Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ
Номер патента: 11654
Опубликовано: 28.04.2009
Авторы: Хэллер Майкл Ф., Букбиндер Луис Х., Кунду Анирбан, Келлер Джилберт А., Фрост Грегори И., Дайлан Тайлер М.
Формула / Реферат
1. Способ доставки фармакологического или другого агента в ткань, включающий
введение растворимой нейтрально-активной гиалуронидазы (sHASEGP) в ткань-мишень; и
введение фармакологического или другого агента в ткань, где фармакологический или другой агент выбран из следующих: Адалимумабы, Агалзидазы Бета, Алефацепты, Ампициллины, Анакинры, Антиполиомиелитные Вакцины, Антитимоциты, Азитромицины, Бекаплермины, Каспофунгины, Цефазолины, Цефепимы, Цефотетаны, Цефтазидимы, Цефтриаксоны, Цетуксимабы, Циластатины, Клавулановые кислоты, Клиндамицины, Дарбепоэтины Альфа, Деаклизумабы, Дифтерия, Дифтерийные антитоксины, Дифтерийные Токсоиды, Эфализумабы, Эпинефрины, Эритропоэтины Альфа, Этанерцепты, Филграстимы, Флуконазолы, Фолликулостимулирующие гормоны, Фоллитропины Альфа, Фоллитропины Бета, Фосфенилоины, Гадодиамиды, Гадопентетаты, Гатифлоксацины, Глатирамеры, GM-CSF, Гозерелины, ацетаты Гозерелина, Гранисетроны, Haemophilus influenza B, Галоперидолы, Вакцины Гепатита, Вакцины Гепатита А, Вакцины Гепатита В, Ибритумомаб-Тиуксетаны, Ибритумомабы, Тиуксетаны, Иммуноглобулины, Вакцины Haemophilus influenza, Вакцины вируса гриппа, Инфликсимабы, HUMALOGд, HUMALOGд MIX 75/25д, продукты HUMULINд (50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra и Ultralente), и NOVOLINд, Инсулин-Гларгины (например, LANTUSд), Интерфероны, Интерфероны Альфа, Интерфероны Бета, Интерфероны Гамма, Интерфероны Альфа-2а, Интерфероны Альфа-2b, Интерфероны Альфакон-1, Интерфероны Альфа-n3, Интерфероны Бета-1а, Интерфероны Альфа-консенсус, Иодиксанолы, Иогексолы, Иопамидолы, Иоверсолы, Кеторолаки, Ларонидазы, Левофлоксацины, Лидокаины, Линезолиды, Лоразепамы, Вакцины против кори, вирус кори, вирусы эпидемического паротита, Вакцины против вирусов кори-эпидемического паротита-коревой краснухи, Вакцины против коревой краснухи, Медроксипрогестероны, Меропенемы, Метилпреднизолоны, Мидазоламы, Морфины, Октреотиды, Омализумабы, Ондансетроны, Паливизумабы, Пантопразолы, Пегаспаргазы, Пегфилграстимы, Пег-Интерфероны Альфа-2а, Пег-Интерфероны Альфа-2b, Пегвисоманты, Вакцины против коклюша, Пиперациллины, Пневмококковые вакцины и Пневмококковые конъюгатные вакцины, Прометазины, Ретеплазы, Соматропины, Сулбактамы, Суматриптаны, Тазобактамы, Тенектеплазы, Очищенные Токсоиды Столбняка, Тикарциллины, Тозитумомабы, Триамцинолоны, Триамцинолона Ацетониды, Триамцинолона гексацетониды, Ванкомицины, иммуноглобулины Varicella Zoster, вакцины ветряной оспы, другие вакцины, Алемтузумабы, Алитретиноины, Аллопуринолы, Алтретамины, Амифостины, Анастрозолы, Мышьяки, Триоксиды мышьяка, Аспарагиназы, вакцины Bacillus Calmette-Guerin (BCG), BCG Live, Бексаротены, Блеомицины, Бусульфаны, Бусульфан внутривенный, Бусульфаны пероральные, Калустероны, Капецитабины, Карбоплатины, Кармустины, Кармустины с Полифепрозанами, Целекоксибы, Хлорамбуцилы, Цисплатины, Кладрибины, Циклофосфамиды, Цитарабины, Цитарабины липосомальные, Дакарбазины, Дактиномицины, Даунорубицины липосомальные, Даунорубицины, Дауномицины, Денилейкин-Дифтитоксы, Дексразоксаны, Доцетакселы, Доксорубицины, Доксорубицины липосомальные, пропионаты Дромостанолона, Растворы Эллиота В, Эпирубицины, Эпоэтины Альфа, Эстрамустины, Этопозиды, фосфаты Этопозида, Этопозиды VP-16, Эксеместаны, Флоксуридины, Флударабины, Фторурацилы, 5-Фторурацилы, Фулвестранты, Гемцитабины, Гемтузумабы, Озогамицины, озогамицины Гемтузумаба, Гидроксимочевины, Идарубицины, Ифосфамиды, мезилаты Иматиниба, Иринотеканы, Летрозолы, Лейковорины, Левамизолы, Ломустины, CCNU, Меклоретамины, Азотные аналоги иприта, Мегестролы, ацетаты Мегестрола, Мелфаланы, L-PAM, Меркаптопурины, 6-Меркаптопурины, Месны, Метотрексаты, Метоксалены, Митомицины, Митомицины С, Митотаны, Митоксатроны, Нандролоны, фенпропионаты Нандролона, Нофетумомабы, Опрелвекины, Оксалиплатины, Паклитакселы, Памидронаты, Пегадемазы, Пентостатины, Пипоброманы, Пликамицины, Митрамицины, Порфимеры, Порфимер-натрия, Прокарбазины, Хинакрины, Расбуриказы, Ритуксимабы, Сарграмостимы, Стрептозоцины, Тальки, Тамоксифены, Темозоломиды, Тенипозиды, Тестолактоны, Тиогуанины, 6-Тиогуанины, Триэтилентиофосфоамиды (Тиотепы), Топотеканы, Торемифены, Трастузумабы, Третиноины, Урацил-азотные аналоги иприта, Валрубицины, Винбластины, Винкристины, Винорелбины, Золедронаты, Ацивицины, Акларубицины, Акодазолы, Акронины, Адозелезины, Альдеслейкины, Ретиноевые кислоты, Алитрениноины, 9-цис-ретиноевые кислоты, Алвоцидибы, Амбазоны, Амбомицины, Аметантроны, Аминоглютетимиды, Амсакрины, Анаксироны, Анцитабины, Антрамицины, Апазиквоны, Аргимесны, Асперлины, Атримустины, Азацитидины, Азетепы, Азотомицины, Баноксантроны, Батабулины, Батимастаты, Бенаксибины, Бендамустины, Бензодепы, Бикалутамиды, Биэтазерпины, Бирикодары, Бисантрены, Биснафида Димезилаты, Бизелезины, Бортезомибы, Бреквинары, Бропиримины, Будотитаны, Кактиномицины, Канертинибы, Карацемиды, Карбетимеры, Карбоквоны, Кармофуры, Карубицины, Карзелезины, Цедефинголы, Цемадотины, Хлорамбуцилы, Циотеронелы, Циролемицины, Кланфенуры, Клофарабины, Криснатолы, Децитабины, Декснигулдипины, Дексормаплатины, Дезагуанины, Диазиквоны, Диброспидиумы, Диеногесты, Диналины, Дисермолиды, Дофеквидары, Доксифлуридины, Дролоксифены, Дуазомицины, Экомустины, Эдатрексаты, Эдотекарины, Эфломитины, Элакридары, Элинафиды, Элсамитруцины, Эмитефуры, Энлоплатины, Энпроматы, Энзастаурины, Эпипропидины, Эпталопросты, Эрбулозолы, Эзорубицины, Этанидазолы, Этоглюциды, Этоприны, Экзисулинды, Фадрозолы, Фазарабины, Фенретиниды, Флуоксиместероны, Фторцитабины, Фосквидоны, Фостриецины, Фотретамины, Галарубицины, Галоцитабины, Герохинолы, Гиматеканы, Гимерацилы, Глоксазоны, Глюфосфамиды, Илмофозины, Иломастаты, Имексоны, Импросульфаны, Индисуламы, Инпроквоны, Интерлейкины, Интерлейкины 2, рекомбинантные Интерлейкины, Интоплицины, Иобенгуаны, Ипроплатины, Ирзогладины, Иксабепилоны, Кетотрексаты, L-Аланозины, Ланреотиды, Лапатинибы, Ледоксандроны, Лейпролиды, Лейпрорелины, Лексакальцитолы, Лиарозолы, Лобаплатины, Лометрексолы, Лонафарнибы, Лозоксантроны, Луртотеканы, Мафосфамиды, Манносульфаны, Маримастаты, Мазопроколы, Майтансины, Мехлоретамины, Меленгестролы, Мелфаланы, Меногарилы, Мепитиостаны, Метезинды, Метомидаты, Метоприны, Метуредепы, Мибоплатины, Мипроксифены, Мизонидазолы, Митиндомиды, Митокарцины, Митокромины, Митофлаксоны, Митогиллины, Митогуазоны, Митомалцины, Митонафиды, Митоквидоны, Митосперы, Митозоломиды, Мивобулины, Мизорибины, Мофаротены, Мопидамолы, Мубритинибы, Микофеноловые кислоты, Недаплатины, Нелзарабины, Неморубицины, Нитракрины, Нокодазолы, Ногаламицины, Нолатрекседы, Нортопиксантроны, Ормаплатины, Ортатакселы, Отерацилы, Оксисураны, Оксофенарсины, Патубилоны, Пелдезины, Пелиомицины, Пелитрексолы, Пеметрекседы, Пентамустины, Пепломицины, Перфосфамиды, Перифозины, Пикоплатины, Пинафиды, Пипосульфаны, Пирфенидоны, Пироксантроны, Пиксантроны, Плевитрекседы, Пломестаны, Порфиромицины, Преднимустины, Пропамидины, Проспидиумы, Пумитепы, Пуромицины, Пиразофурины, Ранимустины, Рибоприны, Ритросульфаны, Роглетимиды, Роквинимексы, Руфокромомицины, Сабарубицины, Сафинголы, Сатраплатины, Себриплатины, Семустины, Симтразены, Сизофираны, Собузоксаны, Сорафенибы, Спарфосаты, Спарфосовые кислоты, Спарсомицины, Спирогермании, Спиромустины, Спироплатины, Скваламины, Стрептонигрины, Стрептоварицины, Суфосфамиды, Сулофенуры, Тацединалины, Талисомицины, Таллимустины, Тариквидары, Тауромустины, Текогаланы, Тегафуры, Телоксантроны, Темопорфины, Тероксироны, Тиамиприны, Тиазофурины, Тиломизолы, Тилороны, Тимкодары, Тимонацики, Тирапазамины, Топиксантроны, Трабектедины, Эктеинасцидин 743, Трестолоны, Трицирибины, Трилостаны, Триметрексаты, Триплатина Тетранитраты, Трипторелины, Трофосфамиды, Тубулозолы, Убенимексы, Уредепы, Валсподары, Вапреотиды, Вертепорфины, Винбластины, Виндезины, Винепидины, Винфлунины, Винформиды, Винглицинаты, Винлейцинолы, Винлейрозины, Винросидины, Винтриптолы, Винзолидины, Ворозолы, Ксантомицины А, Гуамециклины, Зениплатины, Зиласкорбы [2-Н], Зиностатины, Зорубицины, Зосуквидары, Ацетазоламифы, Ацикловиры, Адипиодоны, Алатрофлоксацины, Алфентанилы, Аллергенные экстракты, ингибиторы альфа-1-протеиназы, Алпростадилы, Амикацины, Аминокислоты, Аминокапроновые кислоты, Аминофиллины, Амитриптилины, Амобарбиталы, Амриноны, Анальгетические средства, Антиполиомиелитные вакцины, Сыворотки против бешенства, Противостолбнячные иммуноглобулины, вакцины против столбняка, Антитромбины III, Противоядные сыворотки, Аргатробаны, Аргинины, Аскорбиновые кислоты, Атенололы, Атракурии, Атропины, Ауротиоглюкозы, Азатиоприны, Азтреонамы, Бацитрацины, Баклофены, Базиликсимабы, Бензойные кислоты, Бензтропины, Бетаметазоны, Биотины, Бивалирудины, Антитоксины ботулизма, Бретилии, Буметаниды, Бупивакаины, Бупренорфины, Буторфанолы, Кальцитонины, Кальцитриолы, Кальций, Капреомицины, Карбопросты, Карнитины, Цефамандолы, Цефоперазоны, Цефотаксимы, Цефокситины, Цефтизоксимы, Цефуроксимы, Хлорамфениколы, Хлорпрокаины, Хлорохины, Хлоротиазиды, Хлорпромазины, Хондроитинсерные кислоты, Хориогонадотропины Альфа, Хром, Цидофовиры, Цимецидины, Ципрофлоксацины, Цисатракурии, Клонидины, Кодеины, Колхицины, Колистины, Коллагены, Кортикорелина овечьего трифлутаты, Кортикотропины, Косинтропины, Цианокобаламины, Циклоспорины, Цистеины, Дакликсимабы, Далфопристины, Далтепарины, Данапароиды, Дантролены, Дефероксамины, Десмопрессины, Дексаметазоны, Дексмедетомидины, Декспантенолы, Декстраны, Декстраны железа, Диатризойные кислоты, Диазепамы, Диазоксиды, Дицикломины, Дигибинды, Дигоксины, Дигидроэрготамины, Дилтиаземы, Дифенгидрамины, Дипиридамолы, Добутамины, Допамины, Доксакурии, Доксапрамы, Доксеркальциферолы, Доксициклины, Дроперидолы, Дифиллины, Эдетовые (этилендиаминтетрауксусные) кислоты, Эдрофонии, Эналаприлаты, Эфедрины, Эпопростенолы, Эргокальциферолы, Эргоновины, Эртапенемы, Эритромицины, Эсмололы, Эстрадиолы, Эстрогенные средства, Этакриновые кислоты, Этаноламины, Этанолы, Этиодизированные масла, Этидроновые кислоты, Этомидаты, Факторы VIII, Фамотидины, Фенолдопамы, Фентанилы, Флумазенилы, Флуоресцеины, Флуфеназины, Фолиевые кислоты, Фомепизолы, Фомиверсены, Фондапаринуксы, Фоскарнеты, Фосфенитоины, Фуросемиды, Гадотеридолы, Гадоверсетамиды, Ганцикловиры, Гентамицины, Глюкагоны, Глюкозы, Глицины, Гликопирролаты, Гонадорелины, Хорионические Гонадотропины, Полисахариды Haemophylus B, Гемины, Лечебные средства из трав, Гистамины, Гидралазины, Гидрокортизоны, Гидроморфоны, Гидроксокобаламины, Гидроксизины, Гиосциамины, Ибутилиды, Имиглюцеразы, Индигокармины, Индометацины, Иодиды, Лопромиды, Иоталамовые кислоты, Локсагловые кислоты, Локсиланы, Изониазиды, Изопротеренолы, Вакцины Японского энцефалита, Канамицины, Кетамины, Лабеталолы, Лепирудины, Левобупивакаины, Левотироксины, Линкомицины, Лиотиронины, Лютеинизирующие гормоны, Вакцины против болезни Лайма, Мангафодипиры, Манниты, Менингококковые полисахаридные вакцины, Меперидины, Мепивакаины, Мезоридазины, Метараминолы, Метадоны, Метокарбамолы, Метогекситали, Метилдопаты, Метилэргоновины, Метоклопрамиды, Метопрололы, Метронидазолы, Миноциклины, Мивакурии, Морруевые кислоты (Morrhuic acids), Моксифлоксацины, Муромонабы-CD3, Микофенолат-мофетилы, Нафциллины, Налбуфины, Налмефены, Налоксоны, Неостигмины, Ниацинамиды, Никардипины, Нитроглицерины, Нитропруссиды, Норепинефрины, Орфенадрины, Оксациллины, Оксиморфоны, Окситетрациклины, Окситоцины, Панкуронии, Пантенолы, Пантотеновые кислоты, Папаверины, Пег-интерфероны Альфа-2А, Пенициллины G, Пентамидины, Пентазоцины, Пентобарбиталы, Перфлутрены, Перфеназины, Фенобарбиталы, Фентоламины, Фенилэфрины, Фенитоины, Физостигмины, Фитонадионы, Полимиксины b, Пралидоксимы, Прилокаины, Прокаинамиды, Прокаины, Прохлорперазины, Прогестероны, Пропранололы, Пиридостигмин-гидроксиды, Пиридоксины, Хинидины, Хинупристины, Иммуноглобины бешенства, Вакцины против бешенства, Ранитидины, Ремифентанилы, Рибофлавины, Рифампины, Ропивакаины, Самарии, Скополамины, Селены, Серморелины, Синкалиды, Соматремы, Спектиномицины, Стрептокиназы, Стрептомицины, Сукцинилхолины, Суфентанилы, Сульфаметоксазолы, Такролимусс, Тербуталины, Терипаратиды, Тестостероны, Антитоксины столбняка, Тетракаины, Тетрадецилсульфаты, Теофиллины, Тиамины, Тиэтилперазины, Тиопентали, Тиреоидстимулирующие гормоны, Тинзапарины, Тирофибаны, Тобрамицины, Толазолины, Толбутамиды, Торсемиды, Транексамовые кислоты, Трепростинилы, Трифлуоперазины, Триметобензамиды, Триметопримы, Трометамины, Туберкулины, Тифоидные вакцины, Урофоллитропины, Урокиназы, Валпроевые кислоты, Вазопрессины, Векуронии, Верапамилы, Вориконазолы, Варфарины, Вакцины желтой лихорадки, Зидовудины, Цинки, гидрохлориды Зипрасидона, Аклациномицины, Актиномицины, Адриамицины, Азасерины, 6-Азауридины, Карзинофилины, Хромомицины, Деноптерины, 6-Диазо-5-Оксо-L-Норлейцины, Эноцитабины, Локсуридины, Оливомицины, Пирарубицины, Пиритрексимы, Птероптерины, Тагафуры, Туберцидины, Альтеплазы, Арцитумомабы, Бевацизумабы, Токсины типа A Botulinum, Токсины типа В Botulinum, Капромаб-пендетиды, Даклизумабы, Дорназы Альфа, Дротрекогины Альфа, Имциромаб-Пентетаты, иод-131, Адриамицины, Блеомицины, Кармустины, Цисплатины, Кладрибины, Цитарабины, Дактиномицины, Даунорубицины, Доксорубицины, Фепирубицины, Флударабины, Фторурацилы, Гемцитабины, Идарубицины, Локсуридины, 6-Меркаптопурины, Метотрексаты, Митрамицины, Митомицины, Микофеноловые кислоты, Ногаламицины, Пепломицины, Пликамицины, Порфиромицины, Пуромицины, Ретиноевые кислоты, Стрептозоцины, Тагафуры, Тамоксифены, Тиогуанины, Трамцинолоны, Туберцидины, Винкристины, Зорубицины, Аминогликозиды, Амфениколы, Ансамицины, Карбацефемы, Карбапенемы, Цефалоспорины или Цефемы, Цефамицины, Клавамы; Циклические липопептиды, Диаминопиримидины, Кетолиды, Линкосамиды, Макролиды, Монобактамы, Нитрофураны, Оксацефемы, Оксазолидиноны, Пенемы, Тиенамицины и разнообразные бета-лактамы, Пенициллины, Хинолоны, Сульфонамиды, Сульфоны, Тетрациклины, Клофоктолы, Фусидовые кислоты, Гекседины, Метенамины, Нитрофурантоины, Нитроксолины, Ритипенемы, Тауролидины, Ксибомолы, модификаторы крови, антибиотический агент, ингибитор ангиогенеза, вещества против катаракты и диабетической ретинопатии, ингибиторы карбоангидразы, мидриатики, агенты фотодинамической терапии, аналоги простагландина, факторы роста, противоопухолевые агенты, антиметаболиты, антивирусные агенты, амебоцидные и антипаразитарные агенты, противотуберкулезные и противолепрозные средства, антитоксины и антивенины, иммуномодуляторный агент, стероидные противовоспалительные агенты, Дукосаноиды, простагландины, аналоги простагландинов, антипростагландины и предшественники простагландинов, миотические агенты, холинергические агенты и антихолинэстеразы, противоаллергические агенты и комбинация агентов.
2. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармацевтически эффективный агент представляет собой иммуноглобулин.
3. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармацевтически эффективный агент выбран из Интерферона Бета, Интерферонов Альфа-2а, Интерферонов Альфакон-1, Интерферонов Альфа-n3, Интерферонов Бета-1, Интерферонов Бета-1а, Интерферонов Гамма-1b, Пег-Интерферонов Альфа-2, Пег-Интерферонов Альфа-2b.
4. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой Памидронат или Золедронат.
5. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой инсулин, который выбран из HUMALOGд, HUMALOGд MIX 75/25д, продуктов HUMULINд (50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra и Ultralente), и NOVOLINд, Инсулин-Гларгинов (например, LANTUSд).
6. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармакологически эффективный агент выбран из Доцетакселов, Доксорубицинов, Доксорубицинов липосомальных и бевацизумабов.
7. Способ по п.1, где sHASEGP вводят в ткань инъекцией sHASEGP в эту ткань или в соседнюю ткань.
8. Способ по п.1, где sHASEGP вводят в ткань предварительным введением sHASEGP в кровоток, снабжающий эту ткань.
9. Способ по п.8, где предварительное введених т кровоток опосредовано внутривенной инъекцией или инфузией sHASEGP.
10. Способ по п.8, где предварительное введение в кровоток опосредовано невнутривенным парентеральным введением sHASEGP.
11. Способ по п.1, где фармакологический или другой агент вводят в ткань инъекцией в эту ткань или в соседнюю ткань.
12. Способ по п.1, где фармакологический или другой агент вводят в ткань после предварительного введения sHASEGP в кровоток, снабжающий эту ткань.
13. Способ по п.12, где фармакологический или другой агент вводят путем введения в кровоток, опосредованного внутривенной инъекцией или инфузией фармакологического или другого агента.
14. Способ по п.12, где фармакологический или другой агент вводят путем введения в кровоток, опосредованного невнутривенным парентеральным введением фармакологического или другого агента.
15. Способ по п.1, где стадию введения фармакологического или другого агента в ткань начинают в пределах трех часов после стадии введения sHASEGP в эту ткань.
16. Способ по п.1, где стадию введения фармакологического или другого агента в ткань начинают в пределах двенадцати часов после стадии введения sHASEGP в эту ткань.
17. Способ по п.1, где sHASEGP содержит последовательность аминокислотных остатков, имеющую последовательность, включенную в SEQ ID NO:1 или последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 91% идентичность аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, включенной в SEQ ID NO:1.
18. Способ по п.17, где sHASEGP кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 36-482 SEQ ID NO:1 или которая кодирует аминокислоты 1-482 SEQ ID NO:1.
19. Способ по п.18, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:48.
20. Способ по п.17, где sHASEGP включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:1, которая усечена по аминокислотному остатку, который является аминокислотным остатком 477 или 483 или находится между ними.
21. Способ по п.17, где sHASEGP имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-477, 36-477, 1-478, 36-478, 1-479, 36-479, 1-480, 36-480, 1-481, 36-481, 1-482, 36-482, 1-483 или 36-483 SEQ ID NO:1.
22. Способ по п.21, где sHASEGP секретируется в клетки CHO.
23. Способ по п.1, где sHASEGP является ПЭГилированным или сверхсиалированным sHASEGP.
24. Способ по п.1, где sHASEGP имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 36-482 SEQ ID NO:1.
25. Способ по п.1, где sHASEGP имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-482 SEQ ID NO:1.
26. ПЭГилированная гиалуронидаза, содержащая по меньшей мере три ПЭГ-группы на полипептид.
27. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, представляющая собой не человеческую гиалуронидазу животного или бактериального происхождения.
28. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.27, представляющая собой не человеческую гиалуронидазу животного происхождения, выбранную из гиалуронидазы овечьих или бычьих яичек.
29. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза представляет собой нейтрально-активный растворимый полипептид гиалуронидазы, содержащий по меньшей мере одну N-связанную молекулу сахара; N-связанная молекула сахара ковалентно присоединена к остатку аспарагина полипептида; и гиалуронидаза является растворимой.
30. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.29, содержащая последовательность аминокислотных остатков, имеющую последовательность, включенную в SEQ ID NO:1, или последовательность, которая обладает по меньшей мере примерно 91% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, включенной в SEQ ID NO:1.
31. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.30, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 36-482 SEQ ID NO:1 или которая кодирует аминокислоты 1-482 SEQ ID NO:1.
32. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.31, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:48.
33. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.30, где гиалуронидаза включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:1, которая является усеченной по аминокислотному остатку, который является аминокислотным остатком 477 или 483 или находится между ними.
34. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.33, где гиалуронидаза имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-477, 36-477, 1-478, 36-478, 1-479, 36-479, 1-480, 36-480, 1-481, 36-481, 1-482, 36-482, 1-483 или 36-483 SEQ ID NO:1.
35. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.34, где гиалуронидаза секретируется в клетки CHO.
36. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 36-482 SEQ ID NO:1.
37. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-482 SEQ ID NO:1.
38. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза является гиалуронидазой бактериального происхождения, которая представляет собой хондроитиназу.
39. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.38, где хондроитиназа представляет собой хондроитиназу ABC.
40. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза является гиалуронидазой бактериального происхождения, которая представляет собой гиалуронатлиазу.
41. Способ увеличения диффузии терапевтического вещества или другой молекулы или макромолекулярного комплекса, предусматривающий
введение субъекту ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26 в количестве, достаточном для открывания или для образования каналов, меньших чем приблизительно 0,5 мкм в диаметре, посредством чего увеличивается диффузия терапевтического вещества или другой молекулы или макромолекулярного комплекса; и
введение терапевтического вещества или другой молекулы или макромолекулярного комплекса.
42. Способ по п.41, где терапевтическое вещество или другая молекула или макромолекулярный комплекс выбран из химиотерапевтического агента, анальгетического агента, противовоспалительного агента, антимикробного агента, амебоцидного агента, трихомоноцидного агента, антипаркинсонического агента, противомалярийного агента, противосудорожного агента, антидепрессивного агента, антиартритного агента, противогрибкового агента, антигипертензивного агента, жаропонижающего агента, антипаразитарного агента, антигистаминного агента, альфа-адренергического агониста, альфа-блокатора, анестезирующего агента, бронхорасширяющего агента, биоцидного агента, бактерицидного агента, бактериостатического агента, бета-адреноблокатора, блокирующего кальциевые каналы агента, сердечно-сосудистого лекарственного агента, контрацептивного агента, противоотечного агента, диуретического (мочегонного) агента, депрессанта, диагностического агента, электролитного агента, гипнотического агента, гормонального агента, гипергликемического агента, миорелаксанта, агента мышечного сокращения, глазного агента, парасимпатомиметического агента, антидепрессанта, седативного агента, индуцирующего сон агента, симпатомиметического агента, транквилизирующего агента, мочевого агента, вагинального агента, противовирусного агента, витаминного агента, нестероидного противовоспалительного агента, ингибитора ангиотензинпревращающего фермента, полипептида, белка, нуклеиновой кислоты, лекарственного средства и органической молекулы.
43. Способ индукции разжижения жидкой части стекловидного тела для лечения нарушения глаза млекопитающего, предусматривающий контактирование жидкой части стекловидного тела с количеством ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26, эффективным для разжижения указанной жидкой части стекловидного тела, посредством чего лечится это нарушение.
44. Способ получения ПЭГилированной гиалуронидазы, предусматривающий реакцию гиалуронидазы с молярным избытком ПЭГ-реагента, выбранного из ПЭГ-сукцинимидилбутаноата, ПЭГ-сукцинимидилметилбутаноата, ПЭГ-сукцинимидилпропионата, ПЭГ-N-гидроксисукцинимида, ПЭГ-альдегида, ПЭГ-карбоната, ПЭГ-пропиональдегидр ш ПЭГ-малеимида.
45. Способ по п.44, где ПЭГ-реагент выбран из mPEG-SBA (5 кДа), mPEG-SBA (20 кДа), mPEG-SBA (30 кДа), mPEG-SMB (20 кДа), mPEG-SMB (30 кДа), mPEG-бутиральдегида (30 кДа), mPEG-SPA (20 кДа), mPEG-SPA (30 кДа), mPEG2-NHS (10 кДа разветвленного), mPEG2-NHS (20 кДа разветвленного), mPEG-NHS (40 кДа разветвленного), mPEG2-NHS (60 кДа разветвленного), PEG-NHS-биотина (5 кДа биотинилированного), ПЭГ-п-нитрофенилкарбоната (30 кДа) и ПЭГ-пропиональдегида (30 кДа).
46. ПЭГилированная гиалуронидаза, полученная согласно способу по п.44.
47. ПЭГилированная гиалуронидаза, полученная согласно способу по п.45.
48. Способ доставки молекулы в ткань, содержащую избыточные количества гликозаминогликана, предусматривающий введение ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26 в ткань в количестве, достаточном для расщепления гликозаминогликанов в достаточной степени для открывания каналов, меньших чем 500 нм в диаметре; и введение молекулы в ткань, содержащую расщепленные гликозаминогликаны.
49. Фармацевтическая композиция, содержащая ПЭГилированную гиалуронидазу по п.26 и фармацевтический носитель.
50. Способ облегчения последствий инсульта или другого повреждения ЦНС у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26 после указанного инсульта или повреждения ЦНС.
51. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где указанные ПЭГ-группы являются разветвленными.
52. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где указанные ПЭГ-группы выбраны из группы, состоящей из mPEG-SBA (5 кДа), mPEG-SBA (20 кДа), mPEG-SBA (30 кДа), mPEG-SMB (20 кДа), mPEG-SMB (30 кДа), mPEG-бутиральдегида (30 кДа), mPEG-SPA (20 кДа), mPEG-SPA (30 кДа), mPEG2-NHS (10 кДа разветвленного), mPEG2-NHS (20 кДа разветвленного), mPEG-NHS (40 кДа разветвленного), mPEG2-NHS (60 кДа разветвленного), PEG-NHS-биотин (5 кДа биотинилированного), ПЭГ-п-нитрофенилкарбоната (30 кДа) и ПЭГ-пропиональдегида (30 кДа).
53. Комбинация, содержащая:
(a) растворимый нейтрально-активный полипептид гиалуронидазы (sHASEGP) и
(b) фармакологический или фармацевтически эффективный агент, выбранный из следующих: Адалимумабы, Агалзидазы Бета, Алефацепты, Ампициллины, Анакинры, Антиполиомиелитные Вакцины, Антитимоциты, Азитромицины, Бекаплермины, Каспофунгины, Цефазолины, Цефепимы, Цефотетаны, Цефтазидимы, Цефтриаксоны, Цетуксимабы, Циластатины, Клавулановые кислоты, Клиндамицины, Дарбепоэтины Альфа, Деаклизумабы, Дифтерия, Дифтерийные антитоксины, Дифтерийные Токсоиды, Эфализумабы, Эпинефрины, Эритропоэтины Альфа, Этанерцепты, Филграстимы, Флуконазолы, Фолликулостимулирующие гормоны, Фоллитропины Альфа, Фоллитропины Бета, Фосфенилоины, Гадодиамиды, Гадопентетаты, Гатифлоксацины, Глатирамеры, GM-CSF, Гозерелины, ацетаты Гозерелина, Гранисетроны, Haemophilus influenza B, Галоперидолы, Вакцины Гепатита, Вакцины Гепатита А, Вакцины Гепатита В, Ибритумомаб-Тиуксетаны, Ибритумомабы, Тиуксетаны, Иммуноглобулины, Вакцины Haemophilus influenza, Вакцины вируса гриппа, Инфликсимабы, HUMALOGд, HUMALOGд MIX 75/25д, продукты HUMULINд (50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra и Ultralente), и NOVOLINд, Инсулин-Гларгины (например, LANTUSд), Интерфероны, Интерфероны Альфа, Интерфероны Бета, Интерфероны Гамма, Интерфероны Альфа-2а, Интерфероны Альфа-2b, Интерфероны Альфакон-1, Интерфероны Альфа-n3, Интерфероны Бета-1a, Интерфероны Альфа-консенсус, Иодиксанолы, Иогексолы, Иопамидолы, Иоверсолы, Кеторолаки, Ларонидазы, Левофлоксацины, Лидокаины, Линезолиды, Лоразепамы, Вакцины против кори, вирус кори, вирусы эпидемического паротита, Вакцины против вирусов кори-эпидемического паротита-коревой краснухи, Вакцины против коревой краснухи, Медроксипрогестероны, Меропенемы, Метилпреднизолоны, Мидазоламы, Морфины, Октреотиды, Омализумабы, Ондансетроны, Паливизумабы, Пантопразолы, Пегаспаргазы, Пегфилграстимы, Пег-Интерфероны Альфа-2а, Пег-Интерфероны Альфа-2b, Пегвисоманты, Вакцины против коклюша, Пиперациллины, Пневмококковые вакцины и Пневмококковые конъюгатные вакцины, Прометазины, Ретеплазы, Соматропины, Сулбактамы, Суматриптаны, Тазобактамы, Тенектеплазы, Очищенные Токсоиды Столбняка, Тикарциллины, Тозитумомабы, Триамцинолоны, Триамцинолона Ацетониды, Триамцинолона гексацетониды, Ванкомицины, иммуноглобулины Varicella Zoster, вакцины ветряной оспы, другие вакцины, Алемтузумабы, Алитретиноины, Аллопуринолы, Алтретамины, Амифостины, Анастрозолы, Мышьяки, Триоксиды мышьяка, Аспарагиназы, вакцины Bacillus Calmette-Guerin (BCG), BCG Live, Бексаротены, Блеомицины, Бусульфаны, Бусульфан внутривенный, Бусульфаны пероральные, Калустероны, Капецитабины, Карбоплатины, Кармустины, Кармустины с Полифепрозанами, Целекоксибы, Хлорамбуцилы, Цисплатины, Кладрибины, Циклофосфамиды, Цитарабины, Цитарабины липосомальные, Дакарбазины, Дактиномицины, Даунорубицины липосомальные, Даунорубицины, Дауномицины, Денилейкин-Дифтитоксы, Дексразоксаны, Доцетакселы, Доксорубицины, Доксорубицины липосомальные, пропионаты Дромостанолона, Растворы Эллиота В, Эпирубицины, Эпоэтины Альфа, Эстрамустины, Этопозиды, фосфаты Этопозида, Этопозиды VP-16, Эксеместаны, Флоксуридины, Флударабины, Фторурацилы, 5-Фторурацилы, Фулвестранты, Гемцитабины, Гемтузумабы, Озогамицины, озогамицины Гемтузумаба, Гидроксимочевины, Идарубицины, Ифосфамиды, мезилаты Иматиниба, Иринотеканы, Летрозолы, Лейковорины, Левамизолы, Ломустины, CCNU, Меклоретамины, Азотные аналоги иприта, Мегестролы, ацетаты Мегестрола, Мелфаланы, L-PAM, Меркаптопурины, 6-Меркаптопурины, Месны, Метотрексаты, Метоксалены, Митомицины, Митомицины С, Митотаны, Митоксатроны, Нандролоны, фенпропионаты Нандролона, Нофетумомабы, Опрелвекины, Оксалиплатины, Паклитакселы, Памидронаты, Пегадемазы, Пентостатины, Пипоброманы, Пликамицины, Митрамицины, Порфимеры, Порфимер-натрия, Прокарбазины, Хинакрины, Расбуриказы, Ритуксимабы, Сарграмостимы, Стрептозоцины, Тальки, Тамоксифены, Темозоломиды, Тенипозиды, Тестолактоны, Тиогуанины, 6-Тиогуанины, Триэтилентиофосфоамиды (Тиотепы), Топотеканы, Торемифены, Трастузумабы, Третиноины, Урацил-азотные аналоги иприта, Валрубицины, Винбластины, Зинкристины, Винорелбины, Золедронаты, Ацивицины, Акларубицины, Акодазолы, Акронины, Адозелезины, Альдеслейкины, Ретиноевые кислоты, Алитрениноины, 9-цис-ретиноевые кислоты, Алвоцидибы, Амбазоны, Амбомицины, Аметантроны, Аминоглютетимиды, Амсакрины, Анаксироны, Анцитабины, Антрамицины, Апазиквоны, Аргимесны, Асперлины, Атримустины, Азацитидины, Азетепы, Азотомицины, Баноксантроны, Батабулины, Батимастаты, Бенаксибины, Бендамустины, Бензодепы, Бикалутамиды, Биэтазерпины, Бирикодары, Бисантрены, Биснафида Димезилаты, Бизелезины, Бортезомибы, Бреквинары, Бропиримины, Будотитаны, Кактиномицины, Канертинибы, Карацемиды, Карбетимеры, Карбоквоны, Кармофуры, Карубицины, Карзелезины, Цедефинголы, Цемадотины, Хлорамбуцилы, Циотеронелы, Циролемицины, Кланфенуры, Клофарабины, Криснатолы, Децитабины, Декснигулдипины, Дексормаплатины, Дезагуанины, Диазиквоны, Диброспидиумы, Диеногесты, Диналины, Дисермолиды, Дофеквидары, Доксифлуридины, Дролоксифены, Дуазомицины, Экомустины, Эдатрексаты, Эдотекарины, Эфломитины, Элакридары, Элинафиды, Элсамитруцины, Эмитефуры, Энлоплатины, Энпроматы, Энзастаурины, Эпипропидины, Эпталопросты, Эрбулозолы, Эзорубицины, Этанидазолы, Этоглюциды, Этоприны, Экзисулинды, Фадрозолы, Фазарабины, Фенретиниды, Флуоксиестероны, Фторцитабины, Фосквидоны, Фостриецины, Фотретамины, Галарубицины, Галоцитабины, Герохинолы, Гиматеканы, Гимерацилы, Глоксазоны, Глюфосфамиды, Илмофозины, Иломастаты, Имексоны, Импросульфаны, Индисуламы, Инпроквоны, Интерлейкины, Интерлейкины 2, рекомбинантные Интерлейкины, Интоплицины, Иобенгуаны, Ипроплатины, Ирзогладины, Иксабепилоны, Кетотрексаты, L-Аланозины, Ланреотиды, Лапатинибы, Ледоксандроны, Лейпролиды, Лейпрорелины, Лексакальцитолы, Лиарозолы, Лобаплатины, Лометрексолы, Лонафарнибы, Лозоксантроны, Луртотеканы, Мафосфамиды, Манносульфаны, Маримастаты, Мазопроколы, Майтансины, Мехлоретамины, Меленгестролы, Мелфалрэы, Меногарилы, Мепитиостаны, Метезинды, Метомидаты, Метоприны, Метуредепы, Мибоплатины, Мипроксифены, Мизонидазолы, Митиндомиды, Митокарцины, Митокромины, Митофлаксоны, Митогиллины, Митогуазоны, Митомалцины, Митонафиды, Митоквидоны, Митосперы, Митозоломиды, Мивобулины, Мизорибины, Мофаротены, Мопидамолы, Мубритинибы, Микофеноловые кислоты, Недаплатины, Нелзарабины, Неморубицины, Нитракрины, Нокодазолы, Ногаламицины, Нолатрекседы, Нортопиксантроны, Ормаплатины, Ортатакселы, Отерацилы, Оксисураны, Оксофенарсины, Патубилоны, Пелдезины, Пелиомицины, Пелитрексолы, Пеметрекседы, Пентамустины, Пепломицины, Перфосфамиды, Перифозины, Пикоплатины, Пинафиды, Пипосульфаны, Пирфенидоны, Пироксантроны, Пиксантроны, Плевитрекседы, Пломестаны, Порфиромицины, Преднимустины, Пропамидины, Проспидиумы, Пумитепы, Пуромицины, Пиразофурины, Ранимустины, Рибоприны, Ритросульфаны, Роглетимиды, Роквинимексы, Руфокромомицины, Сабарубицины, Сафинголы, Сатраплатины, Себриплатины, Семустины, Симтразены, Сизофираны, Собузоксаны, Сорафенибы, Спарфосаты, Спарфосовые кислоты, Спарсомицины, Спирогермании, Спиромустины, Спироплатины, Скваламины, Стрептонигрины, Стрептоварицины, Суфосфамиды, Сулофенуры, Тацединалины, Талисомицины, Таллимустины, Тариквидары, Тауромустины, Текогаланы, Тегафуры, Телоксантроны, Темопорфины, Тероксироны, Тиамиприны, Тиазофурины, Тиломизолы, Тилороны, Тимкодары, Тимонацики, Тирапазамины, Топиксантроны, Трабектедины, Эктеинасцидин 743, Трестолоны, Трицирибины, Трилостаны, Триметрексаты, Триплатина Тетранитраты, Трипторелины, Трофосфамиды, Тубулозолы, Убенимексы, Уредепы, Валсподары, Вапреотиды, Вертепорфины, Винбластины, Виндезины, Винепидины, Винфлунины, Винформиды, Винглицинаты, Винлейцинолы, Винлейрозины, Винросидины, Винтриптолы, Винзолидины, Ворозолы, Ксантомицины А, Гуамециклины, Зениплатины, Зиласкорбы [2-Н], Зиностатины, Зорубицины, Зосуквидары, Ацетазоламиды, Ацикловиры, Адипиодоны, Алатрофлоксацины, Алфентанилы, Аллергенные экстракты, ингибиторы альфа-1-протеиназы, Алпростадилы, Амикацины, Аминокислоты, Аминокапроновые кислоты, Аминофиллины, Амитриптилины, Амобарбиталы, Амриноны, Анальгетические средства, Антиполиомиелитные вакцины, Сыворотки против бешенства, Противостолбнячные иммуноглобулины, вакцины против столбняка, Антитромбины III, Противоядные сыворотки, Аргатробаны, Аргинины, Аскорбиновые кислоты, Атенололы, Атракурии, Атропины, Ауротиоглюкозы, Азатиоприны, Азтреонамы, Бацитрацины, Баклофены, Базиликсимабы, Бензойные кислоты, Бензтропины, Бетаметазоны, Биотины, Бивалирудины, Антитоксины ботулизма, Бретилии, Буметаниды, Бупивакаины, Бупренорфины, Буторфанолы, Кальцитонины, Кальцитриолы, Кальций, Капреомицины, Карбопросты, Карнитины, Цефамандолы, Цефоперазоны, Цефотаксимы, Цефокситины, Цефтизоксимы, Цефуроксимы, Хлорамфениколы, Хлорпрокаины, Хлорохины, Хлоротиазиды, Хлорпромазины, Хондроитинсерные кислоты, Хориогонадотропины Альфа, Хром, Цидофовиры, Цимецидины, Ципрофлоксацины, Цисатракурии, Клонидины, Кодеины, Колхицины, Колистины, Коллагены, Кортикорелина овечьего трифлутаты, Кортикотропины, Косинтропины, Цианокобаламины, Циклоспорины, Цистеины, Дакликсимабы, Далфопристины, Далтепарины, Данапароиды, Дантролены, Дефероксамины, Десмопрессины, Дексаметазоны, Дексмедетомидины, Декспантенолы, Декстраны, Декстраны железа, Диатризойные кислоты, Диазепамы, Диазоксиды, Дицикломины, Дигибинды, Дигоксины, Дигидроэрготамины, Дилтиаземы, Дифенгидрамины, Дипиридамолы, Добутамины, Допамины, Доксакурии, Доксапрамы, Доксеркальциферолы, Доксициклины, Дроперидолы, Дифиллины, Эдетовые (этилендиаминтетрауксусные) кислоты, Эдрофонии, Эналаприлаты, Эфедрины, Эпопростенолы, Эргокальциферолы, Эргоновины, Эртапенемы, Эритромицины, Эсмололы, Эстрадиолы, Эстрогенные средства, Этакриновые кислоты, Этаноламины, Этанолы, Этиодизированные масла, Этидроновые кислоты, Этомидаты, Факторы VIII, Фамотидины, Фенолдопамы, Фентанилы, Флумазенилы, Флуоресцеины, Флуфеназины, Фолиевые кислоты, Фомепизолы, Фомиверсены, Фондапаринуксы, Фоскарнеты, Фосфенитоины, Фуросемиды, Гадотеридолы, Гадоверсетамиды, Ганцикловиры, Гентамицины, Глюкагоны, Глюкозы, Глицины, Гликопирролаты, Гонадорелины, Хорионические Гонадотропины, Полисахариды Haemophylus B, Гемины, Лечебные средства из трав, Гистамины, Гидралазины, Гидрокортизоны, Гидроморфоны, Гидроксокобаламины, Гидроксизины, Гиосциамины, Ибутилиды, Имиглюцеразы, Индигокармины, Индометацины, Иодиды, Лопромиды, Иоталамовые кислоты, Локсагловые кислоты, Локсиланы, Изониазиды, Изопротеренолы, Вакцины Японского энцефалита, Канамицины, Кетамины, Лабеталолы, Лепирудины, Левобупивакаины, Левотироксины, Линкомицины, Лиотиронины, Лютеинизирующие гормоны, Вакцины против болезни Лайма, Мангафодипиры, Манниты, Менингококковые полисахаридные вакцины, Меперидины, Мепивакаины, Мезоридазины, Метараминолы, Метадоны, Метокарбамолы, Метогекситали, Метилдопаты, Метилэргоновины, Метоклопрамиды, Метопрололы, Метронидазолы, Миноциклины, Мивакурии, Морруевые кислоты (Morrhuic acids), Моксифлоксацины, Муромонабы-CD3, Микофенолат-мофетилы, Нафциллины, Налбуфины, Налмефены, Налоксоны, Неостигмины, Ниацинамиды, Никардипины, Нитроглицерины, Нитропруссиды, Норепинефрины, Орфенадрины, Оксациллины, Оксиморфоны, Окситетрациклины, Окситоцины, Панкуронии, Пантенолы, Пантотеновые кислоты, Папаверины, Пег-интерфероны Альфа-2А, Пенициллины G, Пентамидины, Пентазоцины, Пентобарбиталы, Перфлутрены, Перфеназины, Фенобарбиталы, Фентоламины, Фенилэфрины, Фенитоины, Физостигмины, Фитонадионы, Полимиксины b, Пралидоксимы, Прилокаины, Прокаинамиды, Прокаины, Прохлорперазины, Прогестероны, Пропранололы, Пиридостигмин-гидроксиды, Пиридоксины, Хинидины, Хинупристины, Иммуноглобины бешенства, Вакцины против бешенства, Ранитидины, Ремифентанилы, Рибофлавины, Рифампины, Ропивакаины, Самарии, Скополамины, Селены, Серморелины, Синкалиды, Соматремы, Спектиномицины, Стрептокиназы, Стрептомицины, Сукцинилхолины, Суфентанилы, Сульфаметоксазолы, Такролимусс, Тербуталины, Терипаратиды, Тестостероны, Антитоксины столбняка, Тетракаины, Тетрадецилсульфаты, Теофиллины, Тиамины, Тиэтилперазины, Тиопентали, Тиреоидстимулирующие гормоны, Тинзапарины, Тирофибаны, Тобрамицины, Толазолины, Толбутамиды, Торсемиды, Транексамовые кислоты, Трепростинилы, Трифлуоперазины, Триметобензамиды, Триметопримы, Трометамины, Туберкулины, Тифоидные вакцины, Урофоллитропины, Урокиназы, Валпроевые кислоты, Вазопрессины, Векуронии, Верапамилы, Вориконазолы, Варфарины, Вакцины желтой лихорадки, Зидовудины, Цинки, гидрохлориды Зипрасидона, Аклациномицины, Актиномицины, Адриамицины, Азасерины, 6-Азауридины, Карзинофилины, Хромомицины, Деноптерины, 6-Диазо-5-Оксо-L-Норлейцины, Эноцитабины, Локсуридины, Оливомицины, Пирарубицины, Пиритрексимы, Птероптерины, Тагафуры, Туберцидины, Альтеплазы, Арцитумомабы, бевацизумабы, Токсины типа A Botulinum, Токсины типа В Botulinum, Капромаб-пендетиды, Даклизумабы, Дорназы Альфа, Дротрекогины Альфа, Имциромаб-Пентетаты и иод-131.
54. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармацевтически эффективный агент представляет собой иммуноглобулин.
55. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармацевтически эффективный агент выбран из Интерферона Бета, Интерферонов Альфа-2а, Интерферонов Альфакон-1, Интерферонов Альфа-n3, Интерферонов Бета-1, Интерферонов Бета-1а, Интерферонов Гамма-1b, Пег-Интерферонов Альфа-2, Пег-Интерферонов Альфа-2b.
56. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой Памидронат или Золедронат.
57. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой инсулин, который выбран из HUMALOGд, HUMALOGд MIX 75/25д, продуктов HUMULINд (50/50, 70/30, Regular, NPH, Ultra и Ultralente), и NOVOLINд, Инсулин-Гларгинов (например, LANTUSд).
58. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармакологически эффективный агент выбран из Доцетакселов, Доксорубицинов, Доксорубицинов липосомальных и бевацизумабов.
59. Комбинация, содержащая:
(a) растворимый нейтрально-активный полипептид гиалуронидазы (sHASEGP); и
(b) модификатор крови.
60. Комбинация по п.59, в которой модификатор крови выбран из следующих: антигемофильные факторы, антиингибитор-коагулент-комплексы, антитромбины III, Факторы коагуляции VII, Факторы коагуляции VIII, Факторы коагуляции IX, фракции белков плазмы, факторы фон Виллебранда; антитромбоцитарные агенты (в том числе, например, абциксимабы, анагрелиды, цилостазолы, клопидогрела бисульфаты, дипиридамолы, эпопростенолы, эптифибатиды, тирофибаны; колониестимулирующие факторы (CSF) (в том числе, например, гранулоцитарные CSF и гранулоцитарно-макрафагальные CSF); стимуляторы эритропоэза (в том числе, например, эритропоэтины), такие как дарбепоэтины альфа (и эпоэтины альфа); гемостатики и альбумины (в том числе, например, апротинины), комбинации антигемофильных факторов и плазмы, Десмопрессина ацетаты и альбумины; иммуноглобулины, а также иммуноглобулины гепатита В; ингибиторы тромбина (в том числе, например, прямые ингибиторы тромбина и лепирудин и дротекогины альфа; антикоагулянты (в том числе, например, далтепарины, эноксаперины и другие гепарины и варфарины).
61. Комбинация, содержащая:
(a) растворимый нейтрально-активный полипептид гиалуронидазы (sHASEGP); и
(b) фармакологический или фармацевтически эффективный агент, выбранный из следующих: антибиотический агент, ингибитор ангиогенеза, вещества против катаракты и диабетической ретинопатии, ингибиторы карбоангидразы, мидриатики, агенты фотодинамической терапии, аналоги простагландина, фактор роста, противоопухолевые агенты, антиметаболиты, антивирусные агенты, амебоцидные и антипаразитарные агенты, противотуберкулезные и противолепрозные средства, антитоксины и антивенины, иммуномодуляторный агент, стероидные противовоспалительные агенты, Дукосаноиды, простагландины, аналоги простагландинов, антипростагландины и предшественники простагландинов, миотические агенты, холинергические агенты и антихолинэстеразы, противоаллергические агенты и комбинация агентов.
62. Комбинация по любому из пп.53-61, где sHASEGP содержит последовательность аминокислотных остатков, имеющую последовательность, включенную в SEQ ID NO:1, или последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 91% идентичность аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, включенной в SEQ ID NO:1.
63. Комбинация по п.62, где sHASEGP кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 1-482 SEQ ID NO:1, или которая кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 36-482 SEQ ID NO:1.
64. Комбинация по п.63, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:48.
65. Комбинация по п.62, где sHASEGP включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:1, которая усечена по аминокислотному остатку, который является аминокислотным остатком 477 или 483 или находится между ними.
66. Комбинация по п.65, где sHASEGP имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-477, 36-477, 1-478, 36-478, 1-479, 36-479, 1-480, 36-480, 1-481, 36-481, 1-482, 36-482, 1-483 или 36-483 SEQ ID NO:1.
67. Комбинация по п.66, где sHASEGP секретируется в клетки CHO.
68. Комбинация по п.62, где sHASEGP имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-482 SEQ ID NO:1.
69. Комбинация по п.62, где sHASEGP имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 36-482 SEQ ID NO:1.
70. Комбинация по любому из пп.53-69, где гликозаминогликаназа модифицирована полимером.
71. Комбинация по п.70, где полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
72. Способ лечения опухоли, включающий введение субъекту ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26.
Текст
011654 Перекрестная ссылка на родственные заявки Заявка на данный патент является частичным продолжением заявки США с регистрационным номером 11/238171, поданной 27 сентября 2005 г., которая является частичным продолжением заявки США с регистрационным номером 11/065716, поданной 23 февраля 2005 г., каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в ее полном объеме. Уровень техники Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение главным образом относится к гликозаминогликаназным ферментам, включающим в себя нейтрально-активные, растворимые гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP) и их части, в частности, домены гиалуронидазы. Более конкретно, это изобретение относится к химическим модификациям, фармацевтическим композициям, экспрессионным плазмидам, способам получения и терапевтическим способам, использующим гликозамингликаназы (и их домены и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот) для терапевтической модификации гликозаминогликанов, в лечении заболевания и для применения для увеличения диффузии других молекул, например инъецируемых молекул, у животных. Информация предыдущего уровня техники Гликозаминогликаны (GAG) являются сложными линейными полисахаридами внеклеточного матрикса (ECM). GAG характеризуются повторяющимися дисахаридными структурами N-замещенного гексозамина и уроновой кислоты (в случае гиалуронана (НА), хондроитинсульфата (CS), хондроитина (С),дерматансульфата (DS), гепарансульфата (HS) и гепарина (H или галактозы (в случае кератансульфата(KS. За исключением НА, все существуют ковалентно связанными с сердцевинным белком (кором).GAG с их сердцевинными белками структурно относятся к протеогликанам (PG). Гиалуронан (НА) обнаруживается у млекопитающих преимущественно в соединительных тканях,коже, хряще и синовиальной жидкости. Гиалуронан является также основным компонентом стекловидного тела глаза. В соединительной ткани вода гидратации, ассоциированная с гиалуронаном, создает гидратированные матриксы между тканями. Гиалуронан играет ключевую роль в биологических явлениях, ассоциированных с подвижностью клеток, включающих в себя быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбриологическое развитие, заживление ран, ангиогенез и онкогенез (Toole 1991Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al., 1993 FASEB J. 7:1233-1241). Кроме того, уровни гиалуронана коррелируют с агрессивностью опухоли (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:21332139; Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354). НА обнаружен во внеклеточном матриксе многих клеток, особенно в мягких соединительных тканях. НА приписывали различные физиологические функции, такие как гомеостаз воды и белка плазмы(Laurent T.C. et al. (1992) FASEB J 6:2397-2404). Продуцирование НА увеличивается в пролиферирующих клетках и может играть роль в митозе. Предполагается также его участие в передвижении и миграции клеток. НА, по-видимому, играет важную роль в регуляции, развитии и дифференцировке клеток(Laurent et al., выше). НА использовали в клинической медицине. Его тканезащитные и реологические свойства оказались применимыми в офтальмической хирургии (например, для защиты роговичного эндотелия во время операции катаракты). Сывороточный НА является диагностическим для заболеваний печени и различных воспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит. Интерстициальный отек, вызванный накоплением НА, может вызывать дисфункцию в различных органах (Laurent et al. выше). Взаимодействия гиалуронан-белок также участвуют в структуре внеклеточного матрикса или основного (промежуточного) вещества. Гиалуронидазы являются группой обычно нейтрально- или кислотно-активных ферментов, обнаруживаемых во всем царстве животных. Гиалуронидазы варьируются в отношении субстратной специфичности и механизма действия. Существует три основных класса гиалуронидаз. 1. Гиалуронидазы типа ферментов млекопитающих (ЕС 3.2.1.35), которые являются эндо-бета-Nацетилгексозаминидазами с тетрасахаридами и гексасахаридами в качестве основных конечных продуктов. Они имеют и гидролитические, и трансгликозидазные активности и могут расщеплять гиалуронан и хондроитинсульфаты (CS), обычно C4-S и C6-S. 2. Бактериальные гиалуронидазы (ЕС 4.2.99.1) расщепляют гиалуронан и, в различной степени, CS и DS. Они являются эндо-бета-N-ацетилгексозаминидазами, которые действуют посредством реакции бета-элиминирования, которая прежде всего дает дисахаридные конечные продукты. 3. Гиалуронидазы (ЕС 3.2.1.36) из пиявок, других паразитов и ракообразных являются эндо-бетаглюкуронидазами, которые генерируют тетрасахаридные и гексасахаридные конечные продукты посредством гидролиза бета-1-3-связи. Гиалуронидазы млекопитающих могут быть дополнительно подразделены на две группы: нейтрально-активные и кислотно-активные. Существует шесть гиалуронидаза-подобных генов в геноме человека, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 и PH20/SPAM. HYALP является псевдогеном, и не было показано, что HYAL3 обладал активностью в отношении каких-либо известных субстратов.HYAL4 является хондроитиназой и проявляет небольшую активность в отношении гиалуронана. HYAL4 является прототипом кислотно-активного фермента, а РН 20 является прототипом нейтрально-активного фермента. Кислотно-активные гиалуронидазы, такие как HYAL1 и HYAL2, обычно не имеют каталитической активности при нейтральном pH (т.е. pH 7). Например, HYAL1 имеет небольшую каталитическую активность in vitro при pH, более высоком чем 4,5 (Frost et al. Anal Biochemistry, 1997). HYAL2 является кислотно-активным ферментом с очень низкой удельной активностью in vitro. Гиалуронидаза-подобные ферменты могут быть также охарактеризованы как ферменты, которые обычно присоединены к плазматической мембране через гликозилфосфатидилинозитольный якорь, такие как HYAL2 человека и РН 20 человека (Danilkovitch-Miagkova et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Апрель 15; 100(8):4580-5, Phelps et al., Science 1988), и ферменты, которые являются обычно растворимыми, такие как HYAL1 человека (Frost et al., Biochem Biophys Res Commun. 1997 Июль 9; 236(1):10-5). Однако имеются вариации от вида к виду: например, бычий фермент РН 20 очень свободно присоединен к плазматической мембране и не закреплен посредством чувствительного к фосфолипазе якоря (Lalancette etal., Biol Reprod. 2001 август; 65(2):628-36). Этот уникальный признак бычьей гиалуронидазы сделал возможным использование этого растворимого фермента гиалуронидазы бычьих яичек в виде экстракта для клинического применения (Widase, Hyalase). Другими разновидностями РН 20 являются липидные заякоренные ферменты, которые являются обычно нерастворимыми без использования детергентов или липаз. Например, РН 20 человека прикреплен к плазматической мембране через GPI-якорь. Попытки получения ДНК-конструкций РН 20 человека, которые не вводили липидный якорь в этот полипептид, приводили либо к каталитически неактивному ферменту, либо к нерастворимому ферменту (Arming et al. EurJ Biochem. 1997 Август 1; 247 (3):810-4). Природная гиалуронидаза спермы макаки обнаружена как в растворимой форме, так и в мембраносвязанной форме. Хотя мембраносвязанная форма 64 кДа обладает ферментативной активностью при pH 7,0, форма 54 кДа активна только при pH 4,0 (Cherr et al., Dev Biol. 1996 Apr 10; 175 (1): 142-53). Таким образом, растворимые формы РН 20 часто не имеют ферментативной активности при нейтральных условиях. Хондроитиназы являются ферментами, обнаруживаемыми во всем царстве животных. Эти ферменты расщепляют гликозаминогликаны посредством эндогликозидазной реакции. Конкретные примеры известных хондроитиназ включают хондроитиназу ABC (полученную из Proteus vulgaris; опубликованная заявка на патент Японии 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, О. Habuchi, and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,243, 1523 (1968), S. Sizuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, and T. Furuhashi, J. Biol.(1985; Хондроитиназу С (полученную из Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi,Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, и Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989 и т.п. Гликопротеины состоят из полипептидной цепи, ковалентно связанной с одной или несколькими углеводными группами. Существуют две обширных категории гликопротеинов, которые имеют углеводы, связанные через N-гликозидные или О-гликозидные связи с их компонентом-белком. Эти N- и Освязанные гликаны присоединены к полипептидам через аспарагин-N-ацетил-D-глюкозамин и серин(треонин)-N-ацетил-D-галактозамин в качестве связей, соответственно. Сложные N-связанные олигосахариды не содержат концевых маннозных остатков. Они содержат только концевые Nацетилглюкозаминовые, галактозные остатки и/или остатки сиаловой кислоты. Гибридные олигосахариды содержат концевые маннозные остатки также как и N-ацетилглюкозаминовые, галактозные остатки и/или остатки сиаловой кислоты. В случае N-связанных гликопротеинов, олигосахаридный предшественник присоединяется к аминогруппе аспарагина во время пептидного синтеза в эндоплазматическом ретикулуме (эндоплазматической сети). Затем эта олигосахаридная часть молекулы последовательно процессируется рядом специфических ферментов, которые делетируют и добавляют сахарные части. Этот процессинг происходит в эндоплазматическом ретикулуме и продолжается с прохождением через цис-, медиальный и транс-аппарат Гольджи. Сущность изобретения Здесь обеспечены растворимые гликозаминогликаназные ферменты, в частности, члены семейства растворимых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы (также называемых здесь sHASEGP),причем предпочтительными членами являются растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы человека, в частности, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека (также называемые здесь rHuPH20). Каждая из растворимых нейтрально активных гиалуронидаз, обеспеченная здесь, является членом семейства sHASEGP, обозначаемым здесь как sHASEGP. Обеспечены также рас-2 011654 творимый домен гиалуронидазы и его применения. Хотя ряд применений и приложений растворимых гликозаминогликаназ (иногда называемых ферментами GAG) проиллюстрированы здесь с использованием rHuPH20 в качестве примера гликозаминогликаназы (например, в стимуляции доставки фармакологических веществ и других агентов в тканях тела млекопитающего), специалистам в данной области будет понятно, что и другие гликозаминогликаназы, такие как описанные здесь, или другие, известные в данной области, могут применяться в ряде таких приложений. Предпочтительные в настоящее время растворимые гликозаминогликаназы, такие как sHASEGP, проявляют некоторую гиалуронидазную активность и могут также проявлять другие гликозаминогликаназные активности. Растворимые гликозаминогликаназы человека являются в настоящее время предпочтительными для приложений, в которых этот фермент должен быть применен в теле человека, в том числе во многих медицинских приложениях, описанных и проиллюстрированных здесь. Один аспект этого изобретения основан на открытии того, что растворимая нейтрально-активная гиалуронидазная активность может быть продуцирована с высоким выходом в экспрессионной системе млекопитающего введением нуклеиновых кислот, которые лишены узкого района, кодирующего аминокислоты в карбоксиконце кДНК РН 20 человека. Обеспечены также дополнительные модификации SHAiSEGP для усиления секреции с использованием неприродных лидерных пептидов. Кроме того, обеспечены способы для модификации sHASEGP для пролонгирования полупериода существования этого фермента посредством маскирования этого белка полиэтиленгликолем (ПЭГ) и/или посттрансляционными модификациями природного гликозилирования. Предшествующие попытки генерирования растворимых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы человека не принесли успеха. Был сделан вывод,что укорочения полипептида гиалуронидазы человека приводили как к потере нейтральной ферментативной активности, так и к неспособности клеток секретировать этот рекомбинантный белок в системах экспрессии млекопитающих (Arming, et al. Eur J Biochem 1997 Aug 1; 247 (3):810-4). Крайне важным является генерирование нейтрально-действующего (действующего при нейтральном pH) секретируемогоsHASEGP для коммерческого производства и терапевтического использования в качестве гиалуронидазы. Описанное здесь изобретение решает эти и другие задачи. Кроме того, это изобретение относится к каталитически активному гликопротеину sHASEGP человека, причем этот sHASEGP имеет по меньшей мере одну N-связанную сахарную часть. Приведенные здесь исследования демонстрируют, что РН 20 человека требует N-связанных гликанов для каталитической активности, в то время как гиалуронидазы быка и пчелиного яда остаются активными без таких Nсвязанных гликанов. Домен гиалуронидазы РН 20 человека, лишенный N-связанных частей, является каталитически неактивным. Таким образом, классическая технология рекомбинантных ДНК не позволяет получать каталитически активный sHASEGP человека, в отличие от гиалуронидазы пчелиного яда, которая может продуцироваться в E. coli. Это изобретение включает способы и клетки для генерирования N-связанного полипептида гликопротеина sHASEGP с использованием клетки, способной вводить N-связанные сахарные части, или введением указанных N-связанных частей на полипептид sHASEGP. Кроме того, описаны способы идентификации правильно гликозилированных sHASEGP. Обеспечены также каталитически активные ПЭГилированные и/или сверхсиалированные гликопротеины sHASEGP. ПЭГилированные и/или сверхсиалированные sHASEGP имеют более высокие полупериоды существования в сыворотке в сравнении с природными несиалированными sHASEGP бычьих и овечьих яичек, и являются, следовательно, предпочтительными в отношении как ферментативной стабильности, так и применения в качестве лекарственных средств или адъювантов в обстоятельствах, в которых желательными являются пролонгированные полупериоды существования (например, как это обычно имеет место в случае внутривенной доставки). Это изобретение обеспечивает способы получения ПЭГилированных и/или сверхсиалированных sHASEGP, их композиции и применения. Без ограничения конкретными приложением или механизмом действия, обычно предполагается, что присоединение ПЭГчастей к sHASEGP и другим гликозаминогликаназам может быть использовано для эффективной защиты этих молекул, уменьшения их относительной чувствительности к протеазам и потенциально также уменьшения степени и скорости их клиренса и элиминирования из тела. Применение этих принципов и способов к другим гликозаминогликаназам, ПЭГилированным, сверхсиалированным и/или другим образом модифицированным версиям таких других гликозаминогликаназ может быть получено таким же образом и использовано в контексте описанных и проиллюстрированных здесь методов и способов (например, способов усиления диспергирования (распределения) фармакологических веществ и других агентов в тканях тела). Обеспечены также белки, кодируемые сплайсинговыми вариантами, природно дефектными в отношении GPI-якоря sHASEGP. Кроме того, обеспечены композиции sHASEGP, содержащие растворимый гликопротеин sHASEGP с ионом металла, где ионом металла являются кальций, магний или натрий. Обычно sHASEGP являются оптимально активными в присутствии указанных металлов. Обеспечены также препараты, состоящие изsHASEGP в присутствии указанных ионов металлов. Обеспечены модификации sHASEGP и других гликозаминогликаназ для дополнительного пролон-3 011654 гирования их полупериодов существования. Обеспечены химические модификации sHASEGP и других гликозаминогликаназ с полимерами, такими как полиэтиленгликоль и декстран. Такие модификации защищают (экранируют) sHASEGP и другие гликозаминогликаназы от удаления из кровотока и иммунной системы, а также от рецепторов гликозилирования для маннозы и асиалогликопротеина. Кроме того,обеспечены способы связывания со специфическими функциональными группами, такими как сайты гликозилирования, положительно заряженные аминокислоты и цистеины. Здесь обеспечены также анализы для идентификации эффекторов, таких как соединения, в том числе малые молекулы, и условий, например, pH, температуры и ионной силы, которые модулируют активацию, экспрессию или активность sHASEGP. B примерах анализов оцениваются эффекты тестируемых соединений на способность домена гиалуронидазы sHASEGP расщеплять известный субстрат, обычно гликозаминогликан или протеогликан. Агенты, обычно соединения, в частности, малые молекулы, которые модулируют активность домена гиалуронидазы, являются кандидатными соединениями для модуляции активности sHASEGP. Домены гиалуронидазы могут быть также использованы для получения гиалуронидаза-специфических антител с нарушающей функцию активностью. Обеспеченные здесь домены гиалуронидазы включают в себя, но не ограничиваются ими, N-концевой гликозилгидролазный домен с С-концевыми укороченными частями этого домена, который проявляет каталитическую активность invitro. Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки и домены гиалуронидазы. Обеспечены молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют растворимый домен гиалуронидазы или его каталитически активные части, а также молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полноразмерный sHASEGP. Нуклеиновая кислота, кодирующая примерный домен гиалуронидазы и расположенную далее по ходу транскрипции нуклеиновую кислоту, представлена в SEQ ID NO:6; а домен гиалуронидазы примерного sHASEGP представлен в SEQ ID NO:1 (аминокислоты 35-464). Последовательность белка и кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты примерного полноразмерного sHASEGP представлены в SEQ ID NO:1 и 6. Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с такой нуклеиновой кислотой sHASEGP вдоль их полной длины или вдоль по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% полной длины и кодируют домен гиалуронидазы или его часть. Гибридизацию обычно выполняют в условиях, по меньшей мере, низкой, обычно, по меньшей мере, умеренной и часто высокой жесткости. Выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты является ДНК, включающая в себя геномную ДНК или кДНК либо РНК, или он может включать в себя другие компоненты, такие как протеиннуклеиновая кислота или другие нуклеотидные аналоги. Эта выделенная нуклеиновая кислота может включать в себя дополнительные компоненты, такие как гетерологичные или природные промоторы, энхансеры и другие регуляторные последовательности транскрипции и трансляции, эти гены могут быть связаны с другими генами, такими как репортерные гены или другие индикаторные гены или гены, которые кодируют индикаторы. Обеспечена также выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает в себя последовательность молекул, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующейsHASEGP или его часть. Обеспечены также ее фрагменты или олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в качестве зондов или праймеров и которые содержат по меньшей мере приблизительно 10-16 нуклеотидов,обычно по меньшей мере 20 нуклеотидов и обычно менее чем 1000, обычно менее чем приблизительно 100 нуклеотидов, представленных в SEQ ID NO:6 (или ее комплементе); или содержат по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов (или их комплемент) или содержат олигонуклеотиды, которые гибридизуются вдоль их цепи (или по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% цепи) с любыми такими фрагментами или олигонуклеотидами. Длина этих фрагментов зависит от функции, для которой их используют, и/или от сложности представляющего интерес генома. Обычно зонды и праймеры содержат меньше чем приблизительно 50, 150 или 500 нуклеотидов. Обеспечены также плазмиды, содержащие любую из молекул нуклеиновых кислот, обеспеченных здесь. Обеспечены также клетки, содержащие эти плазмиды. Такие клетки включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки животных. Обеспечены также усиленные экспрессионные системы млекопитающих, использующие сигнальные лидеры, способные к эффективной секреции sHASEGP. Пример аминокислотной последовательности такого эффективного секреторного лидерного пептида и слитого белка с sHASEGP можно найти вSEQ ID NO:43 и 46. Обеспечен также способ получения sHASEGP выращиванием вышеуказанных клеток в условиях,посредством которых sHASEGP экспрессируется этими клетками, и выделение экспрессированного полипептида или гликопротеина sHASEGP. Способы выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей другие sHASEGP, также обеспечены. Обеспечены также клетки, обычно эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих или дрожжевые клетки, в которых полипептид sHASEGP экспрессируется на поверхности этих клеток. Такие-4 011654 клетки могут быть использованы в анализах скрининга лекарственных средств для идентификации соединений, которые модулируют активность полипептида, sHASEGP. Эти анализы включают в себя анализы связывания in vitro и анализы на основе транскрипции, в которых оценивается трансдукция сигнала, опосредованная прямо или косвенно, например, посредством активации профакторов роста, полипептидом sHASEGP. Обеспечены также пептиды, кодируемые такими молекулами нуклеиновых кислот. Среди этих полипептидов включены домен гиалуронидазы или полипептид sHASEGP с аминокислотными заменами,которые по существу не изменяют специфичность и/или активность гиалуронидазы. В частности, обеспечен по существу очищенный гликопротеин sHASEGP, который содержит секретируемый нейтральноактивный фермент. Данное изобретение относится также к каталитическому домену гиалуронидазы и может дополнительно включать другие домены. sHASEGP может образовывать гомодимеры и может также образовывать гетеродимеры с некоторым другим белком, таким как мембраносвязанный белок. Обеспечен также по существу очищенный гликопротеин, включающий последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности относительно примерного sHASEGP, где процентную идентичность определяют с использованием стандартных алгоритмов и штрафов за пропуск, которые максимизируют процентную идентичность. Здесь рассматриваются также сплайсинговые варианты sHASEGP, в частности, сплайсинговые варианты с каталитически активными доменами гиалуронидазы. В других вариантах осуществления обеспечены по существу очищенные полипептиды, которые включают в себя домен гиалуронидазы полипептида sHASEGP или его каталитически активную часть,но не включают в себя полную последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:1. Среди этих полипептидов находятся полипептиды, которые включают в себя последовательность аминокислот,которая имеет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичность с SEQ ID NO:1 или 3. В конкретном варианте осуществления обеспечена нуклеиновая кислота, которая кодирует эукариотический гликопротеин гиалуронидазы, названный эукариотическим sHASEGP. В частности, эта нуклеиновая кислота включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:6,в частности представленную в виде нуклеотидов 106-1446 SEQ ID NO:6, или ее часть, которая кодирует каталитически активный полипептид. Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в условиях, по меньшей мере, низкой жесткости, обычно умеренной жесткости, более часто высокой жесткости с SEQ ID NO:6 или ее вырожденными последовательностями. В одном варианте осуществления выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQsHASEGP представлен в SEQ ID NO:1 и кодируется последовательностью SEQ ID NO:6 или ее вырожденными последовательностями. Обеспечены также мутеины домена гиалуронидазы sHASEGP, в частности, мутеины, в которых один или несколько остатков Cys в домене гиалуронидазы, которые являются свободными (т.е. не образуют дисульфидных связей с любым другим остатком Cys в домене гиалуронидазы), заменены другой аминокислотой, обычно (хотя и необязательно), консервативной аминокислотной заменой или заменой,которая не элиминирует активность, и мутеины, в которых элиминирован специфический сайт гликозилирования. Здесь обеспечены полипептиды sHASEGP, в том числе, но не только, их сплайсинговые варианты,и нуклеиновые кислоты, кодирующие sHASEGP, и их домены, производные и аналоги. Обеспечены также одноцепочечные секретируемые гликопротеины гиалуронидазы, которые имеют N-конец, функционально эквивалентный N-концу, генерируемому активацией сигнальной пептидазы с образованием sHASEGP. Имеются семь потенциальных сайтов N-связанного гликозилирования в N82, N166, N235, N254,N368, N393, N490 sHASEGP PH20 человека, приведенного в качестве примера в SEQ ID NO:1. Дисульфидные связи образуются между остатками Cys C60-C351 и остатками Cys C224-C238 с образованием сердцевинного домена гиалуронидазы. Однако требуются дополнительные цистеины на карбоксиконце для каталитической активности нейтрального фермента, так что домен sHASEGP от аминокислоты 36 доCys 464 в SEQ ID NO:1 содержит минимально активный домен гиалуронидазы sHASEGP PH20 человека. Таким образом, N-связанный сайт гликозилирования N-490 не требуется для правильной активностиsHASEGP. Как будет понятно специалистам в данной области, минорные изменения могут быть произведены в отношении таких композиций, которые описаны и проиллюстрированы здесь, без существенного элиминирования или в некоторых случаях без существенного уменьшения (или потенциально даже с улучшением) их полезной активности, и, следовательно, они могут быть сходным образом использованы в различных описанных здесь приложениях.N-связанное гликозилирование некоторых sHASEGP (таких как sHASEGP, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1), может быть очень важным для их каталитической активности-5 011654 и стабильности. Хотя изменение типа гликана, модифицирующего гликопротеин, может в значительной степени влиять на антигенность, структурную укладку, растворимость и стабильность белка, считается,что большинство ферментов не требуют гликозилирования для оптимальной активности фермента. Таким образом, sHASEGP являются уникальными в этом отношении, в связи с тем, что удаление Nсвязанного гликозилирования может приводить к почти полной инактивации гиалуронидазной активности. Для таких sHASEGP присутствие N-связанных гликанов является решающим в отношении генерирования активного фермента. В изобретение включены системы экспрессии белков, пригодные для введения необходимых N-связанных остатков гликозилирования на sHASEGP. Кроме того, в данное изобретение включено введение дегликозилированного полипептида sHASEGP в присутствии экстрактов, способных к введению N-связанных гликанов. В одном аспекте этого изобретения описано комплексное гликозилирование, кэппированное (заканчивающееся) сиалированием, в то время как обсуждаются также другие, кэппированные свободными остатками маннозы. Предпочтительно, остатки сиаловой кислоты обнаруживаются в концевых остатках N-связанного гликозилирования на sHASEGP.N-связанные олигосахариды подразделяются на несколько основных групп (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфатированные), все из которых имеют (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-кора, присоединенные через амидный азот к остаткам Asn, которые находятся в последовательностях -Asn-XaaThr/Ser (где Хаа не является Pro). Гликозилирование в сайте -Asn-Xaa-Cys сообщалось для белка С коагуляции. N-связанные сайты часто непосредственно связывают с появлением холостого цикла во время секвенирования. Положительная идентификация может быть выполнена после высвобождения этого олигосахарида ферментом PNGase F, который превращает гликозилированный Asn в Asp. После высвобождения ферментом PGNазой F N-связанный олигосахарид может быть очищен, например, с использованием Bio-Gel P-6-хроматографии, причем олигосахаридный пул подвергают препаративной анионообменной хроматографии при высоком pH (HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Некоторые олигосахаридные изомеры могут быть разделены с использованием HPAEC. Остатки фукозы будут смещать положения элюции в более ранние положения на хроматограмме HPAEC, тогда как дополнительные остатки сиаловой кислоты будут увеличивать время удерживания. Одновременная обработка гликопротеинов, олигосахаридные структуры которых являются известными (например, бычьего фетуина, кислотного гликопротеина а-1, овальбумина, РНКазы В, трансферрина), могут облегчать отнесение олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды могут быть охарактеризованы комбинацией анализов состава и метилирующих связей (Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304) с аномерными конфигурациями, приписываемыми ЯМР-спектроскопией (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230). В случае некоторых sHASEGP, примером которых является sHASEGP человека rHuPH20, описанный здесь, sHASEGP может содержать как N-гликозидные, так и О-гликозидные связи. Например, было обнаружено, что rHuPH20 (продуцируемый в линии 3D3 CHO DG44, как описано в примерах ниже) имеет О-связанные олигосахариды, а также N-связанные олигосахариды. Гликозидные модификации такихsHASEGP (например, модификации, содержащие одно или несколько добавлений, удалений или изменений таких N-связанных и/или О-связанных олигосахаридов) могут быть использованы для генерирования гликозидных вариантных sHASEGP, проявляющих измененные фармакокинетические и/или фармакодинамические профили, которые делают их желаемыми для конкретных приложений. В качестве иллюстрации, но без ограничения конкретным механизмом действия, удалением или изменением (например, посредством кэппирования или деэкспонирования другим образом), один или несколько Nсвязанных и/или О-связанных олигосахаридов, которые участвуют в связывании с клеточными или другими рецепторами, могут быть использованы для изменения степени и/или скорости, с которыми sHASEGP связывается или поглощается конкретной тканью, что, в свою очередь, может быть использовано,например, для изменения его фармакокинетического профиля (например, увеличением его полупериода существования в сыворотке или другим изменением его биоабсорбции). Обеспечены также готовые формы sHASEGP. sHASEGP может быть приготовлен, например, в лиофилизированных формах и стабилизированных растворах. Готовые формы, содержащие специфические ионы металлов, таких как кальций, магний или натрий, применимы для оптимальной активности при нейтральном pH. Наряду с формами стабилизированных растворов, формы замедленного высвобождения рассматриваются здесь для пролонгированного удаления гликозаминогликанов или пролонгированного стимулирования распределения или диффузии таких агентов, как фармакологические вещества. Здесь обеспечены также наборы, обеспечивающие предварительно упакованные шприцы sHASEGP для введения малых объемов sHASEGP для внутриглазных хирургических процедур и других использующих малые объемы процедур. Обеспечены также сбалансированные солевые формы для использования exvivo в процедурах искусственных репродуктивных технологий. Обеспечены также способы применения гликозаминогликаназ, в том числе sHASEGP, в удалении гликозаминогликанов. Гликозаминогликаназы, включающие в себя sHASEGP, открывают каналы в интерстициальном пространстве посредством расщепления гликозаминогликанов, которые обычно делают возможной диффузию молекул с размером, меньшим чем приблизительно 500 нм. Эти каналы могут оставаться открытыми в течение периода 24-48 ч в зависимости от дозы и формы композиции. Такие каналы могут быть использованы для облегчения диффузии экзогенно введенных молекул, таких как жидко-6 011654 сти, малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты и векторы генотерапии и другие молекулы с размером, меньшим чем приблизительно 500 нм. Кроме того, без ограничения конкретной теорией или механизмом действия, авторы считают, что образование таких каналов может облегчать протекание общей жидкости в интерстициальном пространстве, что может, в свою очередь, стимулировать диспергирование или передвижение растворенного вещества (такого как детектируемая молекула или другой диагностический агент, анестезирующий или другой модифицирующий ткань агент, фармакологический или фармацевтически активный агент или косметический или другой эстетический агент), который эффективно переносится этой жидкостью в процессе, называемом иногда здесь конвективным транспортом или просто конвекцией. Такой конвективный транспорт может существенно повышать скорость и кумулятивные эффекты молекулярной диффузии и, следовательно, может заставлять терапевтическую или другую введенную молекулу более быстро и эффективно перфузировать ткань. Кроме того, когда такую молекулу, как терапевтический или другой агент (например, лекарственное средство с малой молекулой или более крупную молекулу или комплекс) готовят вместе или вводят вместе с sHASEGP (или другой гликозаминогликаназой) и обе инъецируют в относительно ограниченный локальный сайт, такой как сайт невнутривенного парентерального введения (например, интрадермального, подкожного, внутримышечного введения, или во внутренние ткани, органы или другие относительно ограниченные пространства в теле или вблизи от них), то жидкость, связанная с вводимой дозой, может обеспечивать как локальную движущую силу (т.е. гидростатическое давление), так и более низкое полное сопротивление(импеданс) потоку (посредством открывания каналов в интерстициальном матриксе), - оба из которых имеют тенденцию увеличения потока жидкости, а вместе с ней и конвективного транспорта терапевтического агента или другой молекулы, содержащейся в этой жидкости. Как обсуждалось и иллюстрировалось более подробно здесь, и как будет понятно специалистам в данной области, эти аспекты использования sHASEGP и других гликозаминогликаназ могут иметь существенную применимость для улучшения биодоступности, а также манипулирования другими фармакокинетическими и/или фармакодинамическими характеристиками совместно приготовленных или совместно вводимых агентов.sHASEGP и другие гликозаминогликаназы могут быть также использованы для удаления избыточных гликозаминогликанов, таких как избыточные гликозаминогликаны, которые имеют место после ишемической реперфузии, при воспалении, артериосклерозе, эдеме, раке, повреждении спинного мозга и других формах образования рубцов. В некоторых случаях, sHASEGP и другие гликозаминогликаназы могут доставляться системно внутривенной инфузией. Это может быть полезным, когда локальный доступ не является легко доступным, например, в случае сердца или головного мозга или в случае диссеминированной неоплазмы, при которой заболевание рассеяно по всему телу. Для таких внутривенных или других внутрисосудистых приложений часто являются предпочтительными сверхсиалированные sHASEGP для увеличения полупериода существования в сыворотке и распределения, превосходящего нативные гиалуронидазные ферменты, которые не имеют концевых сиаловых кислот. В некоторых обстоятельствах, таких как повреждение спинного мозга и другие нарушения нервной системы, глаукома и некоторые другие нарушения глаза, а также аутоиммунные, воспалительные состояния, раковые заболевания и другие хронически прогрессирующие заболевания и состояния, и косметические лечения, предпочтительной является пролонгированная доставка. Как будет понятно специалистам в данной области, ряд различных композиций и способов были разработаны для обеспечения готовых форм замедленного высвобождения или поддерживаемого высвобождения или депо представляющих интерес молекул. В случае других показаний предпочтительной является единственная действующая в течение короткого времени доза. Временное удаление гликозаминогликанов может быть использовано для усиления доставки растворов и лекарственных средств в и/или через интерстициальные пространства. Это может быть полезным для диффузии анестезии и для введения терапевтических жидкостей, молекул и белков. Подкожное, внутрикожное и внутримышечное введение молекул в присутствии sHASEGP (и/или других гликозаминогликаназ) также способствует их более быстрому системному распределению. Такие способы являются очень полезными, когда внутривенный доступ является недоступным или когда требуется более быстрая системная доставка молекул. В качестве иллюстрации, другие большие молекулы,такие как фактор VIII, которые являются трудно биодоступными после подкожного введения, могут инъецироваться с sHASEGP для увеличения их доступности. Обеспечены также применения sHASEGP для ферментативного удаления матрикса Cumulus oophorus s. proligerus, окружающего ооциты. Удаление матрикса кумулуса с использованием очищенногоsHASEGP без токсичных примесей полученного из экстракта гиалуронидазы делает возможным более мягкое извлечение ооцита с более высокой жизнеспособностью. Кроме того, sHASEGP могут быть приготовлены без использования экстрактов крупного рогатого скота или других организмов, которые несут вирусы и другие патогены, такие как вирусы трансмиссивных губчатых энцефалопатий. Инъекции малых объемов sHASEGP для внутриглазного применения могут быть также использованы для малых пространств. Например, sHASEGP и/или другие гликозаминогликаназы могут быть инъецированы в переднюю камеру глаза для удаления избытка вязкоупругих субстратов, которые вводят во время хирургии. Внутриглазная инъекция sHASEGP может быть также использована для уменьшения-7 011654 внутриглазного давления в случае глаукомы, для растворения агрегатов стекловидного тела, или мушек летающих, для очистки кровоизлияния стекловидного тела, для лечения макулярной дегенерации, для стимуляции витреоретинального отслоения в диабетической ретинопатии и для смешивания с другими ферментами для стимуляции придания новой формы роговице вместе с корректирующими линзами. Как описано здесь, sHASEGP и/или другие гликозаминогликаназы могут быть также инъецированы в глаз или в окружающие периорбитальные пространства в форме распространяющего агента, т.е. для стимуляции доставки диагностических, анестезирующих или фармакологических агентов к сайтам в тканимишени и/или около ткани-мишени. Например, инъекция sHASEGP, одновременно или в близких временных точках с инъекцией диагностических, анестезирующих или фармакологических агентов в субтеноново или эписклеральное пространство может быть использована для усиления транссклеральной доставки фармакологического агента во внутренние части глаза (такие как хороид, сетчатка и стекловидное тело). Эписклеральное пространство является содержащим лимфу пространством между Fascia Bulbi(капсулой Тенона) и склерой, которая является относительно плотной защитной тканью, окружающей хороид и сетчатку и внутреннее пространство глаза. Суб-теноново или эписклеральное пространство,которое иногда называют перисклеральным содержащим лимфу пространством, является обычно также непрерывным с субдуральной и субарахноидальной полостями и пересекается полосами соединительной ткани, простирающимися от фасции к склере. Как будет понятно специалистам в данной области, способность доставлять композиции через этот защитный склеральный слой, покрывающий глаз, делает возможной удобную и эффективную доставку большого разнообразия фармакологических и других агентов в нижележащие ткани в глазу, такие как хороид, сетчатка или жидкая часть стекловидного тела. Посредством применения композиций этого изобретения к таким способам доставки in vivo, даже относительно трудные для доступа ткани, такие как ткани на обратной стороне глаза, могут лечиться минимально инвазивными средствами. Должно быть понятно, что в некоторых случаях будет желательным более долго сохраняющийся sHASEGP, такой как ПЭГилированный sHASEGP. Важно отметить, что, хотя полученные от животных гиалуронидазы могут быть и были использованы для лечения определенных состояний глаза и в качестве распространяющего фактора для стимуляции доставки анестезирующих средств и других терапевтических или фармакологических агентов, несколько важных соображений относятся к применению полученных от животных ферментов и потенциально либо ограничивают их применение, либо вызывает обеспокоенность в отношении безопасности или дополнительный риск, когда эти гиалуронидазы используются для лечения людей. Среди этих соображений находится беспокойство в отношении того, что белки или другие примеси, присутствующие в этих композициях, могут приводить к иммуногенным и/или другим проблемам при применении к тканям человека in vivo. Кроме того, в том смысле, что используются ферменты животного, не являющегося человеком, даже очищенные ферменты могут сами дополнительно способствовать иммуногенности, так как они не происходят от человека. Кроме того, в этом отношении, потенциал в отношении расщепляющих ферментов, таких как гиалуронидазы, для эффективной стимуляции их собственного диспергирования (описанного здесь) мог бы увеличивать вероятность того, что эти иммуногенные версии или композиции таких полученных от животных продуктов контактируют с иммунной системой. Беспокойства, связанные с полученными от животных и/или примесными факторами, являются также еще более значимыми в ряде ситуаций; например, в ситуациях, в которых ткань-мишень уже подвергалась хирургическим или другим процедурам, в ситуациях, в которых этот агент вводят в относительно иммунопривилегированное пространство (такое как части глаза, сердце, нервная система и многие другие ткани и органы, которые обычно не экспонированы наружной среде), и/или в ситуациях, в которых пациент имеет ослабленный иммунитет или иным образом находится при повышенном риске,связанном с инфекцией. Таким образом, применение таких происходящих от животного композиций можно избежать в ряде приложений, в которых риск инфицирования или других осложнений снижает их потенциальную применимость. В этих ситуациях и в других ситуациях применение рекомбинантно полученных sHASEGP этого изобретения может обеспечивать применения, которые являются высокоэффективными и также имеют благоприятные профили безопасности и, следовательно, улучшает и расширяет условия и ситуации, в которых могут быть успешно использованы эти ферменты. В контексте невнутривенных парентеральных инъекций (таких как внутрикожная, подкожная,внутримышечная и другие инъекции в пространства, другие, чем сосудистая сеть) sHASEGP (и/или другая гликозаминогликаназа) и другой агент (например, совместная композиция или смесь, содержащаяsHASEGP и другой агент, такой как диагностический агент, анестезирующий агент, фармакологический агент, эстетический агент или их комбинации) в объеме жидкости (например, фармацевтического эксципиента или другого раствора) могут быть введены в место или места в теле инъекцией или инфузией. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что могут быть приведены в действие несколько сил для усиления доставки фармакологического или другого агента (степень которого, например, зависит частично от конкретных композиции, объема и места введения). Эти движущие силы могут включать в себя увеличение гидростатического давления, когда объем жидкости эффективно вводится в ограниченное пространство (такое как вышеуказанное суб-теноново пространство, или место внутрикожной, подкожной, внутримышечной или другой не-IV парентеральной инъекции, последующее увели-8 011654 чение конвективного транспорта растворенных веществ (или конвекции), когда поток жидкости увеличивается вдоль его градиента давления (и растворенные молекулы или макромолекулярные комплексы переносятся им), а также увеличение диффузии и/или проницаемости, опосредованное расщеплением гликозаминогликанов и сопутствующим образованием каналов в расположенном ниже по потоку межклеточном матриксе или интерстициальном пространстве. В случае sHASEGP, инъецируемых в переднюю камеру глаза для удаления избытка вязкоупругих субстратов, таких как содержащие гликозаминогликан композиции (которые обычно используются в качестве офтальмохирургических добавок в различных процедурах для переднего сегмента), специалистам в данной области будет понятно, в связи с описаниями этого изобретения, что sHASEGP может быть использован для дополнения или для устранения необходимости послеоперационных процедур,таких как промывание и аспирация, которые обычно используют для уменьшения количества вязкоупругих веществ, остающихся в глазу после завершения хирургии. Вязкоупругие вещества обычно используют во время хирургии переднего сегмента для поддержания глубокой передней камеры, позволяющей более эффективные манипулирования, и потенциальной защиты эндотелия роговицы и других тканей во время хирургии. Различные вязкоупругие вещества, содержащие гиалуронат и/или хондроитинсульфат,используют в хирургических процедурах, таких как процедуры для переднего сегмента глаза (см., например, Provisc, Viscoat и Duovisc (доступные из Alcon Laboratories, Inc., www.alconlabs.com);AmviscEM Plus (доступные из BauschLomb, www.bausch.com); I-Visc, I-Visc Plus, I-Visc 18 и IVisc Phaco (доступные из I-MED Pharma, www.imedpharma.com); La Lon (доступный из General Innovations, www.generaltrade.net. Однако, как известно в данной области, удержанное вязкоупругое вещество в передней камере после хирургических процедур, таких как хирургия катаракты, может привести к нарушенному вытеканию из передней камеры (потенциально посредством уменьшения вытекания через трабекулярную сеть), которое может вызывать повышения во внутриглазном давлении (IOC-спайки),которые могут привести к глаукоме. Таким образом, sHASEGP этого изобретения может быть введен, например, инъекцией в переднюю камеру глаза в качестве антидота вязкоупругого вещества в отношении ранее введенных вязкоупругих композиций, содержащих гликозаминогликаны, такие как гиалуронан. Для применения в качестве антидота вязкоупругого вещества sHASEGP будет обычно вводиться послеоперационной инъекцией в переднюю камеру (с предварительной ирригацией или аспирацией для удаления некоторой части ранее введенного вязкоупругого вещества) после процедур в переднем сегменте, таких как хирургия катаракты и имплантация внутриглазного хрусталика (например, посредством факоэмульсификации или внекапсульной хирургии), фильтрационная хирургия глаукомы (трабекулэктомия), хирургия для трансплантации роговицы (например, сквозная кератопластика), посттравматическая хирургия глаза, и т.п. Как будет понятно специалистам в данной области, количество введенного sHASEGP в таком контексте будет зависеть, inter alia, от его удельной активности, а также от количества используемого вязкоупругого агента и от того, удаляют или не удаляют некоторое количество вязкоупругого вещества сначала физически (например, ирригацией и аспирацией). Таким образом, каждое применение будет оптимизироваться для конкретных обстоятельств, как будет понятно специалистам в данной области в связи с обеспеченными здесь описаниями и иллюстрациями. Некоторые вязкоупругие агенты, такие как Viscoat и Duovisc (доступные из Alcon Labs), содержат как гиалуронат, так и хондроитинсульфат. Выгодным образом, многие sHASEGP этого изобретения являются ферментативно активными как в качестве гиалуронидаз, так и в качестве хондроитиназ, что делает их особенно подходящими в отношении таких имеющих двойной состав вязкоупругих агентов. Гиалуронидазы, включающие в себя sHASEGP, могут быть также объединены с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами (такими как хондроитиназы) для таких применений, как предыдущие применения, или для дополнительного открывания каналов в интерстициальных пространствах для других приложений, таких как приложения, описанные и проиллюстрированные здесь. В том смысле, что вязкоупругие вещества используют также в других процедурах, sHASEGP данного изобретения может быть подобным образом использован вместе со способами или в качестве замены способов уменьшения или элиминирования количеств примененного вязкоупругого вещества, т.е. в качестве антидота вязкоупругого вещества. В применениях sHASEGP в качестве распространяющих агентов в тканях, таких как глаз, композицию, содержащую один или несколько sHASEGP, описанную здесь, обычно применяют к ткани-мишени до применения или одновременно с применением анестезирующего, диагностического, фармакологического или другого агента, который должен быть доставлен в эту ткань-мишень или в участок вблизи этой ткани-мишени. В некоторых контекстах, sHASEGP могут быть использованы для усиления доставки фармакологических или других агентов через первую ткань к одной ткани-мишени или нескольким тканям-мишеням, расположенных дистально от первой ткани. В качестве иллюстрации, введение sHASEGP в эписклеральное пространство, окружающее глаз, до введения или одновременно с введением фармако-9 011654 логического или другого агента в это эписклеральное пространство, может быть использовано для стимуляции доставки этого агента через эту защитную склеральную ткань и в хороид, сетчатку и стекловидное тело. Таким образом, ряд фармакологических и/или других агентов, которые применимы для лечения состояний хороида, сетчатки и/или стекловидного тела, могут доставляться относительно локализовано в ткани-мишени, но в то же самое время с использованием неинвазивного подхода, такого как инъекция в суб-теноново пространство. Аналогичные ситуации существуют в других ситуациях, в которых sHASEGP могут быть применены к одной ткани или к одному местоположению в теле для облегчения доставки фармакологического или другого агента в эту ткань или это местоположение и/или к дистальным участкам, как описано и проиллюстрировано здесь. Хотя степень и скорость диспергирования совместно приготовленного или совместно вводимого агента зависит частично от участвующих ткани и агента, такое диспергирование может быть обычно увеличено, inter alia, увеличением количества примененного sHASEGP, использованием sHASEGP,имеющего более высокую удельную активность, использованием sHASEGP, который является более устойчивым к расщеплению или другой инактивации, например, ПЭГилированного, сверхсиалированного или другим образом модифицированного sHASEGP, с обеспечением пролонгированного высвобождения или депо-композиции sHASEGP, или другими подобными подходами для увеличения эффективной активности и/или длительности действия примененного sHASEGP. Кроме того, когда желательно, чтобыsHASEGP облегчал диспергирование (рассеяние) агента в ткань или местоположение, дистальные, например, относительно места инъекции, тогда может быть использовано обеспечение sHASEGP и/или агента в значительном объеме жидкости (так чтобы частично заполнить или даже слегка расширить место инъекции) для дополнительного усиления диспергирования посредством процесса конвективного транспорта, как описано и проиллюстрировано здесь. Как будет понятно специалистам в данной области, sHASEGP могут быть использованы для эффективного ускорения доставки ряда анестезирующих средств, фармакологических веществ и/или других агентов к задним сегментам глаза для лечения состояний, таких как отслойки сетчатки, закупорки ретинальных вен, пролиферативные ретинопатии, диабетические ретинопатии, воспалительные состояния(такие как увеит, хороидит, ретинит и т.п.), а также дегенеративные заболевания, сосудистые заболевания и различные опухоли. Опять-таки, как будет понятно специалистам в данной области, различные фармакологические или фармацевтически эффективные агенты могут быть с пользой использованы для лечения таких состояний и заболеваний заднего сегмента, в том числе, в качестве иллюстрации, анестезирующие и фармакологические агенты, таких как описанные и проиллюстрированные ниже агенты. Совместные композиции или совместные введения sHASEGP с другими веществами могут также ожидаться для инъекционных карандашей для малого объема или быстрого подкожного введения. В качестве примеров, могут быть приготовлены Epipen, инсулин и другие жидкости. Способы этого изобретения включают в себя введение полипептида или фармацевтической композиции sHASEGP, содержащих sHASEGP, до введения, одновременно с введением или после введения других терапевтических молекул. sHASEGP может вводиться в место, другое, чем место введения терапевтической молекулы,или sHASEGP может вводиться в то же самое место, в какое вводится терапевтическая молекула. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что способность sHASEGP и других гликозаминогликаназ вызывать деградацию части гликозаминогликанов в интерстициальных пространствах между клетками приводит к временному открыванию каналов в этом интерстициальном пространстве, которое, в свою очередь, имеет тенденцию увеличивать протекание интерстициальной жидкости и одновременно облегчать диффузию и/или конвективный транспорт растворенных компонентов (конвекцию) в интерстициальной жидкости (таких как анестезирующие агенты, лекарственные средства и другие фармакологические агенты, метки и диагностические агенты, и т.п.). Как будет понятно специалистам в данной области, sHASEGP этого изобретения могут быть использованы для повышения биодоступности (и потенциально улучшения других фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств) ряда фармакологических или других агентов, которые применимы для лечения или диагностики различных патологических состояний, или для модификации иным образом одной или нескольких тканей in vivo. Иллюстративные категории таких агентов включают в себя: противораковые агенты, противоинфекционные агенты, анестезирующие средства, противовоспалительные агенты, цитокины, антитела и другие белки, нуклеиновые кислоты, макромолекулярные комплексы и многочисленные другие молекулы и фармакологические агенты (и их примерные члены), описанные здесь и в данной области. Хотя диффузия и конвективный транспорт даже малых молекул может быть усилен открыванием интерстициальных каналов и увеличением протекания жидкости, в случае более крупных фармакологических или других агентов, таких как многие биотерапевтические вещества (в том числе антитела и другие белки, большие нуклеиновые кислоты, макромолекулярные комплексы (такие как липосомы и другие макромолекулярные носители), а также векторы генотерапии и т.п.), размер этих молекул и присутствие интерстициальных компонентов, таких как гликозаминогликаны, существенно ухудшает диффузию и/или конвекцию этих агентов. Могут возникать несколько последствий, потенциально ограничивающих применимость такого агента. Например, фармакокинетика этого агента может быть эффективно нарушена замедлением абсорбции и, следовательно, распространения этого агента. Кроме того, захват части- 10011654 этого агента в месте введения или вблизи него ограничивает в обоих случаях его биодоступность и может также вызывать токсичность в результате потенциально непрерывной и высокой локальной дозы. В последнем случае, локальная токсичность, которая может быть ассоциирована с болезненными или другими побочными эффектами, является проблемой при использовании многих больших биомолекул, которые вводят невнутривенной инъекцией, такой как подкожная, внутрикожная или внутримышечная инъекция. В результате, ряд фармакологических агентов имеют фармакокинетические (PK) и/или фармакодинамические (PD) профили, которые могут быть усилены совместным приготовлением этого агента сsHASEGP (или другой гликозаминогликаназой) и/или совместным введением этого агента с sHASEGP(или другой гликозаминогликаназой), которые могут быть обеспечены до этого агента, одновременно с этим агентом или после этого агента, и введены в одно и то же место или в другое место, причем эти параметры могут быть предметом оптимизации в стандартных моделях (таких как модели животных,обычно используемые для оценки фармакокинетики и фармакодинамики этого агента). Таким образом,любое разнообразие терапевтических агентов и фармакологических агентов, а также других агентов (таких как косметические или эстетические композиции), которые обычно вводят парентеральным введением, могут быть усилены с использованием sHASEGP. Хотя внутрисосудистое введение, в частности, внутривенная (IV) инъекция, может обычно обеспечивать быструю биодоступность, IV инъекции часто являются неудобными, связанными с риском или неприменимыми (и даже, когда они практикуются, могут быть ассоциированы с менее чем оптимальными общими профилями PK/PD). Поскольку sHASEGP могут быть использованы для повышения биодоступности агентов, вводимых не-IV парентеральными способами (такими как подкожный, внутрикожный,внутримышечный и другие способы доставки агентов интерстиций), агенты, которые доставлялись IVинъекцией, могут быть приготовлены для доставки не-IV парентеральными способами. Такие улучшения композиций могут обеспечить существенную пользу, например, создание возможности использования агентов, в случае которых IV-введение является неудобным, неприменимым, небезопасным, слишком дорогостоящим или имеющим другие недостатки. Это изменение IV-агентов с получением не-IV парентеральных композиций сможет также позволить пациентам самим производить введение этих агентов и сможет позволить оптимизацию введения доз (например, улучшенным приспособлением к параметрамPK/PD этого агента) посредством устранения необходимости введения внутривенной инъекцией. Как будет понятно специалистам в данной области, параметры PK/PD, которые могут быть улучшены с использованием sHASEGP (и/или других гликозаминогликаназ), включают в себя такие критерии, как Cmax (максимальную концентрацию агента, достигаемую после абсорбции, например, в кровотоке), Tmax (максимальное время, необходимое для достижения максимальной концентрации), T1/2(время, необходимое для уменьшения концентрации наполовину), Cmin (минимальную концентрацию агента после метаболизма и экскреции), AUC (площадь под кривой зависимости концентрации от времени, критерий общей величины биодоступности), концентрации в различных представляющих интерес тканях (в том числе, например, скорость достижения желаемых концентраций, общие уровни и продолжительность поддержания желаемых уровней) и Emax (максимальный достигнутый эффект). В качестве иллюстрации, приготовление лекарственного средства или другого фармакологического агента с sHASEGP или совместное введение этого агента с sHASEGP (который может быть введен локально или системно и до этого агента, вместе с этим агентом или после этого агента) может быть использовано для увеличения Cmax, уменьшения его Tmax, уменьшения его Т 1/2, увеличения его AUC и/или увеличения его Emax. Как будет понятно, способность легко и пропорционально манипулировать такими ключевыми параметрами PK и PD (например, применением большего и меньшего количества единиц sHASEGP и изменением хронометрирования (тайминга) и/или места введения) позволяет улучшить ряд фармакологических и других агентов. Оценка уровней этих параметров может быть выполнена в моделях, например, в моделях животных, используемых для измерений PK/PD этого агента, и совместных композиций и/или совместных введений, которые повышают относительную эффективность в отношении профиля безопасности, выбранного таким образом для конкретного введения. Среди не-IV парентеральных агентов, sHASEGP (и/или другие гликозаминогликаназы) могут быть также использованы для создания возможности введения этих агентов более удобными способами и/или с более высокой эффективностью. В качестве иллюстрации (и без ограничения), посредством улучшения композиции введением в нее sHASEGP и/или совместного введения агентов с sHASEGP (либо локально,либо системно и до этого агента, вместе с этим агентом или после этого агента) агенты, которые обычно вводят подкожной инъекцией, могут быть вместо этого введены внутрикожной инъекцией, а агенты, которые вводят внутримышечной инъекцией, могут быть вместо этого введены подкожной или внутрикожной инъекцией. Альтернативно, агенты могут быть введены тем же самым способом, но с улучшенными фармакокинетикой и фармакодинамикой с использованием sHASEGP. Применение sHASEGP (и/или других гликозаминогликаназ) для улучшения композиции вводимыхIV лекарственных средств и других агентов в качестве не-IV парентеральных агентов делает также возможной доставку этих агентов с использованием любого из разнообразных новых инъекционных устройств, предназначенных для легкой и/или быстрой доставки, и для облегчения самостоятельного введения. Такие устройства включают в себя, например, устройства с ультраострыми иглами или микроигла- 11011654 ми (такие, как разработанные Becton Dickinson и другими), а также инъекционные устройства без иглы(такие как Biojector и другие устройства, доступные из Bioject; IntraJect, и другие устройства, доступные из Aradigm; устройства Medijector и т.п.). Ряд устройств (например, Biojector) применимы, в частности, для облегчения внутридермальных инъекций, которые обычно требуют большего опыта при использовании стандартных игл (из-за потенциальной возможности прокалывания дермы во время помещения иглы и доставки этого агента в участок нижележащей ткани, например, в подкожный слой). Для некоторых фармакологических агентов, таких как, например, вакцины (например, вакцины на основе ДНК или другой вакцины), может быть особенно предпочтительной доставка этого агента в дермальные,а не в субдермальные слои, так как в дерме обычно имеется относительно высокая концентрация антигенпредставляющих клеток (APC). В контексте агентов, которые обычно доставляются внутрикожной инъекцией (независимо от того,доставляются ли они стандартными иглами или другими более новыми иглами), или многих других агентов, которые в настоящее время не доставляются внутрикожной инъекцией, но могли бы доставляться внутрикожной инъекцией, локальное совместное введение sHASEGP (и/или другой гликозаминогликаназы) может использоваться для ускорения доставки фармакологического или другого доставляемого агента или для усиления его распространения или распределения в дерме. В случае вакцины, где дерма может быть первичной тканью-мишенью, вследствие локального обилия APC, sHASEGP (и/или другая гликозаминогликаназа) может, следовательно, облегчать распространение этой вакцины в тканимишени, увеличивая посредством этого вероятность и степень взаимодействий между вакциной и APC(что может значительно потенцировать генерирование иммуномодуляторного ответа). В случае других агентов, дерма может не быть первичной тканью-мишенью, а является скорее тканью, в которую вводят дозу этого агента, из которой этот агент предпочтительно абсорбируется в другую ткань, обычно в кровоток. В последнем случае, кровоток может быть сам представляющей интерес тканью-мишенью (например, для модулирующих кровь факторов, описанных здесь и в данной области), или кровоток может быть сам доставляющей тканью, при помощи которой этот агент транспортируется к дистальной тканимишени (например, к ткани в теле, снабжаемой этим кровотоком). В любом из этих последних случаев (в которых доставка является внутрикожной, но желательно, чтобы этот агент был доставлен в кровоток),sHASEGP (и потенциально объем жидкости, в которой его инъецируют) может облегчать распространение этого агента сначала в дерме и отсюда в сосудистую сеть, дренирующую дерму, и в конечном счете в более крупные кровеносные сосуды, как описано и проиллюстрировано здесь. Применение sHASEGP для усиления фармакокинетики и/или фармакодинамики других терапевтических или фармакологических агентов может быть также использовано для агентов, доставляемых другими способами, чем не-IV парентеральное введение. Например, не желая быть связанными теорией,авторы изобретения считают, что присутствие sHASEGP в интерстициальных пространствах в теле (которое может достигаться локальным и/или системным введением sHASEGP) ведет к активации интерстициальных каналов и увеличению потока жидкости в интерстициальном пространстве, что, в свою очередь, облегчает как диффузию, так и конвективный транспорт растворенных агентов интерстициальной жидкостью (например, фармакологических и других агентов). В качестве иллюстрации, агенты, которые вводят непосредственно в кровоток (например, внутривенной инъекцией) или перорально (и, следовательно, они входят в кровоток, например, после поглощения из желудочно-кишечного тракта), могут быть все еще предметом ограничений в послеабсорбционной, т.е. распределительной фазе их фармакокинетики. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что sHASEGP могут усиливать доставку к клеткам-мишеням посредством увеличения интерстициальной проницаемости и тока жидкости и, следовательно, увеличения диффузии и/или конвекции агентов в интерстициальном пространстве, которое эффективно образует промежуточную среду между почти всеми фармакологическими способами доставки и клетками-мишенями. Кроме того, считается, что изменения в онкотическом давлении, вызываемые введением sHASEGP,могут способствовать ускорению доставки фармакологических агентов. Опять, не желая быть связанными теорией, авторы считают, что присутствие sHASEGP и сопутствующее расщепление вдоль интерстициальной стороны васкуляризованной ткани, имеет тенденцию уменьшения онкотического давления в интерстициальном пространстве, которое, в свою очередь, усиливает фильтрацию жидкости из сосудистой сети в интерстициальное пространство. Считается, что потенциал уменьшения интерстициального давления является особенно важным в связи со многими раковыми заболеваниями, в которых интерстициальное давление в опухоли (опухолевое интерстициальное давление TIF) является повышенным. Высокое TIF может приводить к относительному импедансу (полному сопротивлению) в отношении потока текучей среды из сосудистой сети в направлении центра опухоли, что ограничивает количество противоракового агента, которое достигает опухоли, в частности, участков, которые являются более глубокими в массе опухоли. Введение sHASEGP в интерстиции опухоли могло бы, следовательно, способствовать ускорению доставки локально доставляемых, а также системно доступных противораковых агентов, которые могут более легко проникать в опухоль при уменьшенном онкотическом давлении и увеличенных диффузии и/или конвективном- 12011654 транспорте. Измерения TIF и гидравлической проводимости (К) в опухолях (например, с использованием меченых молекул, таких как альбумин, меченый красителем Evan's Blue) может быть использовано для количественной оценки действия различных концентраций sHASEGP на динамику текучей среды опухолей in vivo, как проиллюстрировано здесь и/или в этой области. Дополнительным ярким доказательством уменьшенной динамики текучей среды во многих опухолях и выдвижением на первый план дополнительной пользы применения sHASEGP к опухолям является тот факт, что многие опухоли обнаруживают накопление гликозаминогликанов, в частности, гиалуронана (что может быть обусловлено тем фактом, что лимфатические сосуды, которые являются преобладающим путем для катаболизма гиалуронана, являются нарушенными или отсутствующими во многих опухолях). Такой избыточный гиалуронан может способствовать сопротивлению гидравлической проводимости. Введение sHASEGP может, следовательно, использоваться для противодействия накоплению гликозаминогликанов во многих опухолях для улучшения гидравлической проводимости в этих опухолях и эффективного придания им большей чувствительности к противораковым агентам (независимо от того, является ли их доставка локальной или системной). Как будет понятно специалистам в данной области, описанные здесь принципы могут быть также применены для многочисленных других фармакологических веществ и других агентов, которые желательно доставлять к участкам в теле, например, для предупреждения, диагностики и/или лечения заболевания или для модуляции иным образом физиологических функций. Здесь обеспечены иллюстративные классы таких агентов (и примеры их членов), и многие другие известны в данной области или находятся в стадии разработки. Кроме их применения в потенциальных улучшениях и/или изменениях в приготовлении различных парентерально вводимых фармакологических веществ и/или агентов, sHASEGP могут быть также с пользой применены в связи с непарентеральными агентами (такими как агенты, приготовленные в виде пилюль, жидкостей или других форм для приема внутрь и обычной абсорбции через желудочно-кишечный тракт). Например, поскольку большинство непарентеральных лекарственных средств должны в конечном счете достигать клеток в интерстиции для проявления их желаемых действий, использование sHASEGP для усиления диффузии и/или конвективного транспорта в интерстиции (либо системно, либо локально (например, локальным или нацеленным введением sHASEGP, может быть применено для улучшения степени и/или скорости, с которой непарентеральные агенты (а также парентеральные) достигают клеток-мишеней. Кроме того, ряд агентов, которые обычно вводят непарентерально (например, перорально), могут быть приготовлены улучшенным образом или их ингредиенты могут быть приготовлены улучшенным образом, для применения в парентеральных введениях, которые становятся более эффективными и/или безопасными в комбинации с sHASEGP. Для иллюстрации этого широко применимого подхода, способность sHASEGP облегчать нацеленную доставку к конкретным тканям (например, способность sHASEGP обеспечивать транссклеральную доставку к тканям в задней камере глаза) может быть использована для доставки любого из разнообразных агентов (в том числе агентов, ранее вводимых системно) прямо и преимущественно в локализованный представляющий интерес участок в теле. Это может не только обеспечивать более желательные и/или более быстро достигаемые концентрации в представляющем интерес участке, но и может существенно уменьшать потенциальные проблемы и недостатки, ассоциированные с системным введением, при котором концентрации в нежелательных участках могут быть равными концентрациям или даже превышающими концентрации в желаемом участке-мишени (с потенциальным запуском нежелательных побочных действий, а также с излишней тратой агента). В некоторых случаях, агенты, которые не используются широко или являются неприменимыми, например, для определенных показаний или в определенных пациентах, могут быть эффективно применены с пользой к дополнительным пациентам, при совместном приготовлении этих агентов или при совместном введении их с sHASEGP, как описано и проиллюстрировано здесь. Как будет понятно специалистам в данной области, возможность применения sHASEGP для повышения скорости и/или нацеленного биораспределения совместно приготовленных и/или совместно вводимых агентов и для манипулирования другими аспектами их фармакокинетики или фармакодинамики(например, для улучшения профиля риск:польза или облегчения их применения пациентами, семьей или профессионалами медико-санитарной помощи), обеспечивает большую благоприятную возможность для улучшения лекарственных средств и других агентов, которые используются для лечения, диагностики или предупреждения заболеваний. Без ограничения каким-либо конкретным перечнем применений, гликозаминогликаназы, в том числе sHASEGP, описанные здесь (а также другие гиалуронидазы и другие гликозаминогликаназы), могут быть использованы для эффективного достижения болюсной или болюс-подобной доставки (доставки ударной дозы) любого числа фармакологических и других агентов невнутривенными парентеральными способами введения, а также другими способами введения (например, посредством усиления доставки агентов в ткань-мишень и/или через ткань-мишень после выхода их из кровотока (независимо от того,вводят ли их непосредственно в кровоток (например, IV-введением), или опосредованно (например, пероральным или не-IV парентеральным введением.- 13011654 Без ограничения конкретным механизмом действия или его аспектом, авторы считают, что способность этих ферментов временно разрушать компоненты интерстициального матрикса между клетками(который ответственен за значительную часть жидкого пространства в теле и, соответственно, большого пространства, которое должно быть пересечено фармакологическими и другими агентами для достижения большинства клеток-мишеней) может значительно активировать доставку агентов к клеткаммишеням с использованием одного или нескольких потенциально синергических способов. Во-первых,хотя масса интерстициальной жидкости проявляет некоторую степень потока, этот поток часто затруднен или испытывает сопротивление со стороны гликозаминогликанов, таких как гиалуронан и другие интерстициальные компоненты. Способность гликозаминогликаназ, в том числе sHASEGP (а также других гиалуронидаз и других гликозаминогликаназ), открывать каналы в таких интерстициальных пространствах, как описано и проиллюстрировано здесь, может быть использована для уменьшения полного сопротивления и увеличения степени и скорости потока, направленного вниз по потоку, происходящего из любого конкретного давления выше по потоку. Во-вторых, в случае не-IV парентеральных инъекций sHASEGP (или другой гликозаминогликаназы) и других фармакологических или других агентов,объем не-IV парентерального инъекционного раствора может быть использован для увеличения расположенного выше по потоку движущего давления или гидравлического напора (например, посредством увеличения гидростатического давления в ограниченном пространстве), которое может дополнительно усиливать поток. В-третьих, поскольку объем жидкости, содержащий введенный sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) и другой агент, эффективно перемещает по увеличенному градиенту давления(т.е. увеличенному градиенту, созданному повышением гидростатического давления, ассоциированным с инъецированным болюсом и одновременным уменьшением интерстициального давления в окружающей ткани), растворенные вещества в этом болюсе могут быть эффективно перенесены (например, посредством конвективного транспорта) в соседнюю ткань. Таким образом, эта инъецированная жидкость,или болюс, может эффективно и относительно быстро перемещаться в соседнюю ткань и доставлять любой фармакологический или другой агент, введенный в том же самом месте введения или вблизи того же самого места введения (например, совместным приготовлением или совместным введением этого агента в комбинации с sHASEGP или другой гликозаминогликаназой). В качестве иллюстрации, применение гликозаминогликаназ, таких как sHASEGP, для открывания каналов в интерстициальных пространствах, как описано и проиллюстрировано здесь, может быть использовано для увеличения интерстициального потока в ткани и через ткани, такие как опухоли и другие ткани, в которых этот поток обычно затруднен, а интерстициальные давления повышены. Иллюстративные примеры описанных здесь принципов включают в себя применение sHASEGP для уменьшения интерстициального давления в опухоли in vivo. Увеличенный поток может быть также применен к нормальной ткани, например, для возможности доставки анестезирующего, диагностического, косметического или другого эстетического или фармакологического или другого агента в ткань (например, для модификации этой ткани или введения депопрепарата в ткань). Увеличенный поток может быть также использован к первой или проксимальной ткани для активации доставки агента через эту ткань или введения в дистальную ткань, причем дистальная ткань сама быть желаемой тканью-мишенью или путем к желаемой ткани-мишени. Иллюстративные примеры описанных здесь принципов включают в себя, например, (i) применение sHASEGP, введенных в эписклеральное пространство, окружающее глаз, для активации доставки агентов через склеру для попадания в дистальные ткани-мишени во внутреннем пространстве глаза, такие как сетчатка и хороид; и(ii) применение sHASEGP, введенных внутрикожно, для активации доставки агентов через субдермальные слои в кровоток, который сам может быть тканью-мишенью (например, для модифицирующих кровь агентов) или путем, при помощи которого этот агент (эти агенты) может(гут) быть доставлен(ы) к другим тканям-мишеням в теле. В качестве дополнительной иллюстрации этих способов и композиций для активации доставки фармакологических веществ и других агентов к желаемым тканям в теле обеспечены следующие дополнительные примеры. При помощи способов, описанных и проиллюстрированных здесь, могут быть повышены или модифицированы иным образом фармакокинетические и/или фармакодинамические профили фармакологических агентов и профили абсорбции, распределения и/или эффективности других агентов. Кроме того, агенты, которые были существенно или практически ограничены доставкой по одному способу (например, IV-инъекцией), могут доставляться другими, более безопасными, менее инвазивными, менее дорогостоящими и/или более удобными способами. В качестве дополнительной иллюстрации и без ограничения каким-либо конкретным типом применения, объем (V) жидкости (L), содержащей sHASEGP или другую гликозаминогликаназу (ФерментGAG), может быть введен в участок ткани в теле (Ткань для введения Дозы). Описанными и проиллюстрированными здесь способами Фермент GAG может быть доставлен в Ткань для введения Дозы и до некоторой степени через Ткань для введения Дозы. Без ограничения конкретным механизмом действия,Фермент GAG может эффективно переноситься в Ткань для введения Дозы конвективным транспортом посредством объема жидкости (L). Конвективный транспорт может быть, в свою очередь, активирован отчасти гидростатическим давлением, ассоциированным с L (которое может обеспечивать запускающее- 14011654 движение давление), и отчасти способностью Фермента GAG открывать каналы в интерстициальных пространствах Ткани для введения Дозы (которые могут уменьшать сопротивление напорному (нагнетательному) потоку, и тем самым понижать давление сопротивления). Таким образом может быть создан движущий жидкость перепад давлений и до некоторой степени он может быть увеличен, например, одним или обоими из следующих действий: (i) введением и, если желательно, увеличением запускающего движение гидростатического давления, например, введением L в ограниченное пространство, и, если желательно, увеличением V; и (ii) уменьшением сопротивления напорному (нагнетательному) потоку(например, введением Фермента GAG и, если желательно, увеличением его эффективности, например,увеличением его концентрации, увеличением его резистентности к расщеплению (например, ПЭГилированием, сверхсиалированием или другой модификацией), и/или увеличением его доставки конвективным транспортом (например, увеличением V. В некоторых вариантах осуществления (например, в которых желательна увеличенная степень или скорость доставки), V является объемом, достаточным для временного расширения участка в Ткани для введения Дозы, в котором вводят Фермент GAG. Как будет понятно специалистам в данной области,объем (V), который может быть предоставлен, и полученная степень расширения (D) зависят от конкретной ткани. Для целей иллюстрации, но не для ограничения, степень, до которой имеет место расширение,варьируется, например, от ситуаций, в которых (i) Ткань для введения Дозы является относительно большим и/или быстро движущимся заполненным жидкостью пространством (таким как кровоток в связи с внутривенной или внутриартериальной доставкой), и в этом случае L может быть большим (например, порядка многих мл, если желательно), но D имеет тенденцию быть минимальным; (ii) Ткань для введения Дозы является относительно меньшим и/или менее быстро движущимся заполненным жидкостью пространством (таким как цереброспинальная жидкость в связи с внутриоболочечной доставкой), и в этом случае L может быть все еще относительно большим, но D может быть большим, чем минимальное D, в зависимости от точного места и объема инъекции; (iii) Ткань для введения Дозы является относительно меньшим, но несколько растяжимым пространством (таким как эписклеральное пространство,окружающее глаз, для целей иллюстрации); или (iv) Ткань для введения Дозы является более плотным и/или более ограниченным пространством с более высоким сопротивлением давлению (таким как дерма в связи с внутрикожной доставкой, для целей иллюстрации). Как будет понятно специалистам в данной области, V может быть в диапазоне от объемов, меньших чем 0,1 мл, до объемов, больших чем 100 мл, причем для многих применений он находится в диапазоне от приблизительно 0,5 до 20 мл и для многих применений в диапазоне 1-10 мл, часто от 2 до 5 мл; но может варьироваться для конкретных ситуаций, как проиллюстрировано здесь. V может быть также специально оптимизирован в пределах таких диапазонов для конкретного применения, как желательно; например, сравнением стандартных фармакокинетических и/или фармакодинамических профилей на протяжении диапазона тест-объемов. Как будет понятно специалистам в данной области в связи с этими описаниями, посредством комбинирования быстро действующей и реинициирующей открывание каналов активности Фермента GAG(который как активирует, так и активируется его собственной доставкой), может быть, следовательно,генерирована система доставки множества синергических лекарственных средств; как дополнительно описано и проиллюстрировано здесь. В первом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащей sHASEGP или другую гликозаминогликаназу (Фермент GAG) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент(Агенты) (таких как детектируемые молекулы или другие диагностические агенты, анестезирующие агенты или другие модифицирующие ткани агенты, фармакологическте агенты или фармацевтически приемлемые агенты, косметические или другие эстетические агенты, и другие агенты, которые желательно ввести в одну или несколько тканей в теле), вводят в участок первой ткани (Ткани для введения Дозы), которая сама является желаемой тканью-мишенью (Ткань-Мишень) для этого агента. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) доставляются в эту Ткань-Мишень или через эту Ткань-Мишень в более высокой степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента GAG. Как будет понятно специалистам в данной области в связи с этим и другими иллюстративными аспектами, описанными здесь, Тканью для введения Дозы может быть любая из разнообразия тканей, к которым возможен легкий доступ снаружи тела (например, с использованием различных способов введения, описанных и проиллюстрированных здесь, и/или способов, известных в данной области) или изнутри тела (например, в связи с хирургией или с использованием любого разнообразия нехирургических или минимально инвазивных подходов и устройств для доступа к тканям в теле). Такие Ткани для введения Дозы включают в себя Ткани для введения Дозы, описанные и проиллюстрированные здесь, а также другие, известные в данной области. Как будет также понятно специалистам в данной области в связи с этим и другими иллюстративными аспектами, описанными здесь, Тканью-Мишенью может быть любая из разнообразия тканей, к которым желательно доставить Фермент GAG и потенциально другой Агент (другие Агенты) (например,(i) ткани, которые являются предметом приложений усилий для диагностики, предупреждения или лече- 15011654 ния патологического состояния (независимо от того, обусловлено ли оно внутренними причинами, например, является наследственным или приобретенным патологическим состоянием, или наружными причинами, например, вызвано инфекцией); (ii) ткани, которые желательно анестезировать или иным образом модулировать (например, в связи с хирургией и/или другими процедурами); (iii) ткани, в которых желательным является запуск иммунной реакции (например, связанной с вакцинацией); (iv) ткани,которые должны служить в качестве участка-депо для высвобождения агента (агентов) в другие ткани;(v) ткани, подлежащие модификации для эстетических или косметических процедур; и (vi) ткани или участки в теле, подлежащие модификации для других целей. Такие Ткани-Мишени включают в себя описанные и проиллюстрированные здесь ткани, а также другие ткани, известные в этой области. Как будет также понятно специалистам в данной области в связи с предыдущими и другими иллюстративными аспектами, описанными здесь, Агентом (Агентами) могут быть любые из разнообразия молекул, макромолекул и макромолекулярных комплексов, которые используются или могут быть использованы для изменения или модуляции условий в теле (например, (i) для целей диагностики, предупреждения или лечения патологического состояния (независимо от того, обусловлено ли оно внутренними причинами, например, является наследственным или приобретенным патологическим состоянием, или наружными причинами, например, вызвано инфекцией), поражающим Ткань-Мишень и/или соседние ткани; (ii) для целей анестезии или модуляции иным образом физиологии этой Ткани-Мишени; (iii) для целей запуска иммунной реакции, связанной с вакцинацией; (iv) для целей использования ТканиМишени в качестве участка-депо для высвобождения агента (агентов) в другие ткани; (v) для эстетических или косметических целей; и/или (vi) для других целей, обслуживаемых доставкой Фермента GAG и потенциально другого Агента (других Агентов) к ткани или к другому участку в теле). Такие Агенты включают в себя различные классы агентов и их члены, описанные и проиллюстрированные здесь, а также другие члены таких классов агентов и другие агенты (и их члены), известные в этой области. Во втором иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG) и один или несколько фармакологических или других агентов(Агент (Агенты) вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является сама желаемой тканью-мишенью). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент(эти Агенты) доставляются из Ткани А в Ткань-мишень В в более высокой степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента GAG. В третьем иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP или другую гликозаминогликаназу (Фермент GAG) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент(Агенты) вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является проксимальной относительно одной или нескольких тканей (Промежуточных Тканей), расположенных между Тканями А и другой тканью или тканями (Дистальными Тканями), которые сами являются желаемыми тканямимишенями или включают в себя желаемую ткань-мишень (ткани-мишени). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А и через одну или несколько Промежуточных Тканей для достижения одной или нескольких Тканей-Мишеней в более высокой степени и/или при скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) GAG). В четвертом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG) и один или несколько фармакологических или других агентов(Агент (Агенты, вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является проксимальной относительно одной или нескольких тканей доставки, таких как кровоток, лимфа или цереброспинальная жидкость (Ткани Доставки), которые являются тканями-мишенями или включают в себя желаемую ткань-мишень. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А к одной или нескольким Тканям Доставки в большей степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) GAG. В пятом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент(Агенты, вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является проксимальной относительно одной или нескольких тканей доставки, таких как кровоток, лимфа или цереброспинальная жидкость (Ткани Доставки), которые доставляют жидкость в одной или нескольким желаемым тканяммишеням (Тканям-Мишеням) в теле. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов,этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А к одной или нескольким Тканям Доставки и из них к одной или нескольким Тканям-Мишеням, расположенным далее в этом процессе, в большей степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента(Ферментов) GAG. В шестом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG) вместе с одним или несколькими фармакологическими или другими агентами (Агентом (Агентами, вводят в одну или несколько тканей доставки, таких как кровоток, лимфа или цереброспинальная жидкость (Ткани Доставки), которые подают жидкость к одной или несколь- 16011654 ким желаемым Тканям-Мишеням (например, через кровоток, снабжающий Ткань-Мишень). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) проникают в эту ТканьМишень в большей степени и при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) GAG. В седьмом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG), вводят в участок ткани в теле (Ткани А), которая является желаемой тканью-мишенью или находится вблизи желаемой ткани-мишени (Ткани-Мишени), и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты вводят в тело другим способом введения (например, пероральной доставкой или внутривенной инъекцией), который позволяет этому Агенту(Агентам) достичь Ткани-Мишени (например, через кровообращение Ткани-Мишени, после абсорбции или инъекции в кровь). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) проникают в эту Ткань-Мишень в большей степени и при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) GAG. В восьмом проиллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG), вводят в участок или участки ткани в теле (Участок (Участки) Ткани), которая имеет повышенное интерстициальное давление. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, интерстициальное давление в этом Участке (Участках) Ткани уменьшается посредством расщепляющей активности Фермента (Ферментов) GAG. В девятом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG), вводят в участок или участки ткани в теле (Участок (Участки) Ткани), которая имеет избыток гиалуронана или другого гликозаминогликана. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов избыток гиалуронана или другого гликозаминогликана в этом Участке (Участках) Ткани уменьшается посредством расщепляющей активности Фермента (Ферментов)GAG. В десятом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий sHASEGP (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент GAG), вводят в участок или участки ткани в теле (Участок (Участки) Ткани), которые находятся в желаемой точке доступа или вблизи желаемой точки доступа для подкожного введения жидкости (Участка введения жидкости). Затем, при помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, жидкости могут доставляться в и через этот Участок для введения жидкости в более высокой степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) GAG. Как будет понятно специалистам в данной области в связи с обеспеченными здесь подробными описаниями и проиллюстративными вариантами, любой из большого разнообразия агентов может вводиться совместно (например, посредством совместного приготовления или совместного введения с Ферментом GAG) и любой из разнообразия Ферментов GAG может использоваться в концентрациях в диапазонах, таких как диапазоны, приведенные здесь, но обычно оптимизированных для используемой конкретной ткани и конкретной цели. Объем жидкости (V), применяемый в приведенных выше иллюстративных аспектах, будет обычно зависеть от характера участка введения и будет также обычно оптимизирован для конкретной используемой ткани и конкретной цели. Как описано и проиллюстрировано здесь,в случае не-IV парентеральных введений V может быть увеличен (в пределах конкретных ограничений участка ткани) для обеспечения повышенного гидростатического напорного давления, которое, в сопряжении с уменьшенным сопротивлением, связанным с расщеплением гиалуронана или другого гликозаминогликана, может эффективно заставит объем жидкости действовать в качестве болюса, несущего любое растворенное вещество, которое он содержит, в лежащее ниже по потоку интерстициальное пространство и потенциально далее. Таким образом, здесь обеспечены множество способов, использующих гиалуронидазы (и/или другие гликозаминогликаназы) для активации доставки фармакологических и других агентов к участкам в теле, а также семейство эукариотических секретируемых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы, названных sHASEGP, и их функциональных доменов, в частности, их гиалуронидазных (или каталитических) доменов, мутеинов и других производных и их аналогов. Здесь обеспечены также нуклеиновые кислоты, кодирующие эти sHASEGP. Кроме того, обеспечены композиции, совместные композиции и терапевтические применения указанных sHASEGP (в том числе совместное введение с другими агентами) для лечения, предупреждения или диагностики заболевания и для применения в качестве модифицирующих ткани ферментов. Краткое описание чертежа Чертеж является векторной картой Вектора HZ24 sHASEGP. Подробное описание изобретения А. Определения. Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, какое обычно понимается специалистом в области, к которой относится это изобретение. Все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и публикации, последовательности GenBank,веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые даются ссылки во всем этом описании, если- 17011654 нет других указаний, включены в качестве ссылки в их полном объеме. В случае, когда имеется множество определений для используемых здесь терминов, предпочтительными являются определения, приведенные в этом разделе. Когда делается ссылка на URL (унифицированный указатель информационного ресурса, т.е. стандартизованную строку символов, указывающую местонахождение документа в сети Интернет) или другой подобный идентификатор или адрес, понятно, что такие идентификаторы могут меняться и конкретная информация в Интернете может поступать и исчезать, но поиском в Интернете может быть найдена эквивалентная информация. Ссылка на нее служит доказательством доступности и публичного распространения такой информации. В данном контексте аббревиатуры для любых защитных групп, аминокислот и других соединений находятся, если нет другого указания, в соответствии с их обычным применением, общепризнанными аббревиатурами или JUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (см. (1972) Biochem. 11: 942944). В данном контексте эукариотической гиалуронидазой называют разнообразное семейство гликозаминогликан-эндоглюкозаминидаз, где остаток глутамата в гиалуронидазе гидролизует бета-1,4-связи гиалуронан- и хондроитинсульфатов посредством кислотного-основного каталитического механизма. Особый интерес представляют растворимые нейтрально-активные гиалуронидазы или sHASEGP млекопитающего, в том числе человека. Специалистам в этой области известно, что, обычно, замены отдельных аминокислот в заменимых районах полипептида по существу не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224). В данном контексте мембранозаякоренными sHASEGP называют семейство мембранозаякоренных гиалуронидаз, которые имеют описанные здесь общие структурные признаки. Как описано и проиллюстрировано здесь, гиалуронидазы (т.е. гликозаминогликаназы, способные расщеплять гиалуронан, предпочтительно гликозаминогликаназы, проявляющие, по меньшей мере, некоторую активность в области нейтрального pH), которые обычно заякорены в мембране, могут быть превращены в растворимые HASEGP, или sHASEGP, удалением или модификацией иным образом одного или нескольких районов, которые ассоциированы с заякориванием гиалуронидазы в мембране. В данном контексте растворимой гиалуронидазой называют полипептид, характеризующийся его растворимостью при физиологических условиях. Растворимые HASEGP можно отличить, например, по их распределению в водной фазе раствора Тритона X-114, нагретого до 37 С (Bordier et al. J Biol Chem. 1981 Feb 25; 256 (4):1604-7). Заякоренные липидом HASEGP, с другой стороны, будут распределяться в богатую детергентом фазу, но будут распределяться в бедную детергентом или водную фазу после обработки фосфолипазой С. Таким образом, ссылка, например, на "sHASEGP" включает в себя все гликопротеины, кодируемые семейством генов sHASEGP, в том числе, но не только: sHASEGP человека, sHASEGP мыши или эквивалентная молекула, полученная из любого другого источника, или молекула, которая была получена синтетически, или молекула, которая проявляет такую же активность. Последовательности кодирующих молекул нуклеиновых кислот и кодируемые аминокислотные последовательности примерных sHASEGP и/или их доменов представлены, например, в SEQ ID NO:4. Этот термин включает в себя также sHASEGP с аминокислотными заменами, которые по существу не изменяют активность каждого члена, и также включает в себя их сплайсинговые варианты. Подходящие замены, в том числе, хотя и необязательно, консервативные замены аминокислот, известны специалистам в этой области и могут быть получены без элиминирования биологической активности, такой как каталитическая активность, полученной молекулы. В данном контексте sHASEGP, в каждом случае упоминания, включает в себя по меньшей мере один полипептид или любую комбинацию из полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO:6, или последовательностью нуклеотидов, которая включает в себя нуклеотиды, которые кодируют аминокислоты 1-509 SEQ ID NO:1; полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется в условиях низкой, средней или высокой жесткости с последовательностью нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO:6; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-509 SEQ ID NO:1; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, имеющих по меньшей мере приблизительно 60, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO:1, или аминокислотами 1-448 SEQ ID NO:4. В частности, обеспечен полипептид sHASEGP с доменами гиалуронидазы, показанный в SEQ IDNO:4. Этот полипептид является одноцепочечным или двухцепочечным полипептидом. Обеспечены также его меньшие части, которые сохраняют гиалуронидазную активность. Домены гиалуронидазы изsHASEGP варьируются по размеру и структуре, включающей в себя инсерции и делеции в поверхностных петлях. Таким образом, для целей этого изобретения, каталитический домен является частью sHASEGP, определенного здесь, и он является гомологичным домену других гиалуронидаза-подобных по- 18011654 следовательностей, таких как HYAL1, HYAL2, HYAL3, которые были идентифицированы ранее; однако,не было известно, что выделенная одноцепочечная форма домена гиалуронидазы человека может функционировать в анализах in vitro. Аспартатные и глутаматные остатки, необходимые для активности, присутствуют в консервативных мотивах. В данном контексте нейтральный домен гиалуронидазы растворимого sHASEGP обозначает бета 1,4-эндоглюкозаминидазный домен sHASEGP, который проявляет гиалуронидазную активность при нейтральном pH, является растворимым в описанных условиях и имеет гомологию и общие структурные признаки с доменами семейства гиалуронидаза-гликозилгидролаз, но содержит дополнительные последовательности в карбоксиконце, которые требуются для нейтральной активности. Таким образом, он является по меньшей мере минимальной частью домена, который проявляет гиалуронидазную активность,как оценено стандартными анализами in vitro, и остается растворимым. Здесь обсуждаются такие домены гиалуронидазы и их каталитически активные части. Обеспечены также укороченные формы домена гиалуронидазы, которые включают в себя его наименьший фрагмент, который действует каталитически в одноцепочечной форме. В данном контексте и в этой области, нейтральным или нейтрально-активным называют белок, проявляющий активность при нейтральном pH (например, проявляющим активность при приблизительно pH 7) и который, следовательно, является активным в диапазоне pH, характерном для многих физиологических тканей. Как будет также понятно специалистам в этой области, белок обычно обнаруживает некоторый диапазон активности около его оптимального pH. Оптимальный pH нейтрально-активного белка будет обычно находиться в пределах одной-нескольких единиц pH выше или ниже pH 7, но его диапазон активности может простираться на протяжении многих единиц pH. Домен гуалуронидазы sHASEGP, в каждом случае упоминания, включает в себя по меньшей мере один или все или любую комбинацию или каталитически активную часть N-связанного полипептида гликопротеина, который включает в себя последовательность аминокислот, представленную в SEQ IDNO:1; полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется в условиях низкой, средней или высокой жесткости с последовательностью нуклеотидов, представленной в SEQ IDID NO:1; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, имеющих по меньшей мере приблизительно 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ IDNO:1; и/или домен гиалуронидазы полипептида, кодируемого сплайсинговым вариантом sHASEGP. Таким образом, для целей этого изобретения домен гиалуронидазы является частью sHASEGP, определенной здесь, и является гомологичным домену других sHASEGP. Как и в случае большего класса ферментов семейства гиалуронидаз, каталитические домены sHASEGP имеют высокую степень идентичности аминокислотной последовательности. Остатки Asp и Glu, необходимые для активности, присутствуют в консервативных мотивах. Под активной формой имеют в виду форму, активную in vivo и/или in vitro. Как описано здесь, домен гиалуронидазы также может существовать в виде растворимого секретируемого гликопротеина. Здесь показано, что, по меньшей мере, in vitro, одноцепочечные формы sHASEGP и их каталитические домены или ферментативно активные части (обычно С-концевые укорочения) проявляют гиалуронидазную активность. Таким образом, здесь обеспечены выделенные формы доменов гиалуронидазы sHASEGP и их применение в анализах скрининга лекарственных средств in vitro для идентификации агентов,которые модулируют их активность. В данном контексте каталитически активным доменом sHASEGP называют домен нейтральноактивной эндогликозаминидазы, определенный по активности in vitro в отношении гликозаминогликана в качестве субстрата. Представляющие интерес sHASEGP включают в себя sHASEGP, которые являются активными против хондроитинсульфатов и хондроитинсульфатпротеогликанов (CSPG) in vivo и in vitro; и sHASEGP,которые являются активными против гиалуронана. В этом контексте sHASEGP человека является sHASEGP, кодируемым нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, присутствующей в геноме человека, включающей в себя все аллельные варианты и консервативные вариации, пока они не являются вариантами,обнаруживаемыми в других млекопитающих. В данном контексте термин нуклеиновая кислота, кодирующая домен гиалуронидазы или каталитически активную часть sHASEGP должен пониматься как относящийся к нуклеиновой кислоте, кодирующей только указанный одноцепочечный домен гиалуронидазы или его активную часть, а не другие смежные часть sHASEGP в виде непрерывной последовательности. В данном контексте заболеванием или нарушением называют патологическое состояние в организме, возникающее, например, в результате инфекции или генетического дефекта, и характеризующееся идентифицируемыми симптомами. В данном контексте сплайсинговым вариантом называют вариант, производимый отличающимся процессингом первичного транскрипта геномной нуклеиновой кислоты, например, ДНК, который приводит к более чем одному типу мРНК. Здесь обеспечены сплайсинговые варианты sHASEGP. В данном контексте доменом белка гиалуронидазы sHASEGP называют домен гиалуронидазы sHA- 19011654SEGP, который проявляет нейтральную эндоглюкозаминидазную активность. Таким образом, он является по меньшей мере минимальной частью белка, которая проявляет эндоглюкозаминидазную активность,оцениваемую стандартными анализами in vitro. Примеры доменов гиалуронидазы человека включают в себя по меньшей мере достаточную часть последовательностей аминокислот, представленную в SEQ IDNO:4, для проявления эндоглюкозаминидазной активности. Рассматриваются также молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, который имеет эндоглюкозаминидазную активность в анализе гиалуронидазы in vitro, и которые имеют по меньшей мере 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с полной длиной домена гиалуронидазы полипептида sHASEGP или которые гибридизуются вдоль их полной длины или вдоль по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% полной длины с нуклеиновыми кислотами, которые кодируют домен гиалуронидазы, в частности, в условиях средней, обычно высокой, жесткости. Например, для доменов гиалуронидазы РН 20 остатки в N-концевом районе могут быть решающими, но еще не достаточными для активности. С использованием таких способов, какие описаны здесь,можно генерировать домены гиалуронидазы sHASEGP, которые являются каталитически активными. В качестве иллюстрации, в то время как домен гиалуронидазы РН 20 человека требует N-концевых аминокислот для активности, С-концевая часть может быть укорочена до последнего остатка цистеина, но все еще требует дополнительных аминокислот для того, чтобы быть оптимально активной. Количество, которое может быть удалено, может быть определено эмпирически испытанием этого полипептида на гиалуронидазную активность в анализе in vitro, который оценивает каталитическое расщепление. Таким образом, обсуждаются меньшие части доменов гиалуронидазы, в частности, их одноцепочечные домены, которые сохраняют гиалуронидазную активность. Такие меньшие версии обычно являются укороченными на С-конце версиями доменов гиалуронидазы. Домены гиалуронидазы варьируются по размеру и структуре, включающей в себя инсерции и делеции в поверхностных петлях. Такие домены обнаруживают консервативную структуру, включающую в себя по меньшей мере один структурный признак, такой как донор протона, и/или другие признаки доменов гиалуронидазы эндоглюкозаминидаз. Таким образом, для целей этого изобретения домен гиалуронидазы является одноцепочечной частьюsHASEGP, как определено здесь, но является гомологичным по его структурным признакам и сохранению последовательности сходства или гомологии домена гиалуронидазы других гиалуронидазаподобных последовательностей. Этот гликопротеин проявляет гиалуронидазную активность в виде отдельной цепи. В данном контексте термин гомологичный обозначает приблизительно большую чем 25% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, такую как 25, 40, 60, 70, 80, 90 или 95%. Если необходимо, будет указываться процентная гомология. Термины гомология и идентичность часто используются взаимозаменяемо. Обычно, последовательности сопоставляют таким образом, что получают совпадение наивысшего порядка (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., OxfordCarillo et al. (1988) Slam J Applied Math 48: 1073). По идентичности последовательности, количества консервативных аминокислот определяют при помощи стандартных программ алгоритмов сопоставления и используют штрафы за гэп по умолчанию,устанавливаемые каждым поставщиком. По существу, гомологичные молекулы нуклеиновых кислот обычно гибридизуются в условиях средней жесткости или в условиях высокой жесткости вдоль всей длины нуклеиновой кислоты или вдоль по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% представляющей интерес полноразмерной нуклеиновой кислоты. Обсуждаются также молекулы нуклеиновых кислот,которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующейся молекуле нуклеиновой кислоты. Имеют ли любые две молекулы нуклеиновых кислот нуклеотидные последовательности, которые являются по меньшей мере, например, на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными, может быть определено с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FASTA", использующая, например, параметры по умолчанию, описанные в Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85: 2444 (другие программы включают в себя пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S. F. et al., J Molec Biol 215:403 (1990);(1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, функция BLAST базы данных Национального Центра Информации по Биотехнологии может быть использована для определения идентичности. Другие коммерчески или публично доступные программы включают в себя DNASTAR "MEGALIGN" PROGRAM(Madison, WI) и программу "Gap" (Madison WI) Компьютерной Группы Генетики Висконсинского Университета (UWG). Процентная гомология или идентичность молекул белков и/или нуклеиновых кислот может быть определена, например, сравнением информации последовательности с использованием ком- 20011654 пьютерной программы GAP, например, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, обновленную Smithand Waterman Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Вкратце, программа GAP определяет сходство как количество сопоставленных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее количество символов в более короткой из этих двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать в себя: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую величину 1 для идентичности и 0 для неидентичностей) и взвешенного сравнения Gribskov et al. (1986)Nucl. Acids Res. 14: 6745, описанную Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого гэпа и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом гэпе; и (3) отсутствие штрафа для концевых гэпов. Таким образом, в данном контексте, термин идентичность представляет сравнение между тестируемым полипептидом или полинуклеотидом и ссылочным полипептидом или полинуклеотидом. В данном контексте термин по меньшей мере на 90% идентичная относится к процентным идентичностям от 90 до 99,99 относительно ссылочных полипептидов. Идентичность на уровне 90% или более указывает на тот факт, что, предположим, с целью примера, сравнивают тестируемый и ссылочный полипептид с длиной 100 аминокислот. Не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в тестируемом полипептиде отличаются от аминокислот ссылочных полипептидов. Подобные сравнения могут быть произведены между тестируемым и ссылочным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точковых мутаций, распределенных на протяжении всей длины аминокислотной последовательности, или они могут быть в виде кластеров в одном или нескольких местоположениях варьирующейся длины до максимально позволяемой, например, различие 10/100 аминокислот (приблизительно 90% идентичность). Различия определяют как замены нуклеиновых кислот или аминокислот, или делеции. При уровне гомологий или идентичностей, более высоких, чем приблизительно 85-90%, этот результат должен быть независимым от программы и набора параметров гэпа; такие высокие уровни идентичности могут быть легко определены, часто без применения программного обеспечения. В данном контексте праймером называют олигонуклеотид, содержащий два или более дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, обычно более чем три нуклеотида, от которых может быть инициирован синтез продукта удлинения праймера. Экспериментальные условия, благоприятные для синтеза, включают в себя присутствие нуклеозидтрифосфатов и агента полимеризации и удлинения, такого как ДНК-полимераза, и подходящие буфер, температуру и pH. В данном контексте животные включают в себя любое животное, такое как, но не только, козы, коровы, олени, овцы, грызуны, свиньи и люди. Термин животные, не являющиеся человеком исключает человека в качестве рассматриваемого животного. Обеспеченные здесь sHASEGP получены из любого источника, животного, растительного, прокариотического или грибного происхождения. Предпочтительные sHASEGP происходят от животного, в том числе человека, и, более предпочтительно, происходят от человека в случае их применения в людях. В данном контексте генетическая терапия (генотерапия) включает в себя перенос гетерологичной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, в определенные клетки, клетки-мишени, млекопитающего, в частности, человека, с нарушением или состояниями, для которых ведется поиск такой терапии. Нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, вводят в выбранные клетки-мишени таким образом, что эта гетерологичная нуклеиновая кислота, например, ДНК, экспрессируется, и образуется терапевтический продукт, кодируемый ею. Альтернативно, гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, может некоторым образом опосредовать экспрессию ДНК, которая кодирует этот терапевтический продукт, или она может кодировать продукт, например, пептид или РНК, который некоторым образом опосредует, прямо или косвенно,экспрессию терапевтического продукта. Генетическая терапия может быть также использована для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена, который вытесняет дефектный ген или дополняет продукт гена, продуцируемый млекопитающим или клеткой, в которые ее вводят. Введенная нуклеиновая кислота может кодировать терапевтическое соединение, такое как фактор роста или его ингибитор,или фактор некроза опухолей или его ингибитор, например, его рецептор, который в норме не продуцируется в млекопитающем-хозяине или который не продуцируется в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически приемлемое время. Эта гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, кодирующая этот терапевтический продукт, может быть модифицирована перед введением в клетки пораженного хозяина для увеличения или другим образом изменения этого продукта или его экспрессии. Генетическая терапия может также включать в себя доставку ингибитора или репрессора или другого модулятора экспрессии генов. В данном контексте гетерологичной нуклеиновой кислотой является нуклеиновая кислота, которая кодирует белки (или, если она является ДНК, то она кодирует РНК, которая кодирует белки), которые в норме не продуцируются in vivo клеткой, в которой она экспрессируется, или которая опосредует или кодирует медиаторы, которые изменяют экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК,действием на транскрипцию, трансляцию или другие регулируемые биохимические процессы. Гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, может также называться чужеродной нуклеиновой кислотой, такой как ДНК. Любая нуклеиновая кислота, такая как ДНК, которая известна специалисту в этой- 21011654 области, и рассматривается им как гетерологичная или чужеродная для клетки, в которой она экспрессируется, считается здесь гетерологичной нуклеиновой кислотой; гетерологичная нуклеиновая кислота включает в себя экзогенно добавленную нуклеиновую кислоту, которая также экспрессируется эндогенно. Примеры гетерологичной нуклеиновой кислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, нуклеиновую кислоту, которая кодирует прослеживаемые маркерные белки, такие как белок, придающий устойчивость к лекарственному средству, нуклеиновую кислоту, которая кодирует терапевтически эффективные вещества, такие как противораковые агенты, ферменты и гормоны, и нуклеиновые кислоты(такие как ДНК и РНК), которые опосредованно или непосредственно кодируют другие типы белков,такие как антитела. Антитела, которые кодируются гетерологичной нуклеиновой кислотой, могут быть секретируемыми или экспрессируемыми на поверхности клетки, в которую была введена гетерологичная нуклеиновая кислота. Гетерологичная нуклеиновая кислота является обычно не эндогенной для клетки, в которую ее вводят, а была получена из другой клетки или получена синтетически. Обычно, хотя и необязательно, такая нуклеиновая кислота кодирует РНК и/или белки, которые в норме не продуцируются клеткой, в которой она экспрессируется. В данном контексте терапевтически эффективный продукт является продуктом, который кодируется гетерологичной нуклеиновой кислотой, обычно ДНК, которая после введения этой нуклеиновой кислоты в хозяина экспрессирует продукт, который ослабляет или элиминирует симптомы, проявления наследственного или приобретенного заболевания или который излечивает это заболевание. В данном контексте фраза, что гликопротеин состоит в основном из домена гиалуронидазы, означает, что только часть sHASEGP этого полипептида является доменом гиалуронидазы или его каталитически активной частью. Этот полипептид может, необязательно, и обычно будет включать в себя происходящие не из sHASEGP последовательности аминокислот. В данном контексте доменом называют часть молекулы, например, гликопротеинов или кодирующих нуклеиновых кислот, которая структурно и/или функционально отличается от других частей этой молекулы. В данном контексте гиалуронидаза является ферментом, катализирующим гидролиз гликозаминогликанов, в том числе гиалуронанов. Для ясности, ссылка на гиалуронидазу относится ко всем формам, и конкретные формы будут особо обозначены. Для целей этого изобретения домен гиалуронидазы включает в себя мембраносвязанные и растворимые формы белка sHASEGP. В данном контексте нуклеиновые кислоты включают в себя ДНК, РНК и их аналоги, в том числе протеиннуклеиновые кислоты (ПРК) и их смесь. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. При упоминании зондов или праймеров, необязательно меченых детектируемой меткой, такой как флуоресцентный краситель или радиоактивная метка, обычно обсуждаются одноцепочечные молекулы. Такие молекулы имеют обычно такую длину, что их мишень является статистически уникальной, или имеют низкое число копий (обычно менее чем 5, в общем, менее чем 3) для зондирования или праймирования библиотеки. Как известно в этой области, обычно зонд или праймер содержит по меньшей мере 14, 16, 20 или 30 остатков смежной или почти смежной последовательности, комплементарной или идентичной представляющему интерес гену. Зонды и праймеры могут иметь длину 10, 20, 30,50, 100 или более нуклеотидов. В данном контексте нуклеиновую кислоту, кодирующую фрагмент или часть sHASEGP, называют нуклеиновой кислотой, кодирующей только указанный фрагмент или указанную часть sHASEGP, а не другие смежные части этого sHASEGP. В данном контексте функциональное связывание гетерологичной нуклеиновой кислоты с регуляторными и эффекторными последовательностями нуклеотидов, такими как промоторы, энхансеры, стопсайты транскрипции и трансляции и другие сигнальные последовательности, обозначают связь между такой нуклеиновой кислотой, например, ДНК, и такими последовательностями нуклеотидов. Например,функциональной связью гетерологичной ДНК с промотором является функциональная (и обычно физическая) связь между этой ДНК и этим промотором, так что транскрипция такой ДНК инициируется от промотора PHK-полимеразой, которая специфически узнает эту ДНК, связывается с ней и транскрибирует эту ДНК в рамке считывания. Таким образом, функционально или оперативно связанные обозначает функциональную связь нуклеиновой кислоты, например, ДНК, с регуляторными и эффекторными последовательностями нуклеотидов, такими как промоторы, энхансеры, стоп-сайты транскрипции и трансляции и другими сигнальными последовательностями. Для оптимизации экспрессии и/или транскрипции invitro может быть необходимым удаление, добавление или изменение 5'-нетранслируемых частей этих клонов для элиминирования лишних, потенциально неподходящих альтернативных кодонов инициации трансляции, т.е. стартовых кодонов или других последовательностей, которые препятствуют экспрессии или уменьшают экспрессию либо на уровне транскрипции, либо на уровне трансляции. Альтернативно,консенсусные сайты связывания рибосом (см., например, Kozak J. Biol. Chem. 266: 19867-19870 (1991 могут быть встроены непосредственно 5' (слева) от стартового кодона и могут усиливать экспрессию. Желательность (или необходимость) такой модификации может быть определена эмпирически.- 22011654 В данном контексте последовательность, комплементарная по меньшей мере части РНК, со ссылкой на антисмысловые олигонуклеотиды, означает последовательность, имеющую достаточную комплементарность, чтобы быть в состоянии гибридизоваться с этой РНК, обычно в условиях средней или высокой жесткости, с образованием стабильного дуплекса; в случае двухцепочечных антисмысловых нуклеиновых кислот sHASEGP, одна цепь этой дуплексной ДНК (или dsDNA) может быть испытана таким образом, или может быть анализировано образование триплекса. Способность гибридизоваться зависит от степени комплементарности и длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Обычно, чем длиннее гибридизующаяся нуклеиновая кислота, тем больше ошибочных спариваний с кодирующей sHASEGP PHK она может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс, в зависимости от обстоятельств). Специалист в данной области может определить допустимую степень ошибочного спаривания с использованием стандартных процедур для определения точки плавления гибридизованного комплекса. Для целей этого изобретения могут быть произведены аминокислотные замены в любом из sHASEGP и доменов гиалуронидазы, при условии, что полученный белок проявляет гиалуронидазную активность. Рассматриваемые аминокислотные замены включают в себя консервативные замены, такие как замены, представленные в табл. 1, и другие модификации, которые не элиминируют протеолитическую активность. Как описано здесь, рассматриваются также замены, которые изменяют свойства этих белков,такие как удаление сайтов расщепления и других подобных сайтов, такие замены обычно являются неконсервативными, но могут быть легко выполнены специалистами в этой области. Подходящие консервативные замены аминокислот известны специалистам в этой области и могут быть произведены обычно без элиминирования (и предпочтительно по существу без изменения) биологической активности, например, ферментативной активности, полученной молекулы. Специалистам в данной области известно, что обычно отдельные аминокислотные замены в заменимых районах полипептида по существу не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224). В это определение включен также каталитически активный фрагмент sHASEGP, в частности, одноцепочечная часть гиалуронидазы. Консервативные аминокислотные замены производят, например, в соответствии с заменами, представленными в табл. 1, следующим образом. Таблица 1. Консервативная замена исходного остатка Другие замены являются также пермиссивными и могут быть определены эмпирически или в соответствии с известными консервативными заменами. В данном контексте Abu обозначает 2-аминомасляную кислоту; Nle обозначает норлеуцин, Nva обозначает норвалин; Orn обозначает орнитин. В данном контексте аминокислоты, которые встречаются в различных аминокислотных последовательностях, представленных здесь, идентифицируются в соответствии с их хорошо известными, трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами. Нуклеотиды,которые встречаются в различных ДНК-фрагментах, обозначаются стандартными однобуквенными обозначениями, используемыми рутинным образом в этой области. В данном контексте зонд или праймер, основанные на нуклеотидной последовательности, описанной здесь, включает в себя последовательность по меньшей мере 10, 14, обычно последовательность по меньшей мере 16 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:6 и даже более предпочтительно, последовательность по меньшей мере 20, 30, 50 или 100 смежных нуклеотидов SEQ ID NO:6. Длина зонда или праймера для уникальной гибридизации зависит от сложности представляющего интерес генома. В данном контексте ослаблением симптомов конкретного нарушения посредством введения конкретной фармацевтической композиции называют любое ослабление, независимо от того, является ли оно перманентным или временным, продолжительным или транзиторным, которое может быть приписано введению или ассоциировано с введением этой композиции. В данном контексте антисмысловыми полинуклеотидами называют синтетические последовательности нуклеотидных оснований, комплементарные мРНК или смысловой цепи двухцепочечной ДНК. Смешивание смысловых и антисмысловых полинуклеотидов при подходящих условиях приводит к связыванию этих двух молекул, или гибридизации. Когда эти полинуклеотиды связываются с мРНК (гибридизуются с мРНК), происходит ингибирование синтеза белка (трансляции). Когда эти полинуклеотиды связываются с двухцепочечной ДНК, происходит ингибирование синтеза РНК (транскрипции). Полученное ингибирование трансляции и/или транскрипции приводит к ингибированию синтеза- 23011654 белка, кодируемого смысловой цепью. Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты обычно содержит достаточное число нуклеотидов для специфического связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью,обычно по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов, часто по меньшей мере 14 или 16 или 30 смежных нуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, комплементарных кодирующей части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует представляющий интерес ген, например, нуклеиновой кислоты,кодирующей одноцепочечный домен гиалуронидазы sHASEGP. В данном контексте матрицей (массивом) называют собрание элементов, таких как антитела, содержащее три или более членов. Адресной матрицей является матрица, в которой члены этой матрицы являются идентифицируемыми, обычно по положению на твердофазном носителе. Таким образом,обычно члены этой матрицы иммобилизованы на дискретных идентифицируемых локусах на поверхности твердой фазы. В данном контексте антителом называют иммуноглобулин, независимо от того, является ли он природным или частично или полностью полученным синтетически, в том числе любое его производное,которое сохраняет способность специфического связывания этого антитела. Таким образом, антитело включает в себя любой белок, имеющий связывающий домен, который является гомологичным или по существу гомологичным иммуноглобулинсвязывающему домену. Антитела включают в себя члены любых классов иммуноглобулина, в том числе IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. В данном контексте фрагмент антитела является любым производным антитела, которое является меньшим, чем полная длина антитела, сохраняющим по меньшей мере часть специфической связывающей способности полноразмерного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечные Fv (scFv), Fv, dsFv-диатела и Fd. Фрагмент может включать в себя множественные цепи, связанные вместе, например, при помощи дисульфидных мостиков. Фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот и обычно по меньшей мере 200 аминокислот. В данном контексте Fv-фрагмент антитела состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи(VH) и одного вариабельного домена легкой цепи (VL), связанных нековалентными взаимодействиями. В данном контексте dsFv обозначает Fv со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью. В данном контексте F(ab')2-фрагмент является фрагментом антитела, который происходит из расщепления иммуноглобулина пепсином при pH 4,0-4,5; он может быть экспрессирован рекомбинантно с получением эквивалентного фрагмента. В данном контексте Fab-фрагменты являются фрагментами антител, которые происходят из расщепления иммуноглобулина папаином; они могут быть экспрессированы рекомбинантно с получением эквивалентного фрагмента. В данном контексте scFv обозначает фрагменты антител, которые содержат вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), ковалентно соединенные полипептидным линкером в любом порядке. Этот линкер имеет такую длину, что эти два вариабельных домена соединяются мостиком без существенной интерференции. Включенными линкерами являются n остатков (GlySer) с несколькими остатками Glu или Lys, рассеянными по всей молекуле, для увеличения растворимости. В данном контексте гуманизированными антителами называют антитела, которые модифицированы таким образом, что они включают в себя последовательности аминокислот человека, так что введение человеку не провоцирует иммунный ответ. Способы получения таких антител известны. Например, для получения таких антител гибридому или другую прокариотическую или эукариотическую клетку, такую как клетка E. coli или CHO, которая экспрессирует моноклональное антитело, изменяют способами рекомбинантных ДНК для экспрессии антитела, в котором аминокислотный состав невариабельного района основан на антителах человека. Созданы компьютерные программы для идентификации таких районов. В данном контексте диателами являются димерные scFv; диатела обычно имеют более короткие пептидные линкеры, чем scFv, и они обычно димеризуются. В данном контексте получение рекомбинантными способами при помощи способов рекомбинантных ДНК обозначает применение хорошо известных способов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированными ДНК. В данном контексте термин оценка включает в себя количественное и качественное определение для получения абсолютной величины для активности sHASEGP или его домена, присутствующих в пробе, а также получения индекса, степени, процента, визуальной или другой величины, являющейся показателем уровня этой активности. Оценка может быть прямой или непрямой, и химические молекулярные частицы, фактически детектируемые, не должны быть, конечно, самим продуктом протеолиза, но могут быть, например, производным этого продукта или некоторым другим веществом. В данном контексте биологической активностью называют активности in vivo соединения или физиологические реакции, которые получают после введения in vivo соединения, композиции или другой смеси. Таким образом, биологическая активность включает в себя терапевтические эффекты и фармацев- 24011654 тическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологические активности могут наблюдаться в системах in vitro, предназначенных для тестирования или использования таких активностей. Таким образом, для целей этого изобретения биологической активностью люциферазы является ее оксигеназная активность, посредством которой, после окисления субстрата, образуется свет. В данном контексте термин функциональная активность относится к полипептиду или его части,которая проявляет одну или несколько активностей, ассоциированных с полноразмерным белком. Функциональные активности включают в себя, но не ограничиваются ими, биологическую активность, каталитическую или ферментативную активность, антигенность (способность связываться или конкурировать с полипептидом за связывание с антителом против полипептида), иммуногенность, способность образовывать мультимеры, способность специфически связываться с рецептором или лигандом этого полипептида. В данном контексте конъюгатом называют обеспеченные здесь соединения, которые включают в себя один или несколько HASEGP, в том числе sHASEGP, в частности, его одноцепочечные домены, и один или несколько нацеливающих агентов. Эти конъюгаты включают в себя конъюгаты, полученные химическими способами, такими как химическое связывание, например, посредством связывания с сульфгидрильными группами, и конъюгаты, полученные любым другим способом, посредством которого по меньшей мере один sHASEGP или его домен связывается прямо или опосредованно через линкер(линкеры) с нацеливающим агентом. В данном контексте нацеливающим агентом является любая часть молекулы, такая как белок или его эффективная часть, которые обеспечивают специфическое связывание этого конъюгата с рецептором клеточной поверхности, который интернализует этот конъюгат или его sHASEGP-часть. Нацеливающим агентом может также быть агент, который активирует или облегчает, например, аффинное выделение или очистку этого конъюгата; присоединение этого конъюгата к поверхности или детектирование этого конъюгата или комплексов, содержащих этот конъюгат. В данном контексте конъюгатом антитела называют конъюгат, в котором нацеливающим агентом является антитело. В данном контексте производное или аналог молекулы является частью, произведенной из этой молекулы или модифицированной версией этой молекулы. В данном контексте эффективным количеством соединения для лечения конкретного заболевания является количество, которое является достаточным для улучшения симптомов или в некоторой степени уменьшения симптомов, связанных с этим заболеванием. Такое количество может быть введено в единственной дозе или может быть введено в соответствии со схемой введения, при которой оно является эффективным. Это количество может лечить это заболевание, но обычно его вводят для улучшения симптомов этого заболевания. Для достижения желаемого улучшения симптомов может быть необходимым повторяемое введение. В данном контексте термин эквивалентные при ссылке на две последовательности нуклеиновых кислот обозначает, что эти две рассматриваемые последовательности кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность или эквивалентные белки. При использовании этого термина в отношении двух белков или пептидов он означает, что эти два белка или пептида имеют по существу одно и ту же аминокислотную последовательность, имеющую только аминокислотные замены (такие как, но не только, консервативные замены, такие как представленные в табл. 1 выше), которые по существу не изменяют активность или функцию этого белка или пептида. Когда термин эквивалентные относится к свойствам, это свойство не должно присутствовать в той же самой степени (например, два пептида могут проявлять разные скорости одного и того же типа ферментативной активности), но эти активности обычно являются по существу одинаковыми. Термин комплементарные, при ссылке на две нуклеотидные последовательности, означает, что эти две последовательности нуклеотидов способны гибридизоваться,обычно с менее чем 25, 15, 5 или 0% ошибочных спариваний между противостоящими нуклеотидами. Если необходимо, будет указываться процент комплементарности. Обычно эти две молекулы выбирают таким образом, что они будут гибридизоваться в условиях высокой жесткости. В данном контексте агент, который модулирует активность белка или экспрессии гена или нуклеиновой кислоты, либо уменьшает, либо увеличивает или другим образом изменяет активность этого белка или, каким-либо образом, повышает или понижает или другим образом изменяет экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетке. В данном контексте ингибитор активности sHASEGP включает в себя любое вещество, которое препятствует продуцированию, посттрансляционной модификации (посттрансляционным модификациям), созреванию или мембранной локализации sHASEGP или уменьшает эти процессы, или любое вещество, которое препятствует протеолитической эффективности или уменьшает протеолитическую эффективность sHASEGP, в частности, одноцепочечной формы, в анализе-скрининге in vitro. В данном контексте способ лечения или предупреждения неопластического заболевания означает,что любые из его симптомов, такие как опухоль, ее метастазирование, васкуляризация опухолей или другие параметры, которыми характеризуется это заболевание, уменьшаются, улучшаются, предотвращаются, переходят в состояние ремиссии или поддерживаются в состоянии ремиссии. Это означает также, что- 25011654 отличительные признаки неопластического заболевания и метастазирование могут быть элиминированы,уменьшены или предупреждены этим лечением. Неограничивающие примеры этих отличительных признаков заболевания включают в себя неконтролируемое разрушение базальной мембраны и проксимального внеклеточного матрикса, миграцию, деление и организацию эндотелиальных клеток в новые функционирующие капилляры и персистирование таких функционирующих капилляров. В данном контексте фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или другие производные этих конъюгатов включают в себя любые соли, сложные эфиры или производные, которые могут быть легко получены специалистами в этой области с использованием известных способов для такой дериватизации и которые дают соединения, которые могут вводиться животным или людям без существенных токсических эффектов и которые являются фармацевтически активными или являются пролекарствами. В данном контексте пролекарством является соединение, которое, после введения in vivo, метаболизируется или другим образом превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически активную форму этого соединения. Для получения пролекарства фармацевтически активное соединение модифицируют таким образом, что это активное соединение регенерируется метаболическими процессами. Это пролекарство может быть предназначено для изменения метаболической стабильности или характеристик транспорта лекарственного средства, для маскирования побочных действий или токсичности, для улучшения вкуса лекарственного средства или для изменения других характеристик или свойств лекарственного средства. Благодаря знанию фармакологических процессов и метаболизма лекарственного средства in vivo, специалисты в этой области, как только фармацевтически активное соединение идентифицировано, могут создавать пролекарства этого соединения (см., например, Nogrady(1985) Medicinal Chemistry, A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392). В данном контексте лекарственным средством, идентифицированным способами скрининга, обеспеченными здесь, называют любое соединение, которое является кандидатом для применения в качестве терапевтического средства или в качестве соединения-примера для создания терапевтического средства. Такими соединениями могут быть малые молекулы, в том числе малые органические молекулы, пептиды, миметики пептидов, антисмысловые молекулы или dsRNA (двухцепочечные РНК), такие как siRNA(малые интерферирующие РНК), антитела, фрагменты антител, рекомбинантные антитела и другие подобные соединения, которые могут служить в качестве кандидатов лекарственных средств или соединений-примеров. В данном контексте пептидомиметиком является соединение, которое имитирует конформацию и некоторые стереохимические признаки биологически активной формы конкретного пептида. Обычно,пептидомиметики создают для имитации некоторых желаемых свойств соединения, но без нежелательных свойств, таких как пластичность, которые приводят к потере биологически активной конформации и разрыву связей. Пептидомиметики могут быть получены из биологически активных соединений заменой определенных групп или связей, которые способствуют нежелательным свойствам, биоизостерами. Биоизостеры известны специалистам в этой области. Например, биоизостер метилена CH2S был использован в качестве замены амида в аналогах энкефалина (см., например, Spatola (1983) pp. 267-357 in Chemistryand Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weistein, Ed. Volume 7, Marcel Dekker, New York). Морфин, который может вводиться перорально, является соединением, которое является пептидомиметиком пептида эндорфина. Для целей этого изобретения среди пептидомиметиков включены циклические пептиды. В данном контексте промоторным районом или промоторным элементом называют сегмент ДНК или РНК, который регулирует транскрипцию ДНК или РНК, с которой он функционально связан. Этот промоторный район включает в себя специфические последовательности, которые являются достаточными для узнавания РНК-полимеразой, связывания и инициации транскрипции. Часть этого промоторного района называют промотором. Кроме того, промоторный район включает в себя последовательности, которые модулируют узнавание, связывание и активность инициации транскрипции РНК-полимеразы. Эти последовательности могут быть цис-действующими или могут быть чувствительными к транс-действующим факторам. Промоторы, в зависимости от природы их регуляции,могут быть консервативными или регулируемыми. Примеры промоторов, рассматриваемых для применения в прокариотах, включают в себя промоторы бактериофагов Т 7 и Т 3. В данном контексте рецептором называют молекулу, которая имеет аффинность в отношении конкретного лиганда. Рецепторы могут быть природными или синтетическими молекулами. Рецепторы могут также называться в данной области антилигандами. В данном контексте термины рецептор и антилиганд являются взаимозаменяемыми. Рецепторы могут быть использованы в их неизмененном состоянии или в виде агрегатов с другими молекулярными частицами. Рецепторы могут быть соединены, ковалентно или нековалентно, или находиться в физическом контакте, со связывающим членом, прямо или опосредованно через вещество специфического связывания или линкер. Примеры рецепторов включают в себя, но не ограничиваются ими: антитела, рецепторы клеточной мембраны, поверхностные рецепторы и интернализующие рецепторы, моноклональные антитела и антисыворотки, реактивные со специфическими антигенными детерминантами, например, на вирусах, клетках или других материалах, лекарственными средствами, полинуклеотидами, нуклеиновыми кислотами, пептидами, факторами, лектинами,- 26011654 сахарами, полисахаридами, клетками, клеточными мембранами и органеллами. Примеры рецепторов и применений с использованием таких рецепторов включают в себя, но не ограничиваются ими: а) ферменты: белки или ферменты специфического транспорта, важные для выживания микроорганизмов, которые могут служить в качестве мишеней для отбора антибиотиков [лигандов];b) антитела: может быть исследована идентификация лигандсвязывающего сайта на молекуле антитела,который объединяется с эпитопом представляющего интерес антигена; определение последовательности,которая имитирует антигенный эпитоп, может привести к развитию вакцин, причем их иммуноген основан на одной или нескольких из таких последовательностей, или привести к развитию родственных диагностических агентов или соединений, применимых в терапевтических способов лечения, например,для аутоиммунных заболеваний; с) нуклеиновые кислоты: идентификация лиганда, такого как белок или РНК, сайтов связывания; d) каталитические полипептиды: полимеры, в том числе полипептиды, которые способны активировать химическую реакцию, участвующую в превращении одного или нескольких реагирующих веществ в один или несколько продуктов; указанные полипептиды обычно включают в себя сайт связывания, специфический в отношении по меньшей мере одного реагирующего вещества или промежуточного продукта, и активную функциональную группу вблизи этого сайта связывания, причем эта функциональная группа способна химически модифицировать связанное реагирующее вещество (см.,например, патент США 5215899); е) рецепторы гормонов: определение лигандов, которые связываются с высокой аффинностью с рецептором, применимо в развитии гормональных заместительных терапий; например, идентификация лигандов, которые связываются с такими рецепторами, может привести к развитию лекарственных средств для регуляции кровяного давления; и f) опиатные рецепторы: определение лигандов, которые связываются с опиатными рецепторами в головном мозгу, применимо в развитии вызывающих меньшее привыкание заменителей морфина и родственных лекарственных средств. В данном контексте пробой называют все, что может содержать аналит, который желательно подвергнуть анализу. Этой пробой может быть биологическая проба, такая как биологическая проба или биологическая ткань. Примеры биологических жидкостей включают в себя мочу, кровь, плазму, сыворотку, слюну, семенную жидкость, мокроту, цереброспинальную жидкость, слезы, слизь, сперму, амниотическую жидкость или т.п. Биологические ткани являются агрегатами клеток, обычно конкретного типа,вместе с их межклеточным веществом, которые образуют один из структурных материалов структуры человека, животного, растения, бактериальной, грибной или вирусной структуры, в том числе соединительную ткань, эпителий, мышечную и нервную ткани. Примеры биологических тканей включают в себя также органы, опухоли, лимфатические узлы, артерии и отдельные клетки. В данном контексте условия жесткости гибридизации в определении процента ошибочных спариваний являются следующими: 1) условия высокой жесткости: 0,1SspE, 0,1% ДСН, 65C; 2) условия средней жесткости: 0,2SspE, 0,1% ДСН, 50C; 3) условия низкой жесткости: 1,0SspE, 0,1% ДСН, 50C. Специалистам в этой области известно, что эта стадия промывания производит отбор на стабильные гибриды, в также им известны ингредиенты SspE (см., например, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol 3, p. B. 13, см. также многочисленные каталоги, которые описывают обычно используемые лабораторные растворы).SspE является забуференным фосфатом pH 7,4 0,18NaCl. Кроме того, специалистам в данной области известно, что стабильность гибридов определяется TmT, которая является функцией концентрации иона натрия и температуры (Tm=81,5 С-16,6+0,41(%G+С)-600/л), так что единственными параметрами в условиях промывки, решающими для стабильности гибридов, являются концентрация ионов натрия в SspE(или SSC) и температура. Понятно, что эквивалентные условия жесткости могут быть достигнуты с использованием других буферов, солей и температур. В качестве примера, но не ограничения, процедуры, использующие условия низкой жесткости, являются следующими (см. также Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792 (1981: фильтры, содержащие ДНК, предобрабатывают в течение 6 ч при 40C в растворе,содержащем 35% формамид, 5 Х SSC, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,1% PVP, 0,1% Фиколл,1% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. (10 х) SSC обозначает 1,5 M хлорид натрия и 0,15 M цитрат натрия, доведенные до pH 7. Гибридизации проводят в том же самом растворе со следующими модификациями: 0,02% PVP,0,02% Фиколл, 0,2% БСА, 100 VG/M ДНК спермы, 10% (мас./об.) декстрансульфат и используют 520106 имп/мин 32 Р-меченого зонда. Фильтры инкубируют в смеси для гибридизации в течение 18-20 ч при 40 С и затем промывают в течение 1,5 ч при 55 С в растворе, содержащем 2 Х SSC, 25 мМ Трис-HCl(pH 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1% ДСН. Этот промывочный раствор заменяют свежим раствором и инкубируют дополнительно в течение 1,5 ч при 60C. Фильтры блоттируют досуха и экспонируют для авторадиографии. Если необходимо, фильтры промывают в третий раз при 65-68 С и повторно экспонируют на пленке. Другие условия низкой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в этой области, например, условия, используемые для перекрестно-видовых гибридизаций. В качестве примера, но не для ограничения, процедуры, использующие условия средней жесткости,- 27011654 включают в себя, например, но не только, процедуры, использующие такие условия средней жесткости,которые являются следующими: фильтры, содержащие ДНК, предобрабатывают в течение 6 ч при 55C в растворе, содержащем 6 Х SSC, 5 Х раствор Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизации проводят в том же самом растворе и используют 5-20106 имп/мин 32 Рмеченого зонда. Фильтры инкубируют в смеси для гибридизации в течение 18-20 ч при 55C и затем промывают дважды в течение 30 мин при 60C в растворе, содержащем 1X SSC и 0,1% ДСН. Фильтры блоттируют досуха и экспонируют для авторадиографии. Другие условия средней жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в этой области. Промывку фильтров выполняют при 37C в течение 1 ч в растворе, содержащем 2 Х SSC, 0,1% ДСН. В качестве примера и не для ограничения, процедуры, использующие условия высокой жесткости,являются следующими: предгибридизацию фильтров, содержащих ДНК, проводят в течение 8 ч - в течение ночи при 65C в буфере, состоящем из 6 Х SSC, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% PVP,0,02% Фиколл, 0,02% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Фильтры гибридизуют в течение 48 ч при 65C в предгибридизационной смеси, содержащей 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 5-20106 имп/мин 32P-меченого зонда. Промывку фильтров выполняют при 37C в течение 1 ч в растворе, содержащем 2 Х SSC, 0,01% PVP, 0,01% Фиколл и 0,01% БСА. Затем следует промывка в 0,1 Х SSC при 50C в течение 45 мин перед авторадиографией. Другие условия высокой жесткости,которые могут быть использованы, хорошо известны в этой области. Термин по существу идентичные или по существу гомологичные или сходные варьируется в зависимости от контекста, как понятно специалистам в этой области, и обычно обозначает по меньшей мере 60 или 70%, предпочтительно обозначает по меньшей мере 30, 85% или более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность. В данном контексте термин по существу идентичный относительно продукта обозначает достаточно сходный, так что представляющее интерес свойство является достаточно неизмененным, так что по существу идентичный продукт может быть использован вместо этого продукта. В данном контексте термин по существу чистое обозначает вещество, достаточно гомогенное,чтобы быть свободным от легко детектируемых примесей, как определено стандартными способами анализа, такими как тонкослойная хроматография (TCX), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ), используемые специалистами в этой области для оценки такой чистоты,или достаточно чистое, так что дополнительная очистка не могла бы детектируемо изменить физические и химические свойства, такие как ферментативные и биологические активности, этого вещества. Способы очистки этих соединений для получения по существу чистых соединений известны специалистам в этой области. Однако по существу химически чистые соединения могут быть, например, смесью стереоизомеров или изомеров. В таких случаях, дополнительная очистка может увеличивать удельную активность этого соединения. В данном контексте клеткой-мишенью называют клетку, которая экспрессирует sHASEGP (в связи с получением sHASEGP, описанным здесь), или клетку, которая является мишенью sHASEGP или совместно приготовленного или совместно вводимого агента in vivo (в связи с использованием sHASEGP для активации доставки фармакологических и других агентов в клетки-мишени, как описано здесь). В данном контексте тест-веществом (или тест-соединением) называют химически определенные соединения(например,органические молекулы,неорганические молекулы,органические/неорганические молекулы, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, липиды, полисахариды, сахариды или гибриды между этими молекулами, такие как гликопротеины, и т.д.) или смеси соединений (например, библиотеку тест-соединений, природные экстракты или культуральные супернатанты, и т.д.), действие которых на sHASEGP, в частности, на одноцепочечную форму, которая включает в себя домен гиалуронидазы или его часть, достаточную для активности, определяют способом invitro, таким как обеспеченные здесь анализы. В данном контексте термины терапевтический агент, схема лечения, радиотерапевтический агент или химиотерапевтический агент обозначают общепринятые лекарственные средства и лекарственные терапии, включающие в себя вакцины, которые известны специалистам в этой области. Радиотерапевтические агенты хорошо известны в данной области. В данном контексте терапия обозначает любой способ, в котором симптомы состояния, нарушения или заболевания улучшаются или выгодно изменяются другим образом. Терапия включает в себя также любое фармацевтическое применение описанных здесь композиций. В данном контексте вектором (или плазмидой) называют дискретные элементы, которые применяют для введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки либо для их экспрессии, либо для их репликации. Векторы обычно остаются эписомными, но могут быть сконструированы для выполнения интеграции гена или его части в хромосому генома. Обсуждаются также векторы, которые являются искусственными хромосомами, такие как дрожжевые искусственные хромосомы и искусственные хромосомы млекопитающих. Селекция и применение таких векторов хорошо известны специалистам в данной области. Термин экспрессирующий вектор включает в себя векторы, способный экспрессировать ДНК,- 28011654 которая функционально связана с регуляторными последовательностями, такими как промоторные районы, которые способны выполнять экспрессию таких ДНК-фрагментов. Таким образом, экспрессирующим вектором называют рекомбинантную конструкцию ДНК или РНК, такую как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор, который после введения в подходящую клетку-хозяина приводит к экспрессии этой клонированной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя векторы, которые являются реплицируемыми в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках и которые остаются эписомными или которые интегрируются в геном клетки-хозяина. В данном контексте белоксвязывающей последовательностью называют последовательность белка или пептида, которая способна специфически связываться с другими последовательностями белка или пептида, обычно с набором последовательностей белков и пептидов или с конкретной последовательностью белка или пептида. В данном контексте эпитопной меткой (тэгом) называют короткий отрезок аминокислотных остатков, соответствующий эпитопу, для облегчения последующего биохимического и иммунологического анализа меченого эпитопом белка или пептида. Эпитопное мечение достигается включением последовательности эпитопной метки в протеинкодирующую последовательность в подходящем экспрессирующем векторе. Меченые эпитопом белки могут быть аффинно очищены с использованием высокоочищенных антител, индуцированных против этих меток (тэгов). В данном контексте металлсвязывающей последовательностью называют последовательность белка или пептида, которая способна специфически связываться с ионами металлов, обычно с набором ионов металлов или с конкретным ионом металла. В данном контексте комбинацией называют любую ассоциацию между двумя или большим количеством компонентов. В данном контексте текучей средой называют любую композицию, которая может течь. Таким образом, термин текучие среды включает в себя композиции, которые находятся в форме полутвердых веществ, паст, растворов, водных смесей, гелей, лосьонов, кремов и других подобных соединений. В данном контексте клеточным экстрактом называют препарат или фракцию, которая приготовлена из лизированной или разрушенной клетки. В данном контексте говорят, что агент выбран случайным образом, когда этот агент выбран случайным образом без учета конкретных последовательностей, участвующих в ассоциации одного белка или белка с ассоциированными субстратами, партнерами связывания и т.д. Примером выбранных случайным образом агентов является использование химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки или бульона для выращивания организма или кондиционированной среды. В данном контексте говорят, что агент является логически выбранным или сконструированным, когда этот агент выбран не на случайной основе, которая учитывает последовательность сайта-мишени и/или его конформацию в связи с действием этого агента. Как описано в примерах, предложены сайты связывания для гиалуронидазы и (каталитические) сайты в гликопротеине, имеющем SEQ ID NO:1 илиSEQ ID NO:4. Агенты могут быть логически выбраны или логически сконструированы с использованием пептидных последовательностей, которые образуют эти сайты. Например, логически выбранным пептидным агентом может быть пептид, аминокислотная последовательность которого идентична сайтам связывания или доменам АТФ или кальмодулина. Считается, что олигосахариды имеют редуцирующий конец и нередуцирующий конец, независимо от того, является или не является сахарид на этом редуцирующем конце действительно редуцирующим сахаром. В соответствии с общепринятой номенклатурой, олигосахариды обозначены здесь с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа. Все описанные здесь олигосахариды описаны названием или аббревиатурой для нередуцирующего сахарида (например, Gal), за которой следует конфигурация гликозидной связи (альфа или бета), кольцевая связь, положение в кольце редуцирующего сахарида, участвующего в этой связи, и затем название или аббревиатура редуцирующего сахарида (например, GlcNAc). Связь между двумя сахарами может быть выражена, например, как 2,3, 2. fw darw.3,или (2,3). Каждый сахарид является пиранозой. В данном контексте N-связанной сахарной частью называют олигосахарид, присоединенный кsHASEGP через амидный азот остатков Asn. N-связанные олигосахариды делятся на несколько основных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфатированные), все из которых имеют (Man) 3GlcNAc-GlcNAc-кора, присоединенные через амидный азот остатков Asn, которые находятся в пределах-Asn-Xaa-Thr/Ser-последовательностей (где Хаа не является Pro). N-связанные сайты часто определяют непрямым путем по появлению холостого цикла во время секвенирования. Положительная идентификация может быть выполнена после высвобождения олигосахарида при помощи PNGase F, которая превращает гликозилированный Asn в Asp. После высвобождения при помощи фермента PNGase F, Nсвязанные олигосахариды могут быть очищены с использованием Bio-Gel P-6-хроматографии, причем пул олигосахаридов подвергают препаративной анионообменной хроматографии при высоком pH(HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Некоторые изомеры олигосахаридов могут быть разделены с использованием HPAEC. Фукозные остатки будут смещать положения элюции в сто- 29011654 рону более ранней элюции в хроматограмме HPAEC, тогда как дополнительные остатки сиаловой кислоты будут увеличивать время удерживания. Конкурентная обработка гликопротеинов, структуры олигосахаридов которых известны (например, бычий фетуин, а-1 кислотный гликопротеин, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) могут облегчать расшифровку (соотнесение) олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды могут быть охарактеризованы комбинацией анализов состава и анализов метилированных связей (Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304), причем аномерные конфигурации определяют ЯМР-спектроскопией (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230). Альтернативно, олигосахариды могут быть идентифицированы электрофорезом углеводов с использованием флуоресценции (FACE) Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281. В данном контексте термин сиаловая кислота относится к любому члену семейства 9-углеродных карбоксилированных сахаров. Наиболее обычным членом семейства сиаловых кислот является Nацетилнейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галактононулопираноз-1 оновая кислота (часто сокращаемая как Neu5Ac, NeuAc или NANA. Вторым членом этого семейства является N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc или NeuGc), в которой N-ацетильная группа NeuAc является гидроксилированной. Третьим членом семейства сиаловых кислот является 2-кето-3 деоксинонулосоновая кислота (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al.(1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819). В это семейство включены также 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-O-C.sub.1 - C.sub.6 ацил-Neu5Ac, такие как 9-O-лактил-Neu5 Ас или 9-O-ацетил-Neu5Ac,9-деокси-9-фтор-Neu5 Ас и 9-азидо-9-деокси-Neu5Ac. B отношении обзора семейства сиаловых кислот см., например, Varki (1992) Glycobiology 2: 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R.Schauer, Ed. (Springer-Verlag, N.Y. (1992). Синтез и применение производных сиаловых кислот в процедуре сиалирования описаны в Международной заявке WO 92/16640, опубликованной 1 октября 1992 г. В данном контексте PNGase (ПНГаза) обозначает специфическую в отношении пептида аспарагинаN-гликозидазу F, такую как пептид-N-гликозидаза F Flavobacterium maningoseptum. ПНГазные ферменты характеризуются их специфичностью в отношении N-связанных, а не О-связанных олигосахаридов. Характеристика ПНГазной эффективности может быть выполнена при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза или электрофореза углеводов с использованием флуоресценции. В данном контексте термин по существу терминированное сиалирование относится к Nсвязанным олигосахаридам, терминирующимся остатком сиаловой кислоты, в качестве терминального(конечного) сахара. Терминальные сиаловые кислоты могут быть идентифицированы анализом FACE высвобожденных углеводов после обработки нейраминидазой. Время пребывания в кровотоке гликопротеинов в крови в высокой степени зависит от состава и структуры их N-связанных углеводных групп. Этот факт имеет прямое отношение к терапевтическим гликопротеинам, которые предназначены для парентерального введения. Обычно, максимальный полупериод существования в кровотоке гликопротеина требует, чтобы его N-связанные углеводные группы заканчивались последовательностью NeuAc-Gal-GlcNAc. Без терминальной сиаловой кислоты (NeuAc) гликопротеин быстро выводится из крови при помощи механизма узнавания лежащих в его основе остатков N-ацетилгалактозамина (GalNAc) или галактозы (Gal) (Goochee et al. (1991) Biol/Technology 9: 1347-1355). По этой причине, гарантия присутствия терминальной сиаловой кислоты на N-связанных углеводных группах терапевтических гликопротеинов является важным моментом, который должен учитываться, для их коммерческого развития. Циркулирующие гликопротеины подвергают действию сиалидазы (или нейраминидазы), которая удаляет терминальные (концевые) остатки сиаловых кислот. Обычно удаление сиаловой кислоты обнажает галактозные остатки, и эти остатки узнаются и связываются галактоза-специфическими рецепторами в гепатоцитах (обзор в Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:531). Печень содержит также другие сахарспецифические рецепторы, которые опосредуют удаление гликопротеинов из кровотока. Такие рецепторы включают в себя рецепторы, специфические в отношении N-ацетилглюкозамина, маннозы, фукозы и фосфоманнозы. Гликопротеины, выводимые галактозными рецепторами гепатоцитов,подвергаются существенному расщеплению и затем поступают в желчь; гликопротеины, выводимые рецептором маннозы в клетках Купффера, поступают в ретикулоэндотелиальную систему (обзор в Ashwelland Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:53). В данном контексте нейтрально-активным называют гликопротеин sHASEGP с каталитической активностью в отношении гликозаминогликанового субстрата in vitro при pH 5-8 в условиях соли, меньшей чем 150 мМ, и буферящей силы, меньшей чем 50 мМ. В данном контексте стабилизированным раствором называют sHASEGP, который сохраняет более чем 60% его начальной активности после хранения при комнатной температуре в течение 30 дней. В данном контексте, если нет другого указания, единица выражена в уменьшающих мутность единицах (TRU). Одна TRU определена как величина гиалуронидазной активности, необходимая для уменьшения мутности подкисленного раствора гуалуроновой кислоты и эквивалентна единицам (NFU)U.S.P. через кривую стандартов образца гиалуронидазы/National Formulary (NF XIII). ELISA-подобный ферментный анализ, описанный здесь, относят к единице TRU, NFU и U.S.P. (например, USP или WHO стандарт), стандартизованной через Фармакопею США (U.S.P.). Таким образом, активности этого фер- 30
МПК / Метки
МПК: A01N 43/04, A01N 37/18, C12N 15/00, C07H 21/02, C07K 16/00, A01K 67/033, C12N 5/00, C07K 1/00
Метки: применения, способы, получения, гликозаминогликаназы, растворимых, гликозаминогликаназ, растворимые
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-11654-rastvorimye-glikozaminoglikanazy-i-sposoby-polucheniya-i-primeneniya-rastvorimyh-glikozaminoglikanaz.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ</a>
Нераспадающаяся твёрдая композиция для перорального применения с высокой дозой растворимых в воде лекарственных средств
Номер патента: 11374
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Джаин Раджеш, Сингх Сукхджит, Джиндал Коур Чанд
МПК: A61K 31/00, A61K 9/20
Метки: дозой, композиция, средств, воде, твёрдая, применения, нераспадающаяся, растворимых, высокой, перорального, лекарственных
Формула / Реферат:
1. Нераспадающаяся, неразрушающаяся, небиоадгезивная и ненабухающая пероральная фармацевтическая композиция с регулируемым высвобождением, содержащая по меньшей мере один водорастворимый в высокой дозе активный ингредиент, выбранный из группы, включающей от примерно 500 до примерно 800 мг антибиотиков, примерно 500 мг метформина, примерно 500 мг никотиновой кислоты и их фармацевтически приемлемых солей или производных, по меньшей мере один...
Аморфные бензотиофены, способы получения и способы применения
Номер патента: 2022
Опубликовано: 24.12.2001
Авторы: Таккар Арвинд Л., Кафф Джордж В.
МПК: A61K 31/381, A61P 19/08, C07D 333/52...
Метки: бензотиофены, аморфные, способы, получения, применения
Формула / Реферат:
1. Аморфная форма гидрохлорида 6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидинилэтокси)бензоил]бензо[b]тиофена формулы или его фармацевтически приемлемого сольвата. 2. Способ получения аморфной формы гидрохлорида 6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидинилэтокси)бензоил]бензо[b]тиофена формулы или его фармацевтически приемлемого сольвата, который включает получение раствора кристаллической формы гидрохлорида соединения формулы I в...
Пиразолпиридины и способы их получения и применения
Номер патента: 9441
Опубликовано: 28.12.2007
Авторы: Сунь Лихун, Чжэн Чжунли, Сингх Джусвиндер, Чуацюй Клаудио, БОРИАК-CЙОДИН Паула, Лайн Пол, Ли Вен-Чернг, Картер Мэри Бет
МПК: A61K 31/415, A61K 31/445
Метки: получения, применения, способы, пиразолпиридины
Формула / Реферат:
1. Соединение следующей формулы: где каждый из X1, X2, X3 и X4 независимо представляет собой CRx или N; при условии, что только два из числа X1, X2, X3 и X4 могут быть N одновременно; каждый из Y1 и Y2 независимо представляет собой CRy или N; при условии, что по крайней мере один из Y1 и Y2 должен являться N; каждый из R1 независимо представляет собой одну из следующих групп: алкил, алкенил, алкинил, алкоксил, галоген, гидрокси, амино, нитро,...
Пиразолы и способы их получения и применения
Номер патента: 10161
Опубликовано: 30.06.2008
Авторы: Петтер Расселл К., Бориак-Сйодин Паула Энн, Сунь Лихун, Сингх Джусвиндер, Шань Фэн, Чуацюй Клаудио, Понтз Тимоти У., Ли Вен-Чернг, Картер Мэрибет, Корнебайс Марк, Линг Леона
МПК: A01N 43/40, A01N 43/42, A01N 43/58...
Метки: пиразолы, применения, способы, получения
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (I) или его N-оксид, или фармацевтически приемлемая соль; где каждый Ra независимо представляет собой алкил, алкенил, галоген, циклоалкил; фрагмент -R1-R2-R3-R4 представляет собой водород, группы -S(O)2OH, -S(О)2NH2, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный циклоалкил, где необязательные заместители алкильной и циклоалкильной группы, каждый, представляют собой нитрил, амино, пирролидинил,тетразолил,...
Арилвинилазациклоалкановые соединения и способы их получения и применения
Номер патента: 10870
Опубликовано: 30.12.2008
Авторы: Женевуа-Борелла Ариель, Шев Мишель, Далл Гари Морис, Шмитт Джеффри Дэниел, Капе Марк
МПК: A61K 31/44, A61K 31/505, A61K 31/506...
Метки: применения, арилвинилазациклоалкановые, соединения, способы, получения
Формула / Реферат:
1. Арилвинилазациклоалкановые соединения формулы где волнистая линия представляет различные возможные геометрии (Е или Z) двойной связи; X представляет азот; R1 представляет водород или галоген; R3 представляет водород; m равно 1-3; n равно 1-3; и их изомеры, смеси, энантиомеры, диастереомеры, таутомеры и фармацевтически приемлемые соли. 2. Соединение по п.1, где R1 представляет водород. 3. Соединение по п.1, где n=1. 4. Соединение по п.1, где...
Предыдущий патент: Аналоги и гибридные полипептиды gip с избираемыми свойствами
Следующий патент: Применение производного пиразола для получения лекарственных средств, подходящих для профилактики и лечения заболеваний почек
Случайный патент: Способ и устройство для обработки жидкости в трубопроводе высокочастотными сигналами