Получение дикарбоновых кислот при низких ph

ПОЛУЧЕНИЕ ДИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ НИЗКИХ pH Изобретение относится к способу получения дикарбоновых кислот. Способ включает в себя ферментацию дрожжей в присутствии углеводсодержащих субстратов и малых количеств кислорода при значении рН, при которых по меньшей мере 50% дикарбоновой кислоты находится в кислотной форме. Способ настоящего изобретения обеспечивает высокие выходы дикарбоновой кислоты-продукта и является более экономичным по сравнению с существующими способами, в которых образуется соль, которую далее необходимо превращать в кислоту. Способ обеспечивает также более простую и более удобную обработку продукта. Янсен Михель Леонардус Аугуст,Вервал Рене (NL) Агуреев А.П. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу получения дикарбоновых кислот. В частности, изобретение относится к получению дикарбоновых кислот с помощью ферментации дрожжей. Предшествующий уровень техники Дикарбоновые кислоты, такие как фумаровая кислота и янтарная кислота, являются важными соединениями, которые используют в пищевой промышленности для приготовления и сохранения пищи, в медицинской промышленности для составления лекарственных препаратов и других промышленных применений, таких как мономеры и (био)полимеры. Для удовлетворения растущей потребности в дикарбоновых кислотах разрабатываются более эффективные и более экономичные способы производства. Дикарбоновые кислоты традиционно получают ферментацией бактерий, которая может давать большие количества дикарбоновых кислот. Это описано, например, в US 5573931, в котором описан способ получения янтарной кислоты в высоких концентрациях с использованием определенного бактериального штамма. Однако одним очень серьезным недостатком, связанным с использованием бактерий для получения дикарбоновых кислот, является образование соли дикарбоновой кислоты. В случае использования бактерий рН во время ферментации следует поддерживать в пределах 6-7, что выше значений pKa всех дикарбоновых кислот. Вследствие этого большая часть кислот будет образовываться в их солевой форме,а соли необходимо превращать в кислоту. В процессах крупномасштабного производства это практически невыгодно и неэффективно и повышает производственные расходы. Для получения органических кислот используются также и микроорганизмы, не являющиеся бактериями. В ЕР 0424384 раскрывается аэробный способ получения органических кислот с помощью гриба вида Rhizopus в среде, содержащей карбонат кальция. В ЕР 1183385 для получения молочной кислоты раскрываются генетически измененные дрожжевые клетки с отрицательным фенотипом Crabtree и содержащие экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения дикарбоновых кислот. Способ включает в себя ферментацию дрожжей в присутствии содержащего углеводы субстрата и небольших количеств кислорода при значении рН ниже pKa дикарбоновой кислоты. Способ настоящего изобретения обеспечивает высокие выходы дикарбоновой кислоты в качестве продукта, упрощает последующую обработку и является более экономичным, чем существующие способы, в которых образуется соль, которую затем необходимо превращать в кислоту. Поскольку дикарбоновые кислоты имеют более одного значения pKa,рН должно быть ниже самого низкого pKa дикарбоновой кислоты. Для большинства кислот рН должно быть в пределах от 1,0 до 5,5, преимущественно от 2,0 до 4,0. В одном из вариантов осуществления янтарную кислоту получают при значении рН 3,0. Другое преимущество состоит в том, что благодаря низкому значению рН снижается вероятность загрязнения. Стадии производства кислоты преимущественно предшествует стадия образования биомассы, целью которой является оптимальное получение биомассы. На стадии образования биомассы рН лежит в пределах от 2 до 7, преимущественно в пределах от 3 до 6 и более предпочтительно в пределах от 4 до 5. Способ согласно настоящему изобретению более экономичен и может давать снижение расходов до 30%. Одной из причин этого является значительное снижение затрат на титрант. Способ может быть использован для получения любой дикарбоновой кислоты. Подходящие примеры включают адипиновую кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, щавелевую кислоту. Предпочтительными дикарбоновыми кислотами являются янтарная,фумаровая и малеиновая кислоты. Используемыми в способе дрожжами могут быть любые подходящие дрожжи. Подходящие примеры дрожжей включают Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia и Yarrowia,такие как виды Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyvermoces lactis, Candidasonorensis, Pichia stipidis и Yarrowia lipolytica. В одном из вариантов осуществления используемым в способе микроорганизмом является Saccharomyces cerevisiae - микроорганизм, являющийся широко применяемым и представляющим промышленный интерес микроорганизмом. В одном из вариантов осуществления дрожжи согласно настоящему изобретению являются генетически модифицированными дрожжами. В соответствии с представлениями изобретения генетически модифицированные дрожжи в способе согласно настоящему патенту определяются как дрожжевые клетки,которые содержат нуклеотидную последовательность или полипептидную последовательность, которая не содержится естественным образом в дрожжевой клетке, либо трансформированы или генетически модифицированы этой последовательностью, либо же содержат дополнительную копию или копии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты. Дикий тип дрожжевой клетки определяется в изобретении как клетка-прародитель для рекомбинантной клетки. Дрожжи в способе настоящего изобретения являются преимущественно генетически модифицированными дрожжами, содержащими нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный фермент, выбираемой из группы, состоящей из фосфоенолпируват-карбоксикиназы, фумарат-редуктазы и фумаразы. Предпочтительные варианты осуществления гетерологичных ферментов определены ниже. Выражение "гомологичный", когда оно используется для указания на родство между данной (ре-1 018463 комбинантной) нуклеиновой кислотой или полипептидной молекулой и данным организмом-хозяином или клеткой-хозяином, следует понимать как означающее то, что в природе нуклеиновая кислота или полипептидная молекула продуцируются клеткой-хозяином или организмами одних и тех же видов, преимущественно одной и той же разновидности или штамма. Выражение "гетерологичный", когда оно используется в отношении какой-либо нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или белка, относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые не встречаются естественным образом в качестве части организма, клетки, генома или последовательности ДНК или РНК, в которых они присутствуют, или которые находятся в какой-либо клетке или участке (участках) в геноме или последовательности ДНК или РНК, которые отличаются от структур, в которых они находятся в природе. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки не являются эндогенными по отношению к клетке, в которую их вводят, но получают из какой-либо другой клетки, полученной синтетическим или рекомбинантным методом. Генетически модифицированные дрожжи преимущественно содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую фосфоенолпируват (РЕР)-карбоксикиназу. РЕР-карбоксикиназа (ЕС 4.1.1.49) является преимущественно гетерологичным ферментом преимущественно бактериального происхождения. Более конкретно, обладающий РЕР-карбоксикиназной активностью фермент происходит изEscherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp. или Anaerobiospirillum sp., еще более конкретно изMannheimia succiniciproducens или Actinobacillus succinogenes. В одном из вариантов осуществления РЕР-карбоксикиназу получают из Actinobacillus succinogenes (PCKa), где PCKa преимущественно предварительно модифицирован путем замены EGY в положении 120-122 на аминокислотную последовательность DAF. Дрожжевая клетка согласно настоящему изобретению предпочтительно генетически модифицирована PEP-карбоксикиназой, последовательность которой по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 99 или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В другом предпочтительном варианте осуществления генетически модифицированные дрожжи в способе согласно настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую фумарат-редуктазу. Фумарат-редуктаза является преимущественно гетерологичным ферментом, преимущественно NAD(H)-зависимой фумарат-редуктазой любого подходящего происхождения и может быть, например, получена из бактерий, грибов, простейших или растений. Дрожжи в способе согласно настоящему изобретению преимущественно содержат NAD(H)-зависимую фумарат-редуктазу, преимущественно полученную из Trypanosoma sp., например из Trypanosoma brucei. В одном из предпочтительных вариантов осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая NAD(H)-зависимую фумарат-редуктазу, экспрессируется в цитозоле. В том случае, когда нуклеотидная последовательность,кодирующая NAD(H)-зависимую фумарат-редуктазу, содержит пероксисомальный или митохондриальный нацеливающий сигнал, чтобы предотвратить пероксисомальное или митохондриальное нацеливание фермента, может оказаться существенным модифицировать или удалить ряд аминокислот (и соответствующих им нуклеотидных последовательностей в кодирующей нуклеотидной последовательности). Присутствие пероксисомального нацеливающего сигнала может быть определено с помощью, например,метода, раскрытого Schlter et al., Nucleic acid Research 2007, 35, D815-D822. Предпочтительно, чтобы дрожжевая клетка согласно настоящему изобретению была генетически модифицирована NAD(H)зависимой фумарат-редуктазой, последовательность которой по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В еще одном предпочтительном варианте осуществления генетически модифицированные дрожжи в способе согласно настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую фумаразу, которая может быть как гетерологичным, так и гомологичным ферментом. Нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичную фумаразу, может быть любого подходящего происхождения, преимущественно микробного происхождения и преимущественно может быть получена из дрожжей, в частности из Saccharomyces cerevisiae или filamentous fungus, например Rhizopus oryzae. Предпочтительно, чтобы дрожжи в способе согласно настоящему изобретению сверхэкспрессировали нуклеотидную последовательность, кодирующую фумаразу, которая бы по меньшей мере на 70, преимущественно по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% либо на 100% была идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В еще одном предпочтительном варианте осуществления генетически модифицированные дрожжи в способе согласно настоящему изобретению содержат дополнительно нуклеотидную последовательность, кодирующую малат-дегидрогеназу (MDH), которая проявляет активность в цитозоле при экспрессировании нуклеотидной последовательности. У MDH преимущественно отсутствует пероксисомальный или митохондриальный нацеливающий сигнал, чтобы локализовать фермент в цитозоле. ЦитозольнойMDH может быть любая подходящая гомологичная или гетерологичная малат-дегидрогеназа. Предпочтительно, чтобы дрожжевая клетка согласно настоящему изобретению содержала нуклеотидную последовательность, кодирующую малат-дегидрогеназу, которая бы по меньшей мере на 70, преимущественно по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% была идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. В еще одном предпочтительном варианте осуществления генетически модифицированные дрожжи в способе согласно настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-переносчик дикарбоновой кислоты, преимущественно белок-переносчик малеиновой кислоты(МАЕ). Белок-переносчик дикарбоновой кислоты может быть гомологичным или гетерологичным белком. Преимущественно белок-переносчик дикарбоновой кислоты является гетерологичным белком. Белок-переносчик дикарбоновой кислоты может быть получен из любого подходящего организма, преимущественно из Schizosaccharomyces pombe. Белком-переносчиком дикарбоновой кислоты преимущественно является белок-переносчик малеиновой кислоты (МАЕ), последовательность которого по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 99% либо на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 10. Используемые в способе согласно настоящему изобретению дрожжи представляют собой генетически модифицированные дрожжи, содержащие гетерологичную РЕР-карбоксикиназу, гетерологичнуюNAD(P)H-зависимую фумарат-редуктазу, гетерологичную фумаразу, гетерологичный белок-переносчик малеиновой кислоты и цитозольную малат-дегидрогеназу. Предпочтительные варианты осуществления этих ферментов являются такими, как описаны выше. Идентичность последовательности определяется в изобретении как взаимоотношение между двумя или более аминокислотными (полипептидными или белковыми) последовательностями или двумя или более нуклеиново-кислотными (полинуклеотидными) последовательностями, определяемое путем сравнения этих последовательностей. Обычно идентичности последовательностей или подобия между последовательностями сравниваются по всей длине сравниваемых последовательностей. В области, к которой принадлежит изобретение, "идентичность" означает также, в зависимости от конкретного случая, степень связанности между аминокислотной и нуклеиново-кислотной последовательностями, которая определяется соответствием между цепочками этих последовательностей. Предпочтительные методы определения идентичности предусматривают нахождение наибольшего соответствия между испытываемыми последовательностями. Методы определения идентичности и подобия кодифицированы в имеющихся в свободном доступе компьютерных программах. Предпочтительные методы определения идентичности и подобия между двумя последовательностями, заложенные в компьютерных программах, включают в себя BLASTP и BLASTN, свободный доступ к которым предоставляют NCBI и другие источники (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Предпочтительными параметрами для сравнения аминокислотных последовательностей с использованием BLASTP являются gap open 11.0, gap extend 1, Blosum 62 matrix. Используемое в патенте выражение "нуклеиновая кислота" включает в себя дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер, т.е. полинуклеотид, либо в одно-, либо в двуспиральной форме и,если не оговорены ограничения, охватывает известные аналоги, обладающие неотъемлемым свойством природных нуклеотидов, т.е. способные гибридизоваться с односпиральными нуклеиновыми кислотами аналогичным образом, как это происходит с природными нуклеотидами (например, с пептидонуклеиновыми кислотами). Полинуклеотид может быть полноразмерным или подпоследовательностью нативного или гетерологичного структурного или регуляторного гена. Если не оговорено иное, указанное выше выражение включает в себя как указанную последовательность, так и комплементарную ей последовательность. В одном из предпочтительных вариантов осуществления дрожжи в способе согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют нуклеотидные последовательности, кодирующие какой-либо из названных выше ферментов. В относящейся к изобретению технике имеются различные средства для сверхэкспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты в дрожжах в способе изобретения. В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая какой-либо фермент, может быть сверхэкспрессирована путем увеличения количества копий гена, кодирующего этот фермент в клетке,например, путем интегрирования дополнительных копий гена в геноме клетки, экспрессии гена из центромерного вектора, из эписомального мультикопийного вектора экспрессии или путем введения (эписомального) вектора экспрессии, который содержит множество копий гена. Сверхэкспрессия фермента согласно изобретению преимущественно достигается с помощью (сильного) конститутивного промотора. Углеводсодержащим субстратом может быть любой углеводсодержащий субстрат, включая мелассу, сок сахарного тростника, пентозы и гексозы, такие как глюкоза, фруктоза, ксилоза, арабиноза. Предпочтительным углеводсодержащим субстратом является субстрат, содержащий глюкозу, такой как мальтоза, сахароза, глюкоза или глюкозный сироп. Содержание углевода в углеводсодержащем субстрате преимущественно больше 50 вес.%, более предпочтительно больше 55, 60, 65, 70, 75, 80 вес.% и наиболее предпочтительно больше 85, 90, 95 или 99 вес.% в расчете на сухой вес. Способ согласно настоящему изобретению преимущественно включает в себя ферментацию дрожжей в ограниченных по углероду (С) условиях. Ограниченные по углероду условия определяются в заявке как концентрация растворенного углевода ниже 1 г/л, преимущественно ниже 0,9 г/л или ниже 0,5 г/л растворенного углевода. Было установлено, что ферментация дрожжей в ограниченных по углероду условиях дает повышенный выход янтарной кислоты по сравнению с неограниченными по углероду условиями. Необходимый для ферментации кислород может подаваться в любой подходящей форме. В одном из вариантов осуществления кислород подается в виде воздуха. Кислород следует подавать в небольших количествах. Это отражается в скорости потребления кислорода (СПК) и/или в удельной скорости потребления кислорода (qO2) дрожжами. СПК в настоящем изобретении ниже примерно 8,0 ммоль кислорода/л/ч, преимущественно ниже примерно 5,0, 4,0, 3,0 или 2,0 ммоль кислорода/л/ч, более предпочтительно ниже примерно 0,1 или 0,5 ммоль кислорода/л/ч и при этом предпочтительно более 0,01 ммоль кислорода/л/ч. Удельная скорость потребления кислорода (qO2) в способе изобретения лежит в пределах от 8 до 0,5 ммоль кислорода/г сухой биомассы/ч, преимущественно от 5, 4, 3 или 2 до примерно 0,4, 0,3 или 0,2 ммоль кислорода/г биомассы/ч. Способ согласно настоящему изобретению может осуществляться в периодическом, пополняемом периодическом или непрерывном режиме. Эти режимы ферментации известны специалистам в данной области. В зависимости от режима ферментации концентрация биомассы во время ферментации может в большей или меньшей степени варьировать. При периодическом и пополняемом периодическом режиме концентрация биомассы обычно повышается. Вследствие этого удельная скорость потребления кислорода при периодическом и пополняемом периодическом режиме обычно падает. Температура способа обычно составляет от 10 до 40 С, преимущественно от 20 до 35 С и более предпочтительно от 30 до 35 С. В одном из вариантов осуществления способа согласно настоящему изобретению наряду с углеводсодержащим субстратом присутствует дополнительный донор электрона. Дополнительным донором электрона преимущественно является органический донор электрона. Подходящие примеры органических доноров электрона включают глицерин, формиат и полиолы, такие как маннит, сорбит и ксилит. Краткое описание чертежа Чертеж. Влияние применяемой СПК на продукцию янтарной кислоты после 90 ч при pH 3. Примеры Пример 1. Получение янтарной кислоты с помощью Saccharomyces cerevisiae. 1.1. Конструирование дрожжевого штамма. 1.1.1. Конструирование экспрессирующих конструкций. Экспрессирующая конструкция pGBS414PPK-3 была создана после рестрикции вектора экспрессииpRS414 у S. Cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1): 19-27) с помощью BamHI/NotI и последующего лигандирования в этом векторе фрагмента BamHI/NotI-рестрикции, состоящего из синтетической генной конструкции для фосфоенолпируват-карбоксикиназы (происхождение: Actinobacillussuccinogenes) (SEQ ID NO: 1). Полученная в результате лигандирования смесь была использована для трансформации клеток Е.coli TOP10 (Invitrogen) с образованием дрожжевой экспрессирующей конструкции pGBS414PPK-1. Далее pGBK414PPK-1 была подвергнута рестрикции с помощью AscI и NotI. Чтобы создать pGBS414PPK-3, фрагмент AscI/NotI-рестрикции, состоящий из синтетической генной конструкции (SEQ ID NO: 2) для гликосомальной фумарат-редуктазы (из Т. brucei (FRDg, был лигандирован с образованием подвергнутого рестрикции вектора pGBS414PPK-1. Полученная в результате лигандирования смесь была использована для трансформации клеток Е.coli ТОР 10 (Invitrogen) с образованием дрожжевой экспрессирующей конструкции pGBS414PPK-3. Экспрессирующая конструкция pGBS415FUM-3 была создана после рестрикции вектора экспрессии pRS415 у S. Cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1): 19-27) с помощьюBamHI/NotI и последующего лигандирования в этом векторе фрагмента BamHI/NotI-рестрикции, состоящего из синтетической генной конструкции для фумаразы (происхождение: Rhizopus oryzae) (SEQID NO: 3). Полученная в результате лигандирования смесь была использована для трансформации клеток Е.coli TOP10 (Invitrogen) с образованием дрожжевой экспрессирующей конструкции pGBS415FUM-1. Далее pGBK415FUM-1 была подвергнута рестрикции с помощью AscI и NotI. Чтобы создатьpGBS415FUM-3 фрагмент AscI/NotI-рестрикции, состоящий из синтетической генной конструкции (SEQID NO: 4) для пероксисомальной малат-дегидрогеназы из S. cerevisiae (MDH3), был лигандирован с образованием подвергнутого рестрикции вектора pGBS415FUM-1. Полученная в результате лигандирования смесь была использована для трансформации клеток Е.coli TOP10 (Invitrogen) с образованием дрожжевой экспрессирующей конструкции pGBS415FUM-3. Экспрессирующая конструкция pGBS416MAE-1 была создана после рестрикции вектора экспрессии pRS416 у S. Cerevisiae (Sirkoski R.S. and Hieter P., Genetics, 1989, 122(1): 19-27) с помощьюBamHI/NotI и последующего лигандирования в этом векторе фрагмента BamHI/NotI-рестрикции, состоящего из синтетической генной конструкции (SEQ ID NO: 5) для переносчика малеиновой кислоты изSchizosaccharomyces pombe. Полученная в результате лигандирования смесь была использована для трансформации клеток Е.coli TOP10 (Invitrogen) с образованием дрожжевой экспрессирующей конструкции pGBS416MAE-1. 1.1.2. Конструирование штамма S. Cerevisiae. Плазмиды pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 и pGBS416MAE-1 (описанные в п.1.1.) были трансформированы с помощью электропорации в штамме RWB064 вида S. cerevisiae (МАТА ura3-52 leu2-112 trp1289 adh1lox adh2lox gpd1Kanlox) с целью создания штамма SUC-200, сверхэкспрессирующего PCKa,-4 018463MDH3, FUMR, FRDg и SpMAE1. Все гены были оптимизированы по кодоновым парам для экспрессии S.cerevisiae согласно WO 2008/000632. 1.2. S. cerevisiae, продуцирующий янтарную кислоту при низком рН и ограниченных по кислороду условиях. Дрожжевой штамм SUC-200 (МАТА ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1lox adh2lox gpd1Kanlox,сверхэкспрессирующий PCKa, MDH3, FUMR, FRDg и SpMAE1) культивировали во встряхиваемой колбе(2300 мл) в течение 3 суток при 30 С и 229 об/мин. В качестве базовой среды была использована Verduyn (Verduyn et al., 1992, Yeast 8, 501-517), которую модифицировали источниками углерода и азота, как показано в табл. 1. Таблица 1 Состав среды перед культивированием во встряхиваемой колбе Вслед за этим содержимое встряхиваемых колб было перенесено в 10-л ферментер (начальный вес 6 кг), в котором находилась следующая среда. Таблица 2 Основной состав ферментационной среды рН контролировали на уровне 3,0 добавлением 6 н. KOH. Температуру контролировали на уровне 30 С. Концентрацию глюкозы ограничивали (1 г/л) путем регулировки добавления сырья в ферментер. При ферментации применяли разные скорости поглощения кислорода (СПК), что давало ограничение по кислороду (чертеж). Применяли общую скорость потока 0,33 об./об. среды, включая 10% СО 2, которые обеспечивают достаточное количество CO2 для эффективной продукции янтарной кислоты. Результаты с разными применяемыми СПК при производстве янтарной кислоты показаны на чертеже. Для поддержания устойчивой продукции при рН 3 был необходим минимальный объем аэрации. При СПК выше 5 ммоль/л/ч продукция янтарной кислоты была более низкой. При культивации в течение 90 ч для типичной концентрации биомассы имел место прирост, равный 8 г сухого веса на 1 л. Соответственным образом в процессе ферментации непрерывно снижалась удельная скорость потребления кислорода (qO2). В одной из ферментации применяли СПК, равную 10 ммоль/л/ч, при которой qO2 падала от 10 до 1,25 ммоль/г сухой биомассы/ч, и СПК, равную 1 ммоль/л/ч, при которой qO2 падала от 1 до 0,1 ммоль/г сухой биомассы/ч. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения дикарбоновых кислот, включающий ферментацию дрожжей в присутствии углеводсодержащих субстратов и малых количеств кислорода при значении рН ниже самого низкого pKa дикарбоновой кислоты, в котором кислород подается при удельной скорости поглощения кислорода от 8 до 0,2 ммоль/г сухой биомассы/ч, в котором указанная дикарбоновая кислота является фумаровой кислотой, малеиновой кислотой или янтарной кислотой. 2. Способ по п.1, в котором рН лежит в пределах от 1,0 до 5,5. 3. Способ по п.1 или 2, включающий ферментацию дрожжей в ограниченных по углероду условиях. 4. Способ по любому из пп.1-3 в присутствии дополнительного донора электрона. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором дрожжи относятся к виду Saccharomyces cerevisiae. 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором дрожжами являются генетически модифицированные дрожжи. 7. Способ по п.6, в котором генетически модифицированные дрожжи содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный фермент, выбираемый из группы, состоящей из фосфоенолпируват-карбоксикиназы, фумарат-редуктазы и фумаразы.