая представляет отличающееся животное в одних и тех же экспериментальных условиях. Фиг. 12 показывает относительные уровни высвобождения TNF- из клеток ТНР-1 вследствие стимуляции RAGE-слитым белком ТТР-4000 и стимуляции IgG человека как меру воспалительной реакции в соответствии с одним вариантом данного изобретения. Фиг. 13 показывает применение RAGE-слитого белка ТТР-4000 для уменьшения рестеноза у диабетических животных в соответствии с альтернативными вариантами данного изобретения, где панель А показывает, что RAGE-слитый белок ТТР-4000 уменьшал отношение интима/медиа в сравнении с отрицательным контролем (IgG), а панель В показывает, что RAGE-слитый белок ТТР-4000 уменьшал пролиферацию клеток гладких мышц зависимым от дозы образом. Фиг. 14 показывает применение RAGE-слитого белка ТТР-4000 для уменьшения образования амилоида и когнитивной дисфункции у животных с болезнью Альцгеймера (AD) в соответствии с альтернативными вариантами данного изобретения, где панель А показывает, что RAGE-слитый белок ТТР-4000 уменьшал амилоидную нагрузку в головном мозге, а панель В показывает, что RAGE-слитый белок ТТР 4000 улучшал когнитивную функцию. Фиг. 15 показывает кривые насыщения-связывания ТТР-4000 с различными иммобилизованными известными лигандами RAGE в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Подробное описание Для целей этого описания, если нет других указаний, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакций и т.д., используемые в этом описании, должны пониматься как модифицируемые во всех случаях термином приблизительно. Таким образом, если нет противоположного указания, численные параметры, представленные в следующем описании, являются приближениями, которые могут варьироваться в зависимости от желаемых свойств, которые авторы стремятся получить с использованием данного изобретения. И, наконец, и не в качестве попытки ограничения применения доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый численный параметр должен, по меньшей мере, рассматриваться в свете количества сообщенных значимых чисел и с применением простых способов округления. Не возражая против того, что численные диапазоны и параметры, устанавливающие широкий объем данного изобретения, являются приближенными, численные величины, представленные в конкретных примерах, авторы сообщают с максимальной возможной точностью. Однако любая численная величина неотъемлемо содержит определенные ошибки, обязательно происходящие из стандартных отклонений,обнаруживаемых в соответствующих измерениях испытаний. Кроме того, следует понимать, что все описанные здесь диапазоны включают в себя любые и все поддиапазоны, заключенные в них. Например,следует рассматривать, что указанный диапазон 1-10 включает в себя любые и все поддиапазоны между (и включительно) минимальной величиной 1 и максимальной величиной 10; т.е. все поддиапазоны,начиная с минимальной величины 1 или более, например 1-6,1, и кончая максимальной величиной 10 или менее, например 5,5-10. Кроме того, любая ссылка, о которой говорится, что она является включенной здесь, должна пониматься как ссылка, включенная в ее полном объеме. Дополнительно следует отметить, что используемые в этом описании единственные формы "a", "an" и "the" включают в себя множественные референты (относящиеся к ним слова), если они не ограничиваются явно и недвусмысленно одним референтом. Термин или используется взаимозаменяемо с термином и/или, если в контексте нет другого указания. Термины часть и фрагмент используются также взаимозаменяемо для обозначения частей полипептида, нуклеиновой кислоты или другой молекулярной конструкции. В данном контексте термин против хода (слева, выше избранного остатка) относится к остатку,который является N-концевым относительно второго остатка, когда эта молекула является белком, или 5' относительно второго остатка, когда эта молекула является нуклеиновой кислотой. В этом контексте также, термин по ходу (справа, ниже избранного остатка) относится к остатку, который является Сконцевым относительно второго остатка, когда эта молекула является белком, или 3' относительно второго остатка, когда эта молекула является нуклеиновой кислотой. Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют-4 012586 значение, обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в данной области. Практики, в частности, отсылаются к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel) в отношении определений и терминов данной области. Аббревиатуры для аминокислотных остатков являются стандартными 3 буквенными и/или 1-буквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычных L-аминокислот. Нуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотид, такой как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Этот термин включает в себя одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты и РНК и ДНК, полученные из нуклеотидных и нуклеозидных аналогов. Термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может быть использована для транспорта второй нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте осуществления этот вектор делает возможной репликацию ДНК-последовательностей, встроенных в этот вектор. Этот вектор может содержать промотор для усиления экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, в некоторых клетках-хозяевах. Векторы могут реплицироваться автономно (внехромосомно) или могут быть интегрированы в хромосому клетки-хозяина. В одном варианте осуществления вектор может быть экспрессионным (экспрессирующим) вектором, способным продуцировать белок, произведенным из по меньшей мере части последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в этот вектор. Как известно в данной области, условия для гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот могут быть описаны как находящиеся в диапазоне от низкой до высокой строгости. Обычно, условиями гибридизации высокой строгости называют промывку гибридов в низкосолевом буфере при высоких температурах. Гибридизация может состоять в фильтровании связанной ДНК с использованием условий гибридизации, стандартных в данной области, таких как 0,5 М NaHPO4, 7% додецилсульфат натрия (ДСН), при 65 С и промывании в 0,25 М NaHPO4, 3,5% ДСН с последующим промыванием 0,1SSC/0,l% ДСН при температуре в диапазоне от комнатной температуры до 68 С в зависимости от длины зонда (см., например, Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2,John WileySons, N.Y.). Например, промывание высокой строгости предусматривает промывание в 6SSC/0,05% пирофосфат натрия при 37 С для олигонуклеотидного зонда из 14 оснований, или при 48 С для олигонуклеотидного зонда из 17 оснований, или при 55 С для олигонуклеотидного зонда из 20 оснований, или при 60 С для олигонуклеотидного зонда из 25 оснований, или при 65 С для нуклеотидного зонда с длиной приблизительно 250 нуклеотидов. Зонды нуклеиновых кислот могут быть помечены радионуклеотидами концевым мечением, например [-32 Р]АТР, или включением радиоактивно меченых нуклеотидов, таких как [-32P]dCTP, случайным мечением праймера. Альтернативно, зонды могут быть помечены включением биотинилированных или меченых флуоресцеином нуклеотидов, и этот зонд может быть детектирован с использованием стрептавидина или антител против флуоресцеина. В данном контексте малые органические молекулы являются молекулами с молекулярной массой, меньшей чем 2000 Да, которые содержат по меньшей мере один атом углерода. Полипептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для описания молекул белков, которые содержат частичные или полноразмерные белки. Термин слитый белок относится к белку или полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, полученную из двух или более белков. Слитый белок может также включать в себя связывающие районы аминокислот между аминокислотными частями, полученными из отдельных белков. В данном контексте "не-RAGE-полипептид" является любым полипептидом, который не произведен из RAGE или его фрагмента. Такие не-RAGE-полипептиды включают в себя пептиды иммуноглобулина, димеризующие полипептиды, стабилизирующие полипептиды, амфифильные пептиды или полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые обеспечивают метки для нацеливания или очистки этого белка. В данном контексте белки иммуноглобулинов могут включать в себя тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть. В одном варианте осуществления частью тяжелой цепи может быть Fc-фрагмент или его часть. В данном контексте Fc-фрагмент содержит шарнирный полипептид тяжелой цепи и домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, в мономерной или димерной форме. Или CH1 и Fcфрагмент могут быть использованы в качестве иммуноглобулинового полипептида. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD,IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Пример биологической активности, которая может быть изменена, включает в себя уменьшение способности изотипа связываться с некоторыми Fc-рецепторами, например, модификацией шарнирной области. Термины идентичность или процентная идентичность относится к идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя последовательностями нуклеиновых кислот. Процентная идентичность может быть определена сопоставлением двух по-5 012586 следовательностей и относится к количеству идентичных остатков (например, аминокислот или нуклеотидов) в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Сопоставление и сравнение последовательностей могу проводиться с использованием алгоритмов, стандартных в данной области (например, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443;Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444), или с использованием компьютеризованных версий этих алгоритмов (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group,575 Science Drive, Madison, WI), публично доступных в виде BLAST и FASTA. Для сравнения последовательностей может быть использована также программа ENTREZ, доступная через National Institutes ofHealth, Bethesda MD. В одном варианте осуществления, процентная идентичность двух последовательностей может быть определена с использованием GCG с весом гэпа 1, так что гэп каждой аминокислоты является взвешенным, как если бы было несовпадение единственной аминокислоты между этими двумя последовательностями. В данном контексте термин консервативные остатки относится к аминокислотам, которые являются одинаковыми среди множества белков, имеющих одну и ту же структуру и/или функцию. Область консервативных остатков может быть важной для структуры и функции белка. Таким образом, смежные консервативные остатки, идентифицированные в трехмерном белке, могут быть важными для структуры и функции белка. Для нахождения консервативных остатков или консервативных районов трехмерной структуры может быть выполнено сравнение последовательностей для одних и тех же или сходных белков из разных видов или индивидуумов одного и того же вида. В данном контексте термин гомолог обозначает полипептид, имеющий степень гомологии с аминокислотной последовательностью дикого типа. Сравнения гомологии могут проводиться визуально или,более часто, с использованием легко доступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитывать процентную гомологию между двумя или более последовательностями (например, Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 80:726-730). Например, гомологичными последовательностями могут считаться последовательности, которые включают в себя аминокислотные последовательности, которые в альтернативных вариантах осуществления являются идентичными по меньшей мере на 75%, идентичными на 85%, идентичными на 90%, идентичными на 95% или идентичными на 98% относительно друг друга. В данном контексте домен полипептида или белка содержит район вдоль полипептида или белка,который содержит независимую единицу. Домены могут определяться по структуре, последовательности и/или биологической активности. В одном варианте осуществления домен полипептида может содержать район белка, который укладывается таким образом, что он является по существу независимым от остальной части этого белка. Домены могут быть идентифицированы с использованием баз данных доменов,таких как, но не только, PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES,SAMRT и PROCLASS. В данном контексте иммуноглобулиновым доменом является последовательность аминокислот,которая является структурно гомологичной, или идентичной, домену иммуноглобулина. Длина этой последовательности аминокислот иммуноглобулинового домена может быть любой длиной. В варианте осуществления иммуноглобулиновый домен может быть меньшим по длине, чем 250 аминокислот. В варианте-примере иммуноглобулиновый домен может иметь длину приблизительно 80-150 аминокислот. Например, вариабельный район и районы CH1, CH2 и CH3 IgG, каждый, являются иммуноглобулиновыми доменами. В другом примере вариабельный район, районы CH1, CH2, CH3 и CH4 IgM, каждый, являются иммуноглобулиновыми доменами. В данном контексте иммуноглобулиновый домен RAGE является последовательностью аминокислот из белка RAGE, которая является структурно гомологичной, или идентичной, домену иммуноглобулина. Например, иммуноглобулиновый домена RAGE может содержать V-домен RAGE, Ig-подобный домен С 2-типа 1 RAGE ("С 1-домен") или Ig-подобный домен С 2-типа 2 RAGE ("С 2-домен"). В данном контексте "междоменный линкер" содержит полипептид, который соединяет два домена вместе. Fc-шарнирная часть является примером междоменного линкера в IgG. В данном контексте термин "непосредственно связанный" идентифицирует ковалентную связь между двумя различными группами (например, последовательностями нуклеиновых кислот, полипептидами, доменами полипептидов), которая не имеет промежуточных атомов между двумя группами, которые связываются. В данном контексте "лигандсвязывающий домен" обозначает домен белка, ответственный за связывание лиганда. Термин лигандсвязывающий домен включает в себя гомологи лигандсвязывающего домена или его части. В этом отношении, произвольные аминокислотные замены могут быть произведены в лигандсвязывающем сайте на основании сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков, пока сохраняется специфичность связывания этого лигандсвязывающего домена. В данном контексте "лигандсвязывающий сайт" содержит остатки в белке, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом, или остатки, участвующие в позиционировании этого лигнада в тесной близости к тем остаткам, которые непосредственно взаимодействуют с этим лигандом. Взаимодействие-6 012586 остатков в лигандсвязывающем сайте может определяться пространственной близостью этих остатков к лиганду в модели или структуре. Термин лигандсвязывающий сайт включает в себя гомологи лигандсвязывающего сайта или его части. В этом отношении произвольные аминокислотные замены могут быть произведены в лигандсвязывающем сайте на основании сходства в полярности, заряде, растворимости,гидрофобности или гидрофильности остатков, пока сохраняется специфичность связывания этого лигандсвязывающего сайта. Лигандсвязывающий сайт может существовать в одном или нескольких лигандсвязывающих доменах белка или полипептида. В данном контексте термин взаимодействуют относится к состоянию близости между лигандом или соединением, или их частями или фрагментами, и частью второй представляющей интерес молекулы. Это взаимодействие может быть нековалентным, например, в результате образования водородной связи, вандерваальсовых взаимодействий или электростатических или гидрофобных взаимодействий,или оно может быть ковалентным. В данном контексте лиганд обозначает молекулу, или соединение, или молекулярную частицу,которые взаимодействуют с лигандсвязывающим сайтом, в том числе субстраты или аналоги или их части. Как описано здесь, термин лиганд может обозначать соединения, которые связываются с представляющим интерес белком. Лигандом может быть агонист, антагонист или модулятор. Или лиганд может не иметь биологического действия. Лиганды могут включать в себя, но не ограничиваются ими, ингибиторы с малыми молекулами. Эти малые молекулы могут включать в себя пептиды, пептидомиметики,органические соединения и т.п. Лиганды могут включать в себя также полипептиды и/или белки. В данном контексте "модуляторное соединение" обозначает молекулу, которая изменяет или переделывает биологическую активность представляющей интерес молекулы. Модуляторное соединение может увеличивать или уменьшать активность или изменять физические или химические характеристики или функциональные или иммунологические свойства представляющей интерес молекулы. Для RAGE,модуляторное соединение может увеличивать или уменьшать активность или изменять характеристики или функциональные или иммунологические свойства RAGE или его части. Модуляторное соединение может включать в себя природные и/или химически синтезированные или искусственные пептиды, модифицированные пептиды (например, фосфопептиды), антитела, углеводы, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, гликолипиды, гетероциклические соединения, нуклеозиды или нуклеотиды или их части и малые органические или неорганические молекулы. Модуляторное соединение может быть эндогенным физиологическим соединением, или оно может быть природным или синтетическим соединением. Или это модуляторное соединение может быть малой органической молекулой. Термин "модуляторное соединение" включает в себя также химически модифицированные лиганд или соединение и включает в себя изомеры и рацемические формы."Агонист" является соединением, которое связывается с рецептором с образованием комплекса, который индуцирует фармакологическую реакцию, специфическую в отношении участвующего рецептора."Антагонист" является соединением, которое связывается с агонистом или рецептором с образованием комплекса, который не вызывает фармакологической реакции и может ингибировать биологическую реакцию, индуцированную агонистом. Таким образом, агонисты RAGE могут связываться с RAGE и стимулировать RAGE-опосредуемые клеточные процессы, а антагонисты RAGE могут ингибировать RAGE-опосредуемые клеточные процессы, препятствуя их стимуляции агонистом RAGE. Например, в одном варианте осуществления клеточный процесс, стимулируемый агонистами RAGE, включает в себя активацию транскрипции гена TNF-. Термин "пептидомиметики" обозначает структуры, которые служат в качестве заменителей пептидов во взаимодействиях между молекулами (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252). Пептидомиметики могут включать в себя синтетические структуры, которые могут содержать или могут не содержать аминокислоты и/или пептидные связи, но сохраняют структурные и функциональные признаки пептида или агониста или антагониста. Пептидомиметики включают в себя также пептоиды, олигопептоиды (Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367); и пептидные библиотеки, содержащие пептиды сконструированной длины, представляющие все возможные последовательности аминокислот, соответствующие пептиду, агонисту или антагонисту данного изобретения. Термин излечение относится к улучшению симптома заболевания или нарушения и может включать в себя излечение данного нарушения, по существу предотвращение возникновения этого нарушения или улучшение состояния субъекта. Термин лечение обозначает в данном контексте полный спектр способов лечения для конкретного нарушения, от которого страдает пациент, в том числе ослабление одного симптома или большинства симптомов, вызываемых этим нарушением, излечение конкретного нарушения или предотвращение возникновения этого нарушения. В данном контексте термин EC50 определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% измеренного биологического действия. Например, EC50 терапевтического агента, имеющего измеримое биологическое действие, может быть величиной, при которой этот агент вызывает 50% этого биологического действия. В данном контексте термин "IC50" определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% ингибированию измеряемого действия. Например, IC50 антагониста связывания RAGE может быть вели-7 012586 чиной, при которой этот антагонист уменьшает связывание лиганда с лигандсвязывающим сайтом RAGE на 50%. В данном контексте "эффективное количество" обозначает количество агента, которое является эффективным для получения желаемого действия в субъекте. Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое будет индуцировать терапевтическую реакцию животного или человека, которую стремятся получить. Фактическая доза, которая содержит это эффективное количество, может зависеть от способа введения, размера и здоровья субъекта, подлежащего лечению нарушения и т.п. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" может относиться в данном контексте к соединениям и композициям, которые пригодны для применения у субъектов-людей и субъектов-животных,например, к терапевтическим композициям, вводимым для лечения RAGE-опосредуемого нарушения или заболевания. Термин "фармацевтическая композиция" обозначает в данном контексте композицию, которая может вводиться млекопитающему-хозяину, например, перорально, парентерально, топически, ингаляцией,в виде спрея, интраназально или ректально, в унифицированных дозированных готовых формах, содержащих общепринятые нетоксичные носители, разбавители, адъюванты, эксципиенты и т.п. Термин "парентеральные" включает в себя, в данном контексте, подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутриполостные инъекции или инфузионные способы.RAGE-слитые белки Варианты осуществления данного изобретения включают в себя RAGE-слитые белки, способы получения таких слитых белков и способы применения таких слитых белков. Данное изобретение может быть осуществлено различными путями. Например, варианты осуществления данного изобретения обеспечивают слитые белки, содержащие полипептид RAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом. В одном варианте осуществления слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт RAGE. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее N-концевой домен слитого белка. Лигандсвязывающий сайтRAGE может содержать V-домен RAGE или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт RAGE содержит SEQ ID NO:9 или последовательность, идентичную ей на 90%, или SEQ IDNO:10 или последовательность, идентичную ей на 90%. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит часть по меньшей мере одного из доменов CH2 или CH3 IgG человека. Белок или полипептид RAGE может содержать полноразмерный белок RAGE человека (например,SEQ ID NO:1) или фрагмент RAGE человека. В данном контексте, фрагмент полипептида RAGE имеет по меньшей мере 5 аминокислот в длину, может быть большим, чем 30 аминокислот в длину, но является меньшим, чем полная аминокислотная последовательность. В альтернативных вариантах осуществления полипептид RAGE может содержать последовательность, которая является на 70, или 80, или 85, или 90% идентичной RAGE человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептид RAGE может содержать RAGE человека или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1992. Или RAGE человека может содержать полноразмерный RAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:2 или SEQ IDNO:3) (фиг. 1 А и 1 В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать sRAGE (например, SEQ ID NO:4), полипептид, на 90% идентчиный sRAGE, или фрагмент sRAGE. В данном контексте sRAGE является белкомRAGE, который не включает в себя трансмембранный район или цитоплазматический хвост (Park et al.,Nature Med., 4:1025-1031 (1998. Например, полипептид RAGE может содержать sRAGE человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al.,(1992. Или полипептид RAGE может содержать sRAGE человека с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) (фиг. 1 С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок RAGE может содержать V-домен RAGE (например, SEQID NO:7 или SEQ ID NO:8: фиг. ID) (Neeper et al., (1992); Schmidt et al. (1997. Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная V-домену RAGE или его фрагменту. Или белок RAGE может содержать фрагмент V-домена RAGE (например, SEQ ID NO:9 или SEQ IDNO:10: фиг. 1D). В одном варианте осуществления белок RAGE может содержать лигандсвязывающий сайт. В одном варианте осуществления этот лигандсвязывающий сайт может содержать SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления этот фрагмент RAGE является синтетическим пептидом. Таким образом, полипептид RAGE, используемый в слитых белках данного изобретения, может содержать фрагмент полноразмерного RAGE. Как известно в данной области, RAGE содержит три имму-8 012586 ноглобулинподобных полипептидных домена, V-домен и С 1- и С 2-домены, каждый из которых связан с каждым другим междоменным линкером. Полноразмерный RAGE включает в себя также трансмембранный полипептид и цитоплазматический хвост справа (С-концевой) от С 2-домена и связанный с С 2 доменом. В одном варианте осуществления полипептид RAGE не включает в себя никакой сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного RAGE. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-116 RAGE человека (SEQ IDID NO:8) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 124-221 RAGE человека (SEQ ID NO:11) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С 1-домену RAGE. В другом варианте осуществления полипептид RAGE может содержать аминокислоты 227-317 RAGE человека (SEQ ID NO:12) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С 2-домену RAGE человека. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-123 RAGE человека (SEQ ID NO:13) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-123 RAGE человека (SEQ ID NO:14) или последовательность на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE человека и междоменному линкеру справа. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-226 RAGE человека (SEQ IDID NO:18) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену, С 1-домену и междоменному линкеру, связывающему эти два домена. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-339 RAGE человека (SEQ ID NO:5) или последовательность, на 90% идентичную ей, или 24-339 RAGE человека (SEQ ID NO:6) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую sRAGE (т.е. кодирующую V-, С 1- и С 2-домены и междоменные линкеры). Или могут быть использованы фрагменты каждой из этих последовательностей. Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид слитого белка может содержать полипептид, произведенный из иммуноглобулина. В одном варианте осуществления этот иммуноглобулиновый полипептид может содержать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть (т.е. фрагмент). Например, фрагмент тяжелой цепи может содержать полипептид, произведенный из Fc-фрагмента иммуноглобулина, где этот Fc-фрагмент содержит шарнирный полипептид тяжелой цепи и домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина в виде мономера. Эта тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4(4), IgA1 (1), IgA2 (2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека или части любого,или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены CH2 иCH3 IgG1 человека или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40.Fc-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной in vivo. Таким образом, в одном варианте осуществления, RAGE-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер,полученный из RAGE, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина. Таким образом, в одном варианте осуществления слитый белок может дополнительно содержать полипептид RAGE, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим домен CH2 иммуноглобулина, или фрагмент, или часть домена CH2 иммуноглобулина. В одном варианте осуществления этот домен CH2, или его фрагмент, содержит SEQ ID NO:42. В одном варианте осуществления полипептидRAGE может содержать лигандсвязывающий сайт. Лигандсвязывающий сайт RAGE может содержать Vдомен RAGE или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт RAGE содержитSEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Полипептид RAGE, используемый в слитых белках данного изобретения, может содержать иммуноглобулиновый домен RAGE. Дополнительно или альтернативно, этот фрагмент RAGE может содержать междоменный линкер. Или полипептид RAGE может содержать иммуноглобулиновый доменRAGE, связанный с левым (т.е. более близким к N-концу) или правым (т.е. более близким к С-концу) междоменным линкером. Еще в одном варианте осуществления полипептид RAGE может содержать два(или более) иммуноглобулиновых домена RAGE, каждый из которых связан с каждым другим междоменным линкером. Кроме того, полипептид RAGE может содержать множественные иммуноглобулиновые домены RAGE, связанные друг с другом одним или несколькими междоменными линкерами и имеющие концевой междоменный линкер, присоединенный к N-концевому иммуноглобулиновому домену RAGE и/или С-концевому иммуноглобулиновому домену. Дополнительные комбинации иммуноглобулиновых доменов RAGE и междоменных линкеров находятся в объеме данного изобретения. В одном варианте осуществления полипептид RAGE содержит междоменный линкер RAGE, свя-9 012586 занный с иммуноглобулиновым доменом RAGE таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен CH2 иммуноглобулина, или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен CH2 иммуноглобулина, может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. Например, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3, или их часть,IgG1 человека, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Как описано выше, слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из RAGE. Полипептид RAGE, содержащий междоменный линкер, связанный с доменом полипептида RAGE, может также содержать фрагмент полноразмерного белка RAGE. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-136 RAGE человека (SEQ ID NO:15) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-136 RAGE человека (SEQ ID NO:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE и междоменному линкеру справа. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-251 RAGE человека (SEQ IDID NO:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену, С 1-домену,междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру справа от С 1. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fcполипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер RAGE, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом RAGE и вторым междоменным линкером RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с Сконцевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой иммуноглобулинового домена CH2. В одном варианте осуществления RAGE-слитый белок из четырех доменов может содержать SEQ ID NO:32. В альтернативных вариантах осуществления RAGE-слитый белок из четырех доменов содержит SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34. Альтернативно слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен RAGE, связанный через междоменный линкер RAGE с N-концевой аминокислотой иммуноглобулинового доменаCH2 или частью иммуноглобулинового домена CH2. В одном варианте осуществления RAGE-слитый белок из трех доменов может содержать SEQ ID NO:35. В альтернативных вариантах осуществления,RAGE-слитый белок из трех доменов может содержать SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37. Междоменный линкерный фрагмент RAGE может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена RAGE и, следовательно, связана с ним. Например, для V-домена RAGE этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от V-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерногоRAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:21. Так, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит SEQ ID NO:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного RAGE. Или могут быть использованы фрагменты SEQ ID NO:21 с делецией, например, 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична, или на 80% идентична, или на 90% идентична SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:23. Для С 1-домена RAGE этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С 1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного RAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:22. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:22 с делецией, например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер RAGE может содержать SEQ IDNO:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать SEQ IDNO:44, соответствующую аминокислотам 318-342 RAGE. Способы получения RAGE-слитых белков Данное изобретение относится также к способу получения RAGE-слитого белка. Таким образом, в- 10012586 одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения RAGE-слитого белка, предусматривающему стадию ковалентного связывания полипептида RAGE, связанного со вторым,не-RAGE-полипептидом, где полипептид RAGE содержит лигандсвязывающий сайт RAGE. Например,эти связанные полипептид RAGE и второй, нe-RAGE-полипептид, могут кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Этот способ может дополнительно предусматривать стадию включения этой конструкции ДНК в экспрессирующий вектор. Этот способ может также предусматривать стадию введения этого экспрессирующего вектора в клетку-хозяина. Например, варианты данного изобретения обеспечивают слитые белки, содержащие полипептидRAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт RAGE. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее N-концевой домен слитого белка. Лигандсвязывающий сайт RAGE может содержать V-домен RAGE или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайтRAGE содержит SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит часть по меньшей мере одного из доменов CH2 или CH3 IgG человека. Этот слитый белок может быть сконструирован способами рекомбинантных ДНК. Например, в одном варианте осуществления данное изобретение может содержать выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид RAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может содержать лигандсвязывающий сайт RAGE. Белок или полипептид RAGE может содержать полноразмерный RAGE (например, SEQ ID NO:1) или фрагмент RAGE человека. В одном варианте осуществления полипептид RAGE не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного RAGE (SEQ ID NO:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид RAGE может содержать последовательность на 70, или 80, или 90% идентичную RAGE человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептидRAGE может содержать RAGE человека или его фрагмент с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1992. Или RAGE человека может содержать полноразмерныйRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3) (фиг. 1 А и 1 В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать sRAGE (например, SEQ ID NO:4), полипептид, на 90% идентичный sRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE может содержать sRAGE человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1997. Или RAGE человека может содержать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ IDNO:5 или SEQ ID NO:6) (фиг. 1 С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок RAGE может содержать V-домен (например, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8; фиг. 1D). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная V-домену или его фрагменту. Или белок RAGE может содержать фрагмент RAGE, содержащий часть V-домена RAGE (например, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, фиг. 1D). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ IDNO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагментRAGE является синтетическим пептидом. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ IDNO:25, кодирующую аминокислоты 1-118 RAGE человека, или ее фрагмент. Например, последовательность, содержащая нуклеотиды 1-348 SEQ ID NO:25, может быть использована для кодирования аминокислот 1-116 RAGE человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать SEQ ID NO:26 для кодирования аминокислот 1-123 RAGE человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать SEQ ID NO:27 для кодирования аминокислот 1-136 RAGE человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержатьSEQ ID NO:28 для кодирования аминокислот 1-230 RAGE человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать SEQ ID NO:29 для кодирования аминокислот 1-251 RAGE человека. Или фрагменты этих последовательностей нуклеиновых кислот могут быть использованы для кодирования фрагментов полипептида RAGE. Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3),IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека или части лю- 11012586 бого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:39 или SEQFc-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной in vivo. Таким образом, в одном варианте осуществления RAGE-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из RAGE, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина. Например, в одном варианте осуществления слитый белок может кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Этот способ может также предусматривать стадию включения ДНК-конструкции в экспрессирующий вектор. Этот способ может также включать в себя трансфекцию этого экспрессирующего вектора в клетку-хозяина. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения RAGE-слитого белка, предусматривающему стадию ковалентного связывания полипептида RAGE с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или часть CH2-домена иммуноглобулина. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт RAGE. Лигандсвязывающий сайт RAGE может содержать V-домен RAGE или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт RAGE содержит SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Например, в одном варианте осуществления данное изобретение содержит нуклеиновую кислоту,кодирующую полипептид RAGE, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления этот CH2-домен, или его фрагмент, содержит SEQ ID NO:42. Этот второй полипептид может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека. В качестве варианта-примера, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:39 или SEQ ID NO:41. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может содержать междоменный линкерRAGE, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера,а С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен CH2 иммуноглобулина, или его фрагмент. Полипептид,содержащий домен CH2 иммуноглобулина, может содержать полипептид, содержащий домены CH2 и CH3IgG1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. Например, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека, или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из RAGE. Полипептид RAGE, содержащий междоменный линкер, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE, может также содержать фрагмент полноразмерного белка RAGE. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер RAGE, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом RAGE и вторым междоменным линкером RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с Сконцевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2, или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-251 RAGE человека (SEQ ID NO:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-251 RAGE человека (SEQ ID NO:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену, С 1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С 1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты,содержащая SEQ ID NO:30 или ее фрагмент, может кодировать RAGE-слитый белок из четырех доменов. Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен RAGE, связанный через междоменный линкер RAGE с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, этот полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-136 RAGE человека (SEQ ID NO:15) или последовательность, на 90% идентичную ей,или аминокислоты 24-136 RAGE человека (SEQ ID NO:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID NO:31 или ее фрагмент, может кодироватьRAGE-слитый белок из трех доменов.- 12012586 Междоменный линкерный фрагмент RAGE может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена RAGE и, следовательно, связана с ним. Например, для V-домена RAGE, этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от V-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерногоRAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит SEQ ID NO:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного RAGE. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:21 с делецией, например, 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична,или на 80% идентична, или на 90% идентична SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:23. Для С 1-домена RAGE этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С 1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного RAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:22. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:22 с делецией, например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер RAGE может содержать SEQ IDNO:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать SEQ IDNO:44, соответствующую аминокислотам 318-342 RAGE. Этот способ может дополнительно предусматривать стадию включения конструкции ДНК в экспрессирующий вектор. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение относится к экспрессирующему вектору, который кодирует слитый белок, содержащий полипептид RAGE, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или часть CH2-домена иммуноглобулина. В одном варианте осуществления полипептид RAGE содержит конструкции, такие как описанные здесь, имеющие междоменный линкер RAGE, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера, а С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего CH2-домен иммуноглобулина или его часть. Например, экспрессирующий вектор, используемый для трансфекции клеток, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:30, или ее фрагмент, или SEQ IDNO:31, или ее фрагмент. Кроме того, этот способ может дополнительно предусматривать стадию трансфекции клетки экспрессирующим вектором данного изобретения. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение содержит клетку, трансфицированную экспрессирующим вектором, который экспрессировал RAGE-слитый белок данного изобретения, так что эта клетка экспрессирует слитый белок, содержащий полипептид RAGE, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или часть CH2-домена иммуноглобулина. В одном варианте осуществления полипептид RAGE содержит конструкции, такие как конструкции, описанные выше, имеющие междоменный линкер RAGE,связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера, а С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего CH2-домен иммуноглобулина или его часть. Например, экспрессирующий вектор,используемый для трансфекции клеток, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQID NO:30, или ее фрагмент, или SEQ ID NO:31, или ее фрагмент. Например, могут быть сконструированы плазмиды для экспрессии слитых белков RAGE-IgG Fcслиянием различных длин 5'-кДНК-последовательности RAGE человека с 3'-кДНК-последовательностьюIgG1 Fc (1) человека. Эти последовательности экспрессионной кассеты могут быть встроены в экспрессирующий вектор, такой как экспрессирующий вектор pcDNA3.1 (Invitrogen, СА), с использованием стандартных рекомбинантных способов. Этот способ может также включать в себя трансфекцию экспрессирующего вектора в клеткухозяина. В одном варианте осуществления рекомбинант может быть трансфицирован в клетки яичника китайского хомячка и оптимизирован для экспрессии. В альтернативных вариантах осуществления эти клетки могут продуцировать 0,1-20 г/л, или 0,5-10 г/л, или приблизительно 1-2 г/л. Как известно в данной области, такие конструкции нуклеиновых кислот могут быть модифицированы мутацией, например, посредством ПЦР-амплификации нуклеиновой кислоты-матрицы с праймерами, содержащими представляющую интерес мутацию. Таким путем могут быть сконструированы полипептиды, имеющие варьирующуюся аффинность в отношении лигандов RAGE. В одном варианте осуществления мутированные последовательности могут быть на 90% или более идентичными с исходной- 13012586 ДНК. Такие варианты могут включать в себя нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются при строгих условиях (т.е. эквивалентных температурам, на приблизительно 20-27 С более низким, чем температура плавления (Tm) ДНК-дуплекса в 1 М соли). Кодирующая последовательность может быть экспрессирована трансфекцией экспрессирующего вектора в подходящего хозяина. Например, рекомбинантные векторы могут быть стабильно трансфицированы в клетки яичника китайского хомячка (СНО), и клетки, экспрессирующие слитый белок, могут быть отобраны и клонированы. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие рекомбинантную конструкцию, отбирают на кодируемую плазмидой устойчивость к неомицину, с использованием антибиотика G418. Индивидуальные клоны могут быть отобраны, и клоны, экспрессирующие высокие уровни рекомбинантного белка, детектированные при помощи Вестерн-блот-анализа клеточного супернатанта, могут быть размножены, и продукт этого гена может быть очищен аффинной хроматографией с использованием Белок А-колонок. Варианты проб рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые кодируют слитые белки данного изобретения, показаны на фигурах 2-5. Например, как описано выше, слитый белок, продуцируемый рекомбинантной ДНК-конструкцией, может содержать полипептид RAGE, слитый со вторым, не-RAGEполипептидом. Этот слитый белок может содержать два домена, полученные из белка RAGE, и два домена, полученные из иммуноглобулина. Пример конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, ТТР-4000 (ТТ 4), имеющий этот тип структуры, показан в виде фиг. 2 (SEQ ID NO:30). Как показано на фиг. 2, кодирующая последовательность 1-743 (выделенная жирным шрифтом), кодирует Nконцевую последовательность RAGE, тогда как последовательность 754-1386 кодирует последовательность белка Fc IgG. Происходящий из SEQ ID NO:30 или последовательности, на 90% идентичной ей, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность из четырех доменов SEQ ID NO:32 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34) (фиг. 4). На фиг. 4 аминокислотная последовательность RAGE выделена жирным шрифтом. Иммуноглобулиновая последовательность является CH2- и CH3-иммуноглобулиновыми доменами IgG. Как показано на фиг. 6 В,первые 251 аминокислот полноразмерного RAGE-слитого белка ТТР-4000 содержат в качестве последовательности полипептида RAGE сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-22/23,V-домен иммуноглобулина (в том числе лигандсвязывающий сайт), содержащий аминокислоты 23/24116, междоменный линкер, содержащий аминокислоты 117-123, второй иммуноглобулиновый домен(С 1), содержащий аминокислоты 124-221, и справа междоменный линкер, содержащий аминокислоты 222-251. В одном варианте осуществления слитый белок может необязательно содержать второй иммуноглобулиновый домен RAGE. Например, слитый белок может содержать один иммуноглобулиновый домен, происходящий из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, происходящих из Fc-полипептида человека. Пример конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей этот тип слитого белка, показан в виде фиг. 3 (SEQ ID NO:31). Как показано на фиг. 3, кодирующая последовательность, содержащая нуклеотиды 1-408 (выделенные жирным шрифтом), кодирует N-концевую последовательность белка RAGE,тогда как последовательность, содержащая нуклеотиды 409-1041, кодирует последовательность белка FcIgG1 (1). Происходящий из SEQ ID NO:31 или последовательности, на 90% идентичной ей, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность из трех доменов SEQ ID NO:35 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37) (фиг. 5). На фиг. 5 аминокислотная последовательность RAGE выделена жирным шрифтом. Как показано на фиг. 6 В,первые 136 аминокислот полноразмерного RAGE-слитого белка ТТР-3000 содержат в качестве последовательности полипептида RAGE сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-22/23,иммуноглобулиновый V-домен (в том числе лигандсвязывающий сайт), содержащий аминокислоты 23/24-116, междоменный линкер, содержащий аминокислоты 117-136. Последовательность 137-346 включает в себя иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 IgG. Слитые белки данного изобретения могут иметь улучшенную стабильность in vivo в сравнении с полипептидами RAGE, не содержащими второго полипептида. Этот слитый белок может быть дополнительно модифицирован для увеличения стабильности, эффективности, активности и биодоступности. Таким образом, слитые белки данного изобретения могут быть модифицированы посттрансляционным процессингом или химической модификацией. Например, слитый белок может быть получен синтетически для включения L-, D- или неприродных аминокислот, альфа-дизамещенных аминокислот или Nалкиламинокислот. Кроме того, белки могут быть модифицированы ацетилированием, ацилированием,АДФ-рибозилированием, амидированием, присоединением липидов, таких как фосфатидилинозит, образованием дисульфидных связей, и т.п. Кроме того, может быть добавлен полиэтиленгликоль для увеличения биологической стабильности слитого белка. Связывание антагонистов RAGE с RAGE-слитыми белками. Слитые белки данного изобретения могут иметь ряд применений. Например, слитые белки данного изобретения могут быть использованы в анализе связывания для идентификации лигандов RAGE, таких- 14012586 как агонисты, антагонисты или модуляторы RAGE. Например, в одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ детектирования модуляторов RAGE, предусматривающий: (а) обеспечение слитого белка, содержащего полипептидRAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом, где этот полипептид RAGE содержит лигандсвязывающий сайт; (b) смешивание представляющего интерес соединения и лиганда, имеющего известную активность связывания в отношении RAGE, со слитым белком; и (с) измерение связывания известного лиганда RAGE с RAGE-слитым белком в присутствии представляющего интерес соединения. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее N-концевой домен слитого белка.RAGE-слитые белки могут также обеспечивать наборы для детектирования модуляторов RAGE. Например, в одном варианте осуществления набор данного изобретения может содержать (а) соединение, имеющее известную аффинность связывания в отношении RAGE в качестве положительного контроля; (b) RAGE-слитый белок, содержащий полипептид RAGE, связанный со вторым, не-RAGEполипептидом, где этот полипептид RAGE содержит лигандсвязывающий сайт; и (с) инструкции для применения. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее N-концевой домен слитого белка. Белок или полипептид RAGE может содержать полноразмерный RAGE человека (например, SEQID NO:1) или фрагмент RAGE человека. В одном варианте осуществления полипептид RAGE не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного RAGE (SEQ ID NO:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид RAGE может содержать последовательность, на 70, или 80,или 90% идентичную RAGE человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептид RAGE может содержать RAGE человека или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1992. Или RAGE человека может содержать полноразмерный RAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:2 или SEQID NO:3) (фиг. 1 А и 1 В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать sRAGE (например, SEQ ID NO:4), полипептид, на 90% идентичныйsRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE может содержать sRAGE человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al.,(1997. Или RAGE человека может содержать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью(например, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) (фиг. 1 С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок RAGE может содержать V-домен (например, SEQ IDNO:7 или SEQ ID NO:8, фиг. ID). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичнаяV-домену или его фрагменту. Или белок RAGE может содержать фрагмент RAGE, содержащий часть Vдомена RAGE (например, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10: фиг. ID). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент RAGE является синтетическим пептидом. Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3),IgG4 (4), IgAl (1), IgA2 (2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:39 или SEQFc-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной in vivo. Таким образом, RAGEслитый белок данного изобретения может содержать Fc-последовательность, полученную из RAGE, а не из цепи иммуноглобулина. В одном варианте осуществления слитый белок может содержать иммуноглобулиновый домен RAGE, связанный с полипептидом, содержащим CH2-домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может содержать междоменный линкерRAGE, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE, так что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен CH2 иммуноглобулина, или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен CH2 иммуноглобулина, может содержать полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. Например, полипептид, содержащий доменыCH2 и CH3 IgG1 человека, или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные до- 15012586 мены из RAGE. Полипептид RAGE, содержащий междоменный линкер, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE, может также содержать фрагмент полноразмерного белка RAGE. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер RAGE, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом RAGE и вторым междоменным линкером RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с Сконцевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2, или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-251 RAGE человека (SEQ ID NO:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-251 RAGE человека (SEQ ID NO:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену, C1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С 1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты,содержащая SEQ ID NO:30 или ее фрагмент, может кодировать RAGE-слитый белок из четырех доменов. Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен RAGE, связанный через междоменный линкер RAGE с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, этот полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-136 RAGE человека (SEQ ID NO:15) или последовательность, на 90% идентичную ей,или аминокислоты 24-136 RAGE человека (SEQ ID NO:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID NO:31 или ее фрагмент, может кодироватьRAGE-слитый белок из трех доменов. Как описано здесь, междоменный линкерный фрагмент RAGE может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена RAGE и, следовательно, связана с ним. Например, для V-домена RAGE этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от V-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерного RAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа отSEQ ID NO:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит SEQ IDNO:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного RAGE. Или могут быть использованы фрагменты SEQ ID NO:21 с делецией, например, 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична, или на 80% идентична, или на 90% идентична SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:23. Для С 1-домена RAGE этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С 1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного RAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:22. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:22 с делецией, например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер RAGE может содержать SEQ IDNO:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать SEQ IDNO:44, соответствующую аминокислотам 318-342 RAGE. Например, RAGE-слитый белок может быть использован в анализе связывания для идентификации потенциальных лигандов RAGE. В одном варианте-примере такого анализа связывания известный лиганд RAGE может быть нанесен на твердый субстрат (например, планшеты Maxisorb) в концентрации приблизительно 5 микрограммов на лунку, где каждая лунка содержит общий объем приблизительно 100 микролитров (мкл). Планшеты могут инкубироваться при 4 С в течение ночи для абсорбции лиганда. Альтернативно, могут быть использованы более короткие периоды инкубации при более высокой температуре (например, при комнатной температуре). После некоторого периода времени, необходимого для связывания лиганда с субстратом, тест-лунки могут быть аспирированы и может быть добавлен блокирующий буфер (например, 1% БСА в 50 мМ имидазоловом буфере, рН 7,2) для блокирования неспецифического связывания. Например, блокирующий буфер может быть добавлен к планшетам и оставлен в планшетах на 1 час при комнатной температуре. Затем планшеты аспирируют и/или промывают промы- 16012586 вочным буфером. В одном варианте осуществления в качестве промывочного буфера может быть использован буфер, содержащий 20 мМ имидазол, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, 5 мМ CaCl2 и 5 мМ MgCl2,рН 7,2. Затем в эти тест-лунки добавляют слитый белок в увеличивающихся разведениях. Затем RAGEслитому белку может быть позволено инкубироваться с иммобилизованным лигандом в тест-лунке для достижения уравновешивания связывания. В одном варианте осуществления RAGE-слитому белку дают инкубироваться с иммобилизованным лигандом в течение приблизительно одного часа при 37 С. В альтернативных вариантах осуществления могут быть использованы более продолжительные периоды инкубации при более низких температурах. После инкубации слитого белка и иммобилизованного лиганда планшет может быть промыт для удаления любого несвязанного слитого белка. Слитый белок, связанный с иммобилизованным лигандом, может детектироваться различными путями. В одном варианте осуществления детектирование использует ELISA. Таким образом, в одном варианте осуществления комплекс для иммунодетектирования, содержащий моноклональное мышиное антитело против IgG1 человека, биотинилированное козье антитело против мышиного IgG и связанную с авидином щелочную фосфатазу, может быть добавлен к слитому белку, иммобилизованному в тест-лунке. Комплексу для иммунодетектирования дают связываться с иммобилизованным слитым белком так, чтобы связывание между слитым белком и комплексом для иммунодетектирования достигло равновесия. Например, этому комплексу дают связываться со слитым белком в течение одного часа при комнатной температуре. В этой временной точке любой несвязанный комплекс может быть удален промыванием тест-лунки промывочным буфером. Связанный комплекс может детектироваться добавлением субстрата щелочной фосфатазы, паранитрофенилфосфата (PNPP), и измерением превращения PNPP в паранитрофенол (PNP) в виде увеличения оптической плотности при 405 нм. В одном варианте осуществления лиганд RAGE связывается с RAGE-слитым белком с наномолярной (нМ) или микромолярной (мкМ) аффинностью. Эксперимент, иллюстрирующий связывание лигандов RAGE с RAGE-слитыми белками данного изобретения, показан на фиг. 7. Готовили растворы ТТР 3000 (TT3) и ТТР-4000 (ТТ 4), имеющие исходные концентрации 1,082 мг/мл и 370 мкг/мл, соответственно. Как показано на фиг. 7, при различных разведениях, слитые белки ТТР-3000 и ТТР-4000 способны связываться с иммобилизованными лигандами RAGE амилоидом-бета (Abeta) (Amyloid Beta (1-40), Biosource), S100b (S100) и амфотерином (Ampho), приводя к увеличению оптической плотности. В отсутствие лиганда (т.е. только с покрытием БСА) не было увеличения оптической плотности. Анализ связывания данного изобретения может быть использован для количественного определения связывания лиганда с RAGE. В альтернативных вариантах осуществления лиганды RAGE могут связываться со слитым белком данного изобретения с аффинностями связывания в диапазоне 0,1-1000 наномолярных концентраций (нМ), или 1-500 нМ, или 10-80 нМ. Слитый белок данного изобретения может быть также использован для идентификации соединений,способных связываться с RAGE. Как показано на фиг. 8 и 9, соответственно, лиганд RAGE может анализироваться на его способность конкурировать с иммобилизованным амилоидом бета за связывание со слитыми белками ТТР-4000 (ТТ 4) или ТТР-3000 (TT3). Таким образом, можно видеть, что лиганд RAGE в конечной тест-концентрации (FAC) 10 мкМ может замещать связывание RAGE-слитого белка с амилоидом-бета в концентрациях 1:3, 1:10, 1:30 и 1:100 исходного раствора ТТР-4000 (фиг. 8) или ТТР-3000(фиг. 9). Модуляция клеточных эффекторов Варианты слитых белков данного изобретения могут быть использованы для модуляции биологической реакции, опосредуемой RAGE. Например, могут быть сконструированы слитые белки для модуляции RAGE-индуцируемых увеличений экспрессии генов. Таким образом, в одном варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть использованы для модуляции функции биологических ферментов. Например, взаимодействие между RAGE и его лигандами может генерировать окислительный стресс и активацию NF-B и NF-B-регулируемых генов, таких как гены цитокинов IL-1, TNF и т.п. Кроме того, было показано, что несколько других регуляторных путей, таких как пути с участием p21ras, МАР-киназ, ERK1 и ERK2, активируются связыванием AGE и других лигандов с RAGE. Применение слитых белков данного изобретения для модуляции экспрессии клеточного эффектораTNF- показано на фиг. 10. Миелоидные клетки ТНР-1 могут культивироваться в среде RPMI-1640, дополненной 10% ФТС, и индуцироваться для секреции TNF- посредством стимуляции RAGE при помощи S100b. Когда такая стимуляция происходит в присутствии RAGE-слитого белка, индукция TNFпосредством связывания S100b с RAGE может быть ингибирована. Таким образом, как показано на фиг. 10, добавление 10 мкг слитого белка ТТР-3000 (TT3) или ТТР-4000 (ТТ 4) уменьшает индукцию TNFпосредством S100b на приблизительно 50-75%. Слитый белок ТТР-4000 может быть, по меньшей мере,таким же эффективным в блокировании индукции TNF- посредством S100b, каким является sRAGE(фиг. 10). Специфичность ингибирования для RAGE-последовательностей ТТР-4000 и ТТР-3000 показана экспериментом, в котором к S100b-стимулированным клеткам добавляли только IgG. Добавление IgG иS100b в анализ показывает те же самые уровни TNF-, что и добавление только S100b.- 17012586 Физиологические характеристики RAGE-слитых белков Хотя sRAGE может иметь терапевтическую пользу в модуляции RAGE-опосредованных заболеваний, sRAGE человека может иметь недостатки в качестве независимого терапевтического средства вследствие относительно короткого полупериода существования sRAGE в плазме. Например, в то время как sRAGE грызуна имеет полупериод существования в нормальных и диабетических крысах приблизительно 20 ч, sRAGE человека имеет полупериод существования, меньший, чем 2 ч, при оценке по сохранению иммунореактивности sRAGE (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999. Для получения терапевтического агента на основе RAGE, который имеет такие же характеристики связывания, какие имеет sRAGE, но более стабильный фармакокинетический профиль, может быть использован RAGE-слитый белок, содержащий лигандсвязывающий сайт RAGE, связанный с одним или несколькими иммуноглобулиновыми доменами человека. Как известно в данной области, эти иммуноглобулиновые домены могут включать в себя Fc-часть тяжелой цепи иммуноглобулина.Fc-часть иммуноглобулина может сообщать несколько характерных признаков слитому белку. Например, Fc-слитый белок может увеличивать полупериод существования в сыворотке такого слитого белка, часто от часов до нескольких дней. Увеличение фармакокинетической стабильности обычно является результатом взаимодействия линкера между CH2- и CH3-районами Fc-фрагмента с FcRn-рецептором(Wines et al., J. Immunol., 164:5213-5318 (2000. Хотя слитые белки, содержащие Fc-полипептид иммуноглобулина, могут обеспечивать преимущество увеличенной стабильности, иммуноглобулин-слитые белки могут индуцировать воспалительную реакцию при введении в хозяина. Эта воспалительная реакция может быть обусловлена, в значительной степени, Fc-частью иммуноглобулина этого слитого белка. Провоспалительная реакция может быть желательным признаком, если предполагаемая мишень экспрессируется на патологическом типе клеток,который должен быть элиминирован (например, на раковой клетке или популяции лимфоцитов, вызывающих аутоиммунное заболевание). Провоспалительная реакция может быть нейтральным признаком,если мишенью является растворимый белок, так как большинство растворимых белков не активируют иммуноглобулины. Однако эта провоспалительная реакция может быть отрицательным признаком, если эта мишень экспрессируется на типах клеток, разрушение которых привело бы к вредным побочным эффектам. Провоспалительная реакция может быть также отрицательным признаком, если воспалительный каскад устанавливается в месте связывания слитого белка с тканью-мишенью, так как многие медиаторы воспаления могут быть вредными для окружающей ткани и/или могут вызывать системные эффекты. Первичный провоспалительный сайт Fc-фрагментов иммуноглобулина находится на шарнирной области между CH1 и CH2. Эта шарнирная область взаимодействует с FcR1-3 на различных лейкоцитах и запускает эти клетки к атаке мишени (Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000. В качестве терапевтических средств для RAGE-опосредуемых заболеваний RAGE-слитые белки данного изобретения могут не требовать генерирования воспалительной реакции. Таким образом, варианты RAGE-слитых белков данного изобретения могут содержать слитый белок, содержащий полипептид RAGE, связанный с иммуноглобулиновым доменом (иммуноглобулиновыми доменами), где Fcшарнирная область из иммуноглобулина удалена и заменена полипептидом RAGE. Таким путем может быть минимизировано взаимодействие RAGE-слитого белка и Fc-рецепторов на воспалительных клетках. Однако может быть важным поддержание правильного стекинга и других трехмерных структурных взаимодействий между различными иммуноглобулиновыми доменами этого слитого белка. Таким образом, варианты слитых белков данного изобретения могут заменять биологически инертный, но структурно сходный междоменный линкер RAGE, который разделяет V- и С 1-домены RAGE, или линкер, который разделяет С 1- и С 2-домены RAGE, вместо нормальной шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Таким образом, полипептид RAGE этого слитого белка может содержать междоменную линкерную последовательность, которая природно обнаруживается справа от иммуноглобулинового доменаRAGE, с образованием фрагмента иммуноглобулиновый домен RAGE/линкер. Таким путем могут поддерживаться трехмерные взаимодействия между иммуноглобулиновыми доменами, которым способствуют либо RAGE, либо иммуноглобулин. В одном варианте осуществления RAGE-слитый белок данного изобретения может иметь существенное увеличение фармакокинетической стабильности в сравнении с sRAGE. Например, фиг. 11 показывает, что как только RAGE-слитый белок ТТР-4000 насытил его лиганды, он может сохранять полупериод существования, больший, чем 300 ч. Это может быть противопоставлено полупериоду существования для sRAGE, который составляет только несколько часов в плазме человека. Таким образом, в одном варианте осуществления RAGE-слитые белки данного изобретения могут быть использованы для противодействия связыванию физиологических лигандов с RAGE в качестве средства для лечения RAGE-опосредуемых заболеваний без генерирования неприемлемой степени воспаления. Слитые белки данного изобретения могут проявлять существенное уменьшение генерирования противовоспалительной реакции в сравнении с IgG. Например, как показано на фиг. 12, RAGE-слитый белок ТТР-4000 не стимулирует высвобождения TNF- из клеток в условиях, в которых детектируется стимуляция высвобождения TNF- посредством IgG человека.- 18012586 Лечение заболевания RAGE-слитыми белками Данное изобретение может также включать в себя способы для лечения RAGE-опосредуемого нарушения у субъекта-человека. В одном варианте осуществления этот способ может предусматривать введение субъекту слитого белка, содержащего полипептид RAGE, содержащий лигандсвязывающий сайт RAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт RAGE. В одном варианте осуществления этот лигандсвязывающий сайт содержит наиболее N-концевой домен этого слитого белка. Лигандсвязывающий сайт RAGE может содержать V-домен RAGE или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт RAGE содержит SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит часть по меньшей мере одного из доменов CH2 или CH3 IgG человека. Белок или полипептид RAGE может содержать полноразмерный RAGE (например, SEQ ID NO:1) или фрагмент RAGE человека. В одном варианте осуществления полипептид RAGE не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного RAGE (SEQ ID NO:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид RAGE может содержать последовательность, на 70, или 80, или 90% идентичную RAGE человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептидRAGE может содержать RAGE человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1992. Или RAGE человека может содержать полноразмерныйRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3) (фиг. 1 А и 1 В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать sRAGE (например, SEQ ID NO:4), полипептид, на 90% идентичный sRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE может содержать sRAGE человека или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1997. Или RAGE человека может содержать полноразмерный sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) (фиг. 1 С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок RAGE может содержать V-домен (например, SEQ ID NO:7 илиSEQ ID NO:8; фиг. 1D). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная Vдомену или его фрагменту. Или белок RAGE может содержать фрагмент RAGE, содержащий часть Vдомена RAGE (например, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, фиг. 1D). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент RAGE является синтетическим пептидом. Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3),IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:39 или SEQID NO:41. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-116 RAGE человека (SEQ IDID NO:8) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 124-221 RAGE человека (SEQ ID NO:11) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С 1-домену RAGE. В другом варианте осуществления полипептид RAGE может содержать аминокислоты 227-317 RAGE человека (SEQ ID NO:12) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С 2-домену RAGE человека. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-123 RAGE человека (SEQ ID NO:13) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-123 RAGE человека (SEQ ID NO:14) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE человека и междоменному линкеру справа. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-226 RAGE человека (SEQ IDID NO:18) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену, С 1-домену и междоменному линкеру, связывающему эти два домена. Или полипептид RAGE может содержать ами- 19012586 нокислоты 23-339 RAGE человека (SEQ ID NO:5) или последовательность, на 90% идентичную ей, или 24-339 RAGE человека (SEQ ID NO:6) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую sRAGE (т.е. кодирующую V-, С 1- и С 2-домены и междоменные линкеры). Или могут быть использованы фрагменты каждой из этих последовательностей.Fc-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной in vivo. Таким образом, в одном варианте осуществления RAGE-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из RAGE, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина. Таким образом, в одном варианте осуществления слитый белок может дополнительно содержать полипептид RAGE, непосредственно слитый с полипептидом, содержащим домен CH2 иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления этот домен CH2 или его фрагмент содержит SEQ IDNO:42. В одном варианте осуществления полипептид RAGE содержит междоменный линкер RAGE, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен CH2 иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен CH2 иммуноглобулина, может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека. Например, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ IDNO:40. Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из RAGE. Полипептид RAGE, содержащий междоменный линкер, связанный с доменом полипептида RAGE, может также содержать фрагмент полноразмерного белка RAGE. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкерRAGE, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом RAGE и вторым междоменным линкеромRAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, Nконцевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-251V-домену, С 1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С 1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащаяSEQ ID NO:30 или ее фрагмент, может кодировать RAGE-слитый белок из четырех доменов. Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен RAGE, связанный через междоменный линкер RAGE с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, этот полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-136 RAGE человека (SEQ ID NO:15) или последовательность, на 90% идентичную ей,или аминокислоты 24-136 RAGE человека (SEQ ID NO:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID NO:31 или ее фрагмент, может кодироватьRAGE-слитый белок из трех доменов. Междоменный линкерный фрагмент RAGE может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена RAGE и, следовательно, связана с ним. Например, для V-домена RAGE этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от V-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерногоRAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит SEQ ID NO:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного RAGE. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:21 с делецией, например 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична,или на 80% идентична, или на 90% идентична SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:23. Для С 1-домена RAGE этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая нахо- 20012586 дится природно справа от этого С 1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного RAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:22. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:22 с делецией, например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер RAGE может содержать SEQ IDNO:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать SEQ IDNO:44, соответствующую аминокислотам 318-342 RAGE. В одном варианте осуществления слитый белок данного изобретения может вводиться различными способами. Введение RAGE-слитого белка данного изобретения может использовать внутрибрюшинную(IP) инъекцию. Альтернативно, RAGE-слитый белок может вводиться перорально, интраназально или в виде аэрозоля. В другом варианте осуществления введение является внутривенным (IV). RAGE-слитый белок может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществления введение этого слитого белка является внутриартериальным. В другом варианте осуществления введение является сублингвальным. Введение может также использовать капсулу с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте осуществления введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозитория или т.п. Например, подкожное введение может быть применимо для лечения хронических нарушений, когда желательным является самостоятельное введение. Для валидизации применения соединений, которые модулируют RAGE, в качестве терапевтических средств использовали различные модели животных. Примерами этих моделей являются следующие модели:a) ингибируемое sRAGE образование новой интимы (внутренней оболочки сосудов) в крысиной модели рестеноза после артериального повреждения как у диабетических, так и у нормальных крыс ингибированием активации эндотелиальных клеток, клеток гладких мышц и макрофагов посредствомb) ингибирование взаимодействий RAGE/лиганд с использованием либо sRAGE, либо анти-RAGEантитела, уменьшенное образование амилоидных бляшек в мышиной модели системного амилоидоза(Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000. Уменьшение числа амилоидных бляшек сопровождалось уменьшением воспалительных цитокинов, интерлейкина-6 (IL-6) и макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), а также уменьшенной активацией NF-B у получавших лечение животных;c) RAGE-трансгенные мыши (сверхэкспрессирующие и RAGE-доминантно-негативные) обнаруживают образование бляшек и нарушения познавательной способности (когнитивные нарушения) в мышиной модели AD (Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004;d) лечение диабетических крыс с использованием sRAGE уменьшало проницаемость сосудов (Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48:2052-2058 (1999;e) лечение sRAGE уменьшало атеросклеротические повреждения у диабетических аполипопротеин Е-нуль-мышей и предотвращало возникновение функциональных и морфологических показателей диабетической нефропатии у мышей db/db (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003; иf) sRAGE аттенуировал тяжесть воспаления в мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (Hofmann et al., Genes Immunol., 3:123-135 (2002, мышиной модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 (2003 и мышиной модели воспалительного заболевания кишечника (Hofmann et al., Cell, 97:889-901 (1999. Таким образом, в одном варианте осуществления белки данного изобретения могут быть использованы для лечения симптома диабета и/или осложнений, происходящих из диабета, опосредуемых RAGE. В альтернативных вариантах осуществления симптом диабета или поздние диабетические осложнения могут включать в себя диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую язву стопы, сердечно-сосудистое осложнение диабета или диабетическую нефропатию. Первоначально идентифицированный в качестве рецептора для молекул, экспрессиия которых ассоциирована с патологией диабета, RAGE, сам, является важным для патофизиологии диабетических осложнений. Было показано, что in vivo ингибирование взаимодействия RAGE с его лигандом (лигандами) является терапевтическим во множественных моделях диабетических осложнений и воспаления(Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003. Например, двухмесячное лечение анти-RAGEантителами нормализовало функцию почек и уменьшало аномальную гистопатологию почек у диабетических мышей (Flyvbjerg et al., Diabetes 53:166-172 (2004. Кроме того, лечение растворимой формойRAGE (sRAGE), которая связывается с лигандами RAGE и ингибирует взаимодействия RAGE/лиганд,уменьшало атеросклеротические повреждения у диабетических аполипопротеин Е-нуль-мышей и аттенуировало функциональную и морфологическую патологию диабетической нефропатии у мышей db/db(Bucciarelli et al., Circulation 106:2827-2835 (2002. Было показано также, что гликоокисление макромолекул, в конечном счете приводящее к образованию продвинутых конечных продуктов гликозилирования (AGE), усиливается в местах воспаления,при почечной недостаточности, в присутствии гипергликемии и других состояний, ассоциированных с- 21012586 системным или локальным окислительным стрессом (Dyer et al., J. Clin Invest., 91:2463-2469 (1992);Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998. Накопление AGE в сосудистой сети может происходить локализованно (в виде очагов), как в случае амилоида суставов, состоящего из AGE-2-микроглобулина,обнаруживаемого у пациентов со связанным с диализом амилоидозом (Miyata et al., J. Clin Invest.,92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin Invest., 98:1088-1094 (1996, или генерализованно, как, например, в сосудистой сети и тканях пациентов с диабетом (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995. Прогрессирующее накопление AGE во времени у пациентов с диабетом предполагает, что эндогенные механизмы клиренса не способны эффективно функционировать в местах отложения AGE. Такие накапливаемые AGE способны изменять клеточные свойства посредством ряда механизмов. Хотя RAGE экспрессируется при низких уровнях в нормальных тканях и сосудистой сети, было показано, что в среде, в которой накапливаются лиганды рецептора, RAGE становится положительно регулируемым (Li etBiol. Chem., 275:25781-25790 (2000. Экспрессия RAGE увеличивается в эндотелии, клетках гладких мышц и инфильтрирующих мононуклеарных фагоцитах в сосудистой сети диабетиков. Исследования в клеточной культуре также продемонстрировали, что взаимодействие AGE-RAGE вызывает изменения в клеточных свойствах, важных в гомеостазе сосудов. Применение RAGE-слитых белков в лечении связанной с диабетом патологии иллюстрируется на фиг. 13. RAGE-слитый белок ТТР-4000 оценивали в модели рестеноза диабетических крыс, которая включала в себя измерение пролиферации гладких мышц и развития интимы после васкулярного повреждения. Как показано на фиг. 13, лечение ТТР-4000 может значимо уменьшать отношение интима-медиа(внутренняя оболочка сосудов - средняя оболочка сосудов) (I/M) (фиг. 13 А; табл. 1) в ассоциированном с диабетом рестенозе зависимым от дозы образом. Лечение с использованием ТТР-4000 может также значимо уменьшать связанную с рестенозом пролиферацию клеток гладких мышц сосудов зависимым от дозы образом. Таблица 1. Действие ТТР-4000 в крысиной модели рестеноза Р 0,05 Как для высокой, так и для низкой дозы использовали ударную дозу 3 мг/животное. В других вариантах осуществления слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения или обращения развития амилоидоза и болезни Альцгеймера. RAGE является рецептором амилоида бета (А), а также других амилоидогенных белков, в том числе SSA и амилина (Yan et al.,Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al., Nat. Med.,6:643-651 (2000); Sousa et al., Lab Invest., 80:1101-1110 (2000. Лиганды RAGE, в том числе белки AGE,S100b и А обнаружены в ткани, окружающей старческую бляшку у людей (Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al., Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003); Sasaki et al., Brain Res., 12:256-262(2001); Yan et al., Restor. Neurol Neurosci., 12:167-173 (1998. Было показано, что RAGE связывает складчатый фибриллярный материал независимо от состава субъединиц (пептид амилоида-, амилин,сывороточный амилоид А, полученный из прионов пептид) (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan etal., Nat. Med., 6:643-651 (2001. Кроме того, было показано, что отложение амилоида приводит к усиленной экспрессии RAGE. Например, в головном мозгу пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) экспрессияRAGE увеличивается в нейронах и глии (Yan et al., Nature 382:685-691 (1996. Одновременно с экспрессией лигандов RAGE, RAGE положительно регулируется в астроцитах и микроглиальных клетках в гиппокампе индивидуумов с AD, но не регулируется положительно в индивидуумах, которые не имеют ADRAGE, активируются взаимодействиями RAGE/лиганд RAGE вблизи старческой бляшки. Аопосредованная активация микроглиальных клеток in vitro может также блокироваться антителами, направленными против лигандсвязывающего домена RAGE (Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:52965301 (1997. Было также продемонстрировано, что RAGE может служить в качестве фокальной точки для сборки фибрилл (Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003.- 22012586 Ингибирование in vivo взаимодействий RAGE/лиганд с использованием либо sRAGE, либо aнтиRAGE-антитела может также уменьшать образование амилоидных бляшек в мышиной модели системного амилоидоза (Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000. Дважды трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют RAGE человека и амилоидный белок-предшественник человека (АРР) с мутациями Swedish и London (мутантный hAPP) в нейронах, развивают дефекты научения и невропатологические аномалии раньше, чем их моносайтовые мутантные трансгенные hAPP-копии. В противоположность этому, дважды трансгенные мыши с уменьшенной способностью передачи сигнала А вследствие нейронов, экспрессирующих доминантно-негативную форму RAGE на том же самом мутантном генетическом фонеhAPP, обнаруживают задержанное возникновение невропатологических аномалий и аномалий научения в сравнении с их моносайтовой АРР-трансгенной копией (Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004. Кроме того, было показано, что ингибирование взаимодействия RAGE-амилоид уменьшает экспрессию клеточного RAGE и маркеров клеточного стресса (а также активацию NF-B) и уменьшает отложение амилоида (Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000, что предполагает роль взаимодействия RAGEамилоид как в пертурбации клеточных свойств в среде, обогащенной амилоидом (даже на ранних стадиях), так и в накоплении амилоида. Таким образом, RAGE-слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения и уменьшения амилоидоза и для уменьшения амилоидных бляшек и когнитивной дисфункции,связанной с болезнью Альцгеймера (AD). Как описано выше, было показано, что sRAGE уменьшает как образование амилоидных бляшек в головном мозгу, так и последующее увеличение количества воспалительных маркеров в модели AD животных. Фиг. 14 А и 14 В показывают, что мыши, которые имеют AD и лечатся в течение 3 месяцев либо ТТР-4000, либо мышиным sRAGE, имели меньше бляшек амилоида бета (А) и меньшую когнитивную дисфункцию, чем животные, которые получали носитель или IgG человека в качестве отрицательного контроля (IgG1). Подобно sRAGE, ТТР-4000 может также уменьшать количество воспалительных цитокинов IL-1 и TNF- (данные не показаны), связанных с AD. Слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых нарушений. Так, было показано, что ишемическая болезнь сердца является особенно высокой у пациентов с диабетом (Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al., J.Am. Med. Assoc, 241:2035-2038 (1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979. Кроме того, исследования показали, что атеросклероз у пациентов с диабетом является более ускоренным и экстенсивным, чем у пациентов, не страдающих от диабета (см., например, Waller et al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980); CrallRev., 3:463-524 (1978. Хотя причинами ускоренного атеросклероза в условиях диабета являются множественные причины, было показано, что уменьшение AGE может уменьшать образование бляшек. Например, RAGE-слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения инсульта (внезапного мозгового приступа сосудистой природы). При сравнении ТТР-4000 с sRAGE в релевантной для этого заболевания модели инсульта у животного было обнаружено, что ТТР-4000 обеспечивает значимо большее уменьшение объема повреждения. В этой модели среднюю сонную аретрию мыши лигируют и затем реперфузируют для образования повреждения. Для оценки эффективностиRAGE-слитых белков для лечения или предупреждения инсульта мышей лечили sRAGE или ТТР-4000 или контрольным иммуноглобулином непосредственно перед реперфузией. Как можно видеть в таблице 2, ТТР-4000 был более эффективным, чем sRAGE, в ограничении площади повреждения у этих животных, что предполагает, что ТТР-4000, вследствие его лучшего полупериода существования в плазме, был способен поддерживать большую защиту, чем sRAGE. Таблица 2. Уменьшение повреждения при инсульте Значимость до р 0,001, в сравнении с солевым раствором. В другом варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения рака. В одном варианте осуществления рак, подвергнутый лечению с использованием слитых белков данного изобретения, содержит раковые клетки, которые экспрессируют RAGE. Например, виды рака, которые могут лечиться RAGE-слитым белком данного изобретения, включают в себя некоторые виды рака легкого, некоторые глиомы, некоторые папилломы и т.п. Амфотерин является негистоновым- 23012586 связывающим хромосомную ДНК белком группы I высокой подвижности (Rauvala et al., J. Biol. Chem.,262:16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem., 268:19726-19738 (1993, который, как было показано, взаимодействует с RAGE. Было показано, что амфотерин стимулирует разрастание неврита, а также служит в качестве поверхности для сборки протеазных комплексов в фибринолитической системе (о которой также известно, что она способствует подвижности клеток). Кроме того, наблюдали ингибиторное действие блокирования RAGE на локальный рост опухоли в модели первичной опухоли (глиомы С 6),модели легочного метастазирования Льюиса (Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000 и спонтанно возникающих папилломах у мышей, экспрессирующих трансген v-Ha-ras (Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,87:9178-9182 (1990. В других вариантах осуществления слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения воспаления. Например, в дополнительных вариантах осуществления слитый белок данного изобретения используют для лечения воспаления, связанного с аутоиммунитетом, воспаления, связанного с воспалительным заболеванием кишечника, воспаления, связанного с ревматоидным артритом, воспаления, связанного с псориазом, воспаления, связанного с рассеянным склерозом, воспаления, связанного с гипоксией, воспаления, связанного с инсультом, воспаления, связанного с сердечным приступом,воспаления, связанного с геморрагическим шоком, воспаления, связанного с сепсисом, воспаления, связанного с трансплантацией органа, или воспаления, связанного с ухудшенным заживлением ран. Например, после тромболитической обработки воспалительные клетки, такие как гранулоциты, инфильтрируют ишемическую ткань и продуцируют радикалы кислорода, которые могут разрушать больше клеток, чем количество клеток, убитых гипоксией. Было показано, что ингибирование этого рецептора на нейтрофилах, ответственного за способность нейтрофилов инфильтрировать эту ткань, антителами или другими антагонистами белка ослабляет эту реакцию. Поскольку RAGE является лигандом для этого рецептора нейтрофилов, слитый белок, содержащий фрагмент RAGE, может действовать в качестве ловушки и предотвращать транспорт нейтрофилов в реперфузированный участок и, следовательно, предотвращать дополнительную деструкцию ткани. Роль RAGE в предупреждении воспаления может быть продемонстрирована исследованиями, показывающими, что sRAGE ингибировал разрастание новой интимы в крысиной модели рестеноза после артериального повреждения как у диабетических, так и у здоровых крыс, предположительно ингибируя пролиферацию эндотелиальных клеток, клеток гладких мышц и активацию макрофагов через RAGE (Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003. Кроме того, sRAGE ингибировал модели воспаления, в том числе аллергию замедленного типа, экспериментальный аутоиммунный энцефалит и воспалительное заболевание кишечника (Hofman et al., Cell, 97:889-901 (1999. В одном варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения аутоиммунных нарушений. Например, слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения почечной недостаточности. Таким образом, слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения системной красной волчанки или воспалительного люпуснефрита (волчаночного нефрита). Например, было показано, что S100b/кальгранулины представляют семейство близкородственных кальцийсвязывающих полипептидов, характеризуемых двумя кальцийсвязывающими EF-hand-мотивами (петлями из 12 аминокислот, обеспечивающими октаэдральную координацию для иона кальция), связанными соединительным пептидом (Schafer et al., TIBS, 21:134-140 (1996);Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995); Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995. Хотя они и не имеют сигнальных пептидов, давно было известно, что S100b/кальгранулины получают доступ во внеклеточное пространство, особенно в местах хронических иммунных/воспалительных реакцией, таких как муковисцидоз и ревматоидный артрит.RAGE является рецептором многих членов семейства S100b/кальгранулина и опосредует их провоспалительные действия на клетки, такие как лимфоциты и мононуклеарные фагоциты. Исследования на моделях аллергической реакции замедленного типа, колита у IL-10-нуль-мышей, индуцированного коллагеном артрита и экспериментального аутоиммунного энцефалита также предполагают, что взаимодействиеRAGE-лиганд (предположительно с S-100b/кальгранулинами) имеет непосредственную роль в воспалительном каскаде. Таким образом, в различных выбранных вариантах осуществления данное изобретение может обеспечивать способ ингибирования взаимодействия AGE с RAGE у субъекта введением этому субъекту терапевтически эффективного количества слитого белка данного изобретения. Субъектом для леченияRAGE-слитыми беклами данного изобретения может быть животное. В одном варианте осуществления этим субъектом является человек. Этот субъект может страдать от AGE-связанного заболевания, такого как диабет, диабетические осложнения, такие как нефропатия, невропатия, ретинопатия, язва стопы,амилоидоз или почечная недостаточность, и воспаление. Или субъект может быть индивидуумом с болезнью Альцгеймера. В альтернативном варианте осуществления этот субъект может быть индивидуумом, страдающим от рака. В других вариантах осуществления этот субъект может страдать от системной красной волчанки или воспалительного люпус-нефрита. Другие заболевания могут быть опосредованыRAGE и, следовательно, могут лечится с использованием слитых белков данного изобретения. Таким образом, в дополнительных альтернативных вариантах осуществления данного изобретения слитые белки могут быть использованы для лечения болезни Крона, артрита, васкулита, нефропатий, ретинопатий и- 24012586 невропатий у субъектов-людей или субъектов-животных. Терапевтически эффективное количество может быть количеством, которое способно предотвращать взаимодействие RAGE с AGE или другими типами лигандов RAGE у субъекта. Соответственно, это количество будет варьироваться в зависимости от получающего лечение субъекта. Введение этого соединения может выполняться один раз в час, один раз в день, один раз в неделю, один раз в месяц, один раз в год или в виде единственного введения. В различных альтернативных вариантах осуществления эффективное количество этого слитого белка может быть в диапазоне приблизительно 1 нг/кг массы тела- приблизительно 100 мг/кг массы тела, или приблизительно 10 мкг/кг массы тела - приблизительно 50 мг/кг массы тела, или приблизительно 100 мкг/кг массы тела - приблизительно 10 мг/кг массы тела. Фактическое эффективное количество может быть установлено анализами зависимости реакции от дозы с использованием способов, стандартных в данной области (Johnson et al., Diabetes, 42: 1179, (1993. Таким образом, как известно специалистам с квалификацией в данной области, эффективное количество может зависеть от биодоступности, биологической активности и биодеградируемости этого соединения. Композиции Данное изобретение может содержать композицию, содержащую слитый белок данного изобретения, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем. Слитый белок может содержать полипептид RAGE, связанный со вторым, не-RAGE-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт RAGE. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт RAGE содержит наиболее N-концевой домен этого слитого белка. В одном варианте осуществления, лигандсвязывающий сайт RAGE может содержать V-домен RAGE или его часть. В одном варианте осуществления, лигандсвязывающий сайт RAGE содержит SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. В одном варианте осуществления полипептид RAGE может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит по меньшей мере часть одного из доменов CH2 или CH3 IgG человека. Белок или полипептид RAGE может содержать полноразмерный RAGE (например, SEQ ID NO:1) или фрагмент RAGE человека. В одном варианте осуществления полипептид RAGE не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного RAGE (SEQ ID NO:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид RAGE может содержать последовательность, на 70%, или 80%, или 90% идентичную RAGE человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления, полипептид RAGE может содержать RAGE человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al., (1992. Или RAGE человека может содержать полноразмерный RAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO:2 или SEQ IDNO:3) (фиг. 1 А и 1 В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать sRAGE (например, SEQ ID NO:4), полипептид, на 90% идентичныйsRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE может содержать sRAGE человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, Neeper et al.,(1997. Или RAGE человека может содержать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью(например, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) (фиг. 1 С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок RAGE может содержать V-домен (например, SEQ IDNO:7 или SEQ ID NO:8; фиг. ID). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичнаяV-домену или его фрагменту. Или белок RAGE может содержать фрагмент RAGE, содержащий часть Vдомена RAGE (например, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, фиг. ID). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать SEQ ID NO:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или SEQ ID NO:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент RAGE является синтетическим пептидом. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-116 RAGE человека (SEQ IDID NO:8) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 124-221 RAGE человека (SEQ ID NO:11) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С 1-домену RAGE. В другом варианте осуществления, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 227-317 RAGE человека (SEQ ID NO:12) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С 2-домену RAGE человека. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-123 RAGE человека (SEQ ID NO:13) или последовательность на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-123 RAGE человека (SEQ ID NO:14) или последовательность на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE человека и междоменному линкеру справа. Или полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-226 RAGE человека (SEQ IDID NO:18) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену, С 1-домену и междоменному линкеру, связывающему эти два домена. Или полипептид RAGE может содержать ами- 25012586 нокислоты 23-339 RAGE человека (SEQ ID NO:5) или последовательность, на 90% идентичную ей, или 24-339 RAGE человека (SEQ ID NO:6) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую sRAGE (т.е. кодирующую V-, С 1- и С 2-домены и междоменные линкеры). Или могут быть использованы фрагменты каждой из этих последовательностей. Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3),IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека или их часть, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:39 или SEQFc-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной in vivo. Таким образом, в одном варианте осуществления RAGE-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из RAGE, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина. Таким образом, в одном варианте осуществления слитый белок может дополнительно содержать полипептид RAGE, непосредственно слитый с полипептидом, содержащим домен CH2 иммуноглобулина,или его фрагмент. В одном варианте осуществления этот домен CH2 или его фрагмент содержит SEQ IDNO:42. В одном варианте осуществления полипептид RAGE содержит междоменный линкер RAGE, связанный с иммуноглобулиновым доменом RAGE таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена RAGE связана с N-концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен CH2 иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен CH2 иммуноглобулина, может содержать домены CH2 и CH3 IgG1 человека. Например, полипептид, содержащий домены CH2 и CH3 IgG1 человека, может содержать SEQ ID NO:38 или SEQ IDNO:40. Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из RAGE. Полипептид RAGE, содержащий междоменный линкер, связанный с доменом полипептида RAGE, может также содержать фрагмент полноразмерного белка RAGE. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкерRAGE, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом RAGE и вторым междоменным линкеромRAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, Nконцевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно связана с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-251V-домену, C1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С 1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащаяSEQ ID NO:30 или ее фрагмент, может кодировать RAGE-слитый белок из четырех доменов. Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен RAGE, связанный через междоменный линкер RAGE с N-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, этот полипептид RAGE может содержать аминокислоты 23-136 RAGE человека (SEQ ID NO:15) или последовательность, на 90% идентичную ей,или аминокислоты 24-136 RAGE человека (SEQ ID NO:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую V-домену RAGE и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая SEQ ID NO:31, или ее фрагмент может кодироватьRAGE-слитый белок из трех доменов. Междоменный линкерный фрагмент RAGE может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена RAGE и, следовательно, связана с ним.- 26012586 Например, для V-домена RAGE этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от V-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерногоRAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит SEQ ID NO:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного RAGE. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:21 с делецией, например 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления, этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична или на 80% идентична, или на 90% идентична SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:23. Для С 1-домена RAGE этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С 1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать SEQ ID NO:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного RAGE. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от SEQ ID NO:22. Или могут быть использованы фрагменты SEQ IDNO:22 с делецией, например 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления, междоменный линкер RAGE может содержать SEQ IDNO:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать SEQ IDNO:44, соответствующую аминокислотам 318-342 RAGE. Фармацевтически приемлемые носители могут содержать любой из фармацевтически признанных носителей, известных в данной области. Этот носитель может содержать разбавитель. В одном варианте осуществления фармацевтический носитель может быть жидкостью и слитый белок, или конструкция нуклеиновой кислоты, может быть в форме раствора. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель может быть твердым веществом в форме порошка, лиофилизированного порошка или таблетки. Или фармацевтический носитель может быть гелем, суппозиторием или кремом. В альтернативных вариантах осуществления этот носитель может включать в себя липосому, микрокапсулу, инкапсулированную полимером клетку или вирус. Таким образом, термин фармацевтически приемлемый носитель включает в себя, но не ограничивается ими, любые стандартные фармацевтически признанные носители, такие как вода, спирты, забуференный фосфатом солевой раствор, сахара (например,сахароза или маннит), масла или эмульсии, такие как эмульсии типа масло/вода или триглицеридная эмульсия, различные типы увлажняющих агентов, таблетки, таблетки с покрытием и капсулы. Введение RAGE-слитых белков данного изобретения может использовать различные способы. Так,введение RAGE-слитого белка данного изобретения может использовать внутрибрюшинную (IP) инъекцию. Альтернативно, RAGE-слитый белок может вводиться перорально, интраназально или в виде аэрозоля. В другом варианте осуществления введение является внутривенным (IV). RAGE-слитый белок может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществления, введение этого слитого белка является внутриартериальным. В другом варианте осуществления введение является сублингвальным. Введение может также использовать капсулу с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте осуществления введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозитория или т.п. Например, подкожное введение может быть применимо для лечения хронических нарушений,когда желательным является самостоятельное введение. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного инъекционного раствора в нетоксичном парентерально приемлемом растворителе или носителе. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, находятся вода, раствор Рингера, 3-бутандиол, изотонический раствор хлорида натрия или водные буферы, такие как, например, физиологически приемлемые цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буферы. Инъекционный раствор может содержать стабилизаторы для защиты против химической деградации и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать в себя антиоксиданты, такие как бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), буферы (цитратный, глициновый, гистидиновый) или поверхностно-активные вещества (полисорбат 80, полоксамеры). Этот раствор может также содержать антимикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Этот раствор может также содержать поверхностно-активные вещества для уменьшения агрегации, такие как полисорбат 80,полоксомер или другие поверхностно-активные вещества, известные в данной области. Этот раствор может также содержать другие добавки, такие как сахар (сахара) или солевой раствор, для коррекции осмотического давления композиции, чтобы оно было сходным с осмотическим давлением крови человека. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного лиофилизированного порошка для инъекции после воссоздания с разбавителем. Этим разбавителем может быть вода для инъекции, бактериостатическая вода для инъекции или стерильный солевой раствор. Лиофилизированный порошок может быть получен лиофилизацией раствора слитого белка для получения этого белка в сухом виде. Как- 27012586 известно в данной области, лиофилизированный белок обычно имеет увеличенную стабильность и более продолжительный период хранения, чем жидкий раствор этого белка. Лиофилизированный порошок(брикет) может содержать буфер для коррекции рН, такой как, например, физиологически приемлемый цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буфер. Этот лиофилизированный порошок может также содержать лиопротекторы для поддержания его физической и химической стабильности. Обычно используемыми лиопротекторами являются нередуцирующие сахара и дисахариды, такие как сахароза, маннит или трегалоза. Лиофилизированный порошок может содержать стабилизаторы для защиты против деградации и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, антиоксиданты (ВНА, ВНТ), буферы (цитратный, глициновый, гистидиновый) или поверхностно-активные вещества (полисорбат 80, полоксамеры). Лиофилизированный порошок может также содержать антимикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Лиофилизированный порошок может также содержать поверхностно-активные вещества для уменьшения агрегации, такие как, но не только, Полисорбат 80 и полоксомер. Лиофилизированный порошок может также содержать добавки (например, сахара или солевой раствор) для коррекции осмотического давления, чтобы оно было сходным с осмотическим давлением крови человека после воссоздания этого порошка в раствор. Лиофилизированный порошок может также содержать наполнители, такие как сахара и дисахариды. Фармацевтические композиции для инъекции могут находиться также в форме маслянистой суспензии. Эта суспензия может быть приготовлена в соответствии с известными способами с применением подходящих диспергирующих и увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, описанных выше. Кроме того, стерильные, нелетучие масла обычно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Например, любое легкое нелетучее масло может быть использовано с использованием синтетических моно- или диглицеридов. Масляные суспензии могут быть также приготовлены суспендированием активного ингредиента в растительном масле, например арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Например, в приготовлении инъекционных растворов находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Масляные суспензии могут содержать загущающий агент, например пчелиный воск,твердый парафин или цетиловый спирт. Эти композиции могут сохраняться добавлением антиоксиданта,такого как аскорбиновая кислота. Фармацевтические композиции данного изобретения могут также быть в форме эмульсий типа масло в воде или водных суспензий. Масляной фазой может быть растительное масло, например оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смесь. Подходящими эмульгирующими агентами могут быть природно встречающиеся камеди, например, аравийская камедь или трагакантовая камедь, природно встречающиеся фосфатиды, например, соя, лецитин и сложные эфиры или неполные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гекситов, например моноолеат сорбитана, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитан. Водные суспензии могут также содержать активные соединения в смеси с эксципиентами. Такие эксципиенты могут включать в себя суспендирующие агенты, например натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон,трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или увлажняющие агенты, такие как природно встречающийся фосфатид, такой как лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гекситов, например моноолеат полиэтиленсорбитана. Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для приготовления водной суспензии добавлением воды, могут обеспечивать активное соединение в смеси с диспергирующим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие консерванты, диспергирующие агенты и суспендирующие агенты описаны выше. Эти композиции могут быть в форме суппозиториев для ректального введения соединений данного изобретения. Эти композиции могут быть приготовлены смешиванием лекарственного средства с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают в себя, например, какао-масло и полиэтиленгликоли. Для местного применения могут быть использованы кремы, мази, гели, растворы или суспензии,содержащие соединения этого изобретения. Местные применения могут также включать в себя жидкости для промывания полости рта и полоскания горла. Могут быть использованы подходящие консерванты,антиоксиданты, такие как ВНА и ВНТ, диспергирующие агенты, поверхностно-активные вещества или буферы.- 28012586 Соединения данного изобретения могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные пузырьки (везикулы), большие однослойные пузырьки и многослойные пузырьки. Липосомы могут быть приготовлены из различных фосфолипидов, таких как холестерин,стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах осуществления соединения данного изобретения могут быть модифицированы для дополнительного замедления клиренса из кровотока метаболическими ферментами. В одном варианте осуществления эти соединения могут быть модифицированы ковалентным присоединением водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры ПЭГ и полипропиленгликоля, поливинилпирролидон или полипролин, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт и т.п. Такие модификации могут также увеличивать растворимость этого соединения в водном растворе. Полимеры, такие как ПЭГ, могут быть ковалентно присоединены к одному или нескольким реакционноспособным аминоостаткам, сульфгидрильным остаткам или карбоксильным остаткам. Были описаны многочисленные активированные формы ПЭГ, в том числе активные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в частности, такие, в которых уходящими (отщепляемыми) группами являются N-гидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-3-сульфон,для реакции с аминогруппами, многомодальные или галогенацетильные производные для реакции с сульфгидрильными группами, и производные аминогидразина или гидразида для реакции с углеводными группами. Дополнительные способы получения белковых композиций, которые могут быть использованы со слитыми беклами данного изобретения, описаны в патентах США 6267958 и 5567677. В следующем аспекте данного изобретения модуляторы RAGE данного изобретения используются в адъювантных терапевтических или комбинированных терапевтических способах лечения с другими известными терапевтическими агентами. Далее приведен неисчерпывающий перечень адъювантов и дополнительных терапевтических агентов, которые могут быть использованы в комбинации с модуляторами RAGE-слитых белков данного изобретения: Фармакологические классификации противораковых агентов: 1. Алкилирующие агенты: циклофосфамид, нитрозомочевины, карбоплатин, цисплатин, прокарбазин. 2. Антибиотики: блеомицин, даунорубицин, доксорубицин. 3. Антиметаболиты: метотрексат, цитарабин, фторурацил. 4. Алкалоиды растений: винбластин, винкристин, этопозид, паклитаксел. 5. Гормоны: тамоксифен, октреотида ацетат, финастерид, флутамид. 6. Модификаторы биологической реакции: интерфероны, интерлейкины. Фармакологические классификации для лечения ревматоидного артрита: 1. Анальгетики: аспирин. 2. NSAID (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства): ибупрофен, напроксен,диклофенак. 3. DMARD (модифицирующие заболевание противоревматические лекарственные средства): метотрексат, препараты золота, гидроксихлороквин, сульфазалазин. 4. Модификаторы биологической реакции, DMARD: этанерцепт, инфликсимаб, глюкокортикоиды. Фармакологические классификации для лечения сахарного диабета: 1. Сульфонилмочевины: толбутамид, толазамид, глибурид, глипизид. 2. Бигуанидины: метформин. 3. Разносторонние пероральные агенты: акарбоза, троглитазон. 4. Инсулин. Фармакологические классификации для лечения болезни Альцгеймера: 1. Ингибитор холинэстеразы: такрин, донепезил. 2. Антипсихотические средства: галоперидол, тиоридазин. 3. Антидепрессанты: дезипрамин, флуоксетин, тразодон, пароксетин. 4. Противосудорожные средства: карбамазепин, вальпроевая кислота. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение может обеспечивать способ лечения опосредуемых RAGE заболеваний, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в нем, терапевтически эффективного количества RAGE-слитого белка в комбинации с терапевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, алкалоидов растений, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологической реакции, анальгезирующих агентов,NSAID, DMARD, глюкокортикоидов, сульфонилмочевин, бигуанидов, инсулина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических средств, антидепрессантов и антиконвульсантов (противосудорожных средств). В дополнительном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию данного изобретения, описанную выше, дополнительно содержащую один или несколько терапевтических агентов, выбранных из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, алкалоидов растений, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологической реакции,анальгезирующих агентов, NSAID, DMARD, глюкокортикоидов, сульфонилмочевин, бигуанидов, инсу- 29012586 лина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических средств, антидепрессантов и антиконвульсантов(противосудорожных средств). Примеры Признаки и преимущества идеи изобретения, охватываемой данным изобретением, иллюстрируются дополнительно в следующих далее примерах. Пример 1. Получение слитых белков RAGE-Fc IgG. Конструировали две плазмиды для экспрессии слитых белков RAGE-Fc IgG. Обе плазмиды конструировали лигированием различных длин 5'-кДНК-последовательности из RAGE человека с той же самой 3'-кДНК-последовательностью из Fc IgG человека (1). Затем эти экспрессионные последовательности (т.е. продукты лигирования) встраивали в экспрессирующий вектор pcDNA3.1 (Invitrogen, CA). Последовательности нуклеиновых кислот, которые являются кодирующим районом слитого белка, показаны на фиг. 2 и 3. Для слитого белка ТТР-4000 последовательность нуклеиновой кислоты 1-753 (выделенная жирным шрифтом) кодирует N-концевую последовательность белка RAGE, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты 754-1386 кодирует последовательность Fc-белка IgG (фиг. 2). Для ТТР 3000, последовательность нуклеиновой кислоты 1-408 (выделенная жирным шрифтом) кодирует Nконцевую последовательность белка RAGE, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты 4091041 кодирует последовательность Fc-белка IgG (фиг. 3). Для получения RAGE-слитых белков экспрессирующие векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот либо SEQ ID NO:30, либо SEQ ID NO:31, стабильно трансфицировали в клетки СНО. Положительные трансформанты отбирали на устойчивость к неомицину, сообщаемую этой плазмидой, и клонировали. Высокопроизводительные клоны, детектируемые при помощи Вестерн-блот-анализа супернатанта,размножали и продукт гена очищали аффинной хроматографией с использованием Белок А-колонок. Экспрессию оптимизировали таким образом, что клетки продуцировали рекомбинантный ТТР-4000 при уровнях приблизительно 1,3 г/л. Экспрессируемые полипептиды, представляющие два слитых белка, иллюстрированы на фиг. 4-6. Для содержащей четыре домена структуры ТТР-4000, первые 251 аминокислота (показанные жирным шрифтом на фиг. 4) содержат сигнальную последовательность (1-22/23), иммуноглобулиновый (и лигандсвязывающий) V-домен (23/24-116), второй междоменный линкер (117-123), второй иммуноглобулиновый домен (CH2) (124-221) и второй линкер (222-251) RAGE-белка человека (фиг. 4, 6 В). Последовательность 252-461 включает в себя иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 IgG. Для содержащей три домена структуры ТТР-3000, первые 136 аминокислот (показанные жирным шрифтом) содержат сигнальную последовательность 1-22/23) иммуноглобулиновый (и лигандсвязывающий) V-домен (23/24-116) и междоменную линкерную последовательность (117-136) RAGE-белка человека (фиг. 5, 6 В). Кроме того, для TT3 последовательность 137-346 включает в себя иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 IgG. Пример 2. Способ испытания активности слитого белка RAGE-IgG1. А. Связывание лиганда in vitro. Известные лиганды RAGE наносили в виде покрытия на поверхность планшетов Maxisorb в концентрации 5 мкг на лунку. Планшеты инкубировали при 4 С в течение ночи. После инкубирования лигандов планшеты аспирировали и в планшеты добавляли блокирующий буфер 1% БСА в 50 мМ имидазоловом буфере (рН 7,2) и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты аспирировали и/или промывали промывочным буфером (20 мМ имидазол, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, 5 мМ CaCl2 и 5 мМ MgCl2, рН 7,2). Готовили раствор ТТР-3000 (TT3) в исходной концентрации 1,082 мг/мл и раствор ТТР-4000 (ТТ 4) в исходной концентрации 370 мкг/мл. Этот слитый белок добавляли при увеличивающихся разведениях исходной пробы. RAGE-слитому белку давали инкубироваться с иммобилизованным лигандом при 37 С в течение одного часа, после чего этот планшет промывали и анализировали на связывание слитого белка. Связывание детектировали добавлением комплекса иммунодетектирования, содержащего моноклональное мышиное антитело против IgG1 человека, разведенное 1:11000 до конечной тест-концентрации (FAC) 21 нг/100 мкл, биотинилированное козье антитело против мышиного IgG, разведенное 1:500, до FAC 500 нг/мкл, и связанную с авидином щелочную фосфатазу. Этот комплекс инкубировали с иммобилизованным слитым белком в течение одного часа при комнатной температуре, после чего планшет промывали и добавляли субстрат для щелочной фосфатазы паранитрофенилфосфат (PNPP). Связывание этого комплекса с иммобилизованным слитым белком определяли количественно измерением превращения PNPP в пара-нитрофенол (PNP), который измеряли спектрофотометрически при 405 нм. Как показано на фиг. 7, слитые белки ТТР-4000 (ТТ 4) и ТТР-3000 (TT3) специфически взаимодействуют с известными лигандами RAGE амилоидом-бета (Abeta), S100b (S100) и амфотерином (Ampho). В отсутствие лиганда, т.е. только с БСА-покрытием (БСА или БСА + промывка), не было увеличения оптической плотности в сравнении с уровнями, относимыми к неспецифическому связыванию комплекса иммунодетектирования. При использовании амилоида-бета в качестве меченого лиганда может быть необходимым предынкубирование амилоида-бета перед анализом.
МПК / Метки
МПК: C12N 15/62, A61K 38/17, C07K 14/705
Метки: способы, применения, белки, слитые
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-12586-rage-slitye-belki-i-sposoby-ih-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Rage – слитые белки и способы их применения</a>
Предыдущий патент: Соединения и способы лечения дислипидемии
Следующий патент: Биотинилированные гексадекасахариды, их получение и применение
Случайный патент: Способ и система программирования и воспламенения электронных детонаторов