Штамм микроорганизма penicillium oxalicum var. armeniaca, используемый для получения красного красителя антрахинонового типа, и способ получения указанного красителя

1 Настоящее изобретение относится к новому штамму грибка, обладающему свойством вырабатывать красный краситель, который может применяться в качестве красителя в пищевой промышленности и при изготовлении косметики. В пищевой промышленности и при изготовлении косметики требуются красители, которые хорошо растворимы в компонентах соответствующих продуктов, цвет таких красителей не должен обладать батохромным эффектом и такие красители должны быть стабильными при кипячении. В соответствии с настоящим изобретением предложен штамм Penicillium oxalicum var, Armeniaca CCM 8242. Когда описываемый штамм, принадлежащий к виду Penicillium oxalicum, культивировали в питательной среде (в жидкой среде и на твердой среде),уже на второй день культивирования наблюдали увеличение синтеза красного красителя, который высвобождался в питательную среду. Выход очищенного красного красителя составляет от 1,5 до 2 г на литр питательной среды. Штамм депонировали в Международном депозитарии Чешской коллекции микроорганизмов (CCM) университета Мазарик, Тврдехо 14, 602 00 Брно, Чешская Республика, 19 марта 1998 г. под номером CCM 8242. Указанный штамм образует короткие конидиофоры размерами 60-70 х 5-6 мкм. Каждая гифа несет от 2 до 7 конидий. Конидии круглые,диаметром от 15 до 20 мкм с гладкой золотистожелтой поверхностью, они легко разлагаются при микроскопическом исследовании. В минеральной питательной среде Чапека штамм образует стандартно растущие колонии,которые достигают размеров 2-2,5 см на третий день культивирования и до 4,5 см на пятыйшестой день. Колонии нефиксированные, бархатистые, гифы короткие, спорулирующие, с хрупкой поверхностью, отламывающиеся. Когда сосуд с созревшей культурой встряхивают,конидии выпадают. Никаких зональных эффектов не наблюдали. Мицелий короткий, светлозеленого цвета, который по мере роста культуры меняется на темно-зеленый. Белые края растущей колонии достигают ширины от 1 до 2 мм. С обратной стороны колония становится красной и, по мере роста колонии, этот красный цвет становится все более интенсивным и диффундирует в агар, который становится интенсивно окрашенным в ярко-красный цвет. Если в качестве органической питательной среды используют солодовый агар, то колонии достигают больших размеров и имеют короткий светлый мицелий, окрашенный в зеленый цвет,в процессе роста штамма никакого биосинтеза красного красителя не происходило, или же этот краситель синтезировался в очень незначительных количествах. 2 В органической среде, например в агаре на капустном экстракте или на картофельном экстакте, образовывались быстрорастущие колонии диаметром от 5 до 7 см. Мицелий хрупкий, зеленый. Наблюдается повышенное образование золотисто-желтых конидий. В процессе роста культуры противоположная сторона колонии окрашивается в красный цвет и краситель диффундирует в агар, который приобретает интенсивный темно-красный цвет. Пигментация обратной стороны колонии начинается на второй день культивирования штамма и достигает максимума на седьмой день культивирования. При показателе рН в питательной среде ниже 3 и выше 9 при стандартных условиях выращивания культуры биосинтез красного красителя прекращается или же краситель образуется в очень небольших количествах. Оптимальное значение рН для образования красного красителя составляет от 5,6 до 6,2. Никакого запаха или экссудата не появляется. Штамм осуществляет интенсивный гидролиз крахмала, он не растворяет желатин и не превращает молочные белки в пептоны. Штамм абсорбирует органический азот в форме аминокислот аспарагина, валина, серина и тирозина.L-(+)-мальтоза, L-(+)-арабиноза, D-(+)сорбит и D-(+)-маннит являются прекрасными источниками сахаридного питания. Что касается органических кислот, то штамм абсорбирует янтарную, молочную и малеиновую кислоты. Оптимальная температура для роста грибков и для биосинтеза красителя составляет 27-29 С. Производственный штамм также размножается при температуре 37-38 С и не теряет способности образовывать пигмент. Грибковый производственный штамм сохраняют путем периодических повторных посевов в пробирках с капустной агаризированной средой в холодильнике при температуре от +4 до+5 С. Периодичность повторных посевов составляет от 2 до 3 месяцев. В настоящем изобретении предложен также способ культивирования штамма микроорганизмовPenicillium oxalicum var. Armeniaca, в соответствии с которым выращивают вышеуказанный производственный штамм при температуре от 25 до 30 С,предпочтительно 27-29 С, при избыточном давлении 50-80 кПа (0,5-0,8 атм.), предпочтительно при непрерывном перемешивании со скоростью 280 об/мин и с подачей воздуха в соотношении 1,2 объема воздуха на 1,0 объем питательной среды, в питательной среде с рН от 3 до 9, предпочтительно с рН от 5,8 до 6,2, содержащей углеводы, предпочтительно в количестве от 1,5 до 1,8 мас.%, и аммиачный азот предпочтительно в количестве от 0,66 до 0,69 мас.%, в течение 60-72 ч, предпочтительно в течение 64-68 ч, с последующим удалением жидкости из питательной среды и выделением из указанной жидкости полученного красного красителя. 3 Полученный краситель можно использовать в качестве пищевого или косметического красителя. Краситель представляет собой темнокрасный кристаллический порошок малинового оттенка в водном растворе. Ни в кристаллическом виде, ни в растворе краситель не обладает ни запахом, ни цветом. Температура плавления красителя составляет 127 С (температура разложения). Краситель нерастворим в воде, он растворим в щелочном растворе (рН от 9,0 до 9,5) и этиловом спирте. Краситель хорошо растворяется в яичном белке, в животных жирах и в концентрированной уксусной кислоте. Цвет красителя не изменяется в зависимости от значения рН, а это значит, что не имеет места батохромный эффект. Краситель обладает хорошей стабильностью при воздействии света и устойчивостью к температурным воздействиям. Никаких изменений цвета не происходит при кипячении в растворах в течение 5 ч при 100 С. Краситель поглощает свет видимого диапазона (Хмакс.=435 мм и 502 мм). Пропорция пиков составляет от 1,0 до 1,5. Результаты масс-спектроскопических анализов показывают, что полученный красный краситель включает в себя производные антрахинона, например производное формулы которое обладает эмпирической формулой С 25 Н 26 О 14 и молекулярной массой около 550. Ультрафиолетовый, инфракрасный спектры и массспектры подтвердили структуру антрахинона. Размножение культуры производственного штамма осуществляют в пробирках с настоем агаризированной капусты в качестве питательной среды путем периодических повторных посевов. Вышеуказанную среду можно приготовить, например, с использованием следующей процедуры: От 200 до 300 г мелко натертой капусты добавляют в 1 л питьевой воды и кипятят 20 мин. После охлаждения до температуры 50 С раствор фильтруют. Объем фильтрата доводят до 1 л и добавляют 20 г агара. Стерилизацию проводят под давлением от 70 до 80 кПа (0,7-0,8 атм.) в течение 20 мин. Полученную среду разливают порциями по 6-8 мл в стерильные пробирки размерами 18 х 150 мм при температуре 50-55 С и стерилизуют в автоклаве в следующих условиях: температура 116 С, давление пара 100 кПа (1,0 атм.), период стерилизации 20 мин. После стерилизации пробирки с агаризованной полужидкой средой сначала высушивают в термостате при температуре 37 С в течение одного дня. Готовые группы пробирок засевают 4 культурой производственного штамма и оставляют вызревать при температуре 27-29 С. Период культивирования составляет 5 дней. Активные колонии микроорганизмов собирают посредством повторного посева спор в чашках Петри с агаризованным капустным экстрактом. Активные колонии выбирают по интенсивности окраски колоний, обладающих минимальным диаметром от 0,5 до 1 см, имеющих гладкую поверхность и зону роста минимум от 0,1 до 0,2 см. Активные колонии собирают в агаризованный капустный экстракт. По своим морфологическим свойствам и свойствам культуры полученный грибковый штамм ближе всего к видам Penicillium oxalicum(по И.М. Пидопличко, 1972). Можно осуществлять культивирование производственного штамма согласно изобретению в ферментерах в жидких средах с использованием способа глубинного культивирования. Количество высеянного материала составляет от 3 до 7 маc.%. После высевания используют рабочие группы пробирок с пятидневной культурой, культивированной в капустном экстракте. Культивирование высеянного материала осуществляют при температуре 27-29 С в течение 64-68 ч. Оптимальные условия для осуществления микробиологического синтеза включают в себя следующие: температура от 27 до 29 С, непрерывное перемешивание со скоростью около 280 об/мин подача воздуха в пропорции 1,2 объема воздуха на 1,0 объем среды, избыточное давление в рабочем ферментере от 50 до 80 кПа (0,5-0,8 атм.). Уже после ферментации производственного микроорганизма в течение 30-35 ч жидкость над культурой становится красной, и интенсивность красной окраски достигает своего максимума - темно-вишневого цвета - после культивирования в течение 68-72 ч. В качестве компонентов питательной среды используются углеводы, различные сахариды, многофункциональные спирты и углеводороды, а также отходы сахарного производства мелассы - в количестве от 10 до 20 г на 1 л воды. Для обеспечения азотом можно использовать кукурузный экстракт, автолизат дрожжей или дрожжевой экстракт, а также соединения,содержащие азот в различных формах (таких как аминокислоты) в количестве от 0,5 до 0,7 мас.% азота). Оптимальные показатели среды: рН от 5,8 до 6,2, содержание углеводов от 1,5 до 1,8 мас.%, содержание аммиачного азота от 0,66 до 0,69 мас.%. Примеры Композиция питательной среды Пример 1. Гранулированный сахар 12-20 г/л Кукурузный экстракт 5-10 г/л 5 Сульфат цинка Сульфат магния Пример 2. Гранулированный сахар Дрожжевой экстракт Сульфат цинка Сульфат магния Пример 3. Меласса Кукурузный экстракт или дрожжевой экстракт Сульфат цинка Сульфат магния 6 Пример 4. Осадок растворяют в этиловом спирте и фильтруют. Спирт удаляют и получают краситель в кристаллической форме. Пример 5. Осадок растворяют в аммиачном растворе при рН от 9,0 до 10,0. Получают 5-50%-ный водный раствор красного красителя. Промышленная применимость Конечный продукт, получаемый способом согласно изобретению, представляет собой красный краситель микробиологического происхождения, предназначенный для использования в пищевой промышленности и при изготовлении косметики. Среду в ферментере засевают двухдневной культурой Penicillium oxalicum var. Armeniaca 8242, которая была культивирована в инокуляторе. Количество высеянного материала составляет от 3 до 7 об.% от объема среды. Отделение надосадочной жидкости от грибковой биомассы. После того как биосинтез красного красителя завершен, жидкость из питательной среды фильтруют или центрифугируют, чтобы отделить ее от биомассы. Для того, чтобы краситель выпал в осадок, жидкость подкисляют до рН от 3,0 до 2,5. Подкисление можно осуществлять при использовании любой органической или неорганической кислоты. Осаждение можно производить при помощи сульфата алюмокислого калия АlK2(SO4)3. Таким образом получают нерастворимый в основаниях и спиртах краситель. Этот краситель растворим в щелочном растворе при рН от 9,0 до 10. После осаждения краситель отделяют от жидкости центрифугированием. 1. Штамм микроорганизма Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, используемый для получения красного красителя антрахинонового типа. 2. Способ получения красного красителя антрахинонового типа, заключающийся в том,что штамм микроорганизма Penicillium oxalicumvar. Armeniaca CCM 8242 культивируют при температуре от 25 до 30 С, давлении от 50 до 80 кПа (0,5-0,8 атм) в культуральной среде с рН от 3 до 9, содержащей углеводы и аммиачный азот,при непрерывном перемешивании со скоростью 280 об./мин и подачей воздуха в соотношении 1,2 объема воздуха на 1,0 объем среды в течение 60-72 ч, отделяют культуральную жидкость от биомассы штамма и выделяют из нее краситель. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при температуре от 27 до 29 С в течение 64-68 ч в среде с рН от 5,8 до 6,2, содержащей углеводы в количестве от 1,5 до 1,8 мас.% и аммиачный азот в количестве от 0,66 до 0,69 мас.%.