Слитые белки taci-иммуноглобулина

010594 Область изобретения Данное изобретение, в целом, относится к усовершенствованным слитым белкам, содержащим фрагмент рецептора фактора некроза опухоли и фрагмент иммуноглобулина. В частности, данное изобретение относится к усовершенствованным TACI-иммуноглобулиновым слитым белкам. Предпосылки изобретения Цитокины являются растворимыми небольшими белками, которые опосредуют ряд биологических эффектов, включая регуляцию роста и дифференциации многих типов клеток (см., например, Arai et al.,Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3/311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994. Белки, которые составляют группу цитокинов, включают интерлейкины, интерфероны,колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухоли и другие регуляторные молекулы. Например, интерлейкин-17 человека является цитокином, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6,внутриклеточной адгезионной молекулы 1, интерлейкина-8, колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов и экспрессию простагландина Е 2 и играет роль в избирательном созревании гемопоэтических предшественников CD34+ в нейтрофилы (Yao et al., Immunol. 755:5483 (1995); Fossiez et al., J.Exp. Med. 183:2593 (1996. Рецепторы, которые связывают цитокины, являются типично состоящими из одного или нескольких интегральных мембранных белков, которые связывают цитокины с высокой аффинностью и передают этот результат связывания в клетку через цитоплазматические участки определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокинов сгруппированы в несколько классов на основе сходств в их внеклеточных лиганд-связывающих доменах. Например, рецепторные цепи, ответственные за связывание и/или трансдукцию действия интерферонов, являются членами рецепторного семейства цитокинов II типа, основанного на характеристике внеклеточного домена из 200 остатков. Клеточные взаимодействия, которые происходят во время иммунного ответа, регулируются членами нескольких семейств поверхностных клеточных рецепторов, включая рецепторное семейство фактора некроза опухоли (TNFR). Семейство TNFR состоит из ряда интегральных мембранных гликопротеиновых рецепторов, многие из которых, связываясь с их соответствующими лигандами, регулируют взаимодействия между различными гемопоэтическими клеточными линиями (см., например, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev. 70:15 (1999); Yeh et al., Immunol. Rev. 169:283(1999); Idriss and Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000. Одним таким рецептором является TACI, трансмембранный активатор, и взаимодействующий с(1999. TACI является мембранно-связанным рецептором, который имеет внеклеточный домен, имеющий в своем составе две обогащенные цистеином псевдоповторности, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который взаимодействует с CAML (кальциевым модулятором и циклофилиновым лигандом), интегральный мембранный белок, локализованный во внутриклеточных везикулах, который является коиндуктором активации NF-AT при сверхэкспрессии в клетках Журката. TACI ассоциированы с В-клетками и субпопуляцией Т-клеток. Нуклеотидные последовательности, которые кодируютTACI и соответствующую ему аминокислотную последовательность, даны здесь как SEQ ID, номера 1 и 2 соответственно. Рецептор TACI связывает два члена семейства лигандов фактора некроза опухоли (TNF). Один лиганд, по-разному определяемый, как ZTNF4, "BAFF", "нейтрокин-", "BlyS", "TALL-1" и "THANK" (YuNO:3. Другой лиганд назвали как "ZTNF2", "APRIL" и "лиганд гибели-1 TNRF" (Hahne et al., J. Exp. Med. 788:1185 (1998); Kelly et al., Cancer Res. 60:1021 (2000. Аминокислотную последовательность ZTNF2 представляют как SEQ ID NO:4. Оба лиганда также связываются рецептором созревания В-клеток(ВСМА) (Gross et al., Nature 404:995 (2000. Нуклеотидную и аминокислотную последовательность ВСМА представляют как SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27 соответственно. Показанная in vivo активность рецепторов фактора некроза опухоли иллюстрирует клинические возможности растворимых форм рецептора. Растворимые формы рецептора TACI были синтезированы в виде иммуноглобулиновых слитых белков. Первоначальные варианты давали в результате слабо экспрессируемый гетерогенный белок. Гетерогенность наблюдали в аминоконце TACI, в карбоксильном конце Fc и в стволовой области TACI. Следовательно, существует необходимость в фармацевтически пригодных композициях рецептора TACI. Сущность изобретения Данное изобретение предусматривает усовершенствованные слитые TACI-иммуноглобулиновые белки, пригодные в качестве терапевтических композиций. Краткое описание чертежей Фиг. 1 демонстрирует аминокислотную последовательность TACI человека. Положения богатых цистеином псевдоповторностей заштрихованы, трансмембранный домен помещен в рамку, и стволовой участок показан мелкими черточками.-1 010594 Фиг. 2 представляет собой схематический чертеж иммуноглобулина подкласса IgG1. CL: константная область легкой цепи; CH1, CH2, CH3: константные области тяжелой цепи; VL: вариабельная область легкой цепи; VH: вариабельная область тяжелой цепи; СНО: углевод; N: аминоконец; С: карбоксильный конец. Фиг. 3 А, 3 В, 3 С и 3D показывают сравнение аминокислотной последовательности константной области Fc 1 дикого типа человека с вариантами Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 и Fc8. CH1-домен константной области 1 человека не является частью Fc и поэтому не показан. Показана локализация шарнирного участка CH2- и CH3-доменов. Отмечены остатки Cys, которые обычно вовлечены в дисульфидные связи константной области легкой цепи (LC) и константной области тяжелой цепи (НС). Обозначение . показывает идентичность с диким типом в этом положении, тогда какобозначает локализацию карбоксильного конца и иллюстрирует различия в карбоксильном конце Fc6 относительно других вариантов Fc. Положения аминокислот обозначены по индексной позиции Европейского сообщества. Фиг. 4 показывает специфическое связывание 125I-ZTNF4 с различными конструкциями TACI-Fc. Слитые белки TACI-Fc содержат фрагменты TACI, у которых отсутствуют первые 29 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. Один из слитых белков содержит фрагментTACI с интактной стволовой областью (TACI(d1-29)-Fc5), тогда как три из слитых белков TACI-Fc содержат фрагменты TACI с различными делециями в стволовой области (TACI(d1-29, d107-154)-Fc5;(TACI(d1-29, d111-154)-Fc5; (TACI(d1-29, d120-154)-Fc5. Экспериментальные подробности описывают в примере 4. Подробное описание изобретения 1. Обзор. Как описано ниже, данное изобретение предусматривает слитые белки трансмембранного активатора и кальциевого модулятора, взаимодействующие с циклофилиновым лигандом (TACI) с иммуноглобулинами, и способы применения TACI-иммуноглобулиновых слитых белков. Например, настоящее изобретение предоставляет способы ингибирования пролиферации опухолевых клеток, предусматривающие введение в опухолевые клетки композиции, которая содержит слитый белок TACI-иммуноглубулина. Такая композиция может быть введена в клетки, культивируемые in vitro. Альтернативно, композиция может быть фармацевтической композицией, которая состоит из фармацевтически приемлемого носителя и слитого белка TACI-иммуноглобулина, и фармацевтическая композиция может быть введена субъекту, который имеет опухоль. Субъект может быть млекопитающим субъектом. Введение фармацевтической композиции может ингибировать, например, пролиферацию В-лимфоцитов у млекопитающего субъекта. Данное изобретение также предоставляет способы ингибирования активности ZTNF4 у млекопитающего, предусматривающие введение млекопитающему композиции, которая содержит TACIиммуноглобулин. Активность ZTNF4 может быть ассоциирована с различными болезнями и нарушениями. Например, фармацевтическая композиция, которая содержит слитый белок TACI-иммуноглобулина может быть использована для лечения аутоиммунных болезней, таких как системная красная волчанка,астенический бульбарный паралич, рассеянный склероз, инсулинзависимый сахарный диабет, болезнь Крона, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный полиартрит и псориатический артрит. Альтернативно, фармацевтическая композиция, которая содержит TACI-иммуноглобулин, может быть использована для лечения расстройства, такого как астма, бронхит, эмфизема и последняя стадия почечной недостаточности. Фармацевтическая композиция, предусматривающая TACI-иммуноглобулин, может быть также использована для лечения почечного заболевания, такого как гломерулонефрит, васкулит, нефрит,амилоидоз и пиелонефрит, или расстройства, такого как неоплазма, хроническая лимфоцитарная лейкемия, множественная миелома, неходчкинкская лимфома, посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение и легкая цепь гаммопатии. В определенных случаях активность ZTNF4 может быть ассоциирована с Т-клетками. Фармацевтическая композиция, которая содержит TACI-иммуноглобулин, может быть также использована для лечения заболевания или нарушения, связанного с иммуносупрессией,отторжением трансплантата, реакцией трансплантат против хозяина и воспаления. Например, фармацевтическая композиция, которая содержит TACI-иммуноглобулин может быть использована для уменьшения воспаления и для лечения нарушений, таких как суставная боль, опухоль, анемия и септический шок. Данное изобретение также предоставляет способы снижения циркулирующих уровней ZTNF4 в крови у млекопитающих субъектов, предусматривающие введение млекопитающему субъекту фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и слитый белокTACI-иммуноглобулина, причем введение фармацевтической композиции снижает циркулирующий уровень ZTNF4 в крови млекопитающего субъекта. В качестве иллюстрации введение такой фармацевтической композиции может снизить циркулирующий уровень ZTNF4 в крови по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10-60%, по меньшей мере на 20-50% или по меньшей мере на 30-40% по сравнению с уровнем ZTNF4 в крови перед введением фармацевтической композиции. Специалисты в данной области могут измерить циркулирующие уровни ZTNF4. Иллюстративные способы-2 010594 описывают в примерах 4 и 5. Как описано ниже, иллюстративные слитые белки TACI-иммуноглобулина содержат:(а) фрагмент рецептора TACI, который состоит из фрагмента полипептида, который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 последовательности SEQ ID NO:2,причем фрагмент рецептора TACI содержит по меньшей мере один из (i) аминокислотных остатков с 34 по 66 последовательности SEQ ID NO:2 и (ii) аминокислотные остатки с 71 по 104 последовательностиSEQ ID NO:2, и причем компонент рецептора TACI связывает по меньшей мере один из ZTNF2 или(b) фрагмент иммуноглобулина, содержащий константную область иммуноглобулина. Подходящие фрагменты рецептора TACI включают: полипептиды, которые содержат аминокислотные остатки с 34 по 66 последовательности SEQ ID NO:2 и аминокислотные остатки с 71 до 104 SEQ ID NO:2; полипептиды,которые содержат аминокислотные остатки с 34 по 104 SEQ ID NO:2; полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 110 SEQ ID NO:2 и полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 30 по 110 SEQ ID NO:2. Иммуноглобулиновый фрагмент слитого белка TACI-иммуноглобулина может содержать константную область тяжелой цепи, например константную область тяжелой цепи человека. Константная область тяжелой цепи IgG1 представляет один пример пригодной константной области тяжелой цепи. Иллюстративной константной областью тяжелой цепи IgG1 является Fc-фрагмент IgG1, который содержит домены CH2 и CH3. Fc-фрагмент IgG1 может быть Fc-фрагментом дикого типа IgG1 или видоизмененным Fc-фрагментом IgG1, таким как фрагмент Fc, содержащий аминокислотную последовательностьSEQ ID NO:33. Одним типичным слитым белком TACI-иммуноглобулина является белок, который содержит аминокислотную последовательность, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO:54. Слитые белки TACI-иммуноглобулина, описанные здесь, могут быть мультимерами, например димерами. Данное изобретение также предоставляет молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют слитый белок TACI-иммуноглобулина. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует слитый белок TACI-иммуноглобулина представлена последовательностью SEQ ID NO:53. Данное изобретение также включает в себя растворимые рецепторы TACI, которые состоят из фрагмента полипептида, который имеет аминокислотную последовательность аминокислотных остатков с 30 по 154 SEQ ID NO:2, причем растворимый рецептор TACI содержит по меньшей мере один из (i) аминокислотных остатков с 34 по 66 SEQ ID NO:2 и (ii) аминокислотные остатки с 71 по 104 SEQ ID NO:2, и причем растворимый рецептор TACI связывает по меньшей мере один из ZTNF2 или ZTNF4. Дополнительные растворимые рецепторы TACI описывают здесь в виде подходящих фрагментов рецептора TACI для слитых белков TACI-иммуноглобулинов. Кроме того, растворимые рецепторы TACI могут быть использованы в способах, описанных для слитых белков TACI-иммуноглобулинов. Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными из ссылки к следующему детальному описанию и фигурам. Кроме того, различные ссылки представляют ниже. 2. Определения. В последующем описании широко используют ряд терминов. Нижеследующие определения представлены для облегчения понимания изобретения. Как используется здесь, нуклеиновая кислота или молекула нуклеиновой кислоты относится к полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота(РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, синтезированным полимеразной цепной реакцией (ПЦР), и фрагментам, произведенным любым из эндонуклеазных действий и экзонуклеазных действий - лигирования, разрезания. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть составлены из мономеров, которые являются природными нуклеотидами (таких как ДНК и РНК), или аналогов природных нуклеотидов (например, -энантиомерных форм природных нуклеотидов), или сочетания обоих. Модифицированные нуклеотиды могут иметь перестройки в сахарных остатках и/или в остатках пиримидиновых или пуриновых оснований. Модифицирование сахаров включает, например, замещение одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, щелочными группами, аминами и азидными группами, или сахара могут быть функционализированы в виде простых или сложных эфиров. Кроме того, целый сахарный остаток может быть замещен пространственно и электронно сходными структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примеры модификаций в основе остатка включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины, или другие хорошо известные гетероциклические замещения. Мономеры нуклеиновых кислот могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфоранилитад, фосфороамидат и т.п. Термин "молекула нуклеиновой кислоты также включает так называемые пептидные нуклеиновые кислоты, которые состоят из природных или модифицированных оснований нуклеиновых кислот, присоединенных к полиамидной основе. Нуклеиновые кислоты могут быть или одноцепочечными, или-3 010594 двухцепочечными. Термин комплементарная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарную нуклеотидную последовательность и противоположное направление по сравнению с эталонной нуклеотидной последовательностью. Например, последовательность 5'ATGCACGGG 3' (SEQ ID NO:57) является комплиментарной последовательности 5'CCCGTGCAT 3'(SEQ ID NO:58). Термин контиг означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая имеет прилегающий отрезок идентичной или комплементарной последовательности другой молекуле нуклеиновой кислоты. Прилегающие последовательности, говорят, перекрывают данный отрезок молекулы нуклеиновой кислотой или полностью, или на частичном протяжении молекулы нуклеиновой кислоты. Термин вырожденная нуклеотидная последовательность означает последовательность нуклеотидов, которая включает один или несколько вырожденных кодонов по сравнению с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют тот же аминокислотный остаток (например, триплеты GAU и GAC каждый кодирует Asp). Термин структурный ген относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в матричную РНК (мРНК), которая затем транслируется в аминокислотную последовательность, характерную для конкретного полипептида. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая не является интегрированной (пер., встроенной) в геномную ДНК организма. Например,молекула ДНК, которая кодирует фактор роста, которая была отделена от геномной ДНК клетки, является изолированной молекулой ДНК. Другим примером изолированной молекулы ДНК является молекула химически синтезированной нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которая выделена из отдельных видов, является меньшей, чем целая молекула ДНК хромосомы тех же видов. Молекулярная конструкция нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты или одно- или двухцепочечной, которая была модифицирована посредством человеческого вмешательства таким образом, что она содержит в себе участки нуклеиновой кислоты, скомбинированные и соединенные в расположении, не существующем в природе. Линейная ДНК означает некольцевые молекулы ДНК, имеющие свободные 5' и 3' концы. Линейная ДНК может быть получена из замкнутых кольцевых молекул ДНК, таких как плазмидные, путем энзиматического переваривания или физического разрыва. Комплементарная ДНК (кДНК) означает одноцепочечную молекулу ДНК, которая образована из матричной мРНК ферментом обратной транскриптазой. Типично, затравка, комплементарная участку мРНК, используется для инициации обратной транскрипции. Специалисты в данной области также используют термин кДНК, который относится к двухцепочечной молекуле ДНК, состоящей из такой одноцепочечной молекулы ДНК и ей комплементарной нити ДНК. Термин кДНК также относится к клону молекулы кДНК, синтезированному из РНК-матрицы. Промотор означает нуклеотидную последовательность, которая направляет транскрипцию структурного гена. Типично, промотор локализован на 5' некодирующем участке гена, ближайшем к сайту начала танскрипции структурного гена. Последовательность элементов внутри промоторов, функция которых в инициации транскрипции, часто отличается консенсусными нуклеотидными последовательностями. Такие промоторные элементы включают РНК-полимеразные связывающие сайты, ТАТАпоследовательности, СААТ-последовательности, специфические для дифференциации элементы (DSEs;McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993, элементы ответа на циклический АМФ (CREs), сывороточные элементы ответа (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 7:47 (1990, элементы ответа на глюкокорикоид (GREs) и связывающие сайты других факторов транскрипции, таких как CRE/ATF (O'Reilly et al.,J. Biol. Chem. 267:19938 (1992, AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994, SP1, белок, связывающий цАМФ-элемент ответа (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993 и октамерные факторы (см. вообще, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) и Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994. Если промотор является индуцибельным промотором, тогда скорость траскрипции возрастает в ответ на индуцирующий агент. Наоборот, скорость траскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором. Репрессируемые промоторы также известны. Коровый промотор содержит нуклеотидные последовательности, существенные для функции промотора, включая ТАТА-бокс и последовательность начала транскрипции. Согласно этому определению коровый промотор может или не может иметь обнаруживаемую активность в отсутствие специфических последовательностей, которые могут усиливать активность, или придавать тканеспецифическую активность. Регуляторный элемент означает нуклеотидную последовательность, которая изменяет активность корового промотора. Например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последовательность, которая связывается с клеточными факторами, разрешающими исключительно транскрипцию, или-4 010594 предпочтительно в отдельных клетках, тканях или органеллах. Такие типы регуляторных элементов обычно ассоциированы с генами, которые экспрессируются в клеточно-специфичной, тканеспецифичной или органельно-специфичной манере. Энхансер означает тип регуляторного элемента, который может усиливать эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации энхансера относительно сайта начала транскрипции. Гетерологичная ДНК относится к молекуле ДНК или популяции молекул ДНК, которая не существует естественным образом внутри данной хозяйской клетки. Молекулы ДНК, гетерологичные по отношению к конкретной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, полученную из разновидностей клеткихозяина (например, эндогенная ДНК), при условии, что хозяйская ДНК скомбинирована с нехозяйской ДНК (например, экзогенной ДНК). Например, молекула ДНК, содержащая отрезок нехозяйской ДНК,кодирующей полипептид, пришита в результате манипуляций к отрезку хозяйской ДНК, содержащему транскрипционный промотор, считается, должна быть гетерологичной молекулой ДНК. Наоборот, гетерологичная молекула ДНК может содержать эндогенный ген, связанный в результате манипуляций с экзогенным промотором. В качестве другой иллюстрации, молекула ДНК, содержащая ген, полученный из клетки дикого типа, считается, должна быть гетерологичной ДНК, если такую молекулу ДНК внедряют в мутантную клетку, в которой отсутствует ген дикого типа. Полипептид означает полимер аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями,созданный или природным путем, или икусственно. Полипептиды меньше чем около 10 аминокислотных остатков обычно относят к пептидам. Белок означает макромолекулу, содержащую один или несколько полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой белок ситезируется, и будут изменяться вместе с типом клетки. В этом патенте белки определяют на основе их аминокислотной структуры основной цепи; заместители, такие как углеводные группы, вообще не указывают, но тем не менее, заместители могут присутствовать. Пептид или полипептид, кодируемый нехозяйской молекулой ДНК, является гетерологичным пептидом или полипептидом. Интегрированный генетический элемент означает отрезок ДНК, который внедрили в хромосому хозяйской клетки, после чего этот элемент вводили в клетку посредством манипуляций человека. В рамках настоящего изобретени, интегрированные генетические элементы чаще всего получают из линеаризованных плазмид, которые вводят внутрь клетки электропорацией или другими способами. Интегрированные генетические элементы передаются из исходной клетки-хозяина ее потомству. Клонирующий вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, например плазмидной, космидной или бактериофага, которая обладает способностью реплицироваться автономно в хозяйской клетке. Клонирующие векторы типично содержат в себе один сайт или небольшое число сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеазами, которые делают возможной инсерцию молекулы нуклеиновой кислоты в устанавливаемой манере без потери существенной биологической функции вектора, так же, как и нуклеотидной последовательности, кодирующей маркерный ген, который является подходящим для использования в идентификации и селекции клеток, трансформированных клонирующим вектором. Маркерные гены типично включают в себя гены, которые придают устойчивость к тетрациклину и устойчивость к ампициллину. Экспрессионный вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, который экспрессируется в хозяйской клетке. Типично, экспрессионный вектор содержит транскрипционный промотор, ген и терминатор транскрипции. Экспрессию гена обычно ставят под контроль промотра и такой ген, указывают, должен быть операбельно связан с промотором. Аналогично регуляторный элемент и коровый промотор являются операбельно связанными, если регуляторный элемент регулирует активность корового промотора. Рекомбинантный хозяин означает клетку, которая содержит в себе гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, например клонирующий вектор или экспрессионный вектор. В настоящем контексте примером рекомбинантного хозяина является клетка, которая синтезирует слитый белок TACI-Fc из экспрессионного вектора. Интегративные трансформанты означает рекомбинантные хозяйские клетки, в которых гетерологичная ДНК становится интегрированной в геномную ДНКклеток. Слитый белок означает гибридный белок, экспрессированный молекулой нуклеиновой кислоты,содержащей нуклеотидные последовательности по меньшей мере двух генов. Например, слитый белокTACI-иммуноглобулина содержит фрагмент рецептора TACI и фрагмент иммуноглобулина. Как используют здесь, фрагмент рецептора TACI является участком внеклеточного домена рецептора TACI, который связывает по меньшей мере один из ZTNF2 или ZTNF4. Фраза иммуноглобулиновый фрагмент имеет отношение к полипептиду, который содержит константную область иммуноглобулина. Например,иммуноглоубулиновый фрагмент может содержать константную область тяжелой цепи. Термин слитый белок TACI-Fc относится к слитому белку TACI-иммуноглобулина, в котором иммуноглобулиновый фрагмент содержит константные области иммуноглобулиновой тяжелой цепи, CH2 и CH3.-5 010594 Термин рецептор означает ассоциированный с клеткой белок, который связывается с биологически активной молекулой, называемой лиганд. Это взаимодействие опосредует эффект лиганда на клетку. В контексте связывание рецептора TACI, фраза специфично связывает или специфичное связывание относится к способности лиганда к конкурентному связыванию с рецептором. Например, ZTNF4 специфически связывается с рецептором TACI, и это может быть показано путем наблюдения за конкуренцией за рецептор TACI между меченым, для обнаружения, ZTNF4 и немеченым ZTNF4. Рецепторы могут быть мембранно-связанными, цитоплазматическими или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреотропина, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например,PDGF-рецептор, рецептор гормона роста, рецептор IL-3, рецептор GM-CSF, рецептор G-CSF, рецептор эритропоэтина и рецептор IL-6). Мембранно-связанные рецепторы характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который типично вовлечен в передачу сигнала. У некоторых мембранно-связанных рецепторов внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен расположены в изолированных полипептидах, которые составляют полный функциональный рецептор. Вообще, связывание лиганда с рецептором приводит в результате к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другими молекулами(другой молекулой) в клетке, которое, в свою очередь, ведет к изменению клеточного метаболизма. Метаболические события, которые часто связаны с лиганд-рецепторными взаимодействиями, включают транскрипцию гена, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение синтеза циклического АМФ,мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитольных липидов и гидролиз фосфолипидов. Термин секреторная сигнальная последовательность означает последовательность ДНК, которая кодирует пептид (секреторный пептид), который в качестве компонента большего полипептида направляет больший полипептид по секреторному пути клетки, в которой он синтезируется. Больший полипептид, как правило, расщепляется для удаления секреторного пептида во время прохождения по секреторному пути. Изолированный полипептид означает полипептид, который является существенно свободным от примесных клеточных компонентов, таких как углеводы, липиды или другие белковые примеси, ассоциированные с полипептидом в природе. Типично получение изолированного полипептида включает в себя полипептид в высокоочищенном виде, т.е. по меньшей мере около 80%-ной чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, больше чем 95% чистоты или больше чем 99% чистоты. Одним из способов показать, что конкретное получение белка содержит изолированный полипептид, является появление одиночной полосы после электрофореза белкового препарата в полиакриламидном геле в додецилсульфате натрия (SDS) и окрашивания геля Кумасси бриллиантовым синим (Coomassie Brilliant Blue). Однако термин изолированный не исключает присутствия такого же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры, или альтернативно гликозилированные или производные формы. Термин аминоконцевой карбоксиконцевой используют здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Где позволяет контекст, эти термины используют со ссылкой на конкретную последовательность, или часть полипептида для обозначения пространственной близости, или относительного положения. Например, определенная последовательность, расположенная на карбоксильном конце,по отношению к исходной последовательности внутри полипептида является близлежащей к карбоксильному концу эталонной последовательности, но не обязательно находится в карбоксильном конце полного полипептида. Термин экспрессия относится к биосинтезу продукта гена. Например, в случае структурного гена экспрессия включает в себя транскрипцию структурного гена в мРНК и трансляцию мРНК в один или несколько полипептидов. Термин вариант сплайсинга используют здесь для обозначения альтернативных форм РНК,транскрибированных с гена. Варьирование сплайсинга происходит естественно вследствие использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибированной молекуле РНК, или реже, между отдельно транскрибированными РНК молекулами и могут давать в результате несколько матричных РНК, транскрибированных из того же гена. Варианты сплайсинга могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин вариант сплайсинга также используют здесь для обозначения полипептида, кодируемого вариантом сплайсинга мРНК, транскрибированной с гена. Как используют здесь, термин иммуномодулятор включает в себя цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимуляторные молекулы, гематопоэтические факторы и синтетические аналоги этих молекул. Термин пара комплемент/антикомплемент означает неидентичные фрагменты, которые образуют нековалентносвязанную, стабильную пару при соответствующих условиях. Например, авидин и биотин(или стрептавидин) являются прототипичными представителями пары комплемент/антикомплемент. Другой пример пары комплемент/антикомплемент включает пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен, или эпитоп), смысловые/антисмысловые полинуклеотидные пары и тому подоб-6 010594 ное. В тех случаях, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания меньшую, чем 109 М-1. Фрагмент антитела представляет собой фрагмент антитела, например F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab и тому подобное. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном,который узнается интактным антителом. Термин фрагмент антитела также включает искусственный или генноинженерный полипептид,который связывается со специфическим антигеном, например полипепептидами, состоящими из легкой цепи вариабельного участка, "Fv-фрагментами, состоящими из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, рекомбинантными одноцепочечными полипептидными молекулами, в которых легкие и тяжелые вариабельные участки связаны пептидным линкером ("scFv-белками") и минимальными единицами узнавания, состоящими из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный участок. Химерное антитело означает рекомбинантный белок, который содержит в себе вариабельные домены и участки, определяющие комплементарность, полученные от антитела грызуна, тогда как остаток молекулы антитела получен от антитела человека. Гуманизированные антитела представляют собой рекомбинантные белки, в которых мышиные участки, определяющие комплементарность моноклонального антитела, перенесли из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в вариабельный домен человека. Как используют здесь, терапевтический агент означает собой молекулу или атом, который конъюгирован с фрагментом антитела для получения конъюгата, который является полезным для терапии. Примеры терапевтических агентов включают лекарственные препараты, токсины, иммуномодуляторы,хелатирующие агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоизотопы. Детектируемая метка представляет собой молекулу или атом, которые могут быть конъюгированы с участком антитела для получения молекулы, пригодной для обнаружения. Примеры детектируемых меток включают комплексоны, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы или другие маркерные агенты. Термин аффинная метка используют здесь для обозначения отрезка полипептида, который может быть прикреплен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или обнаружения второго полипептида или предоставления сайтов прикрепления второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого антитело или другой специфический связывающий агент является доступным, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают полигистидиновый участок, протеинА (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Niisson et al., Methods Enzymol. 198:3(Grussemeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985, Р-вещество, FLAG-пептид (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1998, стрептавидин-связывающий пептид или другие антигенные эпитопы или связывающие домены. Вообще, см. Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Молекулы ДНК,кодирующие аффинные метки, являются доступными от коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Оголенное антитело означает целое антитело в противоположность фрагменту антитела, которое не конъюгировано с терапевтическим агентом. Оголенные антитела включают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также определенные рекомбинантные антитела, например химерные и гуманизированные антитела. Как используют здесь, антительный компонент включает в себя как целое антитело, так и антительный фрагмент. Иммуноконъюгат означает конъюгат антительного компонента с терапевтическим агентом или детектируемой меткой. Полипептид-мишень или пептид-мишень означает аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере один эпитоп и которая экспрессируется в клетке-мишени, такой как опухолевая клетка, или клетка, которая переносит антиген инфекционного агента. Т-клетки узнают пептидные эпитопы, представленные молекулой главного комплекса гистосовместимости на полипептидемишени или пептиде-мишени и типично лизируют клетку-мишень или призывают другие иммунные клетки к местонахождению клетки-мишени, таким образом, убивая клетку-мишень. Антигенный пептид означает пептид, который свяжет молекулу главного комплекса гистосовместимости с образованием МНС-пептидного комплекса, который узнается Т-клеткой, таким образом, индуцируя цитотоксический ответ лимфоцитов при представлении Т-клетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связываться с соответствующей молекулой главного комплекса гистосовместимости и индуцировать цитотоксический ответ Т-клеток, например клеточный лизис или выброс специфического цитокина, против клетки-мишени, которая связывает или экспрессирует антиген. Антигенный пептид может быть связан в контексте с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса или II класса на клетке, представляющей антиген, или на клетке-мишени. У эукариот, РНК-полимераза II катализирует транскрипцию структурного гена для получения мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована таким образом, чтобы содержать матрицу РНК-полимеразы II, в которой РНК-транскрипт имеет последовательность, которая комплемен-7 010594 тарна последовательности специфической мРНК. РНК-транскрипт называют антисмысловой РНК и молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антисмысловую РНК, называют антисмысловой ген. Молекулы антисмысловой РНК способны связываться с мРНК, приводя в результате к ингибированию трансляции мРНК. Вследствие погрешностей стандартных аналитических методов, понятно, что молекулярные массы и длины полимеров являются приблизительными. Если такие значения выражают как около X, или приблизительно X, то указанная величина X, будет понятным, является с точностью до 10%. 3. Получение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки TACI-иммуноглобулин. Фиг. 1 предоставляет прогнозируемую аминокислотную последовательность TACI человека (vonBlow and Bram, Science 278:138 (1997. Полипептид TACI содержит в себе следующие прогнозируемые элементы: (а) две богатых цистеином псевдоповторяющихся структуры, характерные для лигандсвязывающих доменов фактора некроза опухоли, (b) 62-аминокислотную стволовую область, которая находится между лиганд-связывающими доменами и трансмембранным доменом, (с) 20 тиаминокислотный трансмембранный домен и (d) 127-аминокислотный внутриклеточный домен. Аминокислотная последовательность не содержит прогнозированную гидрофобную аминоконцевую сигнальную последовательность. Для того чтобы создать растворимую форму TACI человека для использования в качестве ингибитора взаимодействия лиганд:нативный рецептор, создали слитый белок:внеклеточный домен TACI-Fc иммуноглобулин человека. Доступную последовательность TACI человека использовали в качестве начальной точки конструирования молекулы слитого белка (von Blow and Bram, Science 278:138 (1997. Эта исходная конструкция, обозначенная как TACI-Fc4, включающая аминокислотные остатки с 1 по 154 полипептида TACI и модифицированный участок Fc человека, описана ниже. Точку слияния 154-го остатка выбрали для присоединения как можно большего стволового участка TACI, при этом не включая любую возможную часть прогнозированного трансмембранного домена. Поскольку нативный полипептид TACI не содержит аминоконцевую сигнальную последовательность, то аминоконцевую сигнальную последовательность присоединяли к TACI для создания секретируемой формы слитого белка TACI-Fc. Сигнальной последовательностью была модифицированная препоследовательность-пропоследовательность активатора плазминогена ткани человека. Модификации были включены для усиления расщепления сигнальной пептидазой и процессинга протеазоспецифичного фурина, и по этой причине эта последовательность была названа как оптимизированная лидирующая последовательность tPA (otPA). Последовательность otPA (SEQ ID NO:25) представлена ниже; модифицированные аминокислотные остатки заштрихованы. Последовательность, кодирующая рекомбинантный слитый белок TACI-иммуноглобулина, встроили в экспрессионный вектор, который искусственно вводили в клетки яичника китайского хомячка. Трансфецированные клетки яичника китайского хомячка производили белок TACI-Fc4 на низком уровне от около 0,3 пкг/клетку/день. Вестерн-блот анализ белка TACI-Fc с козьей антисывороткой против Fc IgG человека выявил две полосы, одна полоса была меньше, чем ожидаемый размер, приблизительно 48 кДа. Анализ аминокислотной последовательности очищенных белков выявил, что меньшая полоса отображала расщепление слитых белков по разным сайтам внутри корового участка TACI. Обращаясь к последовательности SEQ ID NO:2, мажорный конец обнаружили на аминокислотных остатках 118 и 123, хотя белки также расщеплялись по аминокислотным остаткам в положениях 110, 139 и 141. В дополнение к гетерогенности, вызванной расщеплением в стволовой области, наблюдали также гетерогенность в аминоконце (N-конце) и карбоксильном конце (С-конце). Со ссылкой на SEQ ID NO:2 мажорный аминоконец обнаружили в положениях аминокислотных остатков 1, 10 и 13. Различия в карбоксильных концах отражают естественную гетерогенность рекомбинантных иммуноглобулинов и слитых иммуноглобулиновых белков, которые включают неполное удаление лизинового остатка, кодированного с карбоксиконца. Другую причину гетерогенности обнаружили в вариабельной природе углеводной структуры, прикрепленной к кодированному иммуноглобулиновому CH2- домену фрагмента Fc. Новые варианты TACI-Fc были синтезированы в ответ на наблюдаемую гетерогенность. Были соз-8 010594 даны конструкции, которые включали по меньшей мере одно из следующих изменений во фрагментеTACI: (1) части стволовой области TACI удалили, (2) часть стволовой области TACI заменили частью стволовой области ВСМА, (3) остаток аргинина в положении 119 изменили для элиминирования потенциального фуринового сайта расщепления, (4) остаток глутамина в положении 121 изменили для элиминирования (удаления) потенциального фуринового сайта расщепления, (5) остаток аргинина в положении 122 изменили для элиминирования потенциального фуринового сайта расщепления, (6) аминокислотный остаток в положениях 123 и 142 изменили на аминокислотные остатки, обнаруженные в соответствующих положениях TACI мышей, (7) сигнальную последовательность otPA человека заменили сигнальной последовательностью вариабельного участка тяжелой цепи человека, (8) остаток валина в положении 29 был изменен на метионин, и сигнальная последовательность otPA была присоединена в аминоконцевом положении к этому остатку, и (9) сигнальная последовательность otPA была присоединена в аминоконцевом положении к остатку аланина в положении 30. Модификации были также внесены в иммуноглобулиновую часть. Пять классов иммуноглобулинов идентифицировано у высших позвоночных: IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. Белки IgG, IgD и IgE являются характерно дисульфидно-связанными гетеротетрамерами, состоящими из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Типично IgM находится в виде пентамера тетрамера, несмотря на то,что IgA существует в виде димера тетрамера.IgG составляют большой класс, который существует в норме как второй наиболее обильный белок,обнаруженный в плазме. У человека IgG состоит из четырех подклассов, обозначенных IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Как показано на фиг. 2, каждая тяжелая цепь иммуноглобулина имеет константную область, которая состоит из константных участков белковых доменов (CH1, шарнирного участка, CH2 и CH3), которые являются неизменными для данного подкласса. Константные области тяжелой цепи класса IgG отождествляют греческой буквой . Например, иммуноглобулины подкласса IgG1 содержат константный участок тяжелой цепи 1. Фрагмент Fc, или Fc-домен, состоит из петлевых участков, CH2- и CH3-доменов тяжелой цепи, связанных дисульфидными мостиками. В иммуноглобулиновых слитых белках Fc-домены подкласса IgG1 часто используют в качестве иммуноглобулиновой части, поскольку IgG1 имеет самый продолжительный период полураспада сыворотки, чем любой из сывороточных белков. Протяженный период полужизни сыворотки может быть желательной характеристикой белка при изучении животных и при потенциальном терапевтическом использовании для человека. Кроме того, подкласс IgG1 обладает очень сильной способностью выполнять эффекторные функции, опосредованные антителом. Первичная эффекторная функция, которая может быть наиболее полезной у иммуноглобулинового слитого белка, является способность IgG1-антител опосредовать связанную с антителом клеточную цитотоксичность. С другой стороны, это может быть нежелательной функцией слитого белка, который функционирует первично как антагонист. Идентифицировали несколько из специфичных аминокислотных остатков, которые являются важными для постоянной активности антител подкласса IgG1. Включение или исключение таких специфических аминокислот, следовательно, предусматривает включение или выключение специфической пространственно-опосредованной иммуноглобулиновой активности. Было получено шесть вариантов модифицированных Fc IgG1 человека для создания слитых белковFc. Fc-488 сконструировали для удобного клонирования слитого белка, содержащего Fc-участок 1 человека, и он был сконструирован с использованием в качестве затравки константной области иммуноглобулина дикого типа 1 человека. Беспокойство о потенциально вредных эффектах вследствие непарного цистеинового остатка привело к решению замены цистеина (аминокислотный остаток 24 последовательности SEQ ID NO:6), который обычно связан дисульфидными связями с константной областью легкой цепи иммуноглобулина, на сериновый остаток. Дополнительное изменение было внедрено в кодирующий кодон, в 218 индексной EU-позиции (аминокислотный остаток 22 последовательности SEQ IDNO:6) для внедрения сайта узнавания фермента рестрикции BglII для облегчения последующих манипуляций с ДНК. Эти изменения были внесены в продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР), кодированный ПЦР-праймерами. Благодаря локализации сайта BglII и для того, чтобы достроить шарнирный участок Fc, кодоны 216 и 217 по индексной EU-позиции (аминокислотные остатки 20 и 21 последовательности SEQ ID NO:6) внедряли в партнерные последовательности слитого белка.Fc4, Fc5 и Fc6 содержат в себе мутации для снижения эффекторных функций, опосредованных Fc,снижением связывания FcRI и связывания комплемента C1q. Fc4 содержит те же самые аминокислотные замещения, что были введены в Fc-488. Дополнительные аминокислотные замещения вводили для снижения потенциальных эффекторных функций, опосредованных Fc. В частности, замещения трех аминокислот вводили для снижения связывания FcRI. Эти замещения 234, 235 и 237 по индексной EUпозиции (аминокислотные остатки 38, 39 и 41 последовательности SEQ ID NO:6). Показали, что замещения в этих положениях снижает связывание с FcRI (Duncan at al., Nature 332:563 (1988. Такие аминокислотные замещения могут снижать связывание FcRIIa так же, как и связвание FcRIII (Sondermann etal., Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 764:5313 (2000. Несколько групп описали важность положений 330 и 331 по индексной позиции Европейского со-9 010594 общества (аминокислотные остатки 134 и 135 в SEQ ID NO:6) в связывании комплемента C1q и последующей фиксации комплемента (Canfield and Morrison, J.Exp.Med. 773:1483 (1991); Tao et al., J.Exp.Med. 778:661 (1993. Аминокислотные замещения в этих положениях вводили в Fc4 для снижения связывания комплемента. CH3-домен Fc4 является идентичным таковому, который нашли в соответствующем полипептиде дикого типа, за исключением стоп-кодона, который изменили с TGA на ТАА для элиминирования потенциального сайта метилирования dam, если клонированную ДНК наращивают в dam-плюс штамме E.coli. В Fc5 аргининовый остаток 218 по индексной позиции Европейского сообщества изменяли обратно на лизин, поскольку схему клонирования BglII не использовали при слиянии белков, содержащих этот конкретный Fc. Остаток последовательности Fc5 соответствует выше описанному для Fc4.Fc6 является идентичным Fc5 за исключением того, что С-концевой лизиновый кодон элиминировали. С-концевой лизин зрелых иммуноглобулинов часто удаляют из зрелых иммуноглобулинов на посттрансляционной стадии перед секрецией из В-клеток, или удаляют во время циркуляции сыворотки. Следовательно, С-концевой лизиновый остаток типично не обнаруживают в циркулирующих антителах. Как в выше упомянутых Fc4 и Fc5, стоп-кодон в последовательности Fc6 заменили на ТАА.Fc7 является идентичным Fc 1 дикого типа за исключением аминокислотнго замещения в положении 297 по индексной позиции Европейского сообщества, локализованного в CH2-домене. По индексной позиции Европейского сообщества Asn-297 (аминокислотный остаток 101, SEQ ID NO:6) является сайтом присоединения углевода, связанного с N-концом. Связанный с N-концом углевод вносит потенциальный источник вариабельности в рекомбинантно экспрессированный белок благодаря потенциальному ваьированию между группами в углеводной структуре. В попытке элиминирования этой потенциальной вириабельности изменяли Asn-297 на остаток глутамина для предотвращения присоединения Nконцевого углевода по этому положению остатка. Углевод при 297 остатке также вовлечен в связываниеFc с FcRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000. Однако удаление углевода должно вообще снизить связывание рекомбинантного Fc7, содержащего слитые белки, с FcRs. Так же, как и выше, стоп-кодон в последовательности Fc7 изменили на ТАА.Fc8 является идентичным участку 1 иммуноглобулина дикого типа, показанного в SEQ ID NO:6, за исключением того, что цистеиновый остаток в положении 220 по индексной позиции Европейского сообщества (аминокислотный остаток 24 последовательности SEQ ID NO:6) заменили сериновым остатком. Это изменение элиминировало цистеиновый остаток, который обычно связан дисульфидными связями с константным участком легкой цепи иммуноглобулина. Иллюстративные конструкции TACI-Fc описывают в табл. 1. Таблица 1 Иллюстративные конструкции слитого белка TACI-Fc Информацию о локализации, мутациях и делециях аминокислотных последовательностей представляют в круглых скобках относительно аминокислотной последовательности SEQ IDb Включает аминокислотные остатки с 1 по 154 SEQ ID NO:2. с Эта конструкция включает аминокислотные остатки с 1 по 104 SEQ ID NO:2 (TACI) и аминокислотные остатки с 42 по 54 SEQ ID NO:27 (BCMA).- 10010594 Белки TACI-Fc синтезировали рекомбинантными клетками яичника китайского хомячка, изолировали и анализировали с использованием Вестерн-блот анализа и анализа аминокислотной последовательности. Удивительно, что делеция первых 29 аминокислот с N-конца полипептида TACI дала в результате десятикратное усиление синтеза слитых белков TACI-Fc клетками яичника китайского хомячка. Эта делеция также уменьшает расщепление полноразмерной стволовой области. Кроме того, расщепление внутри стволовой области подавлено или укорачиванием стволовой области TACI, или замещением стволовой области TACI частью другой аминокислотной последовательностью (например, аминокислотной последовательностью стволовой области ВСМА). Как описано в примере 4, функциональный анализ конструкций TACI-Fc показывает, что слитые белки TACI(d1-29)-Fc5, TACI(d1-29, d107-154)-Fc5, TACI(d1-29, d111-154)-Fc5 и TACI(d1-29, d120-154)Fc5 имеют сходные аффиности связывания ZTNF4. Однако конструкции TACI(d1-29)-Fc5, TACI(d1-29,d111-154)-Fc5 и TACI(d1-29, d120-154)-Fc5, по-видимому, связывают больше ZTNF4 на моль TACI-Fc,чем конструкция TACI(d1-29, d107-154)-Fc5. В зависимости от использования по назначению (т.е. терапевтическое, диагностическое или научное), могут быть использованы слитые белки TACI-Fc или с высокой, или с низкой емкостью. Кроме того, комбинация слитых белков TACI-Fc с высокой емкостью и с низкой емкостью делает возможным титрование ZTNF2 или ZTNF4. Настоящее изобретение рассматривает слитые белки TACI-иммуноглобулина, которые включают в себя фрагмент рецептора TAG, состоящий из аминокислотных остатков с 30 по 106 SEQ ID NO:2, с 30 по 110 SEQ ID NO:2, с 30 по 119 SEQ ID NO:2 или с 30 по 154 SEQ ID NO:2. Настоящее изобретение также включает в себя слитые белки TACI-иммуноглобулина, которые включают в себя фрагмент рецептораTACI, состоящий из аминокислотных остатков с 31 по 106 SEQ ID NO:2, с 31 по 110 SEQ ID NO:2, с 31 по 119 SEQ ID NO:2 или с 31 по 154 SEQ ID NO:2. В более общем смысле, настоящее изобретение включает слитые белки TACI-иммуноглобулина,причем фрагмент рецептора TACI состоит из фрагмента аминокислотных остатков с 30 по 154 SEQ IDNO:2, и причем фрагмент рецептора TACI связывает по меньшей мере один из ZTNF2 или ZTNF4. Такие фрагменты содержат богатую цистеином псевдоповторяющуюся область и произвольно могут включать по меньшей мере один из N-концевых отрезков, которому свойственно положение аминоконца в богатой цистеином псевдоповторяющейся области, и стволовой отрезок, которому свойственно положение Сконца в богатой цистеином псевдоповторяющейся области. Подходящие богатые цистеином псевдоповторяющиеся области включают полипептиды, которые: (а) содержат по меньшей мере один из аминокислотных остатков с 34 по 66 SEQ ID NO:2 и аминокислотные остатки с 71 по 104 SEQ ID NO:2, (b) содержат как аминокислотные остатки с 34 по 66 SEQ ID NO:2, так и аминокислотные остатки с 71 по 104SEQ ID NO:2, или (с) содержат аминокислотные остатки с 34 по 104 SEQ ID NO:2. Подходящие N-концевые отрезки включают следующие с обращением к SEQ ID NO:2: аминокислотный остаток 33, аминокислотные остатки с 32 по 33, аминокислотные остатки с 31 по 33 и аминокислотные остатки с 30 по 33. Подходящие стволовые отрезки включают одну или несколько аминокислот аминокислотных остатков со 105 по 154 SEQ ID NO:2. Например, стволовой отрезок может состоять из следующих с обращением к SEQ ID NO:2: аминокислотного остатка 105, аминокислотных остатков со 105 по аминокислотных остатков со 106, аминокислотных остатков со 105 по 107, аминокислотных остатков со 105 по 108, аминокислотных остатков со 105 по 109, аминокислотных остатки со 105 по 110,аминокислотные остатки со 105 по 111, аминокислотных остатков со 105 по 112, аминокислотных остатков со 105 по 113, аминокислотных остатков со 105 по 114, аминокислотных остатков со 105 по 115,аминокислотных остатков со 105 по 116, аминокислотных остатков со 105 по 117, аминокислотных остатков со 105 по 118, аминокислотных остатков со 105 по 119, аминокислотных остатков со 105 по 120,аминокислотных остатков со 105 по 121, аминокислотных остатков со 105 по 122, аминокислотных остатков со 105 по 123, 105 по 124, аминокислотных остатков со 105 по 125, аминокислотных остатков со 105 по 126, аминокислотных остатков со 105 по 127, аминокислотных остатков со 105 по 128, аминокислотных остатков со 105 по 129, аминокислотных остатков со 105 по 130, аминокислотных остатков со 105 по 131, аминокислотных остатков со 105 по 132, аминокислотных остатков со 105 по 133, аминокислотных остатков со 105 по 134, аминокислотных остатков со 105 по 135, аминокислотных остатков со 105 по 136, аминокислотных остатков со 105 по 137, аминокислотных остатков со 105 по 138, аминокислотных остатков со 105 по 139, аминокислотных остатков со 105 по 140, аминокислотных остатков со 105 по 141, аминокислотных остатков со 105 по 142, аминокислотных остатков со 105 по 143, аминокислотных остатков со 105 по 144, аминокислотных остатков со 105 по 145, аминокислотных остатков со 105 по 146, аминокислотных остатков со 105 по 147, аминокислотных остатков со 105 по 148, аминокислотных остатков со 105 по 149, аминокислотных остатков со 105 по 150, аминокислотных остатков со 105 по 151, аминокислотных остатков со 105 по 152, аминокислотных остатков со 105 по 153, аминокислотных остатков со 105 по 154. Дополнительные подходящие стволовые отрезки включают один или несколько аминокислот стволового отрезка ВСМА (т.е. аминокислотные остатки с 42 по 54 SEQ ID NO:27). Например, стволовой отрезок может состоять из следующих аминокислотных остатков с обращением к SEQ ID NO:27: аминокислотного остатка 42, аминокислотных остатков с 42 по 43, аминокислотных остатков с 42 по 44, ами- 11010594 нокислотных остатков с 42 по 45, аминокислотных остатков с 42 по 46, аминокислотных остатков с 42 по 47, аминокислотных остатков с 42 по 48, аминокислотных остатков с 42 по 49, аминокислотных остатков с 42 по 50, аминокислотных остатков с 42 по 51, аминокислотных остатков с 42 по 52, аминокислотных остатков с 42 по 53, аминокислотных остатков с 42 по 54. В более общем смысле стволовая область может состоять из от 2 до 50 аминокислотных остатков. Иммуноглобулиновый фрагмент слитого белка, описанного здесь, содержит по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина. Предпочтительно иммуноглобулиноввый фрагмент представляет отрезок иммуноглобулина человека. Последовательность иммуноглобулина человека может быть аминокислотной последовательностью дикого типа или модифицированной аминокислотной последовательностью дикого типа, которая имеет по меньшей мере одну из аминокислотных мутаций, обсужденных выше. Аминокислотная последовательность иммуноглобулина человека может также варьировать от дикого типа, имея одну или несколько мутаций, характерных для известной аллотипической детерминанты. Табл. 2 показывает аллотипические детерминанты константной области IgG1 человека (Putman,The Plasma Proteins, Vol. V, стр. 49-140 (Academic Press, Inc. 1987. Индексная позиция Европейского сообщества (EU) 214, 356, 358 и 431 определяет известные аллотипы IgG1. Положение 214 находится в домене CH1 константной области IgG1 и, следовательно, не находится внутри последовательности Fc. Последовательность Fc дикого типа последовательности SEQ ID NO:6 включает в себя аллотипы Glm(1) и Glm(2-). Однако часть Fc белка TACI-Fc может быть модифицирована для отображения всякой комбинации таких аллотипов. Таблица 2 Аллотипические детерминанты константной области иммуноглобулина 1 человека Примеры белков TACI-Fc, раскрытых здесь, содержат константные участки IgG1 человека. Тем не менее, подходящие иммуноглобулиновые фрагменты также включают полипептиды, содержащие по меньшей мере одну константную область, такую как константая область тяжелой цепи любого из следующих иммуноглобулинов: IgG2, IgG3, IgG4, IgGA1, IgGA2, IgD, IgE и IgM. Преимущественно иммуноглобулиновые фрагменты, полученные из IgG2 дикого типа или IgG4 дикого типа, обеспечивают сниженную эффекторную функцию по сравнению с IgG1 дикого типа или IgG3 дикого типа. Настоящее изобретение также рассматривает слитые белки, которые содержат фрагмент рецептора TACI, как описано выше, и/или альбумин, или 2-макроглобулин. Другим типом рецепторного слитого белка, который связывает ZTNF2 или ZTNF4, является слитый белок ВСМА-иммуноглобулин. Исследования выполнили со слитым белком BCMA-Fc4, в котором фрагмент ВСМА состоит из аминокислотных остатков с 1 по 48 последовательности SEQ ID NO:27. Удивительно, что фармакокинетические исследования на мышах показали, что слитый белок BCMA-Fc4 имел период полужизни около 101 ч, тогда как белок TACI-Fc имел период полужизни 25 ч. Таким образом, введение слитого белка ВСМА-иммуноглобулин может быть предпочтительным в некоторых клинических состояниях. Кроме того, комбинирование слитых белков TACI-иммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин может быть полезным для лечения некоторых состояний. Такая комбинационная терапия может быть достигнута введением слитых белков TACI-иммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин или введением гетеродимеров слитых белков TACI-иммуноглобулина и ВСМАиммуноглобулин. Другим типом рецепторного слитого белка, который связывает ZTNF4, является слитый белок, содержащий внеклеточных домен рецептора, обозначенный как "Ztnfr12". Аминокислотную и нуклеотидную последовательности Ztnfr12 представляют в виде SEQ ID NO:59 и SEQ ID NO:60 соответственно. Пригодные части рецептора Ztnfr12 включают полипептиды, содержащие аминокислотные остатки с 1 по 69 SEQ ID NO:60 или аминокислотные остатки с 19 по 35 SEQ ID NO:60. Слитые белки настоящего изобретения могут иметь форму одноцепочечных полипептидов, димеров, тримеров или мультимеров, состоящих из димеров или тримеров. Димеры могут быть гомодимера- 12010594 ми или гетеродимерами, и тримеры могут быть гомотримерами или гетеротримерами. Примеры гетеродимеров включают полипептид TACI-иммуноглобулин с полипептидом ВСМА-иммуноглобулин, полипептид TACI-иммуноглобулин с полипептидом Ztnfr12-иммуноглобулин и полипептид ВСМАиммуноглобулин с полипептидом Ztnfr12-иммуноглобулин. Примеры гетеротримеров включают полипептид TACI-иммуноглобулин с двумя полипептидами ВСМА-иммуноглобулин, полипептид TACIиммуноглобулин с двумя полипептидами Ztnfr12-иммуноглобулин, полипептид ВСМА-иммуноглобулин с двумя полипептидами Ztnfr12-иммуноглобулин, два полипептида TACI-иммуноглобулин с полипептидом ВСМА-иммуноглобулин, два полипетида TACI-иммуноглобулин с полипептидом Ztnfr12 иммуноглобулин, два полипептида ВСМА-иммуноглобулин с полипептидом Ztnfr12-иммуноглобулин и тример полипептида TACI-иммуноглобулин, ВСМА-иммуноглобулин и полипетид Ztnfr12 иммуноглобулин. В таких слитых белках фрагмент рецептора TACI может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2: аминокислотные остатки с 30 по 154, аминокислотные остатки с 34 по 66, аминокислотные остатки с 71 по 104, аминокислотные остатки с 47 по 62 и аминокислотные остатки с 86 по 100. Фрагмент рецептора ВСМА может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:27: аминокислотные остатки с 1 по 48, аминокислотные остатки с 8 по 41 и аминокислотные остатки с 21 по 37. Фрагмент рецептора Ztnfr12 может содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:60: аминокислотные остатки с 1 по 69 и аминокислотные остатки с 19 по 35. Слитые белки могут быть синтезированы с использованием методов ПЦР, использованных для конструирования иллюстративных молекул TACI-Fc, которые описаны в примерах. Однако специалисты в данной области могут использовать другие стандартные подходы. Например, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды TACI, BCMA, Ztnfr12 или иммуноглобулин, могут быть получены скринингом кДНК или геномной библиотек человека с использованием полинуклеотидных проб, основанных на последовательностях, раскрытых здесь. Эти способы являются стандартными и хорошо известными (см., например, Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, стр. 4-1 по 4-6 (John WileySons 1995) ("Ausubel (1995)"); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, стр. 33-41 (CRCPress, Inc. 1997) ("Wu (1997)"); Ausubel (1995) стр. 5-1 по 5-6; Wu (1997) стр. 307-327. Альтернативно, молекулы для конструирования иммуноглобулиновых слитых белков могут быть получены путем синтезирования молекул нуклеиновых кислот с использованием взаимных длинных олигонуклеотидов в качестве затравки и нуклеотидных последовательностей, описанных здесь (см., например, Ausubel (1995) стр. 8-8 по 8-9). Принятые способы с использованием полимеразной цепной реакции предоставляют возможность синтеза молекул ДНК длиной по меньшей мере две тысячи нуклеотидов (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266(1993), Dillon ef al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of SyntheticGenes," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15:PCR Protocols: Current Methods and Applications,White(ed.), стр. 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), и Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995. Молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения могут также быть синтезированы генной машиной с использованием протоколов, таких как фосфоамидит-метод. Если для применения необходима химически синтезированная двухцепочечная ДНК, например, для синтеза гена или фрагмента гена,то каждую комплементарную цепь делают отдельно. Получение коротких генов (от 60 до 80 пар оснований) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжига. Однако для получения более длинных генов (300 пар оснований) могут понадобиться специальные стратегии поскольку эффективность сопряжения каждого цикла во время синтеза ДНК редко сотавляет 100%. Для преодоления этой проблемы искусственные гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов, которые являются длиной от 20 до 100 нуклеотидов. В качестве обзоров по синтезу полинуклеотидов см., например, Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), и Climie et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:633 (1990). 4. Получение TACI-иммуноглобулиновых полипептидов. Полипептиды данного изобретения могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах, следуя общепринятым способам. Для экспрессирования последовательности, кодирующей TACIиммуноглобулин, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, должна быть исправно связана с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипционную экпрессию в экспрессионном векторе, и затем введена внутрь клетки-хозяина. В добавление к транскрипционным регуляторным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, экспрессионные векторы могут включать трянсляционные регуляторные последовательности и маркерные гены, которые являются пригодными для селекции клеток, которые несут экспрессионный вектор. Экспрессионные векторы, которые являются подходящими для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, типично содержат: (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующей бактериальную точку начала репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора- 13010594 экспрессионного вектора в бактерии-хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, которые контролируют инициацию транскрипции, например промотор; и (3) ДНК-элементы, которые контролируют процессинг транскриптов, таких как транскрипционная последовательность терминации/полиаденилирования. Экспрессионные векторы могут также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологичный полипептид по секреторному пути клетки-хозяина. Например, экспрессионный вектор может содержать нуклеотидную последовательность, которая кодирует TACI-иммуноглобулин и секреторную последовательность, полученную от любого секреторного гена. Как обсуждают выше, одной подходящей сигнальной последовательностью является сигнальная последовательность tPA. Пример сигнальной последовательности tPA представляют последовательностью SEQ ID NO:25. Другой пригодной сигнальной последовательностью является VH 26-10 сигнальная последовательность мыши. Мышиные антитела 26-10 описывает, например, Near et al,Mol. Immunol. 27:901 (1990). Иллюстративные аминокислотные и нуклеотидные последовательности мышиной 26-10 VH сигнальной последовательности представляют последовательностями SEQ ID NO:61 и SEQ ID NO:65 соответственно. SEQ ID NO:62 раскрывает аминокислотную последовательность слитого белка TACI-Fc5, которая содержит мышиную 26-10 VH сигнальную последовательность. Белки TACI-иммуноглобулин данного изобретения могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Примеры пригодных клеток-хозяев млекопитающих включают почечные клетки африканской зеленой обезьяны (Vero; ATCC CRL 1587), почечные клетки человеческого эмбриона (293-HEK; АТСС CRL 1573), клетки почек детенышей хомячка (BHK-21, BHK-570; АТСС CRL 8544, АТСС CRL 10314), почечные клетки собаки (MDCK; АТСС CCL 34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-K1; АТСС CCL61; СНО DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986, клетки гипофиза крысы(GH1; АТСС CCL82), S3-клетки HeLa (ATCC CCL2.2), клетки гепатомы крысы (H-4-II-E; АТСС CRL 1548), почечные клетки обезьяны, трансформированные SV40 (COS-1; АТСС CRL 1650) мышиные эмбриональные клетки (NIH-3T3; АТСС CRL 1658). Для млекопитающего хозяина регуляторные сигналы транскрипции и трансляции могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирусы, вирусы папилломы быка, вируса обезьяны или подобных, в которых регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Пригодные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности также могут быть получены из генов млекопитающих, таких как гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина. Регуляторные последовательности транскрипции включают промоторный участок, достаточный для прямой инициации синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают промотор гена металлотионеина I мыши (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 7:273 (1982, TK-промотор вируса герпеса(McKnight, Cell 37:355 (1982, ранний промотор SV40 (Benoist et ai, Nature 290:304 (1981, промотор вируса саркомы Rous (Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 79:6777 (1982, промотор цитомегаловируса (Foecking et al., Gene 45:101 (1980 и промотор вируса опухоли молочных желез мыши (см. вообще,Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell culture", в Protein Engineering: Principlesand Practice, Cleland et al., (eds), стр. 163-181 (John WileySons, Inc. 1996. Одну полезную комбинацию промотора и энхансера обеспечили посредством миелопролиферативнго промотора вируса саркомы и энхансера цитомегаловируса человека. Альтернативно прокариотический промотор, такой как РНК-полимеразный промотор бактриофага Т 3, может быть использован для контроля синтеза белков TACI-иммуноглобулин в клетках млекопитающих, если прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (Zhou et al., Moll.Cell. Biol. 10:4529 (1990), и Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 79:4485 (1991. Экспрессионный вектор может быть введен внутрь клеток хозяина с использованием множества стандартных способов, включающих трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию с помощью липосом, доставку с помощью микропроекции, электропорацию и т.п. Трансфецированные клетки могут быть отобраны и размножены для получения рекомбинантных клеток хозяина, которые содержат экспрессирующий вектор, устойчиво интегрированный в геном клеки-хозяина. Способы внедрения векторов в эукариотические клетки и методы отбора таких устойчивых трансформантов с использованием селективных маркеров описаны, например, Ausubel (1995) and Murray (ed), Gene Transfer and Expression Protocols(Humana Press, 1991). Например, одним подходящим селективным маркером является ген, который предоставляет устойчивость к антибиотику неомицину. В этом случае отбор проводят в присутствии лекарственного препарата неомицинового типа, например G-418, или ему подобным. Системы отбора могут также быть использованы для усиления уровня экспрессии интересующего гена, процесс, называемый амплификацией. Амплификацию осуществляют культивированием трансфектантов в присутствии низкого количества селективного агента, и затем увеличения количества селективного агента для отбора клеток, которые производят высокие уровни продуктов внедренных генов. Подходящим амплифицируемым селективным маркером является дигидрофолатредуктаза, которая придает устойчивость к метотрексату. Также могут быть использованы другие гены устойчивости к лекарственным препаратам (например, устойчивости к гигромицину, устойчивости ко многим лекарственным препаратам, к пуромицин-ацетилтрансферазе).- 14010594 Альтернативно маркеры, которые вводят в измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или поверхностные клеточные белки, такие как CD4, CD8, Class I МНС, плацентарная щелочная фосфатаза, могут быть использованы для отделения трансфецированных клеток от нетрансфецированных клеток путем так называемой FACS-сортировки, или технологии разделения на намагниченных шариках. Полипептиды TACI-иммуноглобулин могут также быть произведены культивированными клетками млекопитающих с использованием вирусной системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают аденовирусы, вирусы герпеса, вакцинные вирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV). Аденовирус, вирус с двухцепочечной ДНК, является наиболее изученным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (см. обзор Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), и Douglasand Curiel, ScienceMedicine 4:44 (1997. Преимущества аденовирусной системы включают размещение относительно крупных вставок ДНК, способность расти до высоких титров, способность инфецирования широкого ряда типов клеток млекопитающих и гибкость, которая позволяет использование с большим числом доступных векторов, содержащих различные промоторы. Путем делеций частей аденовирусного генома могут быть помещены крупные вставки гетерологичной ДНК (вплоть до 7 т.п.). Такие вставки могут быть внедрены в вирусную ДНК прямым лигироанием, или гомологичной рекомбинацией с котрансфецированными плазмидами. Альтернативой является удаление существенного гена Е 1 из вирусного вектора, что в результате дает неспособность к репликации, если ген Е 1 не предоставлен клеткой-хозяином. 293 клетки человека, ифицированные аденовирусным вектором (АТСС, NN. CRL-1573, 45504, 45505), например, могут быть выращены в виде адгерентных клеток, или в суспензионной культуре при относительно высокой плотности клеток для получения существенного количества белка (см. Gamier et al., Cytotechnol. 75:145 (1994. Специалисты в данной области могут изобрести пригодные экспрессионные векторы для получения слитых белков, описанных здесь, с клетками млекопитающих. Пример 4 описывает особенности одного из экспрессионных векторов. Другой пример экспрессионного вектора может содержать бицистронную экспрессионную кассету, которая включает часть энхансера цитомегаловируса человека, миелопролиферативный промотор вируса саркомы, нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок,полиовирусные внутренние рибосомальные сайты входа, нуклеотидную последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу мыши, за которой следует дополнительная поли-А поледовательностьSV40. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:69 показывает конструкцию энхансер цитомегаловируса/миелопролиферативный LTR-промотор вируса саркомы, в которой энхансер цитомегаловируса простирается от 1 нуклеотида до 407. Миелопролиферативный LTR-промотор вируса саркомы в отсутствие участка негативного контроля простирается от 408 нуклеотида до 884 нуклеотида SEQ ID NO:69. Нуклеотидную последовательность миелопролиферативного LTR-промотора вируса саркомы без участка негативного контроля представляют в SEQ ID NO:70. Пример 1 описывает экспрессионный вектор, который содержит промотор цитомегаловируса для прямой экспресси трансгена рекомбинантного белка, иммуноглобулиновый интрон и сигнальную последовательность тканевого активатора плазминогена. Одним подходящим иммуноглобулиновым интроном является интрон VH 26-10. SEQ ID NO:66 представляет иллюстративную нуклеотидную последовательность интрона VH 26-10 мыши. Экспрессионный вектор может также включать 5'-нетранслируемую область (UTR), локализованную выше нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок TACIиммуноглобулин. Подходящая 5'-UTR может быть произведена из гена VH 26-10 мыши. SEQ ID NO:63 раскрывает нуклеотидную последовательность полезной нативной 5'-UTR VH 26-10 мыши, в то время какSEQ ID NO:64 показывает нуклеотидную последовательность 5-UTR VH 26-10 мыши, которую оптимизировали на 3'-конце. В качестве иллюстрации последовательность SEQ ID NO:67 предоставляет нуклеотидную последовательность, которая включает следующие элементы: нативную 5'-UTR VH 26-10 мыши (нуклеотиды с 1 по 51), сигнальную последовательность VH 26-10 мыши (нуклеотиды с 52 по 97 и со 182 по 192), интронTACI (нуклеотиды со 193 по 435) и нуклеотидную последовательность, которая кодирует часть Fc5 (нуклеотиды с 436 по 1131). Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:68 отличается от SEQ ID NO:67 вследствие замещения 5'-UTR VH 26-10 (нуклеотиды с 1 по 51) нативной последовательности мыши оптимизированной последовательностью. Белки TACI-иммуноглобулин могут также быть экспрессированы в других эукариотических клетках высших, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, грибов или растений. Бакуловирусная система предоставляет эффективные способы внедрения клонированных генов внутрь клеток насекомых. Подходящие экспрессионные векторы основаны на вирусе ядерного полиэдроза Autographs californica(AcMNPV) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка теплового шока 70 (hsp)Drosophila, предранний генный промотор (ie-1) вируса ядерного полиэдроза Autographa californica и задержанно ранний промотор 39K, бакуловирусный промотор р 10 и металлотионеиновый промотор Drosophila. Второй способ создания рекомбинантных бакуловирусов использует систему, основанную на транспозонах, описанную Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993. Эта система, которая исполь- 15010594 зует вектор для переноса, продается в наборе BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Эта система использует вектор для переноса PFASTBAC (Life Technologies), содержащий транспозон Tn7 для перемещения ДНК, кодирующей полипептид TACI-иммуноглобулин, в бакуловирусный геном, поддерживающийся в E.coli в виде большой плазмиды, называемой "bacmid". См. Hill-Perkins and Possee, J. Gen.Virol. 77:971 (1990), Bonning., et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), и Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Кроме того, векторы для переноса могут включать слияние внутри рамки с ДНК, кодирующей эпитопную метку на С-конце или на N-конце экспрессированного полипептита TACIиммуноглобулин, например эпитопная метка Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952(1985. Используя способ, известный в данной области, вектор для переноса, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок TACI-иммуноглобулин, переносят внутрь E.coli и отбирают бактериальные плазмиды, которые содержат прерывающийся lacZ-ген, указывающий на рекомбинантные бакуловирусы. ДНК бактериальных плазмид, содержащую рекомбинантный бакуловирусный геном,затем выделяют, используя общепринятые способы. Иллюстративный вектор PFASTBAC может быть модифицирован до существенной степени. Например, полиэдриновый промотор может быть удален и замещен бакуловирусным основным белковым промотором (также известным как промотор Pcor, р 6.9 или MP-промотор), который является раннеэкспрессируемым при бакуловирусной инфекции, и было показано, что он должен быть полезным для экспрессии секретируемых белков (см., например, Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning., et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), и Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). В таких конструкциях векторов для переноса может быть использован короткий или длинный вариант основного белкового промотора. Кроме того, векторы для переноса могут быть сконструированы с секреторными сигнальными последовательностями, полученными из белков насекомых. Например, в таких конструкциях может быть использована секреторная сигнальная последовательность экдистероидных глюкозилтрансфераз (EGT), или меллитина медоносных пчел (Invitrogen Corporation, Carlsbad, СА) или бакуловирусного gp67 (PharMingen: San Diego, Ca). Рекомбинантные вирусы или бактериальные плазмиды используют для трансфекции клетокхозяина. Подходящие клетки-хозяина насекомых включают клеточные линии, полученные из IPLB-Sf21, клеточной линии яичников куколки Spodoptera frugiperda, таких как Sf9 (АТСС CRL 1711), Sf21AE иSf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, Ca) так же, как и клеток Schneider-2 Drosophyila и клеточной линии HIGH FIVEO (Invitrogen), полученной из Trichoplusia ni (патент США 5300435). Коммерчески доступная среда, не содержащая сыворотку, может быть использована для наращивания и для поддержания клеток. Подходящими средами являются Sf900 II (Life Technologies) или ESF 921 (ExpressionSystems) для клеток Sf9; и Ex-cellO405 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) или Express FiveO (Life Technologies) для клеток T.ni. При использовании рекомбинантного вируса клетки типично выращивают от плотности инокулята приблизительно 2-5105 клеток до плотности 1-2106 клеток, во время которой добавляют рекомбинантный вирусный маточный раствор при множественности заражения (MOI) от 0,1 до 10, более типично около 3. Установленные способы производства рекомбинантных белков в бакуловирусных системах представлены Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors," в Methods in Molecular Biology, Volume 7:Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed), стр. 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), Patel et al.,"The baculovirus expression system," в DNA Cloning 2:Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.),стр.205-244 (Oxford University Press 1995), Ausubel (1995) на стр. с 16-37 по 16-57, Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), и Lucknow," Insect Cell Expression Technology," в Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), стр. 183-218 (John WileySons, lnc. 1996). Клетки грибов, в том числе дрожжевые клетки, также могут быть использованы для экспрессии генов, описанных здесь. Особенно интересные в этом отношении представители дрожжей включают Saccaromyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Подходящие промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы от GAL1 (галактозы), PGK (фосфоглицеринкиназы), ADH (алкогольдегидрогеназы), АОХ 1 (алкогольоксидазы), HIS4 (гистидиндигидрогеназы) и прочие. Созданы многие дрожжевые клонирующие векторы и являются легкодоступными. Вектор может быть сконструирован для создания конструкций, использующих необходимые элементы для осуществления гомологичной рекомбинации в дрожжах (см., например, Raymond et al., BioTechniques 26:134 (1999. Например, такой экспрессионный вектор может включать последовательности URA3 и CEN-ARS (автономно реплицирующуюся последовательность), требуемые для отбора и репликации в S. cerevisiae. Другие пригодные векторы включают векторы на основе YIp, такие как YIp5, векторы YRp, такие как YRp17, векторы YEp, такие как YEp13, и векторы YCp, такие как YCp19. Способы трансформирования клеток S. cerevisiae экзогенной ДНК и получения рекомбинантных полипептидов из этих клеток раскрыты, например, Kawasaki,патент США 4599311, Kawasaki et al., патент США 4931373, Brake, патент США 4870008, Welchet al., патент США 5037743 и Murray et al., патент США 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селективным маркером, обычно устойчивостью к препарату или- 16010594 способностью расти в отсутствие специфического питательного вещества (например, лейцина). Пригодной векторной системой для использования в Saccaromyces cerevisiae является векторная система РОТ 1,раскрытая Kawasaki et al. (патент США 4931373), которая позволяет трансформированным клеткам быть отобранными путем роста в глюкозосодержащей среде. Дополнительные подходящие промоторы и терминаторы для использования в дрожжах включают таковые из генов гликолитических ферментов(см., например, Kawasaki, патент США 4599311, Kingsmann et al., патент США 4615974 и Bitter патент США 4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США 4990446, 5063154,5139936 и 4661454. В данной области известны системы трансформации на основе других дрожжей, включая HansenulaGen. Microbiol. 732:3459 (1986) и Cregg, патент США 4882279. Клетки Aspergillus могут быть использованы в соостветствии со способом McKnight et al., патент США 4935349. Способы трансформирования Acremonium chrysogenum раскрыты Sumino et al., патент США 5162228. Способы трансформирования Neurospora раскрыты Lambowitz, патент США 4486533. Например, применение Pichia methanolica в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков раскрыто Raymond в патенте США 5716808, Raymond, патент США 5736383, Raymond et al.,Yeast 74:11-23 (1998) и в международной публикацииWO 97/17450, WO 97/17410, WO 98/02536 иWO 98/02565. Молекулы ДНК для использования в трансформированных Р. methanolica обычно будут подготовлены в виде двухцепочечных, кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризирут перед трансформацией. Для наработки полипептидов в P. methanolica промотором и терминатором в плазмиде может быть промотор гена P. methanolica, например ген утилизации спирта P. methanolica (AUG1 или AUG2). Другие пригодные промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы(DHAS), формиатдегидрогеназы (FMD) и каталазы (CAT). Для облегчения интегрирования ДНК внутрь хромосомы хозяина предпочтительно иметь цельный экспрессионный отрезок плазмиды, фланкированный с обоих концов последовательностями хозяйской ДНК. Пригодным селективным маркером для использования в Pichia methanolica является ген ADE2 P. methanolica, который кодирует фосфорибозил-5 аминоимидазолкарбоксилазу (AIRC; ЕС 4.1.1.21) и который позволяет клеткам хозяина ade2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных производственных процессов, где желательно минимизирование использования метанола, могут быть использованы клетки хозяина, в которых удалены оба гена,утилизирующих метанол (AUG1 и AUG2). Для наработки секретируемых белков в клетках хозяина могут отсутствовать гены вакуолярных протеаз (РЕР 4 и PRB1). Используют электропорацию для способствования внедрения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующей полипептид интереса, внутрь клеток P.methanolica. Клетки P. methanolica могут быть трансформированы электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего мощность от 2,5 до 4,5 кВ/см и фиксированное время (t) от 1 до 40 мс, более предпочтительно около 20 мс. Экспрессионные векторы могут также быть внедрены внутрь протопластов растений, интактных растительных тканей или внутрь изолированных растительных клеток. Способы внедрения экспрессионных векторов внутрь растительной ткани включают прямое инфицирование или совместное культивирование растительной ткани с Agrobacterium tumefaciens, микропроэкционную доставку, инъекцию ДНК,электропорацию и прочие. См., например, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 70:268 (1992) и Miki et al., Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" в Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology, Glick et al., (eds.), стр. 67-88 (CRC Press, 1993). Альтернативно, белки TACI-иммуноглобулин могут быть произведены в прокариотических клетках хозяина. Подходящими промоторами, которые могут быть использованы для получения полипептидовTACI-иммуноглобулин в прокариотическом хозяине, являются промоторы, хорошо известные в данной области, и включают промоторы, допускающие узнавание полимеразами Т 4, Т 3 Sp6 и Т 7, промоторы бактериофага ламбда PR и PL, промоторы E.coli trp, recA, теплового шока, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA иlacZ, промоторы B.subtilis, промоторы бактериофагов Bacillus, промоторы Streptomyces, промотор int бактериофага ламбда, промотор bla pBR322 и промотор CAT гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы рассмотрены Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., MolecularPress 1991. Пригодные штаммы Bacillus subtilus включают BR151, YB886, MI119, MI120 и В 170 (см.,например, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985. При экспрессии белка TACI-иммуноглобулин в бактерии, например в E.coli, полипептид может быть аккумулирован в цитоплазме, типично в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секретирующей последовательностью. В ранее рас- 17010594 смотренном случае клетки лизируют, а гранулы выделяют и денатурируют с помощью, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Денатурированный полипептид может затем быть повторно свернут и димеризован растворением в денатурирующем агенте, например, диализом против раствора мочевины и сочетанием восстанавленного и окисленного глутатиона, с последущим диализом против буферносолевого раствора. В последнем случае полипептид может быть выделен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения клеток (например, ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения белка, таким образом, избегая необходимость денатурирования и повторного сворачивания. Способы экспрессии белков в прокариотических организмах хозяина являются хорошо известными специалистам в данной области (см., например, Williams et al., "Expression of foreign proteins inand Practice, Cleland et al., (eds.), стр. 101 (John WileySons, Inc. 1996. Стандартные способы внедрения экспрессионных векторов в клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений представлены, например, Ausubel (1995). Общие способы экспрессии и получения чужеродного белка, произведенного клеточной системой млекопитающих, представлены, например, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in MammalianCell Culture" в Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), стр. 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Стандартные способы выделения белка, произведенного бактериальной системой, предоставлены,например, Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E.coli cells," in DNA Cloning2:Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.) стр. 59-92 (Oxford University Press 1995). Принятые способы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны Richardson (ed.) Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995). В качестве альтернативы, полипептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы первоклассным твердофазным синтезом, частичными твердофазными методами, конденсацией фрагментов или традиционным жидкофазным синтезом. Эти методы синтеза хорошо известны в данной области (см.,например, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", (2ndPeptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), и Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1977. Изменения в стратегиях общего химического синтеза, например нативное химическое лигирование и лигирование экспрессированных белков, также являются стандартными (см., например, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng etNat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) и Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998. 5. Анализ слитых белков TACI-иммуноглобулинов. Функция слитых белков TACI-иммуноглобулинов может быть оценена с использованием разнообразных подходов для оценки способности слитых белков связывать ZTNF4 или ZTNF2. В качестве иллюстрации пример 4 предоставляет способы измерения аффинности связывания и емкости связывания дляZTNF4. Альтернативно слитые белки TACI-иммуноглобулина могут быть охарактеризованы по способности ингибировать стимуляцию В-клеток человека растворимым ZTNF4, как описано Gross et al., International Publication No. WO 00/40716. Кратко, В-клетки человека выделяют из периферических мононуклеарных клеток крови с использованием намагниченных шариков CD19 и магнитной системы для разделения VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Очищенные В-клетки смешивают с растворимым ZTNF4 (25 нг/мл) и рекомбинантным IL-4 человека (10 нг/мл, Pharmingen) и клетки вносят в лунки 96-луночных круглодонных планшетов при 1105 клеток на лунку. Растворимые белки TACI-иммуноглобулин могут быть растворены от около 5 мкг/мл до около 6 нг/мл и инкубированы с В-клетками в течение пяти дней, с подачей импульсов 1 мкКи Н 3-тимидина на лунку в течение ночи в четвертый день. В качестве контроля белок TACI-иммуноглобулин может также быть инкубирован с В-клетками и IL-4 без ZTNF4. Для наращивания планшеты помещали в прибор для наращивания Packard и просчитывали с использованием счетчика Packard. Для оценки трех слитых белков TACI-Fc использовали общий подход. Хотя все слитые белки ингибировали пролиферацию В-клеток, конструкции TACI(d1-29, d111-154)-Fc5 и TACI(d1-29, d120-154)-Fc5 были более эффективными, чем TACI(d1-29, d107-154)-Fc5. Твердо установившиеся экспериментальные модели на животных возможны для тестирования эффективности белков TACI-иммуноглобулин in vivo при определенных болезненных состояниях. Например, белки TACI-иммуноглобулин могут быть проанализированы в ряде экспериментальных моделей аутоиммунныых заболеваний на животных, такими как родственные линии мышей MRL-Ipr/Ipr или F1- 18010594 близкородственных линий мышей NZBxNZW, которые служат в качестве модели SLE (системной красной волчанки). Такие экспериментальные модели на животных известны в данной области (см., например, Cohen and Miller (eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc. 1994). Потомство от скрещивания между мышами новозелландской черной New Zealand Black (NZB) и новозелландской белой New Zealand White (NZW) обнаруживает спонтанную форму SLE, которая имеет близкое сходство с SLE человека. Потомство мышей, известное как NZBW, в возрасте одного месяца начинает нарабатывать антитела IgM против Т-клеток и в возрасте от пяти до семи месяцев аутоантитела против ДНК являются доминирующим иммуноглобулином. Вклад этих аутоантител, особенно тех, которые направлены против одноцепочечной ДНК, связан с развитием гломерулонефрита, который клинически проявляется как протеинурия, азотемия и смерть от почечной недостаточности. Почечная недостаточность является главной причиной смертности у мышей, пораженных спонтанной SLE, а у линии NZBW этот процесс является хроническим и уничтожительным. Заболевание является более быстрым и тяжелым у женских особей, чем у мужских, со средней жизнеспособностью в течение только 245 дней по сравнению с 406 днями для мужских особей. Несмотря на то, что многие из мышей женских особей в 5-7 месячном возрасте будут с клинически выраженной протоуренией, некоторые особи могут быть гораздо моложе или старше при проявлении у них симптомов. Смертельный иммунный нефрит, наблюдаемый у мышей NZBW, является очень похожим на наблюдаемый гломерулонефритSLE у человека, что делает эту спонтанную экспериментальную модель на мышах очень привлекательной для исследования лечений потенциальной SLE (Putterman and Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus", in Autoimmune Disease Models: A Guidebook, стр. 217-234 (AcademicPress, Inc., 1994); Mohan et al., J. Immunol. 754:1470 (1995); и Daikh et al., J. Immunol. 759:3104 (1997. Как описано Gross et al., международная публикацияWO 00/40716, белки TACI-иммуноглобулин могут быть введены мышам NZBW для выявления их подавляющего эффекта на В-клетки в течение пятинедельного периода в среднем, как полагают, что наработка антител к В-клеткам у мышей NZBW достигает высокого уровня. Кратко, 100 женских особей мышей 8-недельного возраста F1 (NZB x NZW) могут быть разделены на шесть групп по 15 особей в каждой. Перед введением мышей поверяют один раз в месяц на белок в моче и отбирают кровь для СВС и заготовки сыворотки. Сыворотка может быть проанализирована на наличие аутоантител. Поскольку протеинурия является выраженным признаком гломерулонефрита, то уровень белка в моче измеряют показателем уровня с регулярными интервалами в течение периода исследования. Введение можно начинать, когда мыши будут приблизительно в пятимесячном возрасте. Мыши получают внутрибрюшинные инъекции только носителя (фосфатно-солевого буферного раствора), или TACI-иммуноглобулина человека (контрольный белок), или TACIиммуноглобулина (например, от 20 до 100 мкг испытуемого белка на дозу) три раза в неделю в течение пяти недель. В течение лечения кровь собирают дважды и соберут по меньшей мере дважды после лечения. Значения показателей уровней в моче для протеинурии и значения масс тела определяют каждые две недели после начала лечения. Значения показаний для крови, мочи и массы тела собирали во время эвтаназии. Селезенку и тимус отделяли для анализа сортировки клеток, обработанных флуоресцентным агентом, и для гистологии. Субмандибулярные слюнные железы, цепь брыжеечных лимфатических узлов, печеночную долю с желчным пузырем, слепую кишку и толстую кишку, желудок, тонкий кишечник, поджелудочную железу, правую почку, надпочечник, язык с трахеей и пищеводом, сердце и легкие также собирали для гистологии. Модели на мышах использовали для экспериментов по аллергическому энцефаломиелиту в качестве инструмента для исследования как механизмов заболеваний, связанных с иммунитетом, так и способов потенциального терапевтического вмешательства. Модель имеет сходство с рассеянным склерозом человека и приводит к демиелинизации, как результату активации Т-клеток на нейробелки, такие как основной белок миелина, или протеолипидный белок. Инокуляция антигеном приводит к индуцированию CD4+, Т-клеток II класса (Th1), заключенных в МНС. Изменения в процедуре экспериментального аллергического энцефаломиелита могут породить острые, хронически-рецидивные или пассивноперенесенные варианты модели (Weinberg et al., J. Immunol. 762:1818 (1999); Mijaba et al., Cell. Immunol. 186:94 (1999); и Glabinski, Meth. Enzym. 288:182 (1997.Gross et al., международная публикацияWO 00/40716, описывает один подход к оценке эффективности белков TACI-иммуноглобулин в улучшении симптомов, связанных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом. Кратко, 25 женских особей мышей F1 PLxSJL (12-недельного возраста) подвергали подкожному инъецированию антигеном 125 мкг/мышь (антигеном является миелиновый протеолипидный белок, PLP, остатки 139-151), приготовленным в полном адъюванте Фрейнда. Мышей делят на пять групп по пять мышей в каждой. Внутрибрюшинные инъекции токсина коклюша (400 нг) производили в 0 день и во второй. Группам давали 1, 10 или 100-кратную дозу белка TACI-иммуноглобулин, одна группа получает только растворитель, и одна группа не получает лечение. Профилактическая терапия начинается в 0 день, лечебное вмешательство начинается на 7 день или при появлении клинических признаков. Признаки заболевания, потеря веса и паралич, обнаруживаются приблизительно на 10-14 день и сохраняются в течение приблизительно одной недели. Животных оценивают ежедневно- 19010594 посредством сбора массы тела и определения клинической оценки соответствия распространения их симптомов. Клинические признаки экспериментального аллергического энцефаломиелита появляются в течение 10-14 дней инокуляции и сохраняются приблизительно в течение одной недели. В конце исследования всех подвергают эвтаназии путем избыточной дозировки газа и вскрывают. Мозг и позвоночник собирают для гистологии или замораживают для анализа мРНК. Результаты массы тела и клинической оценки вносят на каждую особь или на группу. В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита у мышей развивался хронический воспалительный артрит, который имеет близкое сходство с ревматоидным артритом человека. Поскольку индуцированный коллагеном артрит обнаруживает сходные с ревматоидным артритом иммунологические и патологические признаки, то это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных компонентов у человека. Другим преимуществом использования модели по изучению индуцированного коллагеном артрита является то, что механизмы его патогенеза известны. Идентифицированы Т- и В-клеточные эпитопы на коллаген II типа и определены различные иммунологические (замедленная гиперчувствительность и антитела против коллагена) и противовоспалительные (цитокины, хемокины, ферменты, разрушающие матрикс) параметры, относящиеся к иммуно-опосредованным артритам, и могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых компонентов в моделях (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407 (1999); Williams et al., Immunol. 89:9784 (1992); Myers et al., Life Sci. 67:1861 (1997); и Wang et al., Immunol. 92:8955 (1995.Gross et al., международная публикацияWO 00/40716, описывает способ оценки эффективности белков TACI-иммуноглобулин в улучшении симптомов, ассоциированных с артритом, индуцированным коллагеном. Кратко, восьминедельных мужских особей мышей DBA/1 J (Jackson Labs) делят на группы по пять мышей в группе и производят две подкожные инъекции коллагена от 50 до 100 мкл в концентрации 1 мг/мл (коллаген цыпленка или бычий) с интервалами в три недели. Одна контрольная (группа) не получает инъекции коллагена. Первый инъекционный раствор приготовлен в полном адъюванте Фрейнда, а второй инъекционный раствор приготовлен в неполном адъюванте Фрейнда. Белок TACIиммуноглобулин вводят с профилактической целью во время или перед вторым инъецированием, или после того, как животное обнаружит два или больше клинических показателей, которые сохраняются по меньшей мере 24 ч. Животные начинают демонстрировать симптомы артрита после второй инъекции коллагена, обычно в течение от двух до трех недель. Например, TACI-Fc, контрольный белок, IgFc или фосфатно-буферный раствор (растворитель) могут быть введены с профилактической целью, начиная с семи дней до начала второго инъецирования (день -7). Белки могут быть введены в (количестве) 100 мкг,даваемые три раза в неделю в виде 200 микролитровой внутрибрюшинной инъекции и продолжающейся в течение четырех недель. В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита степень заболевания оценивают в каждой лапке с использованием циркуля для определения толщины лапки и задания клинической оценки каждой лапке. Например, клиническая отметка 0 означает нормальная мышь, отметка 1 означает, что один или больше пальцев являются воспаленными, отметка 2 означает слабое воспаление лапок, оценка 3 означает среднее воспаление лапок и оценка 4 означает тяжелое воспаление лапок. Животных подвергают эвтаназии после того, как устанавливают заболевание в течение установленного периода времени, обычно семи дней. Лапки собирают для гистологического анализа, или для анализа мРНК, а сыворотку собирают для анализа иммуноглобулинов и цитокинов. Миастения гравис является другим аутоиммунным заболеванием, для которого экспериментальные модели на мышах являются пригодными. Миастения гравис является нарушением нервно-мышечной проводимости, затрагивающим выработку аутоантител, направленных против никотинового ацетилхолинового рецептора. Это заболевание является приобретенным или наследственным с клиническими признаками, включающими огромную слабость и утомляемость при напряжении. Установлена экспериментальная модель на мышах миастении гравис (Christadoss et al., "Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravid Pathogenesis for Immune Intervention", in Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi and Bixler (Eds.), стр. 195-199(1995. Экспериментальная аутоиммунная миастениа гравис является заболеванием, опосредованным антителами, охарактеризованным наличием антител к ацетилхолиновому рецептору. Эти антитела разрушают рецептор, приводя к повреждению нейромускульных электрических импульсов, выражающихся в мышечной слабости. В экспериметальной модели для миастении гравис мышей иммунизировали никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Клинические признаки миастении гравис становятся очевидными через неделю после второй иммунизации. Экспериментальную миастениа гравис оценивают нескольким способами, включая измерение уровней сыворотки антител к рецептору ацетилхолина, радиоиммунологический анализ (Christadoss and Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom et al., MethodsEnzymol. 74:432 (1981, измерение мышечного рецептора ацетилхолина, или электромиографию (Coligan et al., (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, стр. 15.8.1 (John WileySons, 1997. Эффект TACI-иммуноглобулин на экспериментальную миастениа гравис может быть установлен введением слитых белков во время проводящейся клинической миастениа гравис на мышах В 6. Например, 100 особей мышей В 6 иммунизируют 20 микрограммами (20 мкг) ацетилхолинового рецептора в- 20010594 полном адъюванте Фрейнда в дни 0 и 30. Приблизительно от 40 до 60% мышей проявят от умеренной(степень 2) до тяжелой (степень 3) клинической миастении гравис после повышения уровня рецептора ацетилхолина. Мышей с клиническим заболеванием 2-й и 3-й степени делят на 3 группы (с одинаковыми степенями заболевания) и взвешивают (мыши вместе со слабостью также теряют в весе, так они испытывают затруднение в потреблении пищи и воды) и отбирают кровь для сыворотки (для предварительной очистки антител против рецептора ацетилхолина и уроня изотипов). Группу А инъецируют I.P в фосфатно-солевом буферном растворе, группу В инъецируют внутрибрюшинно IgG-Fc человека в качестве контрольного белка (100 мкг) и группу С инъецируют 100 мкг TACI-Fc три раза в неделю в течение четырех недель. Мышей просматривают на клиническую мышечную слабость дважды в неделю и взвешивают и отбирают кровь для сыворотки через 15 и 30 дней после начала введения. Цельную кровь собирают на 15-й день для определения соотношения клеток Т/В с помощью анализа сортировки флуоресцентноактивированных клеток, с использованием маркеров В 220 и CD5. Выживших мышей убивают после 3045 дней после начала лечения и их тела замораживают для последующего выделения рецептора ацетилхолина для определения потери мышечного рецептора ацетилхолина, первичной патологии в миастениа гравис (см., например, Coligan et al., (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, стр. 15.8.1 (John WileySons, 1997. Сывороточные антитела к мышиному мышечному рецептору ацетилхолина могут быть определены установленным радиоиммунологическим анализом, а изотипы антител против рецептора ацетилхолинаTACI-иммуноглобулина на текущую клиническую миастениа гравис, антитела против рецептора ацетилхолина и уровень изотипов, и на потерю мышечного ацетилхолинового рецептора. Приблизительно 100 мышей может быть иммунизировано 20 мкг рецептора ацетилхолина в полном адъюванте Фрейнда на 0 и 30 день. Мышей с клинической миастениа гравис делят на четыре группы. Группу А инъецируют внутрибрюшинно 100 мкг конрольного Fc, группу В инъецируют 20 мкг конрольного Fc, группу С инъецируют 100 мкг TACI-Fc и группу D инъецируют 20 мкг TACI-Fc три раза в неделю в течение четырех недель. Мышей взвешивают, а кровь отбирают для сыворотки перед и после 15 и 30 дней после начала лечения. Сыворотку исследуют на антитела против рецептора ацетилхолина и изотипы, как описано выше. Потеря мышечного рецептора ацетилхолина может также быть измерена. Другие анализы слитых белков TACI-иммуноглобулинов могут быть определены специалистами в данной области. 6. Получение конъюгатов TACI-иммуноглобулин. Настоящее изобретение включает в себя химически модифицированные TACI-иммуноглобулиновые композиции, в которых полипептид TACI-иммуноглобулин связан с полимером. Типично,полимер является водорастворимым, так что иммуноглобулиновый конъюгат не преципитируется в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером пригодного полимера является полимер, который модифицировали, чтобы в его состав входила одна реакционноспособная группа, например активный сложный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования. Таким образом, может быть проконтролирована степень полимеризации. Примером реакционноспособного альдегида является пропионовый альдегид полиэтиленгликоля, или моно-(С 1-С 10)алкокси, или арилоксипроизводные от них (см., например, Harris, et al., патент США 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Кроме того, для получения TACI-иммуноглобулиновых конъюгатов могут быть использованы смеси полимеров.TACI-иммуноглобулиновых конъюгаты, используемые для терапии, могут содержать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные компоненты. Подходящие водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, моно-(C1-C10)алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, поли-(N-винилпирролидон)ПЭГ, трезилмонометокси-ПЭГ, ПЭГ-пропиональдегид, bis-сукцинимидкарбонат-ПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярную массу от около 600 до около 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат TACI-иммуноглобулина может также содержать смесь таких водорастворимых полимеров. Один пример конъюгата TACI-иммуноглобулин содержит часть TACI-иммуноглобулина и часть полиалкилоксида, присоединенную к N-концу TACI-иммуноглобулина. ПЭГ является одним подходящим полиалкилоксидом. В качестве иллюстрации, TACI-иммуноглобулин может быть модифицирован ПЭГом, процесс известен как ПЭГилирование. ПЭГилирование TACI-иммуноглобулина может быть достигнуто любой их реакций ПЭГилирования, известных в данной области (см., например, ЕР 0154316,Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin.Pharmacokinet. 27:290 (1994), и Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998. Например, ПЭГилирование может быть произведено реакцией ацилирования или реакцией алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. В альтернативном подходе, конъюгаты TACI-иммуноглобулина образуют конденсированием активированного ПЭГа, при котором концевую гидроксильную или аминогруппу ПЭГа замещают активированным линкером (см., например, Karasiewicz et al., патент США 5382657).- 21010594 ПЭГилирование ацилированием типично требует взаимодействия активного производного сложного эфира ПЭГа с полипептидом TACI-иммуноглобулин. Примером активированного сложного эфира ПЭГа является ПЭГ, этерифицированный до N-гидроксисукцинимида. Как используют здесь, термин ацилирование включает в себя следующие типы связей между TACI-иммуноглобулином и водорастворимым полимером: амидом, карбаматом, уретаном и т.п. Способы получения ПЭГилированногоTACI-иммуноглобулина ацилированием будут типично содержать этапы: (а) взаимодействия полипептида TACI-иммуноглобулин с ПЭГом (таким как реакционноспособный сложный эфир альдегидного производного ПЭГа) в условиях, при которых одна или несколько групп ПЭГа прикрепляются к TACIиммуноглобулину, и (b) получения продукта (продуктов) реакции. Вообще, оптимальные условия взаимодействия реакций ацилирования будут определены на основе известных параметров и желаемых результатов. Например, чем больше соотношение ПЭГ:TACI-иммуноглобулин, тем выше процентное содержание поли-ПЭГилированного TACI-иммуноглобулинового продукта. Продукт ПЭГилирования ацилированием является типично поли-ПЭГилированным продуктомTACI-иммуноглобулина, причем лизиновые -аминогруппы являются ПЭГилированными через ацильную связывающую группу. Примером соединительного звена является амид. Типично образующийся в результате TACI-иммуноглобулин будет по меньшей мере на 95% моно-, ди- или трипэгилированным,хотя могут быть образованы некоторые разновидности с более высокой степенью ПЭГилирования в зависимости от условий взаимодействия. ПЭГилированные разновидности могут быть отделены от неконъюгированных полипептидов TACI-иммуноглобулина с использованием стандартных способов очистки, например диализа, ультрафильтрации, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т.п. ПЭГиляция алкилированием вообще включает в себя взаимодействие конечного производного альдегида ПЭГа с TACI-иммуноглобулином в присутствии редуцирующего агента. Группы ПЭГа могут быть присоединены к полипептиду через -CH2-NH-группу. Получение производных посредством редуктивного алкилирования для получения моноПЭГилированного продукта использует дифференциальную реакционную способность различных типов первичных аминогрупп, пригодных для получения производных. Типично, взаимодействие проводят приpH, которое позволяет взаимодействию использовать различия pKa между -аминогруппами остатков лизина и -аминогруппой N-концевого остатка белка. Путем такого селективного получения производных контролируют присоединение водорастворимого полимера, который имеет в своем составе реакционную группу, например альдегид, к белку. Конъюгирование с полимером происходит преимущественно на N-конце белка без существенной модификации реакционных групп, таких как аминогруппы лизинов боковой цепи. Настоящее изобретение предоставляет существенно гомогенное получение конъюгатов монополимера TACI-иммуноглобулина. Восстановительное алкилирование для производства существенно гомогенной популяции молекул конъюгата TACI-иммуноглобулина с монополимером может предусматривать этапы: (а) взаимодействия полипептида TACI-иммуноглобулин с реакционноспособным ПЭГом в условиях восстановительного алкилирования при pH, подходящем для позволения избирательной модификации -аминогруппы на аминоконце TACI-иммуноглобулина, и (b) получения продукта (продуктов) взаимодействия. Редуцирующий агент, используемый для восстановительного алкилирования, должен быть стабильным в водном растворе и способным к восстановлению шиффового основания, образованного на начальных этапах восстановительного алкилирования. Иллюстративные восстановители включают боргидрид натрия, цианборгидрид натрия, диметиламинборан и пиридинборан. Для существенно гомогенной популяции конъюгатов TACI-иммуноглобулина с монополимерами условия взаимодействия восстановительного алкилирования являются такими, что позволяют избирательное присоединение водорастворимой части полимера к N-концу TACI-иммуноглобулина. Такие условия взаимодействия вообще предусматривают различия pKa между аминогруппами лизина и аминогруппой на N-конце. pH также влияет на соотношение полимера к белку, что должно быть использовано. Вообще, если рН ниже, то будет желательно избыточное количество полимера по отношению к белку, поскольку меньшее количество реакционных N-концевых -групп, больше полимера необходимо для достижения оптимальных условий. Если рН выше, то полимер:TACI-иммуноглобулин не должен быть большим, поскольку большее количество реакционных групп имеется в распоряжении. Типично рН будет находиться в диапазоне от 3 до 9 или от 3 до 6. Другим фактором для рассмотрения является молекулярная масса водорастворимого полимера. Вообще, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше число полимерных молекул, которые могут быть присоединены к белку. Для взаимодействия с ПЭГом типичная молекулярная масса составляет от около 2 до около 100 кДа, от около 5 до около 50 кДа или от около 12 до около 25 кДа. Молярное соотношение водорастворимого полимера к TACI-иммуноглобулину будет вообще в области от 1:1 до 100:1. Типично молярное соотношение водорастворимого полимера к TACI-иммуноглобулину будет от 1:1 до 20:1 для поли-ПЭГилирования и от 1:1 до 5:1 для моно-ПЭГилирования. Общие способы получения конъюгатов, содержащих части полипептида и водорастворимых поли- 22010594 меров, известны в данной области. См., например, Karasiewicz et al., патент США 5382657, GreenwaldBiochem. 247:434 (1997. Настоящее изобретение рассматривает композиции, содержащие пептид, или полипептид, описанные здесь. Такие композиции могут, кроме того, содержать носитель. Носителем может быть общепринятый органический или неорганический носитель. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макрогол, кунжутное масло, кукурузное масло и т.п. 7. Выделение полипептидов TACI-иммуноглобулин. Полипетиды настоящего изобретения могут быть очищены по меньшей мере до 80%-ной чистоты,по меньшей мере до около 90%-ной чистоты, по меньшей мере до около 95%-ной чистоты или выше чем 95% чистоты относительно примесных макромолекул, особенно относительно других белков и нуклеиновых кислот и не содержать инфекционные и пирогенные агенты. Полипептиды настоящего изобретения могут также быть очищены до фармацевтически чистого состояния, которое является выше чем 99,9% чистоты. В определенных препаратах очищенный полипептид является существенно освобожденным от других полипептидов, особенно от других полипептидов животного происхождения. Способы фракционирования и/или общепринятой очистки могут быть использованы для получения препаратов полипептидов, искусственных полипептидов TACI-иммуноглобулин и рекомбинантных полипептидов TACI-иммуноглобулин, очищенных от рекомбинантных клеток хозяина. Вообще осаждение сульфатом аммония и кислотная экстракция или хаотропная экстракция могут быть использованы для фракционирования образцов. Примеры этапов очистки могут включать жидкостную хроматографию на гидроксиапатите, эксклюзивную хроматографию, FPLC (скоростная жидкостная хроматография белков) и обратнофазовую жидкостную хроматографию с высоким разрешением. Пригодные хроматографические среды включают замещенные декстраны, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные селикагели и т.п. Производные PEI, DEAE, QAE и Q являются пригодными. Примеры хроматографических носителей включают такие носители, модифицированные фенильными, бутильными или октильными группами, например Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville,PA) Octyl-Sepharose (Pharmacia) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как Amberchrom CG 71 (TosoHaas) и т.п. Пригодные твердые носители включают стеклянные шарики, смолы на основе силикагеля,целлюлозные смолы, агарозные шарики, сшитые шарики агарозы, полисиреновые шарики, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, при которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционными группами, что делает возможным присоединение белков аминогруппами, карбоксильными группами, сульфгидрильными группами, гидроксильными группами и/или углеводными остатками. Примеры процессов химического связывания включают активирование циан-бромидом, активирование N-гидроксисукцинимидом, эпоксидное активирование, сульфгидрильное активирование, активирование гидразидом и карбокси- и аминопроизводными для процессов химической сшивки карбодиимидов. Эти и другие твердые носители являются хорошо известными и широко используются в данной области и являются доступными от коммерческих поставщиков. Выбор специфического способа выделения и очистки полипептида является рутинным делом и определяется, отчасти, свойствами выбранного носителя. См., например, Affinity Chromatography: PrinciplesMethods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) иDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996). Дополнительные варианты выделения и очистки TACI-иммуноглобулинов могут быть придуманы специалистами в данной области. Например, могут быть использованы антитела анти-TACI или анти-Fc для выделения больших количеств белка методом иммуноаффинной очистки. Полипептиды настоящего изобретения также могут быть выделены с использованием индивидуальных свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованными ионами металла(IMAC) может быть использована для очистки белков, богатых гистидином, включая те белки, содержащие полигистидиновые метки. Кратко, сначала гель наполняют ионами металла для образования хелатов(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985. Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различной аффинностью, зависящей от использованного иона металла, будут сэлюированы конкурентной элюцией, понижением pH или использованием сильных хелатирующих агентов. Другие способы очистки включают очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином, Protein A-хроматография, и ионообменную хроматографию (M.Deutscher, (ed.),Meth. Enzymol. 182:529 (1990. Полипептиды TACI-иммуноглобулин или их фрагменты могут также быть получены путем химического синтеза, как описано выше. Полипептиды TACI-иммуноглобулин могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; ПЭГилированными или неПЭГилированными и могут включать, или могут не включать, начальный аминокислотный остаток метионина. Слитый белок TACI-иммуноглобулина может быть негликозилированным, гликозилированным или гликозилированным только в части TACI или в части иммуноглобулина. Иммуноглобулиновая часть может быть получена из антител человека, химерных антител или антител человекообразных. 8. Терапевтическое применение полипептидов TACI-иммуноглобулин.- 23010594 Белки TACI-иммуноглобулин могут быть использованы для модуляции иммунной системы путем связывания ZTNF4 или ZTNF2, и таким образом, препятствуя связыванию этих лигандов с эндогенными рецепторами TACI или ВСМА. Следовательно, настоящее изобретение включает использование белковTACI-иммуноглобулин субъекту, который испытывает недостаток в достаточном количестве рецепторовTACI или ВСМА, или который производит избыток ZTNF4 и ZTNF2. Эти молекулы могут быть введены любому субъекту, который нуждается в лечении, и настоящее изобретение рассматривает как применение в ветеринарии, так и в терапии человека. Иллюстративные субъекты включают субъекты млекопитающих, таких как сельскохозяйственные животные, домашние животные и больные люди. Полипептиды TACI-иммуноглобулин могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, карциномы В-клеток, иммуномодуляции, IBD и любых патологий, опосредованных антителами(например, ITCP, миастениа гравис и т.п.), почечная недостаточность, косвенный Т-клеточный иммунный ответ и отторжение трансплантата и заболевания трансплантат против хозяина. Полипептиды настоящего изобретения могут быть мишенями к специфичным ответам, регулируемым В-клетками во время иммунного ответа. Кроме того, полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для модулирования развития В-клеток, развития других клеток, наработки антител и наработки цитокинов. Полипептиды настоящего изобретения также могут модулировать взаимодействие Т-клеток и Вклеток путем нейтрализации пролиферативных эффектов ZTNF4. Полипептиды TACI-иммуноглобулин настоящего изобретения могут быть полезными для нейтрализации эффектов ZTNF4 для лечения пре-В- или В-клеточных лейкозов, таких как плазмоклеточный лейкоз, хронический или острый лимфоцитарный лейкоз, миеломы, такие как множественная миелома,плазмоклеточная миелома, омобластома и гигантоклеточная миелогенная опухоль и лимфомы, такие как неходжкинская лифома, которая ассоциирована с ростом полипептидов ZTNF4.ZTNF4 экспрессируется в CD8+-клетках, моноцитах, дендровидных клетках, активированных моноцитах, которые указывают, что в определенных аутоиммунных заболеваниях, цитотоксические Т-клетки могут стимулировать наработку В-клеток посредством избыточной наработки ZTNF4. Иммунодепрессантные белки, которые избирательно блокируют действие В-лимфоцитов, могли бы использоваться при лечении заболевания. Наработка аутоантител является одинаковой для нескольких аутоиммунных заболеваний и вносит вклад в разрушение ткани и обострение заболевания. Аутоантитела могут также привести к появлению осложнений осаждения иммунного комплекса и привести ко многим симптомам системной красной волчанки, включая почечную недостаточность, невралгические симптомы и смерть. Модулирование наработки антител, не зависящее от клеточного ответа, также было бы выгодным во многих болезненных состояниях. Было показано также, что В-клетки играют роль в секреции артрогенных иммуноглобулинов при ревматоидных артритах. Как таковое, ингибирование наработки антител ZTNF4 было бы выгодным в лечении аутоиммунных заболеваний, таких как миастениа гравис, ревматоидный артирит, детский полиартрит и псориатический артрит. Иммунодепрессантная терапия, например, белками TACI-иммуноглобулин, которые избирательно блокируют или нейтрализуют действие Влимфоцитов, была бы полезной для таких целей. Изобретение предусматривает способы применения белков TACI-иммуноглобулин для селективного блокирования или нейтрализации действия В-клеток в связи с конечной стадией почечной недостаточности, которая может или не может быть ассоциирована с аутоиммунным заболеванием. Такие способы также были бы полезны для лечения иммунологических почечных заболеваний. Такие способы были бы полезными для лечения гломерулонефрита, связанного с заболеваниями, такими как мембранная нефропатия, IgA нефропатия или болезнь Бергера, IgM нефропатия, болезнь Гудпасчура, постинфекционный гломерулонефрит, мезангиопролиферативное заболевание, хронический лимфоидный лейкоз, минимально-измененный нефротический синдром. Такие способы также могли бы служить в качестве терапевтических применений для лечения вторичного гломерулонефрита или ангины, связанными с такими заболеваниями, как волчанка, полиартрит, болезнь Шенлейна-Геноха, склеродерма, заболеваниями,связанными с ВИЧ, амилоидоз или гемолитико-уремический синдром. Способы настоящего изобретения также были бы полезными в качестве части (доли) терапевтического применения для лечения интерстициального нефрита или пиелонефрита, ассоциированного с хроническим пиелонефритом, злоупотребления болеутоляющими средствами, нефрокальциноза, нефропатии, вызванной другими агентами, почечнокаменной болезни или хронического или острого интерстициального нефрита. Способы настоящего изобретения также включают применение белков TACI-иммуноглобулин для лечения гипертонических заболеваний или заболеваний крупных сосудов, включая стеноз почечной артерии, или окклюзию, или холестериновую эмболию, или почечную эмболию. Настоящее изобретение также предоставляет способы лечения почечных или урологических истинных опухолей, множественных миелом, лимфом, легкой цепи невропатии или амилоидоза. Изобретение также предоставляет способы блокирования или ингибирования активированных Вклеток с использованием белков TACI-иммуноглобулин для лечения астмы и других хронических заболеваний дыхательных путей, таких как бронхиты и эмфизема. Описанные здесь белки TACIиммуноглобулин также могут быть использованы для лечения синдрома Шегрена. Также предоставляют способы ингибирования или нейтрализации эффекторного ответа Т-клеток с- 24010594 использованием белков TACI-иммуноглобулин для использования при иммунодепрессии, в частности для такого терапевтического использования как при реакции трансплантат против хозяина, так и при отторжении трансплантата. Кроме того, белки TACI-иммуноглобулин будут полезными в терапевтических протоколах для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как инсулинзависимый сахарный диабет(IDDM) и болезнь Крона. Способы настоящего изобретения могут иметь дополнительную терапевтическую ценность для лечения хронических воспалительных заболеваний, в частности, для уменьшения суставных болей, опухолей, анемии и других ассоциированных симптомов, так же как и лечения септического шока. Хорошо установленные модели на животных являются пригодными для анализа in vivo эффективности белков TACI-иммуноглобулин настоящего изобретения в точных болезненных состояниях. В частности, белки TACI-иммуноглобулин могут быть проанализированы in vivo в ряде экспериментальных моделей на животных на аутоиммунное заболевание, таких как MRL-Ipr/Ipr или F1 NZBxNZW родственных линий мышей, которые служат в качестве модели SLE (системной красной волчанки). Такие модели животных являются известными в данной области. Потомство от скрещивания между мышами New Zealand Black (NZB) и New Zealand White (NZW) проявляет спонтанные формы SLE, которые имеют близкое сходство с SLE человека. Потомство мышей,известное как NZBW, начинает обнаруживать IgM-аутоантитела против Т-клеток в возрасте 1 месяца и в 5-7-месячном возрасте, Ig-аутоантитела против ДНК являются доминантным иммуноглобулином. Поликлональная гиперактивность В-клеток приводит к чрезмерной наработке аутоантител. Накопление этих аутоантител, особенно аутоантител направленных против однонитевой ДНК, связано с развитием гломерулонефрита, который проявляется клинически как протеинурия, азотемия и смертью от почечной недостаточности. Почечная недостаточность является главной причиной смерти мышей, пораженных спонтанной SLE, а у линии NZBW этот процесс является хроническим и уничтожающим. Заболевание является более быстрым и тяжелым у женских особей, чем у мужских, со средним выживанием только 245 дней по сравнению с 406 днями для мужских особей. В то время как многие из женских особей мышей будут симптоматичными (протенуриа) в возрасте 7-9 месяцев, некоторые из них могут быть намного моложе или старше при проявлении симптомов. Смертельный иммунный нефрит, обнаруженный у мышейNZBW, является очень похожим на гломерулонефрит, обнаруженный у человека с SLE, делая эту спонтанную модель на мышах полезной для тестирования потенциальной терапии SLE. Модели на мышах для экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) использовали в качестве инструмента для исследования как механизмов иммунно-опосредованного заболевания, так и способов потенциального терапевтического вмешательства. Модель имеет сходство с рассеянным склерозом человека и дает демиелинизацию в качестве результата активации Т-клеток к нейробелкам, таким как основной белок миелина (MBP) или протеолипидный белок (PLP). Инокуляция антигеном приводит к индуцированию CD4+, Т-клеток II класса (Th1), рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (МНС). Изменения в протоколе по ЕАЕ могут породить острые, хронически-рецидивные или пассивно-перенесенные варианты модели. В экспериментальной модели на животных по изучению индуцированного коллагеном артрита(CIA) у мышей развивался хронический воспалительный артрит, который имеет близкое сходство с ревматоидным артритом (RA) человека. Поскольку CIA обнаруживает сходные с RA иммунологические и патологические признаки, то это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных компонентов у человека. Другим преимуществом использования модели по изучениюCIA является то, что механизмы его патогенеза известны. Идентифицированы Т- и В-клеточные эпитопы на коллаген II типа и определены различные иммунологические параметры (замедленная гиперчувствительность и антитела против коллагена) и противовоспалительные (цитокины, хемокины, ферменты, разрушающие матрикс) параметры, относящиеся к иммунно-опосредованным артритам, и могут быть использованы для оценки эффективности тестируемых компонентов в моделях. Миастения гравис (MG) является другим аутоиммунным заболеванием, для которого экспериментальные модели на мышах являются пригодными. MG является нарушением нервно-мышечной проводимости, затрагивающим выработку аутоантител, направленных против никотинового ацетилхолинового рецептора (AChR). MG является приобретенным или наследственным с клиническими признаками,включающими огромную слабость и утомляемость при напряжении. Установлена экспериментальная модель на мышах MG. Экспериментальная аутоиммунная миастениа гравис (EAMG) является заболеванием, опосредованным антителами, характеризующимся наличием антител к AChR. Эти антитела разрушают рецептор, приводя к повреждению нейромускульных электрических импульсов, выражающемуся в мышечной слабости. В экспериметальной модели EAMG мышей иммунизировали никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Клинические признаки MG становятся очевидными через неделю после второй иммунизации. EAMG оценивают несколькими способами, включая измерение уровней сыворотки антител к AChR радиоиммунологическим анализом, измерение мышечного AchR, или электромиографией. Вообще, доза введенного белка TACI-иммуноглобулин будет варьировать в зависимости от таких факторов, как возраст субъекта, вес, пол, общее медицинское состояние и предыдущая история болезни.- 25010594 Типично, является желательным обеспечение реципиента дозой белка TACI-иммуноглобулин, которая находится в диапазоне от около 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество агента/массу тела субъекта), хотя более низкие или более высокие дозы также могут быть введены, как диктуют обстоятельства. Введение белка TACI-иммуноглобулин субъекту может быть внутривенным, внутриартериальным,внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, перфузиионным через региональный катетер или прямой внутриповреждающей инъекций. При введении терапевтических белков инъекцией введение может быть в виде непрерывной инфузии или простыми или сложными болюсами. Дополнительные пути введения включают оральный, мембранно-слизистый, пульмональный и чрескожный. Оральный прием является пригодным для полиэфирных микросфер, зеиновых микросфер,белковых микросфер, полицианакрилатных микросфер и систем на основе липидов (см., например, DiBase and Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", in Protein Delivery: Physical Systems, Sandersand Hendren (eds.), стр. 255-288 (Plenum Press 1997. Удобоисполнимость интраназального введения иллюстрируют таким способом введения инсулина (см., например, Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv.Rev. 35:199 (1999. Сухие или жидкие частицы, содержащие TACI-иммуноглобулин, могут быть приготовлены и поглощены путем вдыхания с помощью диспергаторов для сухого порошка, аэрозольных генераторов для жидкостей или распылителей (например, Pettit and Gombotz, TIBTECH 76:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999. Этот подход иллюстрируют системой управления диабетом AERX, которая представляет собой портативный электронный ингалятор, который доставляет аэрозольный инсулин в легкие. Исследования показывают, что белки до 48000 кДа были доставлены через кожу в терапевтических концентрациях с помощью низкочастотного ультразвука, который иллюстрирует выполнимость чрескожного введения (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995. Чрескожная доставка с использованием электропорации предоставляет другие способы введения белков TACI-иммуноглобулин(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 70:213 (1997. Фармацевтическая композиция, содержащая белок TACI-иммуноглобулин, может быть технологически произведена в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически полезных композиций, в соответствии с чем терапевтические белки комбинируют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Указывают, что композиция должна быть фармацевтически пригодным носителем, если ее введение может быть толерантным для реципиентного пациента. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор является одним примером фармацевтически удовлетворяющего носителя. Другие подходящие носители являются хорошо известными в данной области. См., например, Gennaro (ed.), Remington's Pharmacerutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995). В терапевтических целях белки TACI-иммуноглобулин вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве. Указывают, что белки TACI-иммуноглобулин и фармацевтически приемлемый носитель должны быть введены в терапевтически эффективном количестве, если вводимое количество является физиологически существенным. Агент является физиологически существенным, если его наличие дает в результате обнаруживаемое изменение в физиологии реципиентного пациента. Например, агент,используемый для лечения воспаления, является физиологически существенным, если его присутствие облегчает воспалительную реакцию. В качестве другого примера агент, используемый для ингибирования роста опухолевых клеток, является существенным, если введение агента приводит в результате к уменьшению количества опухолевых клеток, уменьшенным метастазам, уменьшенной в размере твердой опухоли или увеличенному некрозу опухоли. Кроме того, агент, используемый для лечения системной красной волчанки, является физиологически значимым, если введение агента дает в результате снижение циркулирующих антител против двухцепочечной ДНК или уменьшение по меньшей мере одного из следующих симптомов: лихорадки, боли суставов, эритемного поражения кожи или других признаков системной красной волчанки. Одним примером общего признака, что белок TACI-иммуноглобулин вводят в терапевтически эффективном количестве, является то, что при последующем введении субъекту наблюдается снижение в циркулирующих уровнях ZTNF4 (BLyS). Фармацевтическая композиция, содержащая белок TACI-иммуноглобулин, может быть предоставлена в жидкой форме, в аэрозольной форме или в твердой форме. Жидкие формы иллюстрируют инъекционными растворами и оральными суспензиями. Экземпляры твердых форм включают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением. Последнюю форму иллюстрируют миниосмотическими насосами и имплантатами (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 70:239 (1997); Ranade, "Implants in DrugImplant," в Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), стр. 93-117 (Plenum Press 1997. Липосомы предоставляют один способ доставки терапевтических полипептидов субъекту внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутримышечно, поверхностно или через оральное введение,ингаляцию или интраназальное введение. Липосомы являются микроскопическими везикулами, которые состоят из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водные компартменты (см., в целом,Bakker-Woudenbergt et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 7j:S61 (1993), Kim, Drugs 46:618(1993), and Ranade," Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," в Drug Delivery Systems,Ranade and Hollinger (eds.), стр. 3-24 (CRC Press 1995. Липосомы по составу сходны с клеточными мембранами, и, в результате, липосомы могут быть введены безопасно и являются биодеградируемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными, или многослойными, и липосомы могут варьировать в размере с диапазоном диаметра от 0,02 мкм до больше чем 10 мкм. Множество агентов может быть инкапсулировано в липосомы: гидрофобные агенты, разделенные в бислоях, и гидрофильные агенты, распределенные во внутреннем (внутренних) водном пространстве (пространствах) (см., например, Machy et al., Liposomes In CellBiology And Pharmacology (John Libbey 1987), и Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989. Кроме того, существует возможность контроля терапевтической эффективности инкапсулированного агента посредством изменения размера липосомы, числа бислоев, липидного состава так же, как и заряда и поверхностных свойств липосом. Липосомы могут адсорбировать, практически, любые типы клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированный агент. Альтернативно, абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу клетками, которые являются фагоцитами. Эндоцитоз происходит с последующей деградацией липосомальных липидов внутри лизосом и высвобождением инкапсулированных агентов (Scherphof et al.,Ann. N.Y. Acad. Sci 446:368 (1985. После внутривенного введения небольшие липосомы (от 0,1 до 1,0 мкм) поглощаются клетками ретикулоэндотелиального аппарата, локализованного, главным образом, в печени и селезенке, в то время как липосомы больше чем 3,0 мкм депонируются в легких. Это преимущественное поглощение более мелких липосом клетками ретикулоэндотелиального аппарата было использовано для доставки хемотерапевтических агентов к макрофагам и к опухолям печени. Ретикулоэндотелиальный аппарат может быть обманут несколькими способами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц, или избирательной инактивацией макрофагов фармакологическими средствами (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984. Кроме того, показано, что внедрение производных гликолипидпроизводных или полиэтиленгликольпроизводных фосфолипидов внутрь липосомных мембран дает в результате существенно сниженное поглощение ретикулоэндотелиальным аппаратом (Allen et al. Biochim. Biophys. Acta 7068:133 (1991); Allen et al. Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993. Липосомы также могут быть подготовлены для специфических клеток-мишеней или органов варьированием фосфолипидной композиции или внедрением рецепторов, или лигандов внутрь липосом. Например, липосомы, очищенные с высоким содержанием неионного поверхностно-активного вещества,использовали для попадания в печень (Hayakawa et al., патент Японии 04-244018; Kato et al., Biol.Pharm. Bull. 76:960 (1993. Эти композиции были получены смешиванием соевого фосфатидилхолина,-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрированием смеси в вакууме и затем разбавления смеси водой. Также было показано, что липосомная композиция дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) со смесью полученного из сои стерилгликозида (SG) и холестерина (Ch) попадает в печень (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997. Альтернативно, различные лиганды-мишени могут быть пришиты к поверхности липосомы, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы разветвленными галактозиллипидными производными для обнаружения рецепторами асиалогликопротеина (галактозы), которые являются исключительно экспрессированными на поверхности клеток печени (Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997. Подобным образом, Wu et al., Hepatology 27:772 (1998), показали, что мечение липосом асиалофетуином приводило к сокращению полужизни липосомной плазмы и вообще усиливало поглощение гепатоцитами липосом, меченных асиалофетуином. С другой стороны,печеночная аккумуляция липосом, содержащих разветвленные производные галактозиллипида, может быть ингибирована предварительной инъекцией асиалофетуина (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259(1997. Полиаконитилированные липосомы сывороточного альбумина человека предоставляют другой подход для попадания липосом в клетки печени (Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997. Кроме того, Geho, et al., патент США 4603044, описывают систему доставки в гепатоциты на основе липосомных пузырьков, которая является специфичной для гепатобилиарных рецепторов, ассоциированных со специализированными метаболическими клетками печени. В более общем подходе по попаданию в ткани клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными для лиганда, экспрессированного клеткой-мишенью (Harasym et al.,Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998. После удаления плазмой свободного антитела вводят стрептавидинконъюгированные липосомы. В другом подходе, анитела, которые служат меткой, прикрепляют прямо к липосомам (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998. Белки TACI-иммуноглобулин могут быть инкапсулированы внутрь липосом с использованием стандартных приемов микроинкапсулирования белков (см., например, Anderson et al., Infect. Immun. 37:1099- 27010594 подчеркивают выше, терапевтически пригодные липосомы могут иметь в своем составе различные компоненты. Например, липосомы могут содержать липидные производные полиэтиленгликоля (Allen et al.,Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993. Для поддержания высоких системных уровней терапевтических белков были созданы распадающиеся полимерные микросферы. Микросферы получают из биодеградируемых полимеров, таких как поли(лактид-когликолид) (PLG), полиангидриды, полиортоэфиры, биологически неразложимые этилвинилацетатные полимеры, в которых белки инкапсулированы в полимер (Gombotz and Pettit, Bioconjugate(1998); Putney, Curr. Opin Chem. Biol. 2:548 (1998. Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ),могут также предоставлять носители для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 70:167 (1997. Настоящее изобретение также рассматривает химически модифицированные белки TACIиммуноглобулин, в которых полипептид связан с полимером, как обсуждают выше. Другие лекарственные формы могут быть разработаны специалистами в данной области, как показано, например, Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th EditionCompany 1995), Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996. В качестве иллюстрации фармацевтические композиции могут быть поставлены в виде набора, содержащего контейнер, который содержит белок TACI-иммуноглобулин. Терапевтические полипептиды могут быть предоставлены в виде инъекционного раствора для одной или нескольких доз или в виде стерильного порошка, который будет растворен перед инъецированием. Альтернативно, такой набор может включать в себя диспергатор для сухих порошков, жидкостно-аэрозольный генератор или распылитель для введения терапевтического полипептида. Такой набор, кроме того, может содержать написанную информацию по указанию и применению фармацевтической композиции. Кроме того, такая информация может включать утверждение, что белковая композиция TACI-иммуноглобулин противопоказана пациентам с известной гиперчувствительностью к любому из компонентов рецептора TAG или иммуноглобулиновому компоненту. 9. Терапевтическое использование нуклеотидных последовательностей TACI-иммуноглобулина. Настоящее изобретение включает в себя применение молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют слитые белки TACI-иммуноглобулина для предоставления этих слитых белков субъекту, который нуждается в таком лечении. Для ветеринарного терапевтического применения или терапевтического применения для человека такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены субъекту, имеющему нарушение или заболевание, как обсуждено выше. В качестве одного примера, обсужденного ранее, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок TACI-иммуноглобулина, могут быть использованы для продолжительного лечения системной красной волчанки. Существует ряд подходов по внедрению гена TACI-иммуноглобулин субъекту, включающих использование рекомбинантных клеток хозяина, которые экспрессируют TACI-иммуноглобулин, доставку очищенной нуклеиновой кислоты, кодирующей TACI-иммуноглобулин, использование катионного липидного переносчика с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует TACI-иммуноглобулин и использование вирусов, которые экспрессируют TACI-иммуноглобулин, таких как рекомбинантные ретровирусы, рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы, рекомбинантные аденовирусы и рекомбинантные симплексные вирусы герпеса (см., например, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al.,Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3:203 (1991. В подходе ex vivo, например, изолированные клетки субъекта, заражают вектором, который экспрессирует ген TACI-иммуноглобулин, и затем пересаживают внутрь субъекта. Для того чтобы произвести экспрессию гена TACI-иммуноглобулин, конструируют вектор, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая ген TACI-иммуноглобулин, пришита в результате манипуляций к коровому промотору и произвольно к регуляторному элементу для контроля транскрипции гена. Общие требования к экспрессионному вектору описывают выше. Альтернативно, ген TACI-иммуноглобулин может быть доставлен с использованием рекомбинантных вирусных векторов, включающих, например, аденовирусные векторы (e.g., Kass-Eisler et al.,Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993), Kolls et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 97:215 (1994), Li et al.Hum.Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993), and Zabner et al., Cell 75:207 (1993,аденовирус-ассоциированные вирусные векторы (Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:1061.3 (1993,альфавирусы, такие как лесной вирус и Sindbis вирус (Hertz and Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju andHuang, J. Vir. 65:2501 (1991), and Xiong et al., Science 243:1188 (1989, вирусные векторы герпеса (e.g.,патенты США 4769331, 4859587, 5288641 и 5328688), векторы парвовирусов (Koering et al., Hum.Gene Therap. 5:457 (1994, векторы вирусов оспы (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 793:653(1993), Panicali and Paoletti, Proc. Natl Acad. Sci. USA 79:4927 (1982, вирусы оспы, например канареечный вирус оспы или вирус коровьей оспы (Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:317 (1989), и(1993), Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile and Hart,Cancer Res. 53:962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993), и Anderson et al., патент США 5399346). В рамках различных вариантов или сами вирусные векторы, или вирусные частицы, которые содержат вирусный вектор, могут быть использованы в способах и композициях, описанных ниже. В качестве иллюстрации одной из систем аденовирус, вирус с двухцепочечной ДНК, является хорошо охарактеризованным ветором для генного переноса доставки гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты (см. обзор, Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, ScienceMedicine 4:44 (1997. Аденовирусная система дает несколько преимуществ, включающих: (i) способность к размещению относительно крупных вставок ДНК, (ii) способность быть нарощенными до высокого титра,(iii) способность к инфицированию широкого ряда типов клеток млекопитающих и (iv) способность быть использованными со многими различными промоторами, включая убиквитиновые, тканеспецифичные и регулируемые промоторы. Кроме того, аденовирусы могут быть введены путем внутривенной инъекции,поскольку вирусы являются устойчивыми в кровотоке. Используя аденовирусные векторы, где части аденовирусного генома удалены, вставки внедряют в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с плазмидой для котрансфекции. В иллюстративной системе важнейший ген Е 1 удаляют из вирусного вектора, и вирус не будет реплицироваться, пока ген Е 1 не будет предоставлен клеткой-хозяином. При внутривенном введении интактным животным аденеовирус сначала поражает печень. Хотя аденовирусная система доставки с делецией в гене Е 1 не может реплицироваться в клетке-хозяине, ткани хозяина будут экспрессировать и подвергать процессингу кодируемый гетерологичный белок. Клетки хозяина будут также секретировать гетерологичный белок, если соответствующий ген включает в себя секреторную сигнальную последовательность. Секретированные белки будут поступать в кругооборот из ткани, которая экспрессирует гетерологичный ген (например, высоковаскулизированная печень). Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть использованы для снижения или элиминирования иммунного ответа на вектор. Такие аденовирусы содержат делецию в Е 1 и, кроме того, содержат делеции Е 2 А или Е 4 (Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998);Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998. Сообщалось также, что делеция E2b понижает иммунный ответ (Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998. Делецией всего аденовирусного генома могут быть размещены очень крупные вставки гетерологичной ДНК. Получение так назывемых бесхарактерных аденовирусов, где все вирусные гены удалены, является особенно выгодным для инсерции крупных вставок гетерологичной ДНК (см., обзор Yeh. and Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997. Матричные растворы с высокими титрами рекомбинантных вирусов, обеспечивающих экспрессию терапевтического гена, могут быть получены из инфицированных клеток млекопитающих с использованием стандартных методов. Например, рекомбинантный вирус герпеса simplex может быть приготовлен в клетках Vera, как описано Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211(1994), Visalli and Brandt, Virology 785:419 (1991), Grau er al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989),Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), и Brown and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997). Альтернативно, экспрессионный вектор, содержащий ген TACI-иммуноглобулин, может быть внедрен в клетки субъекта липофекцией in vivo с использованием липосом. Искусственные катионные липиды могут быть использованы для получения липосом для трансфекции in vivo геном, кодирующим маркер (Feigner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 (1988. Использование липофекции для внедрения экзогенных генов в специфические органы invivo имеет определенные практические преимущества. Липосомы могут быть использованы для прямой трансфекции отдельных типов клеток, которые являются особенно полезными в ткани с клеточной гетерогенностью, таких как ткани поджелудочной железы, печени, почек и мозга. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами с целью мечения. Пептиды-мишени (например, гормоны или нейротрансмиттеры), белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть присоединены к липосомам химическим путем. Электропорация является другим альтернативным способом введения. Например, Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 76:867 (1998) демонстрировали использование электропорации in vivo для переноса генов в мышцу. Вообще, доза композиции, содержащей терапевтический вектор, имеющий нуклеотидную последовательность TACI-иммуноглобулина, например рекомбинантный вирус, будет варьировать в зависимости от таких факторов, как возраст субъекта, вес, рост, пол, общее медицинское состояние и предыдущая история болезни. Пригодные пути введения терапевтических векторов включают внутривенную инъекцию, внутриартериальную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриопухолевую инъекцию и инъекцию внутрь каверны, которая содержит опухоль. В качестве иллюстрации Horton et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 96:1553 (1999), показал, что внутримышечная инъекция плазмидной ДНК, кодирующей- 29010594 интерферон-, вызывает сильные противоопухолевые эффекты на первичные и метастазирующие опухоли в модельных экспериментах на мышах. Композиция, содержащая вирусные векторы, не вирусные векторы или сочетание вирусных и не вирусных векторов настоящего изобретения, могут быть приготовлены в соответствии с известными способами получения фармацевтически пригодных композиций, тем самым векторы или вирусы комбинируют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем. Как отмечалось выше, композиция, такая как фосфатно-солевой буферный раствор, указывается, должна быть фармацевтически приемлемым носителем, если ее введение может быть выдержано субъектом-реципиентом. Другие пригодные носители хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), и Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed.(MacMillan Publishing Co. 1985. В терапевтических целях, экспрессионный вектор терапевтического гена или рекомбинантный вирус, содержащий такой вектор, и фармацевтически приемлемый носитель вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. Указывают, что комбинация экспрессионного вектора (или вируса) и фармацевтически приемлемого носителя должна быть введена в терапевтически эффективном количестве, если вводимое количество является физиологически существенным. Агент является физиологически существенным, если его наличие дает в результате обнаруживаемое изменение в физиологии реципиентного субъекта. Например, агент, используемый для лечения воспаления, является физиологически существенным, если его наличие смягчает воспалительный ответ. В другом примере, агент, используемый для ингибирования роста клеток опухоли, является физиологически значимым, если введение агента приводит к уменьшению числа опухолевых клеток, уменьшению метастаз, уменьшению в размере твердой опухоли или усилению некроза опухоли. Если субъектом, которого лечат экспрессионным вектором терапевтического гена или рекомбинантным вирусом, является человек, тогда терапией является предпочтительно генная терапия соматической клетки. Это означает, что предпочтительное лечение человека экспрессионным вектором терапевтического гена или рекомбинантным вирусом не влечет за собой внедрение внутрь клеток молекулы нуклеиновой кислоты, которая может образовывать часть зародышевой линии человека и быть передана следующим поколениям (т.е. исправление генетических дефектов методами генетической инженерии в зародышевой линии человека). 10. Получение трансгенных мышей. Трансгенные мыши могут быть созданы со сверхэкспрессируемыми последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими слитые белки TACI-иммуноглобулина во всех тканях, или под контролем тканеспецифичного или тканепредпочтительного регуляторного элемента. Это сверхпроизводство слитых белков TACI-иммуноглобулинов может быть использовано для отличия фенотипа, который получается в результате сверхэкспрессии, и трансгенные животные могут служить моделью для заболеваний человека, вызванных избытком рецепторного белка TACI. Трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют слитые белки TACI-иммуноглобулина, также предоставляют модель биореакторов по производству слитых белков TACI-иммуноглобулинов в молоке или в крови высших животных. Способы получения трансгенных мышей являются хорошо известными специалистам в данной области (см., например, Jacob,"Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice," в Overexpression and Knockout of Cytokines inin Transgenic Mice," в Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), стр. 367-397 (Academic Press, Inc. 1999. Например, способ получения трансгенной мыши, которая экспрессирует нуклеотидную последовательность, которая кодирует слитый белок TACI-иммуноглобулина, может начинаться с взрослых, фертильных мужских особей (производителей) (B6C3f1, в возрасте от 2 до 8 месяцев (Taconic Farms Germantown, NY, самцов после вазектомии (поддельных) (B6D2f1, в возрасте от 2 до 8 месяцев (TaconicFarms, препубертатных фертильных самок (доноры) (В 6C3f1, от 4 до 5 недель (Taconic Farms и взрослых фертильных самок (реципиентов) (B6D2H, от 2 до 4 месяцев, (Taconic Farms. Доноров акклиматизируют в течение одной недели и затем инъецируют гонадотропином сыворотки жеребых кобыл в дозе приблизительно 8 МЕ/мышь (Sigma Chemical Company; St. Louis, МО) внутрибрюшинно и через 46-47 ч хорионическим гонадотропным гормоном человека в дозе 8 МЕ/мышь (hCG (sigma внутрибрюшинно,для индуцирования суперовуляции. Доноров спаривали с производителями вслед за гормональными инъекциями. Овуляция вообще происходит в течение 13 ч инъекции hCG. Копуляцию подтверждают наличием вагинальной пробки утром после спаривания. Оплодотворенные яйцеклетки собирают под хирургическим микроскопом. Яйцеводы собирают и яйцеклетки выпускают на пластинки для анализа мочи, содержащие гиалуронидазу (sigma). Яйцеклетки промывают один раз в гиалуронидазе и дважды в среде Виттена (Whitten's W640 medium, описанной,например, Menino and O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986), и Dienhart and Downs, Zygote 4:129 (1996,яйцеклетки инкубировали с 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 при 37C. Яйцеклетки затем хранят в инкубаторе