Способ получения цитотоксических лимфоцитов

012520 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксического лимфоцита, который применим в области медицины. Уровень техники Живой организм защищен от чужеродных веществ главным образом иммунным ответом, и иммунная система основана на различных клетках и продуцируемых ими растворимых факторах. Среди них ключевую роль играют лейкоциты, особенно лимфоциты. Лимфоциты делят на два основных типа, Влимфоциты (которые в дальнейшем могут называться В-клетками) и Т-лимфоциты (которые в дальнейшем могут называться Т-клетками), и те, и другие специфично узнают антиген и действуют на антиген,защищая живой организм. Т-клетки подразделяют на хелперные Т-клетки, имеющие маркер CD4 (кластер дифференцировки)(в дальнейшем называемые TH), главным образом вовлеченные в оказание помощи в продуцировании антител и индукции различных иммунных ответов, и цитотоксические Т-клетки, имеющие маркер CD8(Tc: цитотоксические Т-лимфоциты, также называемые Т-клетками-киллерами, которые в дальнейшем могут называться CTL), главным образом проявляющие цитотоксическую активность. CTL, которые играют важнейшую роль в узнавании, разрушении и элиминации опухолевых клеток, инфицированных вирусом клеток и т.п., не продуцируют антитело, специфично взаимодействующее с антигеном, подобно В-клеткам, но непосредственно узнают и действуют на антигены (антигенный пептид) из клеткимишени, которые связаны с молекулами класса I главного комплекса гистосовместимости [МНС, которые у человека также могут называться человеческим лейкоцитарными антигенами (HLA)], существующими на поверхности мембраны клетки-мишени. В это время рецептор Т-клеток (в дальнейшем называемый TCR), существующий на поверхности мембраны CTL, специфично узнает указанные выше антигенные пептиды и молекулы МНС класса I и определяют, является ли антигенный пептид аутологичным или неаутологичным. Затем клетка-мишень, которая была определена как неаутологичная, специфично разрушается и элиминируется клеткой CTL. В последние годы терапия, которая могла бы вызвать тяжелую физическую нагрузку для пациента,такая как фармакотерапия и лучевая терапия, была пересмотрена, и возрос интерес к иммунотерапии с небольшой физической нагрузкой для пациента. Особенно отмечалась эффективность адоптивной иммунотерапии, при которой CTL, способный специфично взаимодействовать с представляющим интерес антигеном, индуцируют ex vivo из лимфоцита, полученного от человека, обладающего нормальной иммунной функцией, или лимфоцит размножают без индукции и затем переносят пациенту. Например, получены свидетельства того, что в животной модели адоптивная иммунотерапия представляет собой эффективную терапию вирусной инфекции и опухоли (например, как в работе Greenberg, P.D., опубликованной в 1992, Advances in Immunology и Reusser P. и трех других авторов, Blood, 1991, 78(5), 13731380). В случае указанной терапии важно сохранить или увеличить количество клеток в состоянии, при котором антиген-специфическая цитотоксическая активность CTL сохраняется или усиливается. В случае описанной выше адоптивной иммунотерапии необходимо вводить цитотоксические лимфоциты в заданном количестве клеток или большем количестве, чтобы получить терапевтический эффект. Другими словами можно сказать, что самой большой проблемой является получение указанного выше количества клеток ex vivo в течение короткого периода времени. Чтобы сохранить и усилить антиген-специфическую цитотоксическую активность CTL, как правило, использовали способ многократной стимуляции представляющим интерес антигеном при индукции специфичного ответа на антиген в случае CTL. Однако в указанном способе количество CTL, получаемое в конечном итоге, как правило, может уменьшаться, так что невозможно получить достаточное количество клеток. В качестве способа получения Т-клетки, которая является эффективной для лечения заболевания,известна, например, адоптивная иммунотерапия с использованием активируемых лимфокином клетоккиллеров (LAK-клетки) (например, Rosenberg S.A. et al., N. Engl. J. Med. 1987, 316(15), 889-897) и адоптивная иммунотерапия с использованием инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), индуцированных интерлейкином-2 (IL-2) в высокой концентрации (например, Rosenberg S.A. et al., N. Engl. J. Med.,1988, 319(25), 1676-1680 и Но М. и девять соавторов, Blood, 1993, 81(8), 2093-2101). Затем в отношении получения антиген-специфических CTL был опубликован способ выделения и экспансии CMV-специфичного клона CTL с использованием аутологичного инфицированного CMV фибробласта и IL-2 (например, Riddell S.А. и четверо соавторов, J. Immunol., 1991, 146(8), 2795-2804) или с использованием моноклонального антитела против CD3 (анти-CD3-мАт) и IL-2 (например, Greenberg,P.D. с соавтором, J. Immunol. Methods, 1990, 128(2), 189-201). Кроме того, в WO 96/06929 описан способ REM (способ быстрой экспансии). Указанный способREM представляет собой способ экспансии популяции первичных Т-клеток, содержащей антигенспецифические CTL и TH, в течение короткого периода времени. Другими словами указанный способ отличается тем, что можно получить большое количество Т-клеток посредством пролиферации отдельных Т-клеточных клонов, и тем, что количество антиген-специфических CTL увеличивают, используя анти-CD3-антитело, IL-2 и РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), которые делают де-1 012520 фицитными в отношении способности к пролиферации путем облучения, и клетки, инфицированные вирусом Эпштейн-Барр (в дальнейшем просто называемым EBV). Кроме того, в WO 97/32970 описан модифицированный способ REM, и данный способ представляет собой способ с использованием в качестве питающих клеток линии неделящихся клеток млекопитающих, экспрессирующих стимулирующий Т-клетки компонент, которые отличаются от РВМС, чтобы уменьшить количество используемых РВМС. Активируемые лимфокином клетки-киллеры (LAK-клетки) являются популяцией функциональных клеток, обладающих цитотоксической активностью, которые получают путем добавления IL-2 к периферической крови (лейкоциты периферической крови), пуповинной крови, тканевой жидкости и т.п., содержащему лимфоциты, и культивируя клетки in vitro в течение нескольких дней. Во время культивирования пролиферацию LAK-клеток дополнительно ускоряют, добавляя к ним анти-CD3-антитела и культивируя клетки. Полученные таким образом LAK-клетки обладают цитотоксической активностью, неспецифически направленной против различных злокачественных клеток и других мишеней. LAK-клетки также используют в адоптивной иммунотерапии таким же образом, что и указанные выше CTL. Как описано выше, применение IL-2 важно на стадии получения цитотоксических лимфоцитов, например, CTL, LAK-клеток, TIL и т.п. Клетки дополнительно активируются связыванием IL-2 с рецептором интерлейкина-2 (IL-2R) на поверхности клетки. Кроме того, IL-2R известен как маркер активации лимфоцита. С этих точек зрения важно увеличить экспрессию IL-2R на поверхности клетки. Кроме того,при индукции CTL важно повысить эффективность индукции клеток-предшественников CTL, подвергаемых стимуляции антигеном, в виде CTL, т.е. увеличить долю (относительное содержание) CD8 позитивных клеток в группе клеток после индукции. Обычно также добавляют сыворотку или плазму в соотношении от 5 до 20 об.% при размножении указанных лимфоцитов ех vivo. Указанная сыворотка или плазма является компонентом, необходимым в том случае, когда клетки, такие как лимфоциты, культивируют ex vivo. Однако нельзя исключать риск развития различных вирусных инфекций и т.п., так как сыворотку или плазму получают из крови неаутологичного животного (человека, жвачных полорогих животных и т.п.). Кроме того, невозможно полностью отрицать присутствие вируса или патогенного микроорганизма, не выявляемого современными способами регистрации. В этой связи в последние годы все больше и больше используют сыворотку или плазму, полученную от пациента (аутологичная сыворотка или плазма). Однако это может быть связано с риском для пациента в связи со взятием большого количества крови у пациента для получения сыворотки или плазмы в количестве, необходимом для культивирования, так как это вызывает тяжелую физическую нагрузку на пациента. Чтобы избежать указанного риска, используют небольшое количество сыворотки или плазмы для размножения, чтобы получить лимфоциты, требуемые для лечения, поэтому их приходится культивировать при низкой концентрации сыворотки или плазмы. Как правило, рост таких клеток, как лимфоциты, является нестабильным в условиях культуры с низкой концентрацией сыворотки или низкой концентрацией плазмы; в связи с этим невозможно получить клетки в количестве, необходимом для лечения. Кроме того, не содержащая сыворотки культура особенно требуется для того, чтобы избежать физической нагрузки и риска инфекции, как указано выше. Однако большинство клеток не может расти в таких условиях культивирования. Следовательно, чрезвычайно необходим способ размножения лимфоцитов при низкой концентрации сыворотки или без сыворотки (при низкой концентрации плазмы или без плазмы). Если разработать способ экспансии лимфоцитов в условиях без сыворотки (без плазмы), то могут быть исключены различия в сыворотке или плазме между партиями и могут быть исключены негативные элементы в результате присутствия сыворотки или плазмы от пациента (такие как иммуносупрессирующие компоненты), при этом преимущество, получаемое в результате разработки такой системы, неоценимо. Фибронектин представляет собой гигантский гликопротеид, имеющий молекулярную массу 250 тысяч, который существует в крови животных, на поверхности культивируемых клеток или во внеклеточном матриксе ткани, и, как известно, обладает различными функциями. Его доменную структуру делят на семь частей (дальнейшее описание относится к фиг. 1), при этом в его аминокислотной последовательности содержится три вида сходных последовательностей, повторы каждой из указанных последовательностей составляют полную последовательность. Три вида сходных последовательностей называют последовательностями типа I, типа II и типа III. Среди них тип III состоит из 71-96 аминокислотных остатков, где доля совпадений указанных аминокислотных остатков составляет от 17 до 40%. В фибронектине имеется четырнадцать последовательностей типа III, из них 8-я, 9-я или 10-я последовательности(каждая из которых в дальнейшем называется III-8, III-9 или III-10) находятся в домене связывания с клеткой, а 12-я, 13-я или 14-я последовательность (каждая из которых в дальнейшем называется III-12,III-13 или III-14) находится в домене, связывающем гепарин. Кроме того, область связывания VLA (антигена очень поздней активации)-5 находится в III-10, и ее коровой последовательностью является RGDS. Кроме того, область, называемая IIICS, существует с С-концевой стороны домена, связывающего гепарин. Область, называемая CS-1, состоящая из 25 аминокислот и обладающая связывающей активностью-2 012520 в отношении VLA-4, существует в IIICS (например, в работе автора Deane F. Momer, опубликованной в 1988, Fibronectin, Academic Press Inc., P1-8, Kimizuka F. и восьми других соавторов, J. Biochem., 1991,110(2), 284-291 и Hanenberg H. и пяти соавторов, Human Gene Therapy, 1997, 8(18), 2193-2206). Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является способ получения цитотоксического лимфоцита, обладающего цитотоксической активностью на высоком уровне, который в высокой степени безопасно и соответствующим образом используют в области медицины. Суммируя, можно отметить, что первый вариант настоящего изобретения относится к способу получения цитотоксических лимфоцитов, который отличается тем, что включает в себя по меньшей мере одну стадию осуществления, выбранную из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации не более 5 об.% от объема среды, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем цитотоксические лимфоциты экспрессируют рецептор интерлейкина-2 в большей степени по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Кроме того, примером цитотоксических лимфоцитов, полученных в первом варианте осуществления настоящего изобретения, являются цитотоксические лимфоциты, которые содержат CD8-позитивные клетки в более высоком относительном количестве по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Кроме того, примером цитотоксических лимфоцитов, полученных в первом варианте осуществления настоящего изобретения, являются цитотоксические лимфоциты, кратность экспансии которых выше, чем кратность экспансии цитотоксических лимфоцитов, полученных способом получения цитотоксических лимфоцитов в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Также примером цитотоксических лимфоцитов, полученных в первом варианте осуществления настоящего изобретения, являются цитотоксические лимфоциты, которые обладают цитотоксической активностью, повышенной или поддерживаемой на высоком уровне по сравнению с цитотоксической активностью цитотоксических лимфоцитов, полученных в отсутствие фибронектина,его фрагмента или их смеси. В первом варианте осуществления настоящего изобретения примером применения фибронектина,его фрагмента или их смеси является применение, при котором фибронектин, его фрагмент или их смесь иммобилизуют на твердой фазе. В данном случае примером твердой фазы является оборудование для культивирования клеток или носитель для культуры клеток. Примером оборудования для культивирования клеток является чашка Петри, флакон или мешок, и примером носителя для культуры клеток являются шарики, мембрана или предметное стекло. В первом варианте осуществления настоящего изобретения примером цитотоксических лимфоцитов являются активируемые лимфокином клетки-киллеры. В первом варианте осуществления настоящего изобретения примером фрагмента фибронектина является полипептид (а), содержащий по меньшей мере любую одну из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1-8 в списке последовательностей, или полипептид (b), содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в любой из указанных выше аминокислотных последовательностей, при этом полипептид (b) обладает функцией, эквивалентной функции указанного выше полипептида (а). Примером фрагмента фибронектина являются фрагменты, которые обладают активностью в клеточной адгезии и/или связывающей активностью по отношению к гепарину. Примером фрагмента фибронектина также является по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, имеющих любую из аминокислотных последовательностей, показанных вSEQ ID NO: 9-20 и 25 в списке последовательностей. В первом варианте осуществления настоящего изобретения одним из вариантов способа получения,который осуществляют на оборудовании для культивирования клеток, является способ, который удовлетворяет следующим требованиям:(a) отношение количества клеток к площади поверхности культуры в оборудовании для культивирования клеток в начале культивирования составляет от 1 до 5105 клеток/см 2; и/или(b) концентрация клеток в среде в начале культивирования составляет от 1 до 5105 клеток/мл. В первом варианте осуществления настоящего изобретения в качестве примера применяют способ,кроме того, включающий в себя стадию трансдукции чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит. В данном случае примером трансдукции чужеродного гена является стадия, включающая в себя применение ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса или вируса обезьян. Второй вариант осуществления настоящего изобретения относится к цитотоксическому лимфоциту,полученному способом согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения. Третий вариант осуществления настоящего изобретения относится к лекарственному средству, содержащему в качестве эффективного ингредиента цитотоксический лимфоцит, полученный способом согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения. Четвертый вариант осуществления настоящего изобретения относится к среде для культивирования-3 012520 цитотоксического лимфоцита, отличающейся тем, что среда содержит в качестве эффективного ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь, и тем, что суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Настоящее изобретения относится к способу получения цитотоксического лимфоцита, который является в высокой степени безопасным и нагрузка которого на пациента снижена. Краткое описание чертежа Чертеж является схемой, показывающей доменную структуру фибронектина. Наилучший способ осуществления изобретения Настоящее изобретение было завершено благодаря выявлению того, что в случае получения цитотоксических лимфоцитов в присутствии фибронектина и/или фрагмента фибронектина в способе индукции, поддержания или экспансии цитотоксических лимфоцитов цитотоксические лимфоциты обладают достаточной цитотоксической активностью даже при более высокой кратности экспансии, высоким уровнем экспрессии IL-2R и высоким относительным содержанием CD8-позитивных клеток, даже если содержание сыворотки или плазмы в среде понижено или исключено. В этой связи получение цитотоксического лимфоцита, используемое в данном описании, относится к стадии, включающей в себя каждую из стадий индукции (активации), поддержания и экспансии клеток или объединенные указанные стадии. Получение цитотоксического лимфоцита согласно настоящему изобретению также относится к культивированию цитотоксического лимфоцита. Настоящее изобретение будет конкретно объяснено ниже.(1) Фибронектин и его фрагмент, используемые в настоящем изобретении. Фибронектин и его фрагмент, упоминаемые в данном описании, могут быть природного происхождения или искусственно синтезированными. Фибронектин и его фрагмент могут быть получены в значительной степени очищенной форме из вещества природного происхождения, например, на основе описания Ruoslahti E., et al. [J. Biol. Chem., 256(14), 7277-7281 (1981)]. Термин в значительной степени очищенный фибронектин или фрагмент фибронектина в использованном в данном описании смысле означает такой фибронектин и фрагмент фибронектина, который по существу не содержит других белков и тому подобного, существующих вместе с фибронектином в природе. Каждый из указанных выше фибронектина и его фрагмента могут быть использованы в настоящем изобретении отдельно или в смеси множества видов. При этом известно, что существует большое количество вариантов сплайсинга фибронектина. В качестве фибронектина, применяемого в настоящем изобретении, можно использовать любой вариант при условии, что проявляются требуемые эффекты согласно настоящему изобретению, например, в случае фибронектина, полученного из плазмы, известно, что делетирована область, называемая ED-B, присутствующая выше домена связывания с клеткой, и область, называемая ED-A, присутствующая между доменом связывания с клеткой и доменом, связывающим гепарин. Такой фибронектин, полученный из плазмы, также можно использовать в настоящем изобретении. Полезную информацию, относящуюся к фрагментам фибронектина, которые можно использовать в настоящем изобретении, и к получению фрагментов, можно найти в Kimiduka F., et al. [J. Biochem., 110,284-291 (1991)], Kornbrihtt A.R., et al. [EMBO J., 4(7), 1755-1759 (1985)], Sekiguchi K., et al. [Biochemistry,25(17), 4936-4941 (1986)] и т.п. публикациях. Кроме того, аминокислотная последовательность фибронектина представлена в Genbank с номером доступаNM002026 (NP002017). В настоящем изобретении примером фрагмента фибронектина является, например, полипептид (а),содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую любую из областей III-8 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей), III-9 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 2 в списке последовательностей), III-10 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 3 в списке последовательностей), III-11 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 4 в списке последовательностей), III-12 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей), III-13 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей), III-14 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей) и CS-1 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей) (см. фиг. 1), или полипептид (b), содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, при этом полипептид(b) обладает функцией, эквивалентной функции указанного выше полипептида (а). Кроме того, в качестве фрагмента предпочтительно может быть использован фрагмент, обладающий активностью в клеточной адгезии и/или связывающей активностью по отношению к гепарину. Активность в клеточной адгезии можно оценить, анализируя связывание фрагмента (его домена связывания с клетками), используемого в настоящем изобретении, с клетками известным способом. Например, указанный выше способ включает способ согласно Williams D.A., et al. [Nature, 352, 438-441 (1991)]. Способ представляет собой способ определения связывания клетки с фрагментом, иммобилизованным на планшете для культивирования.-4 012520 Кроме того, связывающую активность по отношению к гепарину можно оценить, анализируя связывание фрагмента (его гепаринсвязывающего домена), используемого в настоящем изобретении, с гепарином известным способом. Например, связывание фрагмента с гепарином можно оценить таким же образом, используя гепарин, например меченый гепарин, вместо клетки в описанном выше способе Williams D.A., et al. Кроме того, примером фрагмента фибронектина является полипептид, выбранный из С-274 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 9 в списке последовательностей), Н-271 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 10 в списке последовательностей), Н-296(аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 11 в списке последовательностей), СН 271 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 12 в списке последовательностей),СН-296 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 13 в списке последовательностей), C-CS1 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 14 в списке последовательностей) или CH-296Na (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 25 в списке последовательностей). В данном случае CH-296Na является полипептидом, полученным впервые в настоящем изобретении. Каждый из указанных выше фрагментов СН-271, СН-296, СН-296Na, С-274 и C-CS1 представляет собой полипептид, имеющий домен связывания с клетками со связывающей активностью по отношению к VLA-5. Также C-CS1, Н-296, СН-296 и CH-296Na являются полипептидами, имеющими CS-1 со связывающей активностью по отношению к VLA-4. Кроме того, Н-271, Н-296, СН-271, СН-296 и CH-296Na являются полипептидами, имеющими гепаринсвязывающий домен. В данном случае CH-296Na является полипептидом, содержащим область от домена связывания с клетками до CS-1 фибронектина, полученного из плазмы. В частности, CH-296Na является полипептидом, в котором область (ED-A) в пределах отPro в положении 1270 до Thr в положении 2016 аминокислотной последовательности фибронектина,описанной в Genbank с номером доступаNM002026 (NP002017). В настоящем изобретении также можно использовать фрагмент, в котором каждый из указанных выше доменов модифицирован. Гепаринсвязывающий домен фибронектина состоит из трех последовательностей типа III (III-12, III-13 и III-14). Фрагмент, содержащий гепаринсвязывающий домен, имеющий делецию одной или двух из указанных выше последовательностей типа III, также может быть использован в настоящем изобретении. Например, примерами фрагментов могут быть CHV-89 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 15 в списке последовательностей), CHV-90 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 16 в списке последовательностей) или CHV92 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 17 в списке последовательностей),которые представляют собой фрагменты, в которых связаны участок фибронектина связывания с клетками (VLA-5-связывающий домен: Pro1239-Ser1515) и одна из последовательностей типа III, или CHV-179CHV-181 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 19 в списке последовательностей), которые являются фрагментами, в которых связаны участок связывания фибронектина с клетками и две последовательности типа III. CHV-89, CHV-90 и CHV-92 содержат III-13, III-14 и III-12 соответственно и CHV-179 содержит III-13 и III-14, и CHV-181 содержит III-12 и III-13 соответственно. Кроме того, в настоящем изобретении может быть использован фрагмент, имеющий присоединение дополнительной аминокислоты к каждому из указанных выше фрагментов. Например, фрагмент может быть получен присоединением требуемой аминокислоты к каждому из указанных выше фрагментов согласно способу получения H-275-Cys, описанному в примерах получения, приведенных ниже. Например,Н-275-Cys (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 20 в списке последовательностей) представляет собой фрагмент, имеющий гепаринсвязывающий домен фибронектина и остаток цистеина на С-конце. Фрагментом, используемым в настоящем изобретении, могут быть фрагменты, включающий в себя полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего фрагмент, по меньшей мере, частично содержащего аминокислотную последовательность встречающегося в природе фибронектина, приведенного в качестве примера выше, при этом полипептид имеет функцию, эквивалентную функции фрагмента, при условии, что получают требуемые эффекты согласно настоящему изобретению. Предпочтительно замену аминокислот или подобное изменение осуществляют в такой степени, что могут быть изменены физико-химические свойства и прочее исходного полипептида в таких пределах, в которых функция полипептида может сохраняться. Например, предпочтительно, чтобы замена аминокислот или подобное изменение было консервативным в таких пределах, чтобы свойства, присущие полипептиду (например, гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд pK и пр.) существенно не изменялись. Например, предпочтительно, чтобы замена аминокислот представляла собой замены внутри каждой из групп: 1) глицин, аланин; 2) валин, изолейцин, лейцин; 3) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; 4) серин, треонин; 5) лизин, аргинин; 6) фенилаланин, тирозин, и что-5 012520 бы делеция, присоединение или инсерция аминокислот представляла собой делецию, присоединение или инсерцию аминокислот, имеющих свойства, сходные со свойствами окружения данного сайта в полипептиде в таких пределах, чтобы свойства окружения данного сайта существенно не изменялись. Замена аминокислот или подобное изменение может представлять собой замены, встречающиеся в природе, которые вызваны различиями между видами или индивидуумами, или может быть индуцирована искусственно. Искусственную индукцию можно осуществлять известным способом. Например, индукция может быть осуществлена, не ограничиваясь указанным, посредством получения заданной нуклеиновой кислоты, имеющей замену, делецию, присоединение или инсерцию одного или большого количества нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, кодирующей указанную выше область или данный фрагмент, получаемый из встречающегося в природе фибронектина, и посредством использования нуклеиновой кислоты для получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую замену или подобное изменение в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего указанную выше область или данный фрагмент, получаемый из встречающегося в природе фибронектина, имеющего функцию, эквивалентную функции фрагмента или т.п., с использованием известного способа. Кроме того, фраза имеющий функцию, эквивалентную в данном описании относится к тому, что полипептид, который является сравнительным контролем, обладает, по меньшей мере, любой из следующих функций: (i) функцией усиления или сохранения цитотоксической активности цитотоксического лимфоцита, (ii) функцией повышения уровня экспрессии IL-2R, (iii) функцией повышения относительного содержания CD8-позитивных клеток или (iv) функцией повышения кратности экспансии цитотоксического лимфоцита, каждой из которых обладает встречающийся в природе фрагмент фибронектина. Указанные выше функции могут быть соответствующим образом подтверждены согласно способу, описанному в примерах, приведенных далее. Кроме того, в качестве фрагмента, содержащего полипептид,имеющий замену аминокислот или подобное изменение, предпочтителен фрагмент, обладающий активностью в адгезии клеток и/или гепаринсвязывающей активностью. Активность в клеточной адгезии и гепаринсвязывающую активность можно оценить согласно указанным выше способам определения указанных активностей. В качестве фрагмента, содержащего полипептид, имеющий замену аминокислот и подобное изменение, в настоящем изобретении также может быть использован фрагмент, имеющий одну или несколько аминокислот, встроенных в виде линкера между двумя разными доменами. В этой связи в качестве фибронектина, подобно описанному выше фрагменту, в настоящем изобретении можно использовать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в аминокислотной последовательности, составляющей полипептид фибронектина, при этом полипептид обладает, по меньшей мере, любой из функций, указанных выше в (i)-(iv). Фрагмент фибронектина, который упоминается в данном описании, также может быть получен из генетического рекомбинанта, например, на основе описания патента США 5198423. Например, каждый из фрагментов Н-271 (SEQ ID NO: 10), Н-296 (SEQ ID NO: 11), СН-271 (SEQ ID NO: 12) и СН-296(SEQ ID NO: 13) и способ получения указанных фрагментов подробно описаны в спецификации данного патента. Кроме того, CH-296Na (SEQ ID NO: 25) и способ его получения описаны в разделе (3) CH-296Na и в примерах, приведенных ниже. Кроме того, указанный выше фрагмент С-274 (SEQ ID NO: 9) может быть получен согласно способу, описанному в патенте США 5102988. Кроме того, фрагмент C-CS1(SEQ ID NO: 14) может быть получен согласно способу, описанному в публикации патента Японии 3104178. Каждый из фрагментов CHV-89 (SEQ ID NO: 15), CHV-90 (SEQ ID NO: 16) или CHV-179(SEQ ID NO: 18) могут быть получены согласно способу, описанному в публикации патента Японии 2729712. Кроме того, фрагмент CHV-181 (SEQ ID NO: 19) может быть получен согласно способу, описанному в WO 97/18318. Фрагмент CHV-92 (SEQ ID NO: 17) может быть получен способом генетической инженерии с использованием плазмиды, сконструированной обычным образом на основе плазмиды,описанной в литературе, при обращении в публикации патента Японии 2729712 и WO 97/18318. Указанные фрагменты или фрагменты, которые могут быть получены из указанных фрагментов обычным способом, могут быть получены с использованием микроорганизмов, депонированных в международной депозитарии патентуемых организмов, National Institute of Advanced Industrial Science иTechnology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan (Zip code 305-8566) со следующими номерами доступа, или посредством модифицирования плазмиды, которую несет каждый микроорганизм, согласно известному способу.FERM P-12183 (Escherichia coli, несущая плазмиду, кодирующую CHV-179. Дата депозита: 8 апреля 1991 г.). Так как фибронектин является гигантским гликопротеидом, нелегко получать и применять встречающийся в природе белок в промышленных целях и в целях получения лекарственного средства. Кроме того, так как фибронектин является многофункциональным белком, нужно учитывать некоторые недостатки, вызванные областью, отличающейся от области, проявляющей эффект, способом согласно настоящему изобретению, в зависимости от условий его применения. По этим причинам предпочтительно в настоящем изобретении может быть использован фрагмент фибронектина, более предпочтительно, если будет использован рекомбинантный фрагмент фибронектина, полученный как описано выше, с точки зрения доступности, простоты обработки и безопасности. Кроме того, особенно предпочтительным будет использование фрагмента фибронектина, который может оказывать такое действие, как увеличение кратности экспансии лимфоцитов, увеличение уровня экспрессии IL-2R в размножаемых лимфоцитах, увеличение относительного содержания CD8-позитивных клеток в размножаемой популяции лимфоцитов или увеличение цитотоксической активности, как описано ниже. Кроме того, молекулярная масса фрагмента фибронектина, используемого в настоящем изобретении, составляет, не ограничиваясь указанным, предпочтительно от 1 до 200 кД, более предпочтительно от 5 до 190 кД, еще более предпочтительно от 10 до 180 кД. Молекулярная масса может быть определена, например, путем электрофореза в SDSполиакриламидном геле. В данном случае в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего фрагмент фибронектина согласно настоящему изобретению, неполная аминокислотная последовательность, отличная от аминокислотной последовательности полипептида, составляющего встречающийся в природе фрагмент фибронектина, является произвольной и конкретно не ограничена, при условии, что не ингибируется проявление требуемых эффектов согласно настоящему изобретению.(2) Способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Ниже будет приведено конкретное объяснение способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ получения цитотоксических лимфоцитов, включающий в себя стадию осуществления по меньшей мере одного из следующего: индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов, с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5%, в присутствии указанного выше фибронектина, его фрагмента или их смеси. Цитотоксические лимфоциты в используемом в данном описании смысле означают группу клеток, содержащих цитотоксические лимфоциты. В узком смысле в некоторых случаях цитотоксические лимфоциты могут относиться только к цитотоксическим лимфоцитам, находящимся в указанной выше группе клеток. Кроме того, получение цитотоксических лимфоцитов в настоящем изобретении охватывает любое из индукции от клеток-предшественников, которые могут быть преобразованы в цитотоксические лимфоциты согласно настоящему изобретению, до лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью, поддержания цитотоксических лимфоцитов и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественников. В способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению вид клеток, подвергаемых обработке способом, условиям культивирования и т.п., соответствующим образом подбирают, чтобы осуществить индукцию, поддержание или экспансию цитотоксических лимфоцитов. Цитотоксические лимфоциты согласно настоящему изобретению включают, но конкретно не ограничены указанным, например, активируемые лимфокином клетки-киллеры (LAK-клетки), цитотоксические Т-клетки (CTL), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), NK-клетки и т.п., каждая из которых обладает цитотоксической активностью. В настоящем изобретении клетки-предшественники могут быть преобразованы в цитотоксические лимфоциты, т.е. примером клеток-предшественников, которые обладают способностью к дифференцировке в лимфоциты, являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), NK-клетки, нативные клетки, клетки памяти, гематопоэтические стволовые клетки, мононуклеарные клетки пуповинной крови и т.п. Кроме того, при условии, что клетки являются гемоцитами, клетки могут быть использованы в настоящем изобретении в качестве клеток-предшественников. Любые из указанных клеток, которые собраны из живого организма, могут быть использованы непосредственно, или могут быть использованы клетки, которые хранят замороженными. В этой связи в способе получения цитотоксических-7 012520 лимфоцитов согласно настоящему изобретению можно использовать материал, содержащий указанные выше клетки, например кровь, такую как периферическая кровь или пуповинная кровь; материал, полученный удалением компонентов, таких как эритроциты и плазма из крови; костно-мозговую жидкость и т.п. Один из основных характерных признаков способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению состоит в том, что цитотоксические лимфоциты получают в присутствии эффективного ингредиента, выбранного из фибронектина, его фрагмента или их смеси. В данном случае способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению осуществляют на протяжении полного периода культивирования цитотоксических лимфоцитов или на протяжении любой части такого периода. Другими словами настоящее изобретение охватывает такие варианты, которые включают в себя указанную выше стадию в виде части стадий получения цитотоксических лимфоцитов. Кроме того, хотя традиционный способ экспансии цитотоксических лимфоцитов требовал добавления в среду сыворотки и плазмы в концентрации от 5 до 20 об.%, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению отличается тем, что суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде может предпочтительно составлять не более 4 об.% и особенно предпочтительно не более 3 об.%. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получение достаточного количества цитотоксических лимфоцитов можно осуществить совсем без добавления сыворотки или плазмы к среде, и является очень полезным способом с точки зрения безопасности или ослабления нагрузки на пациента. Кроме того, в настоящем изобретении в том случае, когда требуется дополнительно уменьшить количество используемой сыворотки и плазмы, количество используемой сыворотки и плазмы можно постепенно уменьшить в середине культивирования. Другими словами количество используемой сыворотки и плазмы может быть уменьшено больше, чем обычно посредством снижения концентрации сыворотки и плазмы в свежей среде, используемой при разведении раствора с культурой клеток, при замене среды или замене оборудования для культивирования клеток, описанных ниже, по отношению к концентрации сыворотки и плазмы в начале культивирования, или не добавляя сыворотку или плазму в свежую среду. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксических лимфоцитов, включающему в себя по меньшей мере одну стадию разбавления раствора для культивирования клеток, стадию замены среды или стадию замены оборудования для культивирования клеток, при этом суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде сразу после по меньшей мере одной стадии разбавления раствора для культивирования клеток, стадии замены среды или стадии замены оборудования для культивирования клеток является такой же, как концентрация в начале культивирования или пониженной по сравнению с концентрацией в начале культивирования. В данном случае источником сыворотки или плазмы может быть любая аутологичная (это означает,что источник используемых цитотоксических лимфоцитов является тем же самым, что и источник клеток-предшественников) сыворотка или плазма или неаутологичная (это означает, что источник используемых цитотоксических лимфоцитов отличается от источника клеток-предшественников) сыворотка или плазма. Предпочтительно можно использовать аутологичную сыворотку или плазму с точки зрения безопасности. В способе согласно изобретению получение цитотоксических лимфоцитов, т.е. индукцию, поддержание и/или экспансию цитотоксических лимфоцитов обычно осуществляют в среде, содержащей определенные компоненты, в присутствии указанного выше эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению. Например, в способе согласно изобретению в том случае, когда планируется индукция или экспансия цитотоксических лимфоцитов, количество клеток (цитотоксических лимфоцитов и/или клеток предшественников) в начале культивирования в настоящем изобретении конкретно не ограничено. Например,примером количества клеток является от 1 до 1108 клеток/мл, предпочтительно от 1 до 5107 клеток/мл и более предпочтительно от 1 до 2107 клеток/мл. Кроме того, условия культивирования конкретно не ограничены и могут быть использованы обычные условия культивирования клеток. Например, клетки можно культивировать в условиях 37 С в присутствии 5% СО 2 и т.п. Кроме того, среду можно разбавлять добавлением свежей среды, среду можно менять или можно менять оборудование для культивирования клеток через соответствующие промежутки времени. Среда, используемая в способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению,конкретно не ограничена, за исключением суммарной концентрации сыворотки и плазмы, и можно использовать известную среду, получаемую смешиванием компонентов, необходимых для поддержания и роста цитотоксических лимфоцитов или их клеток-предшественников. Например, коммерчески доступная среда может быть соответствующим образом выбрана для применения. Указанные среды могут содержать подходящие белки, цитокины и другие компоненты, кроме составляющих их собственных компонентов. Предпочтительно в настоящем изобретении используют среду, содержащую IL-2. Концентрация IL-2 в среде, например, составляет предпочтительно от 0,01 до 1105 ед./мл, более предпочтительно-8 012520 от 0,1 до 1104 ед./мл, но конкретно не ограничена указанными значениями. В качестве оборудования для культивирования клеток, используемого в способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению, например, можно использовать, без ограничения, чашку Петри, флакон, мешок, большую кювету для культивирования, биореактор и т.п. В данном случае в качестве мешка можно использовать проницаемый для газа СО 2 мешок для культивирования клеток, как описано в примерах 34-38 и 45-52, приведенных ниже. Кроме того, при промышленном получении большого количества цитотоксических лимфоцитов можно использовать большие кюветы для культивирования. Кроме того, для культивирования можно использовать любую из открытых и закрытых систем. Предпочтительно культивирование осуществляют в закрытой системе с точки зрения безопасности получаемых в результате лимфоцитов. Кроме того, клетки-предшественники, которые могут быть преобразованы в цитотоксические лимфоциты, можно культивировать совместно в среде, дополнительно содержащей анти-CD3-антитело. Концентрация анти-CD3-антитела в среде составляет, например, предпочтительно от 0,001 до 100 мкг/мл, особенно предпочтительно от 0,01 до 100 мкг/мл, но конкретно не ограничена указанными значениями. Анти-CD3-антитело может быть добавлено с целью активации рецептора на лимфоците. Также кроме указанного выше, может быть добавлен стимулирующий лимфоциты фактор, такой как лектин. Концентрация компонента в среде конкретно не ограничена при условии, что могут быть получены требуемые эффекты. Кроме одновременного присутствия указанных компонентов, включая эффективный ингредиент согласно настоящему изобретению, в результате растворения компонентов в среде, можно использовать иммобилизацию на соответствующей твердой фазе, например, оборудовании для культивирования клеток (включая любое оборудование в виде открытой системы и закрытой системы), таком как чашка Петри, флакон или мешок, или на носителе для культур клеток, таком как шарики, мембрана или предметное стекло. В данном случае иммобилизацию на шариках можно осуществлять в соответствии с описанием примеров 61 и 62, приведенных ниже, и полученные шарики можно использовать в соответствии с описанием примеров 63 и 64, приведенных ниже. Материалы для таких твердых фаз конкретно не ограничены при условии, что материалы могут быть использованы для культивирования клеток. В том случае,когда компоненты иммобилизуют, например, на указанном выше оборудовании, предпочтительно иммобилизовать определенное количество каждого компонента относительно заданного количества среды,помещаемой в оборудование, так чтобы среда имела соотношение, сходное с требуемой концентрацией в том случае, когда компоненты используют посредством растворения компонентов в среде при помещении среды в оборудование. Количество иммобилизованных компонентов конкретно не ограничено при условии, что могут быть получены требуемые эффекты. Указанный выше носитель используют посредством погружения носителя в культуральную среду в оборудовании для культивирования клеток во время культивирования клеток. Когда указанные выше компоненты иммобилизуют на указанном выше носителе, то при помещении носителя в среду предпочтительно иммобилизовать заданное количество каждого компонента на определенное количество среды, помещаемой в оборудование, так чтобы среда имела соотношение, сходное с требуемой концентрацией в том случае, когда компоненты используют посредством растворения компонентов в среде. Количество иммобилизованных компонентов конкретно не ограничено при условии, что могут быть получены требуемые эффекты. Например, иммобилизация фрагмента фибронектина может быть осуществлена в соответствии со способами, описанными в WO 97/18318 и WO 00/09168. После того как различные указанные выше компоненты или эффективный ингредиент согласно настоящему изобретению иммобилизуют на твердой фазе, цитотоксические лимфоциты можно легко отделить от эффективного ингредиента или т.п. после того, как лимфоциты получают способом согласно настоящему изобретению, только посредством отделения лимфоцитов от твердой фазы, так что можно предотвратить загрязнение лимфоцитов эффективным ингредиентом. Кроме того, вместе с указанными выше компонентами можно использовать соединение, выбранное из группы, состоящей из кислых полисахаридов, кислых олигосахаридов, кислых моносахаридов и их солей, которые являются эффективными для индукции цитотоксических Т-клеток, обладающих антигенспецифичной цитотоксической активностью, описанных в WO 02/14481, или вещество, выбранное из следующих веществ (А)-(D):(A) вещества, обладающего связывающей активностью в отношении CD44;(B) вещества, способного регулировать сигнал, испускаемый при связывании лиганда CD44 с CD44;(C) вещества, способного ингибировать связывание фактора роста с рецептором фактора роста; и(D) вещества, способного регулировать сигнал, испускаемый при связывании фактора роста с рецептором фактора роста. Примером указанного выше вещества, обладающего связывающей активностью в отношении CD44,является, например, лиганд CD44 и/или анти-CD44-антитело. Вещества, способные регулировать сигнал,испускаемый при связывании лиганда CD44 с CD44, включают в себя, например, различные ингибиторы или активаторы фосфоферментов и дефосфорилаз. Вещества, способные ингибировать связывание фактора роста с рецептором фактора роста, включают в себя, например, вещество, обладающее связываю-9 012520 щей активностью в отношении фактора роста и образующее комплекс с фактором роста, тем самым ингибирующее связывание фактора роста с рецептором фактора роста, или вещество, обладающее связывающей активностью в отношении рецептора фактора роста, таким образом ингибирующее связывание фактора роста с рецептором фактора роста. Кроме того, вещества, способные регулировать сигнал, испускаемый при связывании фактора роста с рецептором фактора роста, включают в себя, например, различные ингибиторы или активаторы фосфоферментов и дефосфорилаз. Концентрация указанных компонентов в среде конкретно не ограничена, при условии, что могут быть получены требуемые эффекты. Также указанные компоненты можно использовать посредством иммобилизации на соответствующей твердой фазе, как указано выше, кроме одновременного присутствия указанных компонентов в среде при растворении компонентов в среде. В данном изобретении каждое из указанных выше различных веществ может быть использовано отдельно или в смеси с двумя или несколькими видами. В настоящем изобретении фраза в присутствии указанного выше эффективного ингредиента относится к тому факту, что указанный выше эффективный ингредиент присутствует в таком состоянии, в котором эффективный ингредиент может проявлять свою функцию при осуществлении индукции, поддержания или экспансии цитотоксических лимфоцитов, и способ, обеспечивающий присутствие, конкретно не ограничен. Например, в том случае, когда эффективный ингредиент растворяют в используемой среде, содержание эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению в среде, в которой осуществляют культивирование, конкретно не ограничено, при условии, что получают требуемые эффекты. Содержание эффективного ингредиента, например, составляет предпочтительно от 0,0001 до 10000 мкг/мл, более предпочтительно от 0,001 до 10000 мкг/мл, еще более предпочтительно от 0,005 до 5000 мкг/мл, особенно предпочтительно от 0,01 до 1000 мкг/мл. Когда определяют уровень экспрессии IL-2R для цитотоксических лимфоцитов, полученных способом согласно изобретению, выявляют значимое увеличение уровня экспрессии IL-2R по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными посредством осуществления, по меньшей мере, любого одного из следующих процессов: индукции, поддержания и экспансии, в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. В данном случае уровень экспрессии IL-2R можно определить известным способом, например, с использованием анти-IL-2R-антитела. Как описано выше, цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению,имеют повышенный уровень экспрессии IL-2R. IL-2R является маркером активации, который экспрессируется на поверхности активированной Т-клетки, и с экспрессией данной молекулы активируется продукция цитокина, цитотоксическая активность, активации пролиферации или пр. Таким образом, цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, представляют собой группу клеток, обладающих высокой функциональной активностью. Кроме того, так как цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению,имеют повышенный уровень экспрессии IL-2R, то цитотоксические лимфоциты обладают повышенной чувствительностью к стимуляции интерлейкином IL-2, добавляемым в среду, или IL-2, продуцируемым клетками-предшественниками цитотоксических лимфоцитов, самими лимфоцитами или другими совместно существующими клетками. По этой причине цитотоксические лимфоциты могут активировать сами себя даже в окружающей среде с меньшим количеством IL-2 (например, в живом организме или т.п.). Кроме того, в цитотоксических лимфоцитах, полученных способом согласно изобретению, относительное содержание (CD8-позитивных) клеток, имеющих маркер CD8, выше по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными при осуществлении по меньшей мере одного из следующих процессов: индукции, поддержания и экспансии, в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Указанный факт имеет некоторые преимущества, например, 1) что CD8-позитивная клетка продуцирует цитокин, такой как интерферон-, таким образом вызывая иммунологическую активацию, изменяя баланс Т-хелперных клеток в сторону доминирующей системы Th1, 2) что CD8-позитивная клетка является клеткой-иммуноцитом, который может эффективно исключать чужеродное вещество, такое как вирус или опухолевая клетка, 3) что в случае получения CD8-позитивных клеток, можно осуществить обогащение CD8-позитивными клетками с помощью культивирования клеток согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, при этом CD8-позитивные клетки обычным образом очищают с использованием магнитных шариков или проточного цитометра, 4) что цитотоксические лимфоциты соответствующим образом используют в качестве клеток-предшественников во время индукции CTL, поскольку относительное содержание CD8-позитивных клеток является высоким, 5) что можно культивировать даже популяцию клеток, имеющую низкое относительное содержание CD8-позитивных клеток, с увеличением относительного содержания CD8-позитивных клетки и пр. Таким образом, способ согласно изобретению особенно применим для получения цитотоксических лимфоцитов. В данном изобретении относительное содержание CD8-позитивных клеток в цитотоксических лимфоцитах, полученных способом согласно изобретению, можно определить, например, с использованием анти-CD8-антитела, но не ограничиваясь указанным. Кроме того, цитотоксический лимфоцит, полученный согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, имеет прекрасное свойство, заключающееся в том, что высокая цитотоксическая ак- 10012520 тивность, которая наблюдалась ранее, сохраняется даже в том случае, когда клетку после культивирования поддерживают в течение длительного периода или когда клетка пролиферирует. Другими словами,цитотоксический лимфоцит сохраняет высокую цитотоксическую активность по сравнению с цитотоксическим лимфоцитом, полученным при осуществлении по меньшей мере одного из процессов: индукции,поддержания и экспансии, в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Таким образом,можно поддерживать лимфоциты в виде лимфоцитов, обладающих стабильной цитотоксической активностью, посредством клонирования культивируемых цитотоксических лимфоцитов. Кроме того, индуцированные цитотоксические лимфоциты можно подвергнуть пролиферации и экспансии посредством стимуляции цитотоксических лимфоцитов антигеном, различными видами цитокинов или анти-CD3 антителом. Можно использовать известный способ для поддержания или экспансии цитотоксических лимфоцитов без конкретного ограничения. Поддержание указанных выше цитотоксических лимфоцитов относится к поддержанию цитотоксических лимфоцитов с сохранением их цитотоксической активности. Условия культивирования во время поддержания конкретно не ограничены, и можно использовать условия, применяемые для обычного культивирования клеток. Например, клетки можно культивировать в условиях 37 С в присутствии 5% СО 2 и т.п. Кроме того, среду можно заменять свежей средой через соответствующие интервалы времени. Используемая среда и другие компоненты, используемые одновременно с ней, и т.п., представляют собой такие же среды и компоненты, которые указаны выше. Один из основных отличительных признаков поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов в способе согласно изобретению заключается в том, что способ включает в себя, соответственно, непрерывное культивирование и экспансию цитотоксических лимфоцитов в среде, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии эффективного ингредиента согласно изобретению, т.е. фибронектина, его фрагмента или их смеси. Соответственно при экспансии может увеличиваться количество клеток цитотоксических лимфоцитов в состоянии, в котором цитотоксическая активность, присущая цитотоксическим лимфоцитам, сохраняется. Другими словами в качестве одного варианта осуществления способа согласно изобретению предлагается способ экспансии цитотоксических лимфоцитов. Цитотоксический лимфоцит, получаемый способом согласно изобретению, обладает способностью узнавать требуемую клетку-мишень и, например, разрушать клетку, которая должны быть мишенью,посредством своей цитотоксической активности. Цитотоксическую активность цитотоксических лимфоцитов можно оценить известным способом. Например, цитотоксическую активность цитотоксических лимфоцитов в отношении клеток-мишеней, меченных радиоактивным веществом, флуоресцентным веществом или пр., можно оценить посредством определения радиоактивности или интенсивности флуоресценции клеток-мишеней, разрушенных цитотоксическими лимфоцитами. Цитотоксическую активность также можно выявить посредством определения количества цитокина, такого как GM-CSF илиIFN-, специфически высвобождаемого из цитотоксических лимфоцитов или клеток-мишеней. Кроме того, цитотоксическую активность можно непосредственно подтвердить, используя комплекс антигенный пептид-МНС, меченный флуоресцентным красителем и т.п. В данном случае цитотоксическую активность цитотоксического лимфоцита можно, например, оценить в результате контактирования цитотоксического лимфоцита с первым флуоресцентным маркером, связанным с антителом, специфическим в отношении цитотоксического лимфоцита, с последующим контактированием с комплексом антигенный пептид-МНС, связанным со вторым флуоресцентным маркером, и осуществлением анализа FACS (активируемая флуоресценцией сортировка клеток) в отношении присутствия клеток с двойным мечением. Кроме того, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению отличается тем,что культивирование можно начинать при небольшом количестве клеток. Для осуществления адоптивной иммунотерапии требуется большое количество лимфоцитов, но большое количество лимфоцитов от пациента трудно получить. Кроме того, при обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов требовалось выбирать оборудование для культивирования клеток, имеющее подходящую площадь для культивирования, в зависимости от количества используемых клеток, и требовалось культивирование в соответствующем количестве среды. Другими словами, обычно культивирование начинают в условиях высокой плотности, чтобы количество (число) клеток к площади культивирования в оборудовании для культивирования клеток [т.е. площади (см 2) поверхности оборудования, контактирующей со средой] составляло 1106 клеток/см 2 или более, и чтобы концентрация клеток составляла 1106 клеток/мл или более. При осуществлении культивирования в условиях ниже указанного уровня клеток, кратность экспансии[отношение количества клеток после экспансии к количеству клеток до экспансии (количество клеток после экспансии/количество клеток до экспансии)] становится очень низкой, тем самым требуя длительного периода культивирования, чтобы получить цитотоксические лимфоциты в большом количестве. Поэтому, как правило, большое количество лимфоцитов в настоящее время получают, например, начиная культивирование с использованием небольшого по объему оборудования для культивирования клеток, и затем используя постепенно все большее оборудование для культивирования клеток, или используя способ на основе увеличения количества отдельных единиц оборудования для культивирования кле- 11012520 ток и повторения процедур разведения. Как описано выше, требуется множество систем культивирования при обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов. Согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, даже в том случае, когда начинают с небольшого количества клеток, клетки можно культивировать с высокой кратностью экспансии, независимо от размера оборудования для культивирования клеток. Поэтому усложненный процесс, который осуществляли обычно, такой как замена оборудования для культивирования клеток или раствора для культивирования клеток и процессы разбавления раствора для культивирования клеток, становятся ненужными. Другими словами согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, экспансию цитотоксических лимфоцитов можно осуществить в достаточно степени посредством способов культивирования с использования одного оборудования для культивирования клеток, т.е. одной системы для культивирования. Таким образом, согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, можно осуществить способ получения цитотоксических лимфоцитов, который не требует стадии разбавления раствора для культивирования клеток. В особенности в том случае, когда размножают клетки LAK согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, клетки LAK можно размножать посредством добавления клеток-предшественников, которые могут быть преобразованы в клетки LAK, и среды в оборудование для культивирования клеток большого объема, и добавления к ним только IL-2 на последующих стадиях. Настоящее изобретение особенно применимо в том аспекте, что можно получить большое количество клеток LAK простым способом. В данном случае предпочтительно можно использовать фрагмент фибронектина в качестве эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению, который необходимо использовать с точки зрения получения более высокой кратности экспансии. Как описано выше, согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, необходимое количество цитотоксических лимфоцитов можно получить в течение более короткого периода времени. Например, в том случае, когда по меньшей мере один из процессов: индукцию, поддержание и экспансию цитотоксических лимфоцитов начинают при небольшом количестве клеток в оборудовании для культивирования клеток, содержащем среду, в присутствии эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению, индукцию, поддержание или экспансию можно осуществлять с использованием количества клеток, удовлетворяющих требованиям, выбранным из следующих требований (а) и (b), при низкой концентрации или низкой плотности в начале культивирования:(a) отношение количества клеток к площади культуры в используемом оборудовании для культивирования клеток предпочтительно составляет от 1 до 5105 клеток/см 2, более предпочтительно от 10 до 1105 клеток/см 2, особенно предпочтительно от 1102 до 5104 клеток/см 2; и(b) концентрация клеток в среде предпочтительно составляет от 1 до 5105 клеток/мл, более предпочтительно от 10 до 1105 клеток/мл и особенно предпочтительно от 1102 до 5104 клеток/мл. Термин количество клеток в используемом в данном описании смысле относится к количеству цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественников. Кроме того, в случае способа согласно изобретению примером может быть способ, включающий в себя осуществление по меньшей мере одного из процессов: индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов в системе культивирования, который не требует стадии разбавления раствора для культивирования клеток. Кроме того, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению отличается тем, что культивирование также можно осуществлять при большом количестве клеток. Другими словами, в том случае, когда способ получения цитотоксических лимфоцитов в оборудовании для культивирования клеток, содержащем среду, включает в себя по меньшей мере одну стадию разбавления раствора для культивирования клеток свежей средой, стадию замены среды или стадию замены оборудования для культивирования клеток во время культивирования, даже когда сразу после указанных стадий устанавливаются условия культивирования в виде высокой концентрации (например, концентрация клеток в растворе для культивирования клеток составляет от 2105 до 1108 клеток/мл, предпочтительно от 2105 до 5107 клеток/мл, более предпочтительно от 2105 до 2107 клеток/мл) или высокой плотности(например, отношение количества клеток в растворе для культивирования клеток к площади культуры в оборудовании для культивирования клеток составляет от 1105 до 1108 клеток/см 2, предпочтительно от 1105 до 5107 клеток/см 2, более предпочтительно от 1105 до 2107 клеток/см 2), способ согласно настоящему изобретению может достигать хорошей кратности экспансии по сравнению с кратностью экспансии при обычном способе. При обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов количество клеток в начале культивирования устанавливают в виде сравнительно высокой концентрации или высокой плотности, и концентрацию клеток в растворе для культивирования клеток или плотность клеток в оборудовании для культивирования клеток устанавливают на низком уровне в соответствии с увеличением коэффициента пролиферации клеток. При установлении концентрации клеток или плотности клеток во время культивирования культура с большим количеством клеток согласно настоящему изобретению относится к получению цитотоксических лимфоцитов, при котором условия устанавливают в виде высокой концентрации или высокой плотности, при этом концентрация клеток в растворе для культивирования клеток составляет от 2105 до 1108 клеток/мл, или отношение количества клеток в растворе для культи- 12012520 вирования клеток к площади культуры в оборудовании для культивирования клеток составляет от 1105 до 1108 клеток/см 2. В используемом в данном описании смысле выражение сразу после стадии разбавления раствора для культивирования клеток свежей средой, стадии замены среды или стадии замены оборудования для культивирования клеток не включает в себя начало культивирования. Преимущества возможности осуществлять культивирование при большом количестве клеток, как описано выше, включают уменьшение количества среды, добавок в среду, таких как сыворотка и плазма,используемого оборудования для культивирования клеток, трудовых затрат и пространства для культивирования. Для адоптивной иммунотерапии необходимо большое количество лимфоцитов, при этом требуется очень большое количество среды или используемого оборудования для культивирования клеток. Соответственно, требуется большое пространство для культивирования и большие трудозатраты. Вышесказанное представляет собой большую проблему для распространения адоптивной иммунотерапии. Поэтому, так как способ согласно изобретению может решить проблему, которая описана выше, то он представляет собой очень творческое изобретение, относящееся к обеспечению или использованию возможностей. Как описано выше, способ согласно изобретению может быть применим для любой культуры клеток при низкой концентрации или низкой плотности, или для культуры клеток при высокой концентрации или высокой плотности. Таким образом, применение способа согласно изобретению дает возможность получения цитотоксических лимфоцитов при различных концентрациях клеток или плотностях клеток, в зависимости от условий культивирования. Кроме того, в способе согласно изобретению клетки можно культивировать совместно с подходящими питающими клетками. Когда цитотоксические лимфоциты культивируют совместно с питающими клетками, желательно, чтобы среда представляла собой среду, которая подходит для поддержания и роста как цитотоксических лимфоцитов, так и питающих клеток. В качестве среды можно использовать коммерчески доступную среду. Питающие клетки, используемые в способе согласно изобретению, конкретно не ограничены при условии, что питающие клетки стимулируют цитотоксические лимфоциты вместе с анти-CD3-антителом,активируя рецептор Т-клеток. В настоящем изобретении используют, например, РВМС или В-клетки,трансформированные вирусом Эпштейн-Барр (клетки EBV-B). Обычно питающие клетки используют после того, как удаляют их способность к пролиферации с помощью облучения и пр. В этой связи содержание питающих клеток в среде можно определить согласно известному способу. Например, содержание предпочтительно составляет от 1105 до 1107 клеток/мл. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве питающих клеток используют неинфицированные вирусом клетки, например клетки, отличные от клеток EBVB. При использовании неинфицированных вирусом клеток исключается возможность того, что клеткиEBV-B смешиваются с размножаемыми цитотоксическими лимфоцитами, что дает возможность повысить безопасность медицинского лечения с использованием цитотоксических лимфоцитов, такого как адоптивная иммунотерапия. Кроме того, в способе согласно изобретению клетки также можно культивировать совместно с подходящими антигенпрезентирующими клетками. Антигенпрезентирующие клетки могут быть получены добавлением антигенного пептида к клеткам, обладающим антигенпрезентирующей способностью, таким образом обеспечивая возможность для презентации клетками антигенного пептида на поверхности[см., например, Bendnarek M.A., et al., J. Immunol., 147(12), 4047-4053 (1991)]. Кроме того, в том случае,когда клетки, обладающие антигенпрезентирующей способностью, обладают способностью процессировать антиген, к клеткам добавляют антиген, при этом антиген внедряется в клетки и там процессируется,и фрагментированные антигенные пептиды презентируются на клеточной поверхности. В этой связи в том случае, когда антигенный пептид добавляют к клеткам, обладающим антигенпрезентирующей способностью, используют антигенный пептид, соответствующий ограничению по МНС, или антигенный пептид, который не ограничен МНС используемых антигенпрезентирующих клеток и индуцируемыми цитотоксическими лимфоцитами. Кстати, антиген, используемый в настоящем изобретении, конкретно не ограничен, и включает в себя, например, экзогенные антигены, такие как бактерии и вирусы, эндогенные антигены, такие как связанные с опухолями антигены (раковые антигены), и пр. В настоящем изобретении предпочтительно антигенпрезентирующие клетки делают неспособными к пролиферации. Чтобы получить непролиферирующие клетки, например, можно подвергать клетки облучению рентгеновскими лучами и пр. или обработке таким агентом, как митомицин. Когда получают клетки LAK способом получения согласно изобретению, культивирование клетокLAK осуществляют посредством инкубации клеток-предшественников, которые могут быть преобразованы в клетки LAK, вместе с IL-2 в присутствии указанного выше эффективного ингредиента. Клеткипредшественники, которые могут быть преобразованы в LAK-клетки, включают в себя, не ограничиваясь указанным, например, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), клетки NK, мононуклеарные клетки пуповинной крови, гематопоэтические стволовые клетки, компоненты крови, содержащие- 13012520 указанные клетки, и т.п. Кроме того, общие условия культивирования клеток LAK могут быть созданы в соответствии с известными условиями [например, см. Saibo Кодаки (Cell Technology), 14(2), 223-227, (1995); Saibo Baiyo(Cell Culture) 17(6), 192-195, (1991); THE LANCET, 356, 802-807, (2000); Current Protocols in Immunology,supplement. 17, UNIT 7.7], за исключением того, что используют указанную выше среду. Условия культивирования конкретно не ограничены, и можно применять условия, которые используют при обычном культивировании клеток. Например, культивирование можно осуществлять в условиях 37 С в присутствии 5% СО 2 и т.п. Указанное совместное культивирование обычно осуществляют в течение примерно от 2 до 15 дней. Кроме того, можно осуществлять стадию разбавления раствора для культивирования клеток, стадию замены среды или стадию замены оборудования для культивирования клеток через соответствующие промежутки времени. В отношении CTL и TIL таким же способом, как способы указанной выше индукции, поддержания или экспансии клеток LAK, может быть получена группа клеток, обладающих высокой цитотоксической активностью, посредством культивирования клеток в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси. В настоящем изобретении не существует конкретного ограничения способов активации указанных клеток, при условии, что одновременно присутствует фибронектин, его фрагмент или их смесь, и используют среду, содержащую сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%. Способы могут быть осуществлены с использованием среды, подходящей для культивирования или активации указанных выше клеток. Что касается используемого количества фибронектина, его фрагмента или их смеси, способа добавления компонента и т.п., то подходящие количества и способы могут быть выбраны в соответствии с указанным выше способом. В данном случае способ экспансии цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению конкретно не ограничен при условии, что указанный выше эффективный ингредиент присутствует в системе культивирования, используемой в способе, и суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Настоящее изобретение охватывает такие варианты, в которых указанный выше эффективный ингредиент присутствует с системе культивирования и в которых суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.% при обычном способе экспансии цитотоксических лимфоцитов, отличном от способов, описанных выше. Примерами заболеваний, при которых вводят цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно настоящему изобретению, являются без конкретного ограничения, например, рак, злокачественная опухоль, гепатит или инфекционные болезни,такие как грипп, вызванные вирусом, бактериями или грибами. Кроме того, в случае дополнительного внедрения чужеродного гена, как описано ниже, также могут ожидаться эффекты по отношению к различным генетическим заболеваниям. Цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно настоящему изобретению, также можно использовать для инфузии донорских лимфоцитов и т.п. с целью профилактики инфекционного заболевания после трансплантации костного мозга или рентгеновского облучения. В другом варианте осуществления изобретения предлагается среда для культивирования цитотоксических лимфоцитов, содержащая в качестве эффективного ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь, при этом суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Среда, кроме того, содержит другой необязательный ингредиент, например, компонент среды, белок и цитокин (предпочтительно IL-2), которые используют для известной культуры клеток, и другие требуемые компоненты. В данном изобретении среда может быть получена известным способом с использованием эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению и аутологичной или неаутологичной сыворотки или плазмы, так, чтобы суммарная концентрация в среде составляла не более 5 об.%. Содержание эффективного ингредиента согласно изобретению и т.п. в среде конкретно не ограничена, при условии, что могут быть получены требуемые эффекты согласно изобретению. Содержание при необходимости можно соответствующим образом определить, например, в соответствии с содержанием эффективного ингредиента и т.п. в указанной выше среде, используемой в способе согласно изобретению. Одним из вариантов среды согласно изобретению является среда, содержащая носитель для культуры клеток, на котором иммобилизован фибронектин, его фрагмент или их смесь, и среда, находящаяся в оборудовании для культивирования клеток, на котором иммобилизован фибронектин, его фрагмент или их смесь. Обычно к культуре, содержащей лимфоциты, полученной с использованием способа получения цитотоксических лимфоцитов, который описан выше, примешивают другие клетки, отличные от цитотоксических лимфоцитов, такие как хелперные Т-клетки. Однако так как лимфоциты, обладающие цитотоксической активностью, находятся в большом количестве в культуре, содержащей лимфоциты, полученной согласно изобретению, то культивируемые клетки могут быть собраны из культуры центрифугированием или подобным способом и непосредственно использованы в качестве цитотоксических лимфоцитов, полученных способом согласно изобретению. Кроме того, если указанный выше эффективный ингредиент или т.п. иммобилизуют на оборудовании для культивирования клеток или т.п., не существует риска смешивания компонента или т.п. с полученными в результате цитотоксическими лимфоцитами. Кроме того, популяция клеток (или культура), обогащенная цитотоксическими лимфоцитами, мо- 14012520 жет быть далее отделена от культуры известным способом и использована в качестве цитотоксических лимфоцитов, полученных способом согласно настоящему изобретению. Другими словами способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению может включать в себя стадию отбора популяции клеток, обогащенной цитотоксическими лимфоцитами, из культуры, полученной данным способом. Способ отбора популяции клеток, обогащенной цитотоксическими лимфоцитами, конкретно не ограничен. Примером способа является, например, способ, включающий в себя селективный сбор только требуемых клеток из культуры с использованием оборудования для культивирования клеток или носителя, с которым связано антитело против поверхностного антигена клетки, экспрессированного на поверхности требуемой клетки, например, анти-CD8-антитело, или способ с использованием проточного цитометра. Примером указанного выше носителя являются магнитные шарики или колонка. Кроме того, популяцию клеток, обогащенную требуемыми клетками, можно получить удалением посредством адсорбции других клеток, отличных от требуемых клеток, из культуры. Например, хелперные Т-клетки можно удалить из культуры лимфоцитов с использованием антитела против поверхностного антигена клетки,экспрессированного на поверхности хелперных Т-клеток, например, анти-CD4-антитела. На указанной стадии также можно использовать проточный цитометр. Кроме того, настоящее изобретение относится к цитотоксическому лимфоциту, полученному способом получения цитотоксического лимфоцита согласно настоящему изобретению, указанному выше. Лимфоцит обладает высокой цитотоксической активностью, которая отличается тем, что происходит незначительное снижение цитотоксической активности даже когда лимфоциты подвергают непрерывному культивированию или экспансии в течение длительного периода времени. Кроме того, настоящее изобретение относится к лекарственному средству (терапевтическому средству), содержащему лимфоцит в качестве эффективного ингредиента. Особенно полезно применение указанного выше терапевтического средства, содержащего лимфоцит, в адоптивной иммунотерапии. В адоптивной иммунотерапии лимфоциты, обладающие цитотоксической активностью, подходящие для лечения пациента, вводят пациенту, например, посредством внутривенного введения. Терапевтическое средство очень полезно для применения при указанных выше заболеваниях или при инфузии лимфоцитов доноров. Терапевтическое средство может быть получено, например, путем смешивания лимфоцитов, полученных способ согласно изобретению, в качестве эффективного ингредиента, например, с известным органическим или неорганическим носителем, подходящим для неперорального введения, эксципиентом, стабилизатором и пр. согласно способу, известному в области фармации. В этой связи различные условия для терапевтического средства, такие как содержание лимфоцитов согласно изобретению в терапевтическом средстве и доза терапевтического средства, могут быть соответствующим образом определены в соответствии с известной адоптивной иммунотерапией. Способ получения цитотоксического лимфоцита согласно изобретению, кроме того, может включать в себя стадию трансдукции чужеродного гена в лимфоцит. Другими словами, один вариант осуществления изобретения относится к способу получения цитотоксического лимфоцита, дополнительно включающему в себя трансдукцию чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит. В данном случае термин чужеродный относится к тому, что является чужеродным по отношению к лимфоциту, в который необходимо трансдуцировать ген. При осуществлении способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, особенно способа экспансии цитотоксических лимфоцитов, усиливают способность культивируемых лимфоцитов к пролиферации. Поэтому посредством комбинирования способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению со стадией трансдукции гена, предполагают увеличение эффективности трансдукции гена. Способы трансдукции чужеродного гена конкретно не ограничены, и подходящий способ может быть выбран из известных способов трансдукции гена. Стадия трансдукции гена может быть осуществлена в любой заданной точке во время получения цитотоксических лимфоцитов. Например, с точки зрения производительности предпочтительно осуществление стадии одновременно с любой стадией из указанных выше стадий индукции, поддержания и/или экспансии лимфоцитов или после стадии. В качестве указанного выше способа трансдукции гена в настоящем изобретении можно применять любой из способов с использованием вирусного вектора и способы без использования вектора. Подробное описание указанных способов уже опубликовано в многочисленной литературе. Указанный выше вирусный вектор конкретно не ограничен, и используют известный вирусный вектор, обычно применяемый в способе трансдукции гена, например, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, вектор на основе вируса обезьян, вектор на основе вируса вакцинии, вектор на основе вируса Сендай или т.п. Особенно предпочтительно в качестве вирусного вектора используют ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус или вирус обезьян. В качестве указанного выше вирусного вектора предпочтительны векторы, не обладающие способностью к репликации, для того чтобы вирусный вектор не мог самореплицироваться в инфицированной клетке. Ретровирусный вектор используют в целях генной терапии и т.п., поскольку можно стабильно вне- 15012520 дрить чужеродный ген, встроенный в вектор, в хромосомную ДНК в клетке, в которую трансдуцируют вектор. Так как вектор обладает высокой эффективностью инфицирования клеток во время митоза и пролиферации, то трансдукцию гена предпочтительно осуществляют на стадии получения цитотоксических лимфоцитов, например, на стадии экспансии. В качестве способа трансдукции гена без использования вирусного вектора можно, например, применять без конкретного ограничения способ с использованием носителя, такого как липосома или лиганд-полилизин, способом на основе фосфата кальция, способом электропорации, способом с применением ушки для частиц и пр. В данном случае трансдуцируют чужеродный ген, включенный в плазмидную ДНК или линейную ДНК. Чужеродный ген, трансдуцируемый в цитотоксические лимфоциты, в настоящем изобретении конкретно не ограничен, и можно выбрать произвольный ген, который требуется трансдуцировать в указанные выше клетки. В качестве описанного выше гена кроме гена, кодирующего белок (например, фермент, цитокин, рецептор или т.п.), можно использовать, например, ген, кодирующий антисмысловую нуклеиновую кислоту, siRNA (малую интерферирующую РНК) или рибозим. Кроме того, одновременно можно трансдуцировать подходящий маркерный ген, который обеспечивает возможность селекции клеток, в которые трансдуцируют ген. Указанный выше чужеродный ген, например, можно встроить в вектор, плазмиду или т.п., так чтобы экспрессировать чужеродный ген под контролем подходящего промотора, и использовать. Кроме того, чтобы добиться эффективной транскрипции гена, в векторе может существовать другой регуляторный элемент, который действует совместно с промотором или сайтом инициации транскрипции, например, последовательность энхансера или последовательность терминатора. Кроме того, с целью встраивания чужеродного гена в хромосому лимфоцита, в который трансдуцируют ген, посредством гомологичной рекомбинации чужеродный ген, например, может быть расположен между фланкирующими последовательностями, содержащими нуклеотидные последовательности, каждая из которых обладает гомологией с нуклеотидными последовательностями, расположенными по обеим сторонам требуемого для инсерции сайта-мишени гена в хромосоме. Трансдуцируемым чужеродным геном может быть ген, который встречается в природе, или искусственно созданный ген, или ген, в котором молекулы ДНК, имеющие разное происхождение, связаны известными способами, такими как лигирование. Кроме того, чужеродным геном может быть ген, имеющий последовательность, в которой введена мутация в последовательности, встречающейся в природе, в зависимости от цели. Согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, например, можно трансдуцировать ген, кодирующий фермент, связанный с резистентностью к лекарственному средству, используемому для лечения пациента со злокачественной опухолью или т.п. заболеванием, в цитотоксические лимфоцит,таким образом, придавая лимфоциту резистентность к лекарственному средству. Если применяют описанные выше цитотоксические лимфоциты, то можно комбинировать адоптивную иммунотерапию и лекарственную терапию и таким образом можно получить более высокие терапевтические эффекты. Примером гена резистентности к лекарственному средству является, например, ген множественной резистентности. С другой стороны, в отличие от указанного выше варианта в цитотоксический лимфоцит может быть трансдуцирован ген для того, чтобы придать чувствительность к конкретному лекарственному средству, таким образом, придавая чувствительность к лекарственному средству. В данном случае лимфоциты после трансплантации в живой организм могут быть удалены с помощью введения лекарственного средства. Примером гена для придания чувствительности к лекарственному средству является, например, ген тимидинкиназы.(3) CH-296Na. В настоящем изобретении также предлагается новый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (а), показанную в SEQ ID NO: 25 (CH-296Na) в списке последовательностей, или полипептид, имеющий аминокислотные последовательности (b), содержащие делецию, инсерцию, присоединение или замену одной или большого количества аминокислот в аминокислотной последовательности(а), при этом полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (b), обладает функцией, эквивалентной функции полипептида, имеющего аминокислотную последовательность (а), и нуклеиновая кислота, кодирующая новый полипептид. Примером нуклеиновой кислоты является нуклеиновая кислота, содержащая (1) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 26(нуклеиновая кислота, кодирующая CH-296Na); (2) ДНК, кодирующую полипептид, содержащую нуклеотидную последовательность, имеющую делецию, замену, инсерцию или присоединение одной или большого количества нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 26,при этом полипептид обладает функцией, эквивалентной функции полипептида, кодируемого ДНК (1); или (3) ДНК, которая гибридизуется с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 26, в жестких условиях, которая кодирует полипептид, обладающий функцией, эквивалентной функции полипептида, кодируемого ДНК (1). В некоторых случаях в настоящем описании новый полипептид называют полипептидом согласно настоящему изобретению, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, называют нуклеиновой- 16012520 кислотой согласно настоящему изобретению. В дальнейшем будет описан полипептид согласно изобретению, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, и способ получения полипептида. Полипептид согласно изобретению включает в себя полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен, делеций, инсерций или присоединений одной или большого количества аминокислот в указанной выше аминокислотной последовательности, при условии, что полипептид обладает любой из требуемых функций [функции согласно указанным выше пунктам (i)-(iv)] при получении цитотоксических лимфоцитов, как указано выше. Примером другого полипептида согласно настоящему изобретению, отличного от СН-296Na, является полипептид, имеющий одну или несколько из замен, делеций, инсерций или присоединений предпочтительно от 1 до 20 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 10 аминокислот и еще более предпочтительно от 1 до 5 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 25 в списке последовательностей. В данном случае замену аминокислоты или т.п. можно осуществить в такой степени, чтобы можно было изменить физико-химические свойства и т.п., присущие полипептиду, в таких пределах, при которых может быть сохранена функция полипептида. Подробности и способ получения полипептида описаны выше. Нуклеиновая кислота, показанная в виде последовательности SEQ ID NO: 26 в списке последовательностей, кодирующая полипептид согласно настоящему изобретению, может быть получена в виде фрагмента ДНК, кодирующего CH-296Na, посредством осуществления ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, кодирующей фибронектин человека, полученный из плазмы. Праймер, используемый в ПЦР, конкретно не ограничен. Например, в качестве праймера можно использовать праймер CH-296Na1 или праймер СН-296Na2, показанные в SEQ ID NO: 27 или 28 в списке последовательностей. Кроме того,нуклеиновую кислоту можно получить связыванием плазмиды указанного выше FERM ВР-2800 (Escherichia cogi, несущая плазмиду, кодирующую СН-296) и фрагмента ДНК, имеющего последовательность, которая присутствует между доменом, связывающим клетки, и гепаринсвязывающим доменом нативного фибронектина, полученного из плазмы (повторяющаяся последовательности типа III, 11 на фиг. 1), с использованием подходящего сайта рестрикции. Кроме того, к нуклеиновым кислотам согласно настоящему изобретению также относится нуклеиновая кислота, имеющая одну или несколько замен, делеций, инсерций или присоединений одного или большого количества нуклеотидов в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 26 в списке последовательностей. Например, примером нуклеиновой кислоты является нуклеиновая кислота, имеющая одну или несколько замен, делеций, инсерций или присоединений от 1 до 60 нуклеотидов, более предпочтительно от 1 до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 1 до 15 нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 26 в списке последовательностей. В данном случае замену нуклеотида или подобное можно осуществить в такой степени, чтобы можно было изменить физико-химические свойства и т.п. полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, в таких пределах, при которых может быть сохранена функция полипептида. Подробности и способ замены нуклеотида или т.п. соответствуют описанию указанной выше замены аминокислоты или т.п. Кроме того, к нуклеиновым кислотам согласно изобретению относится нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 26, в жестких условиях, и которая кодирует полипептид, обладающий функцией, эквивалентной функции полипептида согласно настоящему изобретению, т.е., по меньшей мере, любой из функций по пунктам (i)-(iv) при получении цитотоксических лимфоцитов, указанных выше. Жесткие условия конкретно не ограничены и могут быть установлены посредством соответствующего определения температуры и концентрации соли при гибридизации, предпочтительно дополнительно при промывке, в зависимости от ДНК, которая гибридизуется с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 26. Жесткие условия включают в себя, например, условия, описанные в литературе, такой как Sambrook et al., Molecular cloning, A laboratory manual 3rd edition, 2001, опубликованной Spring Harbor Laboratory Press. В частности, примером жестких условий является, например, инкубация при 50 С, предпочтительно при 65 С в растворе, содержащем 6SSC (1SSC представляет собой 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, pH 7,0), 0,5% SDS, 5 раствор Денхардта(0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 0,1% поливинилпирролидон, 0,1% фикол 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Когда известно значение Tm используемой ДНК, указанная выше температура может быть ниже, чем данное значение на 5-12 С. Кроме того, могут быть добавлены такие условия, как осуществление стадии удаления ДНК, гибридизующейся неспецифически, посредством промывки, при этом с точки зрения повышения точности промывку осуществляют в условиях, например, 2SSC, более жестко 0,1SSC и т.п. и/или в условиях более высокой температуры, такой как 25 С или выше, более жесткие условия при 37 С или выше, еще более жесткие условия 42 С или выше, еще более жесткие условия 50 С или выше, варьирующих в зависимости от значения Tm используемой ДНК.- 17012520 Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению в условиях более низкой жесткости. Варьирование жесткости гибридизации и регистрации сигнала осуществляют, главным образом манипулируя концентрацией формамида (более низкое процентное содержание формамида приводит к пониженной жесткости), концентрацией соли или температурой. Например, менее жесткие условия включают инкубацию в течение ночи при 37 С в растворе, содержащем 6SSPE (20SSPE=3 М NaCl; 0,2 М NaH2PO4; 0,02 МEDTA, pH 7,4), 0,5% SDS, 30% формамид, 100 мкг/мл блокирующей ДНК спермы лосося; с последующей промывкой 1SSPE и 0,1% SDS при 50 С. Кроме того, чтобы осуществить менее жесткие условия,промывку, проводимую после жесткой гибридизации, можно осуществлять при более высокой концентрации соли (например, 5SSC). Указанные выше условия могут быть модифицированы добавлением и/или заменой альтернативным блокирующим реагентом, используемым для подавления фона в эксперименте по гибридизации. Обычный блокирующий реагент включает в себя реагент Денхардта, BLOTTO, гепарин, денатурированную ДНК спермы лосося и коммерчески доступный препарат. Кроме того, в некоторых случаях для модификации необходимы другие элементы, отличные от указанных выше условий гибридизации, в зависимости от такой модификации. С другой стороны, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQID NO: 25 в списке последовательностей, можно получить способом генетической инженерии, используя полученную нуклеиновую кислоту. Другими словами, полипептид может быть получен встраиванием нуклеиновой кислоты в подходящий экспрессирующий вектор, включая, но конкретно не ограничивая указанным, вектор рЕТ, вектор pCold и т.п., чтобы экспрессировать полипептид известным способом,например, в Escherichia coli или т.п. Примеры Настоящее изобретение будет более конкретно описано с помощью примеров, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Пример получения 1. Получение фрагмента фибронектина.(1) Получение фрагмента фибронектина. Н-271, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали из Escherichia coliHB101/pHD101 (FERM BP-2264) согласно способу, описанному в патенте США 5198423. Кроме того, Н-296, СН-271 и СН-296, фрагменты, происходящие из фибронектина человека, каждый получали из культуры. Полученной культивированием Escherichia coli HB101/pHD102 (FERM BP7420), Escherichia coli HB101/pCH101 (FERM BP-2799) или Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP2800) согласно способу, описанному в указанном выше издании. С-274, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали из культуры, получаемой культивированием Escherichia coli JM109/pTF7221 (FERM BP-1915) согласно способу, описанному в патенте США 5102988.C-CS1, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали из культуры, получаемой культивированием Escherichia coli HB101/pCS25 (FERM BP-5723) согласно способу, описанному в публикации патента Японии 3104178.CHV-89 и CHV-179, фрагменты, происходящие из фибронектина человека, каждый получали из культуры, получаемой культивированием Escherichia coli HB101/pCHV89 (FERM P-12182) или Escherichia coli HB101/pCHV179 (FERM P-12183) согласно способу, описанному в публикации патента Японии 2729712. Кроме того, CHV-90, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали согласно способу, описанному в публикации патента Японии 2729712. Конкретно, конструировали плазмидуCHV-181, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали конструированием плазмиды (pCHV181), содержащей ДНК, кодирующую CHV-181, согласно способу, описанному вWO 97/18318, затем культивируя Escherichia coli HBl01/pCHV181, в которую была введена плазмида, и получая фрагмент из культуры таким же образом, как в случае указанного выше CHV-179.(2) Получение CHV-92. Что касается pCHV181, плазмиды для экспрессии указанного выше полипептида CHV-181, то конструировали плазмиду CHV92, имеющую делецию области, кодирующей область III-13 в области, кодирующей CHV-181. Способы делеции осуществляли в соответствии со способами делеции области, кодирующей III-14, из плазмиды pCHV179, которые описаны в публикации патента Японии 2729712. Культивировали Escherichia coli HB101, трансформированные указанной выше плазмидой pCHV92(Escherichia coli HB101/pCHV92), и способы очистки осуществляли согласно способу очистки полипептида CHV-89, описанному в публикации патента Японии 2729712, чтобы получить очищенный препарат CHV-92 из полученной в результате культуры.- 18012520 Конструировали плазмиду для экспрессии полипептида Н-275-Cys согласно следующим способам. Конкретно плазмиду рСН 102 получали из Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM ВР-2800). Осуществляли ПЦР с использованием праймера 12S, имеющего нуклеотидную последовательность, показанную вSEQ ID NO: 21 в списке последовательностей, и праймера 14 А, имеющего нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 22 в списке последовательностей, с указанной выше плазмидой в качестве матрицы, получая фрагмент ДНК фрагмент длиной примерно 0,8 т.п.о., кодирующий гепаринсвязывающий домен фибронектина. Полученный в результате фрагмент ДНК расщепляли NcoI и BamHI (оба производства TAKARA BIO INC.), и затем лигировали с pTV118N (производства TAKARA BIO INC.),которая была расщеплена NcoI и BamHI, чтобы сконструировать плазмиду pRH1. Плазмидный вектор pINIII-ompA1 [Ghrayeb J., et al., EMBO J., 3(10), 2437-2442 (1984)] расщеплялиBamHI и HincII (производства TAKARA BIO INC.), чтобы собрать фрагмент ДНК длиной примерно 0,9 т.п.о., содержащий область терминатора липопротеида. Полученный фрагмент смешивали и лигировали с указанной выше плазмидой pRH1, которая была расщеплена BamHI и Hindi, получая плазмидуpRH1-T, содержащую промотор lac, фрагмент ДНК, кодирующий гепаринсвязывающий домен, и терминатор липопротеида в указанном порядке. Реакцию ПЦР осуществляли, используя праймер Cys-A, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 23 в списке последовательностей, и праймер Cys-S, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 24 в списке последовательностей, с указанной плазмидой pRH1-T в качестве матрицы. Затем собранный амплифицированный фрагмент ДНК расщепляли ферментом NotI (производства TAKARA BIO INC.), и затем фрагмент ДНК фрагмент подвергали самолигированию. Полученную таким образом циклическую ДНК расщепляли SpeI и ScaI (производстваTAKARA BIO INC.), получая фрагмент ДНК длиной 2,3 т.п.о., и полученный в результате фрагмент смешивали и лигировали с фрагментом ДНК фрагмент длиной 2,5 т.п.о., полученным расщеплением плазмиды pRH1-T ферментами SpeI и ScaI (производства TAKARA BIO INC.), получая плазмиду pRHCys. Плазмида кодирует полипептид H-275-Cys, в котором четыре аминокислоты Met-Ala-Ala-Ser были добавлены с N-концевой стороны указанного выше Н-271 и дополнительный Cys был добавлен к Сконцу Н-271. Полипептид H-275-Cys получали следующим способом. Escherichia coli HB101, которую трансформировали указанной выше плазмидой pRH-Cys (Escherichia coli HB101/pRH-Cys), культивировали в течение ночи при 37 С в 120 мл среды LB. Бактериальные клетки, собранные из культуральной среды, суспендировали в 40 мл буфера для разрушения (50 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, 150 MM NaCl, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, pH 7,5), и суспензию подвергали ультразвуковой обработке, чтобы разрушить бактериальные клетки. Надосадок, полученный при центрифугировании, наносили на колонку Hi Trap-гепарин (производства Pharmacia), которая была уравновешена буфером для очистки (50 мМ трис-HCl, pH 7,5). Неадсорбированную на колонке фракцию промывали таким же буфером, затем осуществляли элюирование буфером для очистки, имеющим градиент концентрации 0-1 M NaCl. Элюат анализировали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и собирали фракции, соответствующие молекулярной массе H-275Cys, получая очищенный препарат Н-275-Cys. Пример 1. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK (активируемые лимфокином клетки-киллеры) с использованием среды с низким содержанием сыворотки.(1) Выделение и хранение РВМС. Собирали компонент крови от отдельного нормального донора, получаемый при согласии с предоставлением полной информации. Собранный компонент крови разбавляли в 2 раза в PBS(-), наслаивали на фикол-пак (производства Pharmacia) и центрифугировали при 500g в течение 20 мин. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) в промежуточном слое собирали пипеткой и промывали. Собранные РВМС суспендировали в растворе для хранения 90% FBS (производства Bio Whittaker)/10% ДМСО(производства SIGMA) и хранили в жидком азоте. Во время индукции LAK указанные находящиеся на хранении РВМС быстро размораживали на водяной бане при 37 С и промывали средой RPMI 1640 (производства Bio Whittaker), содержащей 10 мкг/мл ДНКазы (производства Calbiochem). Затем количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим. Клетки подвергали каждому из описанных экспериментов.(2) Иммобилизация антитела против CD3 человека и фрагмента FN. Антитело против CD3 человека и фрагмент FN иммобилизовали на оборудовании для культивирования, используемом в следующем эксперименте. Конкретно, 1 мл (в случае 24-луночного планшета) или 2 мл (в случае флакона объемом 12,5 см 2) PBS, содержащего антитело против CD3 человека (производства Janssen-Kyowa) (конечная концентрация 5 мкг/мл), добавляли в 24-луночный планшет для культивирования клеток или во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см 2 (производства Falcon). При добавлении каждый из фрагментов фибронектина (FNfr), перечисленных в примере получения 1,добавляли в группу с добавлением фрагмента FN так, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкг/мл (в случае 24-луночного планшета) или 25 мкг/мл (в случае флакона объемом 12,5 см 2). В качестве контроля также помещали группу без добавления FNfr. После инкубации указанного оборудования для культивирования при комнатной температуре в те- 19012520 чение 5 ч оборудование для культивирования хранили при 4 С вплоть до использования. Сразу после использования PBS, содержащий антитело и FNfr, удаляли отсасыванием из указанного оборудования для культивирования и затем каждую лунку два раза промывали PBS и затем один раз средой XVIVO20(производства Bio Whittaker), и оборудование для культивирования использовали в каждом из экспериментов.(3) Индукция и культивирование клеток LAK. РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в XVIVO20, содержащей 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемой 1% XVIVO20), так чтобы получить концентрацию 1106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет с иммобилизованным антителом против CD3 человека или планшет с иммобилизованным антителом против CD3 человека и FNfr, полученным согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, и к ней добавляли IL-2 (производства Shionogi and Co., Ltd.) так, чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Полученные планшеты подвергали культивированию при 37 С в 5% CO2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 1% XVIVO20, содержащую 1000 Ед./мл IL-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду,надлежащим образом разбавленную 1% XVTVO20, переносили в свежий флакон, на котором ничего не иммобилизовали, и добавляли IL-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Культивирование продолжали, культуральную среду соответствующим образом разбавляли 1% XVIVO20 каждые 2 или 3 дня таким же образом, как на четвертый день после начала культивирования, и добавляли IL-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 300-500 Ед./мл. На одиннадцатый или пятнадцатый день после начала культивирования подсчитывали количество живых клеток способом окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 1. Таблица 1 Как показано в табл. 1, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина, с использованием на ранней стадии индукции клеток LAK среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была высокой по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше,выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки. Пример 2. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием среды с низким содержанием сыворотки (экспансия при многократной стимуляции).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 0,5% или 1% XVIVO20 так, чтобы получить концентрацию 1106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против CD3 человека, или планшет, на котором иммобилизовали антитело против CD3 человека и FNfr, полученный согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, и добавляли IL-2 (производства Shionogi and Co., Ltd.) так, чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Полученные планшеты подвергали культивированию при 37 С в 5% СО 2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 0,5 или 1%XVIVO20, содержащую 1000 Ед./мл IL-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду, надлежащим образом разбавленную 0,5 или 1% XVIVO20, переносили в свежий флакон, на котором ничего не иммобилизовали, и добавляли IL-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На девятый день после начала культивирования культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0,5 или 1% XVIVO20, переносили во флакон, в котором иммобилизовали антитело против CD3 человека, или во флакон, в котором иммобилизовали антитело против CD3 человека и FNfr (так, чтобы концентрация антитела против CD3 человека, используемая при иммобилизации, составляла 0,5 мкг/мл), приготовленный таким же образом, как в пункте (2) примера 1,и добавляли IL-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На двенадцатый день после начала культивирования культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0,5 или 1%XVIVO20, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и добавляли IL-2 так,чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирова- 20012520 ния количество живых клеток считывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 2. Таблица 2 Как показано в табл. 2, в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-CD3-антитело на ранней стадии и промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-CD3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клетокLAK. Другими словами, очевидно, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и антиCD3-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK даже в том случае,когда использовали среду, содержащую низкую концентрацию сыворотки. Пример 3. Индукция экспрессии рецептора IL-2 (IL-2R) в системе культивирования клеток LAK с использованием среды с низким содержанием сыворотки.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(2) Определение относительной экспрессии IL-2R в клетках LAK. Клетки LAK, которые получали согласно пункту (1) примера 3, в количестве 2105 клеток фиксировали в PBS (производства Nissui), содержащем 1% параформальдегида (производства Nakalai Tesque,Inc.), и затем промывали PBS. Фиксированные клетки суспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 1% БСА (производства SIGMA), и добавляли ФИТЦ-меченый IgGl мыши или ФИТЦ-меченое мышиное антитело против IL-2R человека (CD25) (оба производства DAKO), и затем смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали PBS и снова суспендировали в PBS, содержащем 1% параформальдегида. Клетки подвергали проточной цитометрии, используя FACS Vantage (производства Beeton Dickinson), и определяли относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток. Результаты показаны в табл. 3. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток (%) показано в виде относительной экспрессии IL-2R (%). Таблица 3 Как показано в табл. 3, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей сыворотку в низкой концентрации, относительную экспрессию IL-2R на поверхности клеток LAK во время культивирования можно было индуцировать на высоком уровне. Другими словами, выяснили, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии IL-2R в том случае, когда клетки LAK индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно содержащей фрагмент фибронектина. Пример 4. Относительное содержание CD8-позитивных клеток в популяции клеток LAK при использовании среды с низким содержанием сыворотки.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же способом, как описано в пункте(2) Определение относительного содержания популяции CD8-позитивных клеток среди клетокLAK. Клетки LAK, которые получали согласно пункту (1) примера 4, в количестве 2105 клеток фиксировали в PBS, содержащем 1% параформальдегида, и затем промывали PBS. Фиксированные клетки суспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 1% БСА, добавляли ФИТЦ-меченый IgG1 мыши или ФИТЦмеченое мышиное антитело против CD8 человека (оба производства DAKO) и затем смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали PBS и снова суспендировали в PBS, содержащем 1% параформальдегида. Клетки подвергали проточной цитометрии, используя FACS Vantage,и определяли относительное содержание CD8-позитивных клеток. Результаты показаны в табл. 4. Таблица 4 Как показано в табл. 4, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание CD8-позитивных клеток среди клеток LAK во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания CD8-позитивных клеток среди клеток LAK в том случае, когда клетки LAK индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно содержащей фрагмент фибронектина. Пример 5. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием бессывороточной среды.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в XVIVO20, не содержащей сыворотки (в дальнейшем просто называемой 0% XVIVO20), так чтобы получить концентрацию- 22012520 1106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против CD3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против CD3 человека иFNfr, полученный согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку и добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37 С в 5% СО 2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 0% XVIVO20, содержащую 1000 Ед./мл IL-2 в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования, культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0% XVIVO20, переносили в свежий флакон, на котором ничего не иммобилизовали, и добавлялиIL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Культивирование продолжали и культуральную среду соответствующим образом разбавляли через каждые 2 или 3 дня средой 0% XVIVO20 таким же образом, как на четвертый день после начала культивирования, и добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию от 300 до 500 Ед./мл. На одиннадцатый день или пятнадцатый день после начала культивирования, количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 5. Таблица 5 Как показано в табл. 5, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Из указанного выше очевидно, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток LAK с использованием среды, не содержащей сыворотки. Пример 6. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK в бессывороточной среде (экспансия посредством многократной стимуляции).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 0% XVIVO20, так чтобы получить концентрацию 1106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против CD3 человека, или в планшет, на котором иммобилизовали антитело противCD3 человека и FNfr, полученный согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку и добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37 С в 5% СО 2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 0% XVIVO20, содержащую 1000 Ед./мл IL-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования, культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0% XVIVO20, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На девятый день после начала культивирования, культуральную среду соответствующим образом разбавленную 0% XVIVO20, переносили во флакон, в котором иммобилизовали антитело против CD3 человека, или во флакон, в котором иммобилизовали антитело против CD3 человека и FNfr (при условии, что концентрация антитела противCD3 человека, используемая при иммобилизации, составляла 0,5 мкг/мл), приготовленный таким же образом, как описано в пункте (2) примера 1, и добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На двенадцатый день после начала культивирования культуральную среду, снова соответствующим образом разбавленную 0% XVIVO20, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 6. Как показано в табл. 6, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в каждом из которых иммобилизовали фрагменты фибронектина и анти-СВ 3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-CD3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клетокLAK. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и антиCD3-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK, даже если использовали среду, не содержащую сыворотки. Пример 7. Индукция экспрессии IL-2R в системе культивирования клеток LAK с использованием бессывороточной среды.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(2) Определение относительной экспрессии IL-2R в клетках LAK. Относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток определяли таким же образом,как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 7. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток (%) показано в виде относительной экспрессии IL-2R (%). Таблица 7 Как показано в табл. 7, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительная экспрессия IL2R на поверхности клеток LAK во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с повышением, относительной экспрессии IL-2R в том случае, когда клетки LAK индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки и одновременно содержащей фрагмент фибронектина. Пример 8. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием бессывороточной среды (AIM V).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(1) примера 5, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду AIM V, не содержащую сыворотки (производства Invitrogen, в дальнейшем просто называемую 0% Как показано в табл. 8, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Кроме того, указанный эффект проявлялся даже когда заменяли основную среду для культивирования без сыворотки. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клетокLAK с использованием среды, не содержащей сыворотки. Пример 9. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK в бессывороточной среде (индукция и культивирование клеток LAK, начиная с небольшого количества клеток/культивирование без процессов разведения).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в XVIVO20 (не содержащей сыворотки) так, чтобы получить концентрацию 1105 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против CD3 человека, или в 6-луночный планшет, на котором иммобилизовали антитело против CD3 человека и FNfr, полученный таким же образом, как описано в пункте (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, добавляли 4 мл XVIVO20 (не содержащей сыворотки) (1104 клеток/см 2), и затем добавляли IL-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37 С в 5% СО 2 (нулевой день культивирования). На второй, третий и четвертый дни после начала культивирования добавляли IL-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Культивирование продолжали и IL-2 добавляли каждые 2 или 3 дня на седьмой день и в последующие дни после начала культивирования так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Во время культивирования процедуру разбавления культуральной среды не проводили совсем. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 9. Таблица 9 Как показано в табл. 9, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина во время индукции клеток LAK, начиная с небольшого количества клеток, высокую кратность экспансии получали на пятнадцатый день после начала культивирования без необходимости в процессах разведения клеток в ходе индукции. С другой стороны,в контрольной группе клетки почти не пролиферировали даже на пятнадцатый день после начала культивирования. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии в том случае, когда клетки LAK индуцировали, начиная с небольшого количества клеток с использованием бессывороточной среды, также содержащей фрагмент фибронектина, без необходимости в процессах разбавления. Пример 10. Индукция экспрессии IL-2R в системе культивирования клеток LAK с использованием(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(2) Определение относительной экспрессии IL-2R в клетках LAK. Относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток определяли таким же образом,как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 10. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток (%) показано в виде относительной экспрессии IL-2R. Таблица 10 Как показано в табл. 10, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина, во время индукции клеток LAK, начиная с небольшого количества клеток, относительная экспрессия IL-2R на поверхности клеток LAK во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне без необходимости в процессах разведения клеток в ходе индукции. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии IL-2R в том случае, когда клетки LAK индуцировали, начиная с небольшого количества клеток, с использованием бессывороточной среды и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина без необходимости в процедурах разбавления. Пример 11. Относительное содержание CD8-позитивных клеток в популяции клеток LAK, культивируемых в бессывороточной среде (AIM V).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(2) Определение относительного содержания популяции CD8-позитивных клеток среди клетокLAK. Относительное содержание CD8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 11. Таблица 11 Как показано в табл. 11, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительное содержание CD8-позитивных клеток среди клеток LAK во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с повышением относительного содержания CD8-позитивных клеток среди клеток LAK в том случае, когда клетки LAK индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина. Пример 12. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием среды с низким содержанием сыворотки (AIM V).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду AIM V, содержащую 1 или 5% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемую 1% AIM Как показано в табл. 12, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды (AIM V), содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток LAK с использованием среды AIM V, содержащей низкую концентрацию сыворотки. Пример 13. Влияние на кратность экспансии в системе культивирования клеток LAK использования различных сред с низким содержанием сыворотки.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду XVIVO20, среду XVIVO10 или среду AIM V, каждая из которых содержала 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем называемые просто 1% XVIVO20, 1% XVIVO10 или 1% AIM V, соответственно). Определяли кратность экспансии в каждой среде. Результаты показаны в табл. 13. Таблица 13 Как показано в табл. 13 в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Кроме того, такой эффект проявлялся даже в том случае, когда основную среду заменяли. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток LAK с использованием любой среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки. Пример 14. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием среды с низким содержанием сыворотки.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду XVIVO20, содержащую 0,2% сыворотки АВ человека. Результаты показаны в табл. 14. Как показано в табл. 14, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды (XVIVO20), содержащей низкую концентрацию (0,2%) сыворотки, кратность экспансии клеток LAK была высокой по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки. Пример 15. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием среды с низким содержанием сыворотки (экспансия посредством многократной стимуляции).(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой XVIVO20, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека, или средой XVIVO10, содержащей 1% сыворотки АВ человека. Результаты показаны в табл. 15. Таблица 15 Как показано в табл. 15, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-CD3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки (0,2%), кратность экспансии клеток LAK была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-CD3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK. Кроме того, данный эффект проявлялся даже когда основную среду заменяли. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии при стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и анти-CD3-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK даже когда использовали среду,содержащую низкую концентрацию сыворотки. Пример 16. Индукция экспрессии рецептора IL-2 (IL-2R) в системе культивирования клеток LAK с использованием среды с низким содержанием сыворотки.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли(2) Определение относительной экспрессии IL-2R в клетках LAK Относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток определяли таким же образом,как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 16. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии IL-2R клеток (%) показано в виде относительной экспрессии IL-2R (%). Таблица 16 Как показано в табл. 16, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительная экспрессия IL-2R на поверхности клеток LAK во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект проявлялся даже когда заменяли основную среду. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии IL-2R в том случае, когда клетки LAK индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина. Пример 17. Относительное содержание CD8-позитивных клеток в популяции клеток LAK при использовании среды с низким содержанием сыворотки.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой XVIVO20, содержащей 0,2 или 1% сыворотки АВ человека, или средой XVIVO10, содержащей 1% сыворотки АВ человека.(2) Определение относительного содержания популяции CD8-позитивных клеток среди клетокLAK. Относительное содержание CD8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 17. Таблица 17 Как показано в табл. 17, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание CD8 позитивных клеток среди клеток LAK во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с повышением относительного содержания CD8-позитивных клеток среди клеток LAK в том случае, когда клетки LAK инду- 29012520 цировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина. Пример 18. Относительное содержание CD8-позитивных клеток в популяции клеток LAK при использовании среды с низким содержанием сыворотки (экспансия посредством многократной стимуляции). 1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой XVIVO20, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека, или средой XVIVO10, содержащей 1% сыворотки АВ человека.(2) Определение относительного содержания популяции CD8-позитивных клеток среди клетокLAK. Относительное содержание CD8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 18. Таблица 18 Как показано в табл. 18, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на промежуточной стадии индукции клеток LAK с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание CD8-позитивных клеток среди клеток LAK во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, что клетки LAK можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания CD8-позитивных клеток среди клеток LAK в том случае,когда клетки LAK индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина. Пример 19. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток LAK с использованием бессывороточной среды.(1) Индукция и культивирование клеток LAK. Индукцию и культивирование клеток LAK осуществляли таким же образом, как описано в пункте(1) примера 5, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой XVIVO10 или средой AIM V, не содержащей сыворотки. Результаты показаны в табл. 19. Таблица 19