Способ дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ БАЛАНСА ВАГИНАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ Куевда Дмитрий Александрович,Шипулина Ольга Юрьевна (RU) Изобретение относится к медицине, более конкретно - к лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры. У пациентки берут влагалищный мазок и определяют в нм концентрацию ДНК всех бактерий,концентрацию ДНК бактерии Gardnerella vaginalis, концентрацию ДНК бактерии Atopobiumvaginae и концентрацию ДНК бактерий Lactobacillus spp. методом амплификации нуклеиновых кислот. На основании полученных данных рассчитывают коэффициенты соотношений концентраций: KC1 = lg [ДНК Lac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]), KC2 = lg [ДНК Вас] - lg[ДНК Lac] и KC3 = lg [ДНК Bac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]). При lg [ДНК Bac]5, KC11 и KC21 констатируют отсутствие бактериального вагиноза, при lg [ДНК Bac]5, 0,5KC11,KC21 и KC32 констатируют промежуточное состояние микрофлоры, при lg [ДНК Bac]5,KC10,5 и KC32 диагностируют бактериальный вагиноз, а при lg [ДНК Bac]5 констатируют,что количество бактерий недостаточно для анализа. При отсутствии бактериального вагиноза и 5lg [ДНК Baс]6 констатируют снижение степени бактериальной обсеменнности влагалища. Дополнительно в мазке определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp. и концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. методом амплификации нуклеиновых кислот. При lg [ДНК Baс]6, ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНКStrep])[ДНК Lac] и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение: "нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено", при lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]) - lg ([ДНК Ent]+ [ДНК Staph] + [ДНК Strep])1 диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры, а при lg [ДНК Вас]5,([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])[ДНК Lac], KC21 и KC32 констатируют преобладание аэробной микрофлоры. При наличии местной воспалительной реакции в сочетании с повышенным содержанием или преобладанием аэробной микрофлоры диагностируют аэробный вагинит. Изобретение позволяет проводить дифференциальную диагностику нарушений баланса вагинальной микрофлоры с высокой диагностической чувствительностью и специфичностью при минимальных затратах материальных и временных ресурсов. Область техники Изобретение относится к медицине, более конкретно - к лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры. Уровень техники Инфекционные заболевания урогенитального тракта у женщин занимают первое место в структуре гинекологической патологии [Donders G.G.G. Definition and classification of abnormal vaginal flora. BestPract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 2007 Jun; 21(3): 355-373. Epub 2007 Apr 16]. Возбудителями инфекционных заболеваний урогенитального тракта могут являться не только облигатно патогенные микроорганизмы (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium,Trichomonas vaginalis и др.), но при определнных условиях и условно-патогенные микроорганизмы, в норме обитающие во влагалище. В составе вагинальной микрофлоры здоровой женщины репродуктивного возраста доминируют лактобактерии (лактобациллы, Lactobacillus spp., от лат. spesiales - виды), такие как LactobacillusInfectious Diseases, Volume 2008, Article ID 750479]. Лактобактерии, составляющие нормофлору влагалища, защищают его от размножения патогенных и условно-патогенных бактерий. К защитным факторам лактобактерии относят образование молочной кислоты, ведущее к поддержанию кислой среды здорового влагалища, образование перекиси водорода и бактериоцинов, высокую адгезионную способность и иммуностимулирующие свойства, в совокупности обеспечивающие колонизационную резистентность влагалищного микробиоценоза [Под ред. Чайки В.К. Инфекции в акушерстве и гинекологии: Практическое руководство. Донецк, ООО "Альматео", 2006]. Кроме лактобактерий, в составе микрофлоры влагалища могут присутствовать в вариабельных, но в норме незначительных количествах следующие бактерии: Bifidobacterium spp., Eubacterium spp.,Clostridium spp., Propionibacterium spp., Corynebacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp.,Fusobacterium spp., Leptotrix spp., Campylobacter spp., Enterobacteriaceae spp. (Escherichia spp., Klebsiella"Альматео", 2006]. Неблагоприятные эндогенные и экзогенные факторы (гормональные нарушения, использование антибиотиков, оральных и внутриматочных контрацептивов, снижение иммунитета, перенеснные воспалительные заболевания и др.) могут приводить к нарушениям баланса вагинальной микрофлоры, т.е. снижению содержания лактобактерий и замещению их условно-патогенными микроорганизмами. Известно два основных вида таких нарушений: бактериальный вагиноз и аэробный вагинит. Бактериальный вагиноз - это клинический синдром, вызванный замещением лактобактерий вагинальной микрофлоры условно-патогенными анаэробными и факультативно-анаэробными бактериями.[Под ред. Савельевой Г.М., Бреусенко В.Г. Гинекология: Учебник. Москва, "ГЭОТАРМЕД", 2004]. Бактериальный вагиноз является полимикробным синдромом с чрезвычайно широким спектром обнаруживаемых условно-патогенных микроорганизмов, насчитывающим сотни видов. Достоверная связь с бактериальным вагинозом была продемонстрирована для представителей восьми родов бактерий Gardnerella,Atopobium, Megasphaera, Eggerthella, Aerococcus, Leptotrichia/Sneathia, Prevotella, Papillibacter [Ling Z. etGenomics. 2010 Sep 7; 11:488]. Также специалисты выделяют промежуточный тип микрофлоры, при котором не происходит полного (или почти полного) замещения лактобактерий условно-патогенными анаэробными и факультативно-анаэробными бактериями, однако количество последних существенно повышено по сравнению с нормой. Промежуточный тип микрофлоры можно рассматривать как переход от нормы к бактериальному вагинозу ("только-только заболевает") или обратно ("восстановление микрофлоры") [Nugent R.P. et al.J. Clin. Microbiol. 1991 Feb; 29(2): 297-301]. Аэробный вагинит - это нарушение баланса вагинальной микрофлоры, отличное от бактериального вагиноза. При аэробном вагините происходит замещение лактобактерий вагинальной микрофлоры условно-патогенными аэробными микроорганизмами (Enterobacteriaceae spp., в том числе Escherichia coli,Klebsiella spp., Proteus spp., Staphylococcus spp., в том числе Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., в том числе Group В Streptococcus, он же Streptococcus agalactiae, Group A Streptococcus, Enterococcus spp.). В отличие от бактериального вагиноза, имеющего не воспалительный характер, аэробный вагинит харак-1 025042 теризуется развитием местной воспалительной реакции и иммунного ответа [Donders G.G.G. et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vagmitis. BJOG. 2002Jan; 109(1): 34-43]. Нарушения баланса вагинальной микрофлоры могут сопровождаться клиническими проявлениями(патологические выделения с неприятным запахом, зуд, жжение, диспареуния), однако могут протекать и бессимптомно. Бессимптомное течение особенно опасно, так как в отсутствие адекватной терапии возможно развитие таких грозных последствий для здоровья женщины и е потомства, как воспалительные заболевания органов малого таза, преждевременные роды, рождение детей с низкой массой тела, воспалительные осложнения беременности и родов, повышенная восприимчивость к инфекциям, передающимся половым путм [Под ред. Савельевой Г.М., Бреусенко В.Г. Гинекология: Учебник. Москва,"ГЭОТАРМЕД", 2004]. В связи с этим трудно переоценить важность наджной и эффективной диагностики (в том числе дифференциальной) нарушений баланса вагинальной микрофлоры, позволяющей своевременно определиться с выбором подходящей терапии. Сложности такой диагностики обусловлены, во-первых, неспецифичностью соответствующих симптомов, а в ряде случаев и их отсутствием, во-вторых, огромным разнообразием видов условно-патогенной микрофлоры, имеющих разные свойства, в том числе различную чувствительность к антибиотикам, в-третьих, условно-патогенным характером возбудителей, который обуславливает ограниченную диагностическую ценность их качественного определения и требует только количественного подхода. Существующие на настоящий момент методы диагностики не в полной мере справляются с указанными затруднениями. Классические методы лабораторной диагностики, основанные на культивировании микроорганизмов на питательных средах, не подходят для выявления некультивируемых и трудно культивируемых условно-патогенных микроорганизмов, среди которых микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом. Для культивируемых микроорганизмов этот метод также не лишн существенных недостатков, среди которых сложности стандартизации и количественного определения, длительные сроки культивирования. Традиционно используемые для диагностики бактериального вагиноза "критерии Амселя" обладают невысокой диагностической чувствительностью [Sha B.E. et al. Utility of Amsel criteria, Nugent score,and quantitative PCR for Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, and Lactobacillus spp. for diagnosis ofbacterial vaginosis in human immunodeficiency virus-infected women. J. Clin. Microbiol. 2005 Sep; 43(9): 4607-4612] и не дают информации о качественном и количественном составе микрофлоры, что может привести к ошибкам в выборе терапии. Метод диагностики бактериального вагиноза, основанный на микроскопии окрашенных по Граму препаратов с подсчтом морфотипов бактерий и применением "критериев Ньюджента", достаточно точен, но не лишн некоторой доли субъективизма и очень трудомок, что значительно снижает пропускные возможности лаборатории. Кроме того, некоторые значимые для диагностики бактериального вагиноза виды условно-патогенной микрофлоры, в частности Atopobium vaginae, не имеют специфических микроскопических признаков и ошибочно принимаются за другие виды [Schwiertz A. et al. Throwing thedice for the diagnosis of vaginal complaints Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2006 Feb 17; 5:4]. Метод диагностики аэробного вагинита, основанный на микроскопии нативных препаратов с оценкой лактобациллярной степени, морфотипов сопутствующей микрофлоры и подсчтом лейкоцитов и парабазальных эпителиоцитов, также трудомок и не лишн некоторой доли субъективизмаaerobic vaginitis. BJOG. 2002 Jan; 109(1): 34-43]. Современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, имеют множество преимуществ перед традиционными методами диагностики. Наибольшее распространение получил метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Анализ методом ПЦР возможно проводить как в качественном, так и в количественном формате. ПЦР позволяет в короткие сроки, с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять как культивируемые, так и некультивируемые микроорганизмы в любом биологическом образце. Количественная ПЦР позволяет объективно и достоверно определять количества микроорганизмов. Возможность стандартизации и автоматизации анализа являются его дополнительными преимуществами. Известен способ исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени и набор реагентов для его осуществления "ФЕМОФЛОР 16". В 16 пробирках определяется общее количество бактерий (общая бактериальная масса, ОБМ) в образце, количество лактобактерий и количества 22 условно-патогенных микроорганизмов/групп микроорганизмов: 16 видов/родов анаэробных бактерий (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacteriumspp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphera spp./Veilonella spp./Dialister spp.,Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp.,Atopobium vaginae), одно семейство и два рода аэробных бактерий (Enterobacteriaceae, Streptococcus spp.,Staphylococcus spp.), Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Candida spp. Способ включает в себя алгоритм формирования лабораторного заключения на основании анализа относительных (в % от ОБМ) количеств выявленных бактерий [ФЕМОФЛОР. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Методическое пособие для лаборантов. ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России. ЗАО "НПФ ДНК-Технология"]. Однако данный подход имеет ряд недостатков. В диагностикум включен ряд представителей условно-патогенной микрофлоры, диагностическая ценность которых не подтверждена опубликованными результатами исследований. Во влагалище женщин с бактериальным вагинозом различными исследователями было обнаружено большое количество разнообразных условно-патогенных микроорганизмов, однако одного факта такого обнаружения недостаточно для эффективного использования микроорганизмов в качестве количественных диагностических маркеров заболевания [Menard J.P. et al. MolecularDis. 2008 Jul. 1; 47(1): 33-43]. Включение невалидированных маркеров в исследование неоправданно повышает трудомкость проведения анализа и сложность его интерпретации. Выдаваемые лабораторные заключения (абсолютный/относительный нормоценоз, выраженный/умеренный аэробный/анаэробный/смешанный дисбиоз) не содержат указаний на известные нозологии. Кроме того, авторам настоящего изобретения не известно опубликованных данных о валидации данного способа, включающего количественный алгоритм формирования заключения, относительно стандартных методов диагностики соответствующих нозологии (бактериальный вагиноз, аэробный вагинит). Наиболее близким по технической сущности к настоящему изобретению является способ диагностики бактериального вагиноза, описанный в международной заявке на изобретение WO 2011/068679vaginosis, 09.06.2011]. Способ включает количественное определение одного или более вида лактобактерий и двух или более видов условно-патогенных микроорганизмов в биологическом образце и расчт на их основании диагностического показателя. При его значении меньше 0,2 диагностируют бактериальный вагиноз, при значении от 0,2 до 4,99 диагностируют промежуточный тип вагинальной микрофлоры, и при значении 5 и более диагностируют нормальное состояние вагинальной микрофлоры. Диагностический показатель представляет собой отношение суммы логарифмов концентраций лактобактерий к сумме логарифмов концентраций условно-патогенных бактерий или отношение логарифма суммы концентраций лактобактерий к логарифму суммы концентраций условно-патогенных бактерий. Условно-патогенные бактерии выбраны из группы Atopobium vaginae, Megasphera spp., Gardnerella vaginalis. Данный способ диагностики валидирован относительно критериев Ньюджента, однако его чувствительность и специфичность невысока: 57 и 60% соответственно (для различных вариантов расчта диагностического показателя значения чувствительности и специфичности различаются, здесь приведены наилучшие характеристики). Кроме того, способ обладает ещ одним существенным недостатком: он разграничивает только три состояния вагинальной микрофлоры: бактериальный вагиноз, промежуточный тип вагинальной микрофлоры и нормальное состояние вагинальной микрофлоры. Нарушения баланса вагинальной микрофлоры, отличные от бактериального вагиноза и промежуточного типа вагинальной микрофлоры (например,преобладание аэробной микрофлоры, аэробный вагинит), способ ошибочно относит к промежуточному типу вагинальной микрофлоры. Отсутствие определения общего количества бактерий в образце не позволяет оценить адекватность взятия биологического образца, что может приводить к погрешностям в определении диагностического показателя; не позволяет отличить нарушения баланса вагинальной микрофлоры иного (не анаэробного) генеза, а также состояние снижения бактериальной обсеменнности влагалища. Сущность изобретения Задачами настоящего изобретения являются: создание наджного и эффективного способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры, основанного на количественном определении ДНК бактерий нормальной и условно-патогенной микрофлоры; повышение диагностической чувствительности и специфичности; минимизация затрачиваемых для диагностики материальных и временных ресурсов посредством оптимального выбора бактерий-маркеров нарушений баланса вагинальной микрофлоры, т.е. выбора маркров, необходимых и достаточных для чувствительной и специфичной диагностики; повышение наджности диагностики с использованием принципа количественной оценки бактерий нормальной и условно-патогенной микрофлоры не в абсолютных показателях, а по отношению к общему количеству бактерий в образце, что позволяет нивелировать значительный разброс в определении абсолютной концентрации микроорганизмов, связанный с качеством взятия биологического материала; разработка экспертного алгоритма интерпретации получаемых результатов количественного анализа; валидация способа, включая алгоритм; расширение арсенала современных методов лабораторной диагностики. В рамках настоящего изобретения был проведн анализ мировой научной литературы с целью оптимального выбора диагностических маркеров бактериального вагиноза, т.е. выбора таких условнопатогенных микроорганизмов, количественное определение которых необходимо и достаточно для чувствительной и специфичной диагностики этого состояния.oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 2006 Sep 15; 194(6): 828-836]. Этот вид бактерий в отличие от других ассоциированных с бактериальным вагинозом видов сочетает в себе три фактора вирулентности: способность к адгезии к эпителиальным клеткам человека, способность образовывать биоплнки и цитотоксичность [Patterson J.L. et al. Analysis of adherence, biofilm formation and cytotoxicity suggests a greaterMicrobiology. 2010 Feb; 156(Pt 2): 392-399]. По последним данным Gardnerella vaginalis является этиологическим агентом бактериального вагиноза [Schwebke J.R. et al. Role of Gardnerella vaginalis in thePathogenesis of Bacterial Vaginosis: A Conceptual Model. J. Infect. Dis. 2014 Mar 31. [Epub ahead of print. Стандартной терапией бактериального вагиноза является метронидазол. При этом обнаружение прочих представителей условно-патогенной микрофлоры не меняет тактику лечения бактериального вагиноза. Исключение составляет Atopobium vaginae, для которой была продемонстрирована устойчивость к метронидазолу [De Backer Е. et al. Antibiotic susceptibility of Atopobium vaginae. BMC Infect Dis. 2006 Mar 16; 6:51]. Соответственно обнаружение этого вида бактерий в значительных количествах меняет тактику терапии. Таким образом, из всего многообразия видов условно-патогенной микрофлоры, ассоциированной с бактериальным вагинозом, в качестве количественных диагностических маркеров заболевания были выбраны два вида: Gardnerella vaginalis и Atopobium vaginae. С целью оптимального выбора диагностических маркеров аэробного вагинита были проанализированы литературные данные и проведн ряд экспериментов. Известны следующие четыре рода/семейства возбудителей аэробного вагинита: Enterobacteriaceaevaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. BJOG. 2002 Jan; 109(1): 34-43]. Экспериментальным путм исследована информативность основных групп аэробных микроорганизмов на уровне родов/семейств (Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcusspp.) и отдельных видов (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae). Была продемонстрирована непригодность Enterococcus spp. в качестве количественного диагностического маркера и установлена низкая чувствительность (48%) совокупности отдельных видов аэробных микроорганизмов для диагностики аэробного вагинита. Таким образом, из известных представителей условно-патогенной микрофлоры, ассоциированной с аэробным вагинитом, в качестве количественных диагностических маркеров заболевания были выбраны следующие три группы аэробных микроорганизмов на уровне родов/семейств: Enterobacteriaceae,Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Задачи настоящего изобретения решены созданием способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры, включающего определение концентрации ДНК всех бактерий,концентрации ДНК бактерии Gardnerella vaginalis, концентрации ДНК бактерии Atopobium vaginae, концентрации ДНК бактерий Lactobacillus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, отличающегося тем, что на основании полученных данных рассчитывают коэффициенты соотношений концентраций:KC1 = lg [ДНК Lac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]),KC2 = lg [ДНК Bac] - lg [ДНК Lac],KC3 = lg [ДНК Bac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]),где [ДНК Lac] - концентрация ДНК бактерий Lactobacillus spp. в ГЭ/мл,[ДНК Gv] - концентрация ДНК бактерии Gardnerella vaginalis в ГЭ/мл,[ДНК Av] - концентрация ДНК бактерии Atopobium vaginae в ГЭ/мл,[ДНК Bac] - концентрация ДНК всех бактерий в ГЭ/мл,при lg [ДНК Bac]5, KC11 и KC21 констатируют отсутствие бактериального вагиноза,при lg [ДНК Bac]5, 0,5KC11, KC21 и KC32 констатируют промежуточное состояние микрофлоры,при lg [ДНК Bac]5, KC10,5 и KC32 диагностируют бактериальный вагиноз,а при lg [ДНК Bac]5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при отсутствии бактериального вагиноза и 5lg [ДНК Bac]6 констатируют снижение степени бактериальной обсеме-4 025042 ннности влагалища. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp., концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот,при lg [ДНК Bac]6 и ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])[ДНК Lac],где [ДНК Ent] - концентрация ДНК Enterobacteriaceae в ГЭ/мл,[ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcus spp. в ГЭ/мл,[ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp. в ГЭ/мл,и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение: нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp., концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот,при lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]) - lg ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])1,где [ДНК Ent] - концентрация ДНК Enterobacteriaceae в ГЭ/мл,[ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcm spp. в ГЭ/мл,[ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp. в ГЭ/мл,диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при бактериальном вагинозе в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют бактериальный вагиноз в сочетании с аэробным вагинитом. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp., концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот,при lg [ДНК Bac]5, ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])[ДНК Lac], KC21 и KC32,где [ДНК Ent] - концентрация ДНК Enterobacteriaceae в ГЭ/мл,[ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcus spp. в ГЭ/мл,[ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp. в ГЭ/мл,констатируют преобладание аэробной микрофлоры. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при преобладании аэробной микрофлоры дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют аэробный вагинит. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что при констатации промежуточного состояния микрофлоры дополнительно определяют рН выделений пациентки и наличие жалоб на патологические выделения у пациентки и при рН 4,5 и отсутствии жалоб на патологические выделения пациентке рекомендуют повторить анализ в следующем менструальном цикле, а при рН 4,5 и наличии жалоб на патологические выделения у пациентки диагностируют бактериальный вагиноз. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что образец представляет собой влагалищный мазок. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что метод амплификации нуклеиновых кислот представляет собой метод количественной полимеразной цепной реакции. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что метод количественной полимеразной цепной реакции представляет собой метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. В частном случае выполнения способ по изобретению характеризуется тем, что полимеразная цепная реакция представляет собой мультиплексную полимеразную цепную реакцию. Изобретение позволяет наджно и эффективно проводить дифференциальную диагностику нарушений баланса вагинальной микрофлоры. При осуществлении способа по изобретению достигается повышение чувствительности до 98,5% и специфичности до 97,4% для диагностики бактериального вагиноза при минимальных затратах материальных и временных ресурсов. Созданное изобретение можно использовать как для первичной диагностики, подтверждения или опровержения ранее поставленных диагнозов и назначения терапии, так и для последующего контроля эффективности лечения и мониторинга критериев излеченности. Перечень фигур Фиг. 1. Распределение пациенток по общему количеству бактерий в образце (в lg). Фиг. 2. Концентрации аэробных микроорганизмов у пациенток с аэробным вагинитом. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения В исследование были включены 274 пациентки репродуктивного возраста, обратившиеся в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Российской Академии Медицинских Наук. Средний возраст пациенток составил 305,7 лет. Каждая пациентка была обследована с использованием как клинических,так и лабораторных методов диагностики с целью дифференцировки различных нарушений баланса вагинальной микрофлоры: бактериального вагиноза, промежуточного состояния микрофлоры, бактериального вагиноза в сочетании с аэробным вагинитом, аэробного вагинита. Первый этап разработки способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры включал в себя: 1) определение критериев Амселя (наличие специфических выделений из влагалища, повышение рН 4,5, положительный аминный тест, наличие "ключевых клеток" при бактериоскопии); 2) микроскопию мазка, окрашенного по Граму, с оценкой баллов Ньюджента (0-3 балла - норма; 4-6 баллов - промежуточный тип микрофлоры; 7-10 баллов - бактериальный вагиноз); 3) определение концентрации ДНК всех бактерий, концентрации ДНК бактерии Gardnerellavaginalis, концентрации ДНК бактерии Atopobium vaginae, концентрации ДНК бактерий Lactobacillus spp. во влагалищном мазке методом амплификации нуклеиновых кислот - мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Для проведения исследования методом мультиплексной ПЦР от каждой пациентки получали вагинальный образец (влагалищный мазок) в транспортной среде с муколитиком ("ТСМ", ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.953) объмом 500 мкл. Далее проводили экстракцию нуклеиновых кислот с использованием комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "АмплиПрайм ДНК-Сорб-АМ" (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.102-22). Для дальнейшей амплификации использовали 10 мкл полученного элюата, содержащего ДНК изучаемых микроорганизмов (объм полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл). Во время приготовления реакционной смеси использовали 100-кратный ТЕ-буфер для получения необходимой концентрации праймеров, зондов и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP). Состав реакционной смеси приведн в табл. 1. Таблица 1 Состав реакционной смеси (ПЦР-смесь-1) Для получения реакционной смеси в пробирку вносили 10 мкл ПЦР-смеси-1 и 5 мкл ПЦР-смеси-2red (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.863). Далее в каждую амплификационную пробирку вносили 15 мкл реакционной смеси и 10 мкл элюата ДНК. Кроме того, в каждой постановке использовали калибраторы для количественного анализа микроорганизмов (в соответствующие пробирки вносили по 10 мкл калибраторов). В каждой постановке участвовали 2 калибратора с концентрацией 105 и 103 копий/реакция. Состав калибраторов (FC1 и FC2). Калибраторы включают в себя два препарата, клонированных в фаг : концентрированный раствор"положительный контрольный образец" (КР ПКО) Gardnerella vaginalis и КР ПКО Lactobacillus spp., и два препарата, клонированных в вектор pGem-T: КР ПКО Atopobium vaginae и КР ПКО Escherichia coli. Для разведения исходных КР используется ДНК-буфер с poly(A). Конечная концентрация каждого препарата для калибратора FC1 составляет 1105 копий/реакция; для калибратора FC2 - 1103 копий/реакция. Амплификацию проводили на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, 1011132). Программа амплификации: Далее проводилось сопоставление результатов, полученных тремя методами диагностики бактериального вагиноза. В связи с тем, что как критерии Амселя, так и оценка с использованием баллов Ньюджента подразумевают определнную долю субъективизма, в качестве "расширенного золотого стандарта" использовались оба метода. Оценка диагностических характеристик способа по изобретению проводилась по тем образцам, для которых заключение по критериям Амселя и баллам Ньюджента совпадали. Результаты исследования образцов от 274 пациенток приведены в табл. 2. Для каждого образца приведены следующие данные: Оценка состояния вагинальной микрофлоры по критериям Амселя - бактериальный вагиноз (БВ) или отсутствие бактериального вагиноза (ОБВ); Оценка состояния вагинальной микрофлоры по баллам Ньюджента - бактериальный вагиноз (БВ),промежуточный тип микрофлоры (ПТ) или отсутствие бактериального вагиноза (ОБВ); концентрации бактерий, выраженные в единицах ГЭ/мл, определнные методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени: [ДНК Gv] - концентрация ДНК бактерии Gardnerella vaginalis, [ДНКAv] - концентрация ДНК бактерии Atopobium vaginae, [ДНК Lac] - концентрация ДНК бактерийLactobacillus spp., [ДНК Bac] - концентрация ДНК всех бактерий; рассчитанные коэффициенты соотношений концентраций бактерий: KC1 = lg [ДНК Lac] - lg ([ДНК Таблица 2 Результаты, полученные при обследовании 274 пациенток по критериям Амселя,по баллам Ньюджента и методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени Далее для анализа были выбраны только те образцы, для которых были получены совпадающие результаты по данным критериев Амселя и баллов Ньюджента (БВ, N=66, ОБВ, N=156), табл. 3 и 4 соответственно. Таблица 3 Результаты исследования методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени образцов от 66 пациенток с бактериальным вагинозом по критериям Амселя и по баллам Ньюджента Таблица 4 Результаты исследования методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени образцов от 156 пациенток без бактериального вагиноза по критериям Амселя и по баллам Ньюджента Из табл. 2-4 видно, что для всех образцов значение показателя [ДНК Bac] превышает 105 ГЭ/мл, т.е. интерпретировать значения ниже этого порога не представляется возможным, поэтому в качестве нижнего порога валидности образцов было принято значение [ДНК Bac] 105 ГЭ/мл. Далее было определено "нормальное" количество бактерий на слизистой влагалища женщины репродуктивного возраста. Для этого оценили распределение пациенток по общему количеству бактерий и путм отсечения пяти процентов наименьших значений была принята нижняя граница нормы [ДНК Bac] 106 ГЭ/мл (фиг. 1). Таким образом, на основании вышеприведнных данных, а также статистической обработки рассчитанных коэффициентов соотношений концентраций бактерий были сформированы критерии дифференциальной диагностики отсутствия бактериального вагиноза, в том числе частного случая отсутствия бактериального вагиноза - снижения степени бактериальной обсеменнности влагалища, промежуточного состояния микрофлоры и бактериального вагиноза. При lg [ДНК Bac]5, KC11 и KC21 констатируют отсутствие бактериального вагиноза, при этом при 5lg [ДНК Bac]6 дополнительно констатируют снижение степени бактериальной обсеменнности влагалища. При lg [ДНК Bac]5, 0,5KC11, KC21 и KC32 констатируют промежуточное состояние микрофлоры. При lg [ДНК Bac]5, KC10,5 и KC32 диагностируют бактериальный вагиноз. При lg [ДНК Bac]5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа. При констатации промежуточного состояния микрофлоры дополнительно определяют наличие у пациентки жалоб на патологические выделения и рН выделений. При рН 4,5 и отсутствии жалоб на патологические выделения пациентке рекомендуют повторить анализ в следующем менструальном цикле,а при рН 4,5 и наличии жалоб на патологические выделения у пациентки диагностируют бактериальный вагиноз. Суммарные данные по распределению заключений, полученных с использованием "расширенного золотого стандарта" и способа по изобретению, представлены в табл. 5. Таким образом, чувствительность способа по изобретению для диагностики бактериального вагиноза составила 98,5%, специфичность - 97,4%. На втором этапе разработки способа дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры для дальнейшего анализа были выбраны образцы, снижение количества лактобактерий в которых не могло объясняться наличием БВ-ассоциированных микроорганизмов, N=22 (табл. 6). Таблица 6 Результаты, полученные при обследовании 22 пациенток, у которых имеется нарушение баланса вагинальной микрофлоры, не объясняемое наличием БВ-ассоциированных микроорганизмов, с применением критериев Амселя, баллов Ньюджента и метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени Второй этап включал в себя следующее. 1. Диагностику аэробного вагинита, основанную на микроскопии нативных препаратов (влагалищных мазков) и подсчтом "баллов аэробного вагинита" ("АВ баллы"). Методика определения "АВ баллов" включает в себя оценку лактобациллярной степени и морфотипов сопутствующей флоры, а также подсчт лейкоцитов и парабазальных эпителиоцитов [Donders G.G.G. et al. Definition of a type of abnormalvaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. BJOG. 2002 Jan; 109(1): 34-43]. В соответствии с классификацией, предложенной Donders G.G.G. et al., при получении 3 "АВ баллов" и более у пациентки диагностируют аэробный вагинит. 2. Выбор оптимальных количественных диагностических маркеров аэробного вагинита: а) оценка информативности основных четырх групп аэробных микроорганизмов (EnterEnterococcus spp. в качестве количественного диагностического маркера аэробного вагинита (фиг. 2); б) оценка возможности выявления отдельных видов аэробных микроорганизмов для диагностики аэробного вагинита (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae) установила низкую чувствительность (48%) данной совокупности маркеров для диагностики аэробного вагинита. Таким образом, в качестве количественных диагностических маркеров аэробного вагинита были выбраны следующие три группы аэробных микроорганизмов на уровне родов/семейств:Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. 3. Определение концентрации ДНК Enter obacteriaceae, концентрации ДНК бактерий Staphylococcusspp., концентрации ДНК бактерий Streptococcus spp. во влагалищном мазке методом амплификации нуклеиновых кислот - мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Для проведения исследования методом мультиплексной ПЦР из ранее полученных вагинальных образцов проводили экстракцию нуклеиновых кислот с использованием комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "АмплиПрайм ДНК-Сорб-АМ" (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.102-22). Для дальнейшей амплификации использовали 10 мкл полученного элюата, содержащего ДНК изучаемых микроорганизмов (объм полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл). Во время приготовления реакционной смеси использовали 100-кратный ТЕ-буфер для получения необходимой концентрации праймеров, зондов и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP). Состав реакционной смеси приведн в табл. 7. Таблица 7 Состав реакционной смеси (ПЦР-смесь-1) Для получения реакционной смеси в пробирку вносили 10 мкл ПЦР-смеси-1 и 5 мкл ПЦР-смеси-2red (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат.863). Далее в каждую амплификационную пробирку вносили 15 мкл реакционной смеси и 10 мкл элюата ДНК. Кроме того, в каждой постановке использовали калибраторы для количественного анализа микроорганизмов (в соответствующие пробирки вносили по 10 мкл калибраторов). В каждой постановке участвовали 2 калибратора с концентрацией 10 и 103 копий/реакция.spp., КР ПКО Staphylococcus saprophyticus, КР ПКО Streptococcus spp. Для разведения исходных КР используется ДНК-буфер с poly(A). Конечная концентрация каждого препарата для калибратора К 1 составляет 1106 копий/мл; для калибратора К 2 - 1104 копий/мл. Амплификацию проводили на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, 1011132). Программа амплификации: Результаты исследования образцов от 22 пациенток приведены в табл. 8. Для каждого образца приведены следующие данные: оценка состояния вагинальной микрофлоры по критериям Амселя - бактериальный вагиноз (БВ) или отсутствие бактериального вагиноза (ОБВ); оценка состояния вагинальной микрофлоры по баллам Ньюджента - бактериальный вагиноз (БВ),промежуточный тип микрофлоры (ПТ) или отсутствие бактериального вагиноза (ОБВ); концентрации бактерий, выраженные в единицах ГЭ/мл, определнные методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени: [ДНК Gv] - концентрация ДНК бактерии Gardnerella vaginalis,[ДНК Av] - концентрация ДНК бактерии Atopobium vaginae, [ДНК Lac] - концентрация ДНК бактерийLactobacillus spp., [ДНК Bac] - концентрация ДНК всех бактерий, [ДНК Ent] - концентрация ДНКEnterobacieriaceae, [ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcus spp., [ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp.; рассчитанные коэффициенты соотношений концентраций бактерий: KC1 = lg [ДНК Lac] - lg ([ДНК"АВ баллы", определнные по методике Donders G.G.G. et al. Таблица 8 Результаты, полученные при обследовании 22 пациенток, у которых имеется нарушение баланса вагинальной микрофлоры, не объясняемое наличием БВ-ассоциированных микроорганизмов, с применением критериев Амселя,баллов Ньюджента, "АВ баллов" и метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени Расчты подтвердили, что во всех случая снижения количества лактобактерий в отсутствие бактериального вагиноза произошло замещение лактобактериий аэробными микроорганизмами. Во всех этих случаях у пациенток установлен аэробный вагинит по методике Donders G.G.G. et al. Таким образом, на основании статистической обработки полученных экспериментальных данных были сформированы критерии дифференциальной диагностики отсутствия нарушений баланса вагинальной микрофлоры, бактериального вагиноза в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры и преобладания аэробной микрофлоры. При lg [ДНК Bac]6, ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])[ДНК Lac] и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение "нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено". При lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]) - lg ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])1 диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры. При lg [ДНК Bac]5, ([ДНК Ent] + [ДНК Staph] + [ДНК Strep])[ДНК Lac], KC21 и KC32 констатируют преобладание аэробной микрофлоры. Для постановки диагноза "аэробный вагинит" пациенткам с повышенным содержанием или преобладанием аэробной микрофлоры необходимо дополнительно оценить наличие местной воспалительной реакции. Для этого определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца. При наличии клинических признаков воспаления и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют аэробный вагинит. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ дифференциальной диагностики нарушений баланса вагинальной микрофлоры, включающий определение концентрации ДНК всех бактерий, концентрации ДНК бактерии Gardnerellavaginalis, концентрации ДНК бактерии Atopobium vaginae, концентрации ДНК бактерий Lactobacillus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что на основании полученных данных рассчитывают коэффициенты соотношений концентраций:KC1 = lg [ДНК Lac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]),KC2 = lg [ДНК Bac] - lg [ДНК Lac],KC3 = lg [ДНК Bac] - lg ([ДНК Gv] + [ДНК Av]),где [ДНК Lac] - концентрация ДНК бактерий Lactobacillus spp., ГЭ/мл;[ДНК Gv] - концентрация ДНК бактерии Gardnerella vaginalis, ГЭ/мл;[ДНК Av] - концентрация ДНК бактерии Atopobium vaginae, ГЭ/мл;[ДНК Bac] - концентрация ДНК всех бактерий, ГЭ/мл; при lg [ДНК Bac]5, KC11 и KC21 констатируют отсутствие бактериального вагиноза; при lg [ДНК Bac]5, 0,5KC11, KC21 и KC32 констатируют промежуточное состояние микрофлоры; при lg [ДНК Bac]5, KC10,5 и KC32 диагностируют бактериальный вагиноз; при lg [ДНК Bac]5 констатируют, что количество бактерий недостаточно для анализа. 2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при отсутствии бактериального вагиноза и 5lg[ДНК Bac]6 констатируют снижение степени бактериальной обсеменнности влагалища. 3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp., концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот и при[ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcus spp., ГЭ/мл;[ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp., ГЭ/мл,и отсутствии бактериального вагиноза делают заключение: нарушений баланса вагинальной микрофлоры не выявлено. 4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp., концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот и при[ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcus spp., ГЭ/мл;[ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp., ГЭ/мл,диагноз бактериальный вагиноз уточняют как бактериальный вагиноз в сочетании с повышенным содержанием аэробной микрофлоры. 5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют бактериальный вагиноз в сочетании с аэробным вагинитом. 6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что дополнительно определяют концентрацию ДНК Enterobacteriaceae, концентрацию ДНК бактерий Staphylococcus spp., концентрацию ДНК бактерий Streptococcus spp. в образце методом амплификации нуклеиновых кислот и при[ДНК Staph] - концентрация ДНК бактерий Staphylococcus spp., ГЭ/мл;[ДНК Strep] - концентрация ДНК бактерий Streptococcus spp., ГЭ/мл,констатируют преобладание аэробной микрофлоры. 7. Способ по п.6, характеризующийся тем, что дополнительно определяют наличие клинических признаков воспаления у пациентки и соотношение полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки при микроскопии образца и при наличии клинических признаков воспаления у пациентки и соотношении полиморфно-ядерные лейкоциты:эпителиальные клетки более 1 диагностируют аэробный вагинит. 8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что при констатации промежуточного состояния микрофлоры дополнительно определяют рН выделений пациентки и наличие жалоб на патологические выделения у пациентки и при рН 4,5 и отсутствии жалоб на патологические выделения пациентке рекомен- 24025042 дуют повторить анализ в следующем менструальном цикле, а при рН 4,5 и наличии жалоб на патологические выделения у пациентки диагностируют бактериальный вагиноз. 9. Способ по пп.1-8, характеризующийся тем, что образец представляет собой влагалищный мазок. 10. Способ по пп.1-9, характеризующийся тем, что метод амплификации нуклеиновых кислот представляет собой метод количественной полимеразной цепной реакции. 11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что метод количественной полимеразной цепной реакции представляет собой метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. 12. Способ по п.10 или 11, характеризующийся тем, что полимеразная цепная реакция представляет собой мультиплексную полимеразную цепную реакцию. Распределение пациенток по общему количеству бактерий в образце (в lg) Фиг. 1 Концентрации аэробных микроорганизмов у пациенток в аэробным вагинитом