Коровые антигенные частицы hbv с множественными иммуногенными компонентами, связанными посредством пептидных лигандов

1 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к коровым антигенным частицам вируса гепатита В("HBV"), характеризующимся множеством иммуногенных свойств. Более конкретно, настоящее изобретение относится к коровым антигенным частицам HBV, включающим иммуногены,эпитопы или другие родственные структуры,перекрестно-сшитые с ними посредством лигандов, представляющих собой связывающиеся с капсидом HBV пептиды, которые селективно связываются с коровым белком HBV. Указанные частицы могут быть использованы в качестве системы доставки иммуногенных эпитопов широкого ряда, включая пептиды, связывающиеся с капсидом HBV, которые также преимущественно ингибируют сборку вируса HBV и препятствуют ей путем блокирования взаимодействия между коровым белком HBV и поверхностными белками HBV. Смеси различных иммуногенов, пептидных лигандов, связывающихся с капсидом HBV или тех и других, могут быть перекрестно сшиты с одной и той же коровой частицей HBV. Такие полученные многокомпонентные или мультивалентные коровые частицы HBV могут быть с успехом использованы в терапевтических и профилактических вакцинах и композициях, а также в диагностических композициях и методах, предусматривающих использование данных частиц. Предпосылки создания изобретения Главным направлением клинических иммунотерапевтических схем лечения является иммунизация пациента против инфекционных патогенов и других агентов, представляющих угрозу для здоровья. Несмотря на избыток иммунизирующих агентов, их введение может давать, в лучшем случае, частичный иммунитет,для поддержания которого требуются частые повторные иммунизации. Это имеет место в случае использования различных стандартных моновалентных или поливалентных вакцин. И даже среди таких вакцин число отдельных агентов-инокулянтов, способных вырабатывать иммунитет против ряда иммуногенов, ограничено. Кроме того, антигенное разнообразие патогенов может ограничивать эффективность стандартных вакцин. Попытки, предпринятые для преодоления этих трудностей, были направлены на методы усиления ответа иммунной системы на данные иммуногены. Для этих целей в попытке усиления иммуногенности присоединенного иммуногена посредством приведения в действие Тклеточно-зависимых и Т-клеточно-независимых детерминант корового антигена HBV, были получены иммуногенные конъюгаты путем присоединения иммуногенов к коровым частицам вируса гепатита В ("HBV") (также называемые нуклеокапсидами или нуклеокапсидными панцирями). См., например, патент США 4818527 иas Carrier for Foreign Epitopes", Adv.Virus. Res.,50, pp. 141-82 (1998). Была также предпринята попытка усиления иммуногенности представляющих интерес эпитопов с использованием гибридных белков, образующих вирусные частицы, и содержащих, по крайней мере, часть природного белка, образующего вирусную частицу, например, поверхностный антиген HBV и один или несколько представляющих интерес эпитопных сайтов. См., патент США 5965140. Результатом этих попыток было использование белков в качестве основы для представления нужных иммуногенов иммунной системе. Вирус гепатита В представляет собой присутствующий в крови вирус, который включает маленький геном, состоящий из частично двухцепочечной ДНК, имеющей четыре в значительной степени перекрывающиеся открытые рамки считывания. HBV состоит из внутреннего нуклеокапсида, включающего коровый белокHBV ("НВсАg"), вирусную полимеразу и вирусную ДНК, и окруженного мембранной оболочкой, содержащей поверхностные антигены HBV(HBsAg). Вирусная оболочка содержит три различных, но родственных поверхностных антигенных белков с длинной (L), средней (М) и короткой (S) цепями, которые имеют общую карбоксиконцевую область, но разные аминоконцы, что обусловлено варьирующимся использованием триплетов инициации в различных точках непрерывной открытой рамки считывания. Длинный полипептид (L-полипептид) состоит из пре-S1, пре-S2 и S-областей. Он является продуктом всей рамки считывания и в своем аминоконце включает прe-S1-домен, состоящий из 108 аминокислот (или 199 в зависимости от подтипа вируса), за которым следует пре-S2 домен, состоящий из 55 аминокислот, и область короткого полипептида (S-полипептида), состоящая из 226 аминокислот. Полипептид средней длины (М-полипептид) имеет у своего аминоконца пре-S2-домен, за которым следует область S, тогда как S-полипептид, который присутствует, в основном, в избытке, состоит только из S-области. Пре-S-области, очевидно, играют важную роль как в сборке вируса, так в присоединении к клетке-хозяину. В данном вирусе S-форма является более избыточной, чем М- и L-формы HBsAg, и присутствует как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах [V. BrussD. Ganem, "The Role ofProteins Needed for the Formation of Dane Particles", J.Virol., 65, pp. 3521-29 (1991)]. Специфические взаимодействия между внешней поверхностью сердцевины и внутренней поверхностью оболочки вероятно способствуют правильной сборке вируса и стабилизации полученной частицы. Коровый белок HBV может быть эффективно экспрессирован в E.coli [M.Pasek et al.,"Hepatitis В Virus Genes and Their Expression inE.coli", Nature, 282, pp. 575-79 (1979)], в которой он образует икосаэдральные капсулы двух размеров, содержащие либо 180 (Т=3), либо 240 субъединиц (T=4) [R.A. Crowther et al., "ThreeDimensional Structure of Hepatitis В Virus CoreParticles Determined by Electron Microscopy",Cell, 77, pp. 943-50 (1994)]. Эти субъединицы кластеризуются в виде димеров и каждый димер образует "шип", выступающий на поверхности капсулы. Недавно, с использованием электронной криомикроскопии и обработки изображения была получена карта капсулы Т=4 с разрешением 7,4 А от более чем 6000 отдельных частицCryomicroscopy", Nature, 386, pp. 88-91 (1997)]. Это позволило определить укладку полипептидной цепи, которая имела, главным образом,-спиральную структуру и полностью отличалась от ранее выявленных вирусных капсидов. Каждый димерный "шип" был образован парой длинных -спиральных "шпилек", по одной от каждого мономера в данном димере [Bttcher et(1997)]. В соответствии со схемой нумерации,которая предусматривает наложение аминокислотной последовательности на складчатую структуру [Bttcher et al., (1997)], главный иммунодоминантный -район корового белка HBV находится примерно в области аминокислот 7882 [J. Salfeld et al., "Antigenic Determinants andHBV, являются агенты, которые связываются с коровым антигеном HBV, что приводит к блокированию взаимодействия между коровыми белками HBV и поверхностными белками HBV. Такие связывающиеся с капсидом HBV пептиды описаны в заявке на патент РСТ WO 98/18818 и 4 такой связывающийся с капсидом пептид,MHRSLLGRMKGA, был перекрестно сшит с коровым антигеном HBV [В. Bttcher et al.,"Peptides that Block Hepatitis В Virus Assembly:Transfection", EMBO J., 17, pp. 6839-45 (1998)]. Как будет видно из нижепривиденного описания, пептиды, связывающиеся с капсидомHBV, могут быть преимущественно использованы в качестве лигандов для конструирования коровых антигенных частиц HBV, характеризующихся способностью вырабатывать усиленные иммунные ответы на один или множество иммуногенов. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к решению вышеуказанных проблем путем создания коровых антигенных частиц HBV, которые вырабатывают усиленные иммунные ответы на один или множество иммуногенов. Такие многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы HBV включают иммуногены, эпитопы или другие родственные структуры, перекрестно сшитые посредством лигандов,представляющих собой пептиды, которые селективно связываются с коровыми антигенными частицами HBV, а также с иммуногенными доменами или эпитопами, связанными с коровым антигенным полипептидом или встроенными в него посредством генетической модификации кодирующей последовательности или путем полипептидного синтеза. Такие частицы могут быть использованы в качестве систем для доставки различных иммуногенных эпитопов,включая пептиды, связывающиеся с капсидомHBV, которые сами по себе ингибируют сборку вируса HBV или препятствуют этой сборке путем блокирования взаимодействия между коровыми белками HBV и поверхностными белкамиHBV. Полученные многокомпонентные и мультивалентные коровые частицы HBV могут быть с успехом использованы в терапевтических или профилактических вакцинах и композициях, а также в качестве диагностических композиций и в методах их применения. Настоящее изобретение позволяет преимущественно получать смеси различных иммуногенов, пептидных лигандов, связывающихся с капсидом HBV, или тех и других, которые подвергают перекрестному сшиванию с указанной коровой частицей HBV. В результате этого получают отдельные частицы, которые являются эффективными стимуляторами Т-клеток и которые являются иммунологически мультивалентными. Таким образом, отдельная антигенпредставляющая клетка может стимулировать пролиферацию множества В-клеточных клонов различной специфичности. Краткое описание графического материала На фиг. 1 показана структура коровой антигенной частицы HBV, содержащей различные связывающиеся с капсидом иммуногены. "Свя 5 зывающийся с капсидом иммуноген" включает по крайней мере один пептидный компонент,связывающийся с капсидом HBV, и по крайней мере один иммуногенный компонент. Каждый связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к коровой антигенной частице HBV посредством пептида, связывающегося с капсидомHBV. На фиг. 2 представлена таблица, где в систематизированной форме указаны различные коровые антигенные гибридные белки HBV,которые могут также служить в качестве коровой антигенной частицы HBV, к которой посредством пептидов, связывающихся с капсидом HBV, могут быть присоединены различные иммуногены. Подробное описание изобретения Для лучшего понимания описанного здесь настоящего изобретения ниже приводится его более подробное описание. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения смеси иммуногенов нескольких разных типов и одного или более пептидных лигандов, связывающихся с капсидом HBV, могут быть перекрестно сшиты с одной и той же коровой частицей HBV. Альтернативно, множество копий того же самого антигена может быть связано с пептидом одного типа,связывающимся с капсидом HBV, и перекрестно сшито с различными положениями на коровой частице HBV. Многокомпонентные и мультивалентные коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения могут быть, в частности,использованы для вырабатывания антител против всех иммуногеннных компонентов. Использование пептидов, связывающихся с капсидом HBV, для присоединения иммуногенов к коровой антигенной частице HBV позволяет увеличивать уровень презентации иммуногена, без нарушения иммуногенности или стабильности данного иммуногена, происходящего вследствие денатурации, конформационного разрушения или других дестабилизирующих факторов. Так, например, пептидные линкеры,связывающиеся с капсидом HBV, снижают риск взаимодействия иммуногенных компонентов друг с другом, приводящего к потере функционального продукта. В результате этого, коровая антигенная частица HBV вырабатывает повышенный иммунный ответ к ее иммуногенным компонентам. Поэтому нужные терапевтические или профилактические эффекты могут быть достигнуты при меньшем числе инокуляций и/или при меньшем количестве инокулянта, чем это требуется в том случае, когда каждый иммуноген вводят в качестве единственного агента. Присоединение иммуногенов к коровым антигенным частицам HBV посредством пептидов, связывающихся с капсидом HBV, также позволяет добиться презентации иммуногенов,которые отличаются по своему размеру, кон 004497 6 формации и природе. В результате этого, настоящее изобретение относится к вакцине или композиции и к комбинациям иммуногенов,которые могут быть использованы для вырабатывания иммунитета широкого спектра или для лечения данного индивидуума. Иммуногены Иммуногенами, которые могут быть присоединены к пептидам, связывающимся с капсидом HBV, и таким образом включены в коровые частицы HBV, являются любые молекулы,содержащие один или несколько иммунологических, иммуногенных или антигенных эпитопов. По своей природе указанные эпитопы могут быть линейными, конформационными, одиночными или смешанными. Более конкретно, иммуногены могут быть выбраны из любых агентов, способных вырабатывать иммунный ответ. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими, антигены,антигенные детерминанты, белки, гликопротеины, антитела, фрагменты антител, пептиды,пептидные мимотопы, которые имитируют антиген или антигенную детерминанту, полипептиды, гликопептиды, углеводы, олигосахариды,полисахариды, олигонуклеотиды и полинуклеотиды. Иммуногенами могут быть также аллергены, токсины или эндотоксины. Указанными агентами также являются агенты, нацеленные на различные патогены или происходящие от этих патогенов, таких как вирусы, паразиты, бактерии, грибы, фаги, простейшие микроорганизмы и растения. Указанные вирусы включают в себя ретровирусы, в том числе вирусы иммунодефицита человека типа 1 и типа 2 и вирус Т-клеточного лейкоза; герпесвирусы, такие как вирусы простого герпеса типа 1 и типа 2, вирусы ветряной оспы; цитомегаловирусы и вирус Эпштейна-Барра; ортомиоксовирусы, такие как вирусы гриппа А,гриппа В и гриппа С; парамиксовирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус, вирус псевдокори, вирус свинки и вирусы парагриппа; гепаднавирусы, такие как вирус гепатита В; флавивирусы, такие как вирус гепатита С, вирус гепатита А, вирус гепатита Е, вирус желтой лихорадки, вирус денге и вирусы клещевого энцефалита; пикорнавирусы, такие как энтеровирусы, риновирусы, вирусы ящура и вирус полиомиелита; тоговирусы, такие как вирус коровой краснухи; рабдовирус, такой как рабивирус; аденовирусы; вирусы Эбола; бакуловирусы; хантавирусы; паповирусы, такие как папилломавирусы; парвовирусы; ДНК-содержащие вирусы; РНК-содержащие вирусы; РНКвирусы, вызывающие опухоли, такие как онковирусы; и поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы. Кроме того, иммуногенами могут быть иммуногены, нацеленные на бациллы, энтеробактерии, клостридии, листерии, микобактерии,псевдомонады, стафилококки, эубактерии, микоплазмы, хламидии, спирохеты, нейссерии или 7 сальмонеллы или происходящие от указанных бактерий. Иммуногены могут быть также выбраны из нижеследующих эпитопов вируса иммунодефицита человека: GELGRWEKI (gag);V3); ELDKWA (gp41) и DRFYKTLRA (gp41). Гликопротеинами, которые могут быть присоединены к пептидам, связывающимся с капсидом HBV, и таким образом введены в коровые частицы HBV, являются, например, антитела, гликопептиды, происходящие от поверхностных компонентов или подобных поверхностым компонентам клеток животных,вирусов или бактерий, например, вызывающих менингит, или фрагментов этих молекул. При этом, следует отметить, что размер иммуногена не должен быть слишком большим,так, чтобы он не препятствовал взаимодействию его функциональной группы с пептидным линкером, связывающимся с капсидом HBV. Коровый антигенный белок HBV Благодаря своей корпускулярной природе,коровый антигенный белок HBV составляет преимущественную основу для презентации иммунной системе множества иммуногенов подобного или отличающегося типа. В соответствии с настоящим изобретением это преимущество еще более повышается, благодаря использованию пептидов, связывающихся с капсидомHBV, для присоединения нужных иммуногенов к коровой частице HBV. Такие частицы содержат 90 или 120 лигандсвязывающих сайтов капсидных "шипов", каждый из которых состоит из димера корового антигенного HBV (см. фиг. 1). Таким образом, множественные иммуногены могут быть физически присоединены к коровой антигенной частице HBV посредством связывающихся с капсидом HBV пептидов, используемых в качестве лигандов. Полученная частица способна индуцировать иммунный ответ ко всем ее иммуногенным компонентам. Коровые антигенные частицы HBV могут быть образованы после экспрессии рекомбинантных последовательностей, кодирующих полипептид корового антигена HBV в подходящей микробной системе, в системе, происходящей от животного, и в растительной системе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Edition., Cold Spring(1989). Экспрессируемый полипептид может включать полноразмерную последовательность корового антигена HBV или ее мутации, производные, усеченые варианты или фрагменты,которые сохраняют способность к сборке в корпускулярной форме в клетках экспрессирующей системы. Рекомбинантные методы продуцирования таких коровых антигенных частиц HBV известны специалистам. См., например, патент США 4710463. Альтернативно, для продуцирования полипептида корового антигена HBV могут быть 8 использованы методы химического синтеза. Химический синтез может быть осуществлен методом твердофазного синтеза на основе аминокислотной последовательности полипептидов корового антигена HBV [R.B. Merrifield,Fed.Proced., 21, p. 412 (1964); R.B. Merrifield,Biochemistry, 3, pp. 1385-90 (1964) и D.R. Milichet al., J. Immunol., 139, pp. 1223-31 (1987)]. При этом следует отметить, что поскольку мутированные или вариантные последовательности корового антигена HBV могут влиять на реакции со связывающимися или лигандными пептидами, то настоящее изобретение в равной степени относится к природным вариантам или мутациям, вводимым путем модификации кодирующих последовательностей или другими методами в коровые антигенные субъединицыHBV или соответствующие связывающиеся или лигандные пептиды. Мутации остатков корового белка, имеющие важное значение для связывания с пептидом Методы, используемые для определения укладки корового белка, были применены в целях определения, путем криомикроскопии, локализации сайтов связывания на коровом белкеHBV пептида, который ингибирует связывание с L-HBsAg. Этот метод показал, что данный пептид связывается с пиками "шипов", как в оболочках Т=3, так и в оболочках Т=4 [B. Bttcher et al., "Peptides that Block Hepatitis В VirusAssembly: Analysis by Cryomicroscopy, Mutagenesis and Transfection", EMBO J. 17, pp. 683945 (1998)]. Анализ изображения показал, что сайты связывания пептида находятся на вершине шипов, которые в предложенной схеме нумерации для полипептидной укладки [B. Bttcheret al. (1997)] соответствуют остаткам в области аминокислот 78-82. Имеются два кислотных остатка (glu77 и asp78), расположенные возле вершины корового белка, и выбранный связывающийся пептид содержит два консервативных основных остатка. Важное значение этих противоположно заряженных остатков в реакциях связывания было подтверждено при обнаружении того факта, что мутация любого из кислотных остатков данного белка путем замены на аланин значительно снижает аффинность данных пептидов по отношению к модифицированным коровым капсулам. Замена аспарагиновой кислоты 78 на аланин приводит к снижению аффинности в 160 раз, а замена глутаминовой кислоты 77 на аланин приводит к снижению аффинности в 1000 раз. Это дает основание предположить, что любой или оба из кислотных остатков на белке корового антигена HBV могут составлять, по крайней мере, часть сайта связывания для пептидов, связывающихся с капсидомHBV. Эти результаты также иллюстрируют важное значение аминокислотной последовательности корового антигена HBV в области вершины"шипа" для связывания с лигандом. При этом,следует отметить, что может потребоваться введение мутации в коровый антиген некоторых штаммов HBV для осуществления эффективного связывания конкретного лиганда и иммуногенного пептида, или может потребоваться отбор и адаптация вариантов данного лиганда для осуществления эффективного связывания со специфическим вариантом корового антигенаHBV. Коровые антигенные гибридные белки HBV В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, коровая антигенная частица HBV, к которой могут быть присоединены иммуногены посредством пептидов, связывающихся с капсидом HBV, может быть частицей, уже отображающей один или несколько иммуногенов в результате применения методов конструирования генных гибридов. В одном из таких методов соответствующие кодирующие последовательности вводят в соответствующие положения в плазмидах или в других векторах,несущих последовательности для полипептида корового антигена HBV. Гибриды с геном -галактозидазы E.coli,используемые для повышения уровней экспрессии полипептида корового антигена HBV, продемонстрировали, что замена первых двух аминокислот данного антигена на последовательность, состоящую из одиннадцати аминокислот(восемь от аминоконца -галактозидазы и три других остатка, полученных после трансляции линкерной последовательности, введенной в гибридный ген) не оказывает негативного влияния на процедуру выделения, антигенность или морфологию данного продукта [S. Stahl et al.,"Hepatitis B Virus Core Antigen. Synthesis in Escherichia Coli and Application in Diagnosis",Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, pp. 1606-10 (1982);E.Coli", Nature, 296, 296, pp. 677-78 (1982)]. Гибридные белки корового антигена HBV,используемые в настоящем изобретении, могут быть продуцированы, как показано в работе S.Sci., USA, 86, pp. 6283-87 (1989). Альтернативно в качестве примера гибриды полипептидных последовательностей с главным сегментом корового антигена HBV, которые дают в высокой степени иммуногенные частицы, были получены с использованием ряда вирусов, кодирующих последовательности, перечисленные на фиг. 2. Таким гибридом является продукт в виде частицы с высокой иммуногенностью, продуцированный путем экспрессии с использованием вектора на основе вируса коровьей оспы, содержащего пептид VP-1 (остатки 142-160), присоединенный посредством гептапептидной линкерной последовательности к шести аминокис 004497 10 лотам предкоровой последовательности, расположенной непосредственно перед аминоконцом полипетида корового антигена HBV [B.E. ClarkeEpitope after Fusion to Hepatitis В Core Protein",Nature, 330, pp. 381-84 (1987)]. Для других подходящих гибридных белков корового антигенаHBV см. также Ulrich et al., (1998). Серия других гибридных белков характеризуется заменой обогащенной аргинином области у карбоксиконца полипептида корового антигена HBV на другие альтернативные кодирующие последовательности. Пептиды, которые включают иммунодоминантную а-область поверхностного антигена HBV (остатки 111-165),пре-Sl-и пре-S2-эпитопы и различные сегменты оболочечного белка вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), были присоединены к остатку 144 полипептида корового антигена HBV. Все они были эффективно экспрессированы в E.coli с получением корпускулярных продуктов,имеющих такую же морфологию, как и сам коровый антиген HBV [StahlMurray, 1989]. Эти продукты обнаруживали антигенную реактивность корового антигена HBV, и, при тестировании, подобно препаратам полипептида корового антигена HBV, усеченного в остатке 144,они также обнаруживали антигенную реактивность HBV, тогда как полноразмерный коровый антиген HBV обнаруживал очень незначительную активность. Гибридные белки, несущие остатки 111-156 или 111-165 от поверхностного антигена HBV, не обнаруживали значимой поверхностно-антигенной реактивности HBV, что не противоречило конформационной зависимости этого главного эпитопа, или вероятности того, что эти последовательности "спрятаны" внутри данных частиц. Однако иммуногенные ответы на гибридные белки свидетельствовали о наличии у них различных эпитопных компонентов. Иммунные ответы на поверхностный антиген HBV являются сложными, так как помимо эпитопов, присутствующих в пре-S1- и пре-S2 областях L-HBsAg и в главной иммунодоминантной области, ряд детерминант вариабельных подтипов был сообщен и другим областям короткого или S-полипептида поверхностного антигена HBV (G.L. Le Bouvier, "The Heterogenicity of Australia Antigen", J.Infect. Dis., 123,pp. 671-75 (1971); W.H. Bancroft et al., "Detection(Philadelphia, USA: Franklin Institute Press), pp. 649-54 (1978)]. Кодирующие поверхностный антиген HBV последовательности, определенные на ДНК HBV, клонированной из сывороток различных подтипов, обнаруживают различия в соответствующих последовательностях белков. 11 Однако специфические единичные мутации,возможно, в критических остатках не влияли на переключение с одного серологического подтипа (у) на другой (d), но дополнительные единичные мутации индуцировали постепенное изменение подтипов с реактивностями у и d и иммуногенностями, обнаруживаемыми у той же самой молекулы [P.G. Ashton-RickardtK.Subtype of Hepatitis В Surface Antigen and Distinguish Between Antigenic and Immunogenic Determination", J. Med. Virol., 29, pp. 204-14 (1989)]. Введенные мутации были сделаны внутри или возле конформационно-восприимчивой иммунодоминантной а-области, и все они находились в сегменте корового антигена HBV, используемого в гибридах с коровым антигеном HBV,описанным выше. Влияние мутаций на специфичность подтипа индуцированных антител дает основание предположить, что гибридные белки могут быть также средством для изменения специфичности ответа на представляющие интерес эпитопы,особенно, если они зависят от конформации. Поэтому мутации с заменой глицина 145 на аргинин, вводимые для имитации природного "ускользнувшего" мутанта, и на другие положительно или отрицательно заряженные остатки(лизин и глутаминовую кислоту) были сделаны в указанном остатке в HBcS111-156 для сравнительных исследований гуморальных и клеточных иммунных ответов [A.L. ShiauK. Murray,"Mutated Epitopes of Hepatitis В Virus Surface(1987)]. Все они эффективно экспрессировались в E.coli с образованием ожидаемых корпускулярных продуктов, обнаруживающих высокий уровень антигенности сердцевины HBV, и все они индуцировали высокие титры антител к коровому антигену HBV у кроликов. Подобно их родительскому белкуHBcS111-156, три мутанта по остатку 145 обнаруживали минимальное взаимодействие с антителом против поверхностного антигена HBV в твердофазных радиоиммунных анализах (AUSRIA; Abbott Laboratories) или в анализах на преципитацию антитела в растворе. Однако после электрофореза в акриламидных гелях в денатурирующих условиях, все они обнаруживали сильные реакции с кроличьей антисывороткой против поверхностного антигена HBV в экспериментах по иммуноблотингу (A.L. Shiau, "Immunological Aspects of Hepatitis В Virus CoreAntigen and its Derivatives", PhD Thesis, University of Edinburgh, UK (1993)]. При высоких концентрациях родительские и мутантные белки,при их захвате на твердой фазе, сенсибилизированной антителом против корового антигенаHBV, также давали слабые позитивные реакции с антителом против поверхностного антигенаHBV, что возможно обусловлено некоторым разрушением частиц, обеспечивающих доступ к молекулам против HBsAg [ShiauMurray,1997] . Для оценки Т-клеточных ответов на гибридные белки, а также для продуцирования антител были использованы иммунизованные кролики. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), взятые в различные периоды времени после иммунизации, были использованы для анализов на пролиферацию, осуществляемых на основе включения [3 Н]-тимидина в ответ на обработку коровым антигеном HBV или гибридным белком, используемым для иммунизации. Во всех случаях наблюдались сильные ответы, причем гибридный белок давал более высокий индекс стимуляции, чем коровый антиген HBV, а поверхностный антиген HBV,как и ожидалось, давал слабую стимуляцию. Для определения уровней антитела против HBS в образцах сыворотки проводили радиоиммунопреципитационный анализ методом двойных антител [C.J. Burrel et al., "Rapid Detection of(1978)] с использованием [125I]-меченного поверхностного антигена HBV, и этот анализ показал ожидаемый положительный ответ наHBcS111-156. Мутант с аргинином также давал положительный ответ в данном анализе, хотя этот ответ был несколько меньше, чем ответ его родительской молекулы, и слабый ответ был получен от мутанта с глутаминовой кислотой,но не от мутанта с лизином. Таким образом,полученные результаты показали, что гибридный белок (обозначенный НВсS145R), несущий мутацию с аргинином в положении 145, является сильным стимулятором Т-клеток и индуцирует вырабатывание антител с более широкой реакционной специфичностью. Для исследования влияния полного размера, числа и положения различных дополнительных компонентов на иммуногенность данных продуктов была получена дополнительная группа гибридов различных частей полипептида поверхностного антигена HBV, включая мутантов по остатку 145, с полипептидом корового антигена HBV [Shiau (1993)]. Эти конструкции представлены на фиг. 2, и как в случае других гибридов, все они давали корпускулярные продукты, имеющие морфологию корового антигенаHBV, хотя гибриды с фрагментом HBcS111-156 на аминоконце корового антигена HBV показали менее удовлетворительный результат, поскольку они давали продукты, которые образовывали нерастворимые агрегаты. Указанная группа продуктов, подобно ранее полученным продуктам с сегментамиHBcS111-156, обнаруживала незначительную реакцию или отсутствие реакции с антителом против поверхностного антигена HBV на твердой фазе или в растворе, но при захвате антителом 13 против корового антигена HBV на твердой фазе,они обнаруживали аналогичную реактивность с антителом против поверхностного антигенаHBV, и эта реактивность была несколько выше(приблизительно в 2 раза) по сравнению с гибридами, которые, помимо НВсS111-156, содержали пре-S1- и пре-S2-сегменты. И снова индексы стимуляции для ингибирования пролиферации лимфоцитов были высокими для всех гибридных белков, и белки, которые включали пре-Sсегменты, однако, также нативные или мутантные HBcS111-156-последовательности, давали более сильные ответы. Включение пре-S1- и преS2-последовательностей между НВс 144 и НВсS111-156-последовательностями (либо дикого типа, либо мутант-ных) давало более высокие уровни антител в радиоиммунопреципитационном анализе с двойным антителом, чем гибриды, в которых отсутствовали пре-Sсегменты, но введение второй HBcS111-156 последовательности между HBc144 и НВсS111-156 последовательностями не давало дополнительного увеличения какого-либо из указанных ответов. Наиболее длинная из этих последовательностей, присоединенных к полипептиду корового антигена HBV в пролина 144, 165 аминокислот, не оказывала какого-либо негативного влияния на выход или на физические свойства данного гибридного белка. Был также получен гибрид корового белка(НСс) вируса гепатита С (HCV), частично и во множестве полноразмерных копий, с полипептидом корового антигена HBV, усеченным у валина 149 [A. Yoshikawa et al., "Chimeric Hepatitis В Virus Core Particles with Parts of Copies ofthe Hepatitis С Virus Core Protein", J.Virol., 67,pp. 6064-70 (1993)]. Гибриды, несущие остатки 39-75 НСс, обнаруживали незначительную антигенность НСс, а остатки 1-91 или полная последовательность из 180 аминокислот давали положительные реакции, а по мере присоединения дополнительных копий (вплоть до четырех) последовательности 1-180 посредством коротких линкеров эта антигенность увеличивалась почти в арифметической прогрессии. Электронная микроскопия показала, что данный гибрид,несущий одну копию остатков 1-91 НСс, образовывал частицы, морфологически эквивалентные полипептиду корового антигена HBV, но три полноразмерные копии НСс значительно искажали эту структуру, и данный продукт был очень восприимчивым к протеолизу, что позволяло, однако, получить продукт, который сохранял коровую антигенность HBV. Хотя наиболее крупный белок имел более 720 дополнительных аминокислот, предел для частиц типа корового антигена HBV, очевидно, был значительно меньше. Для исследований влияния положения гибрида с НВсАд на иммуногенность были использованы последовательности PrcS. Борисова и др. (Borisova et al., (1989 сконструировали 14 гибриды с сегментами пре-S1 (остатки 20-68,20-69 или 69-106) или со всей пре-S2 последовательностью, присоединенной к коровому антигену HBV, усеченному у пролина 144,или встроенной в это положение в полноразмерной последовательности корового антигенаHBV. В этих и аналогичных конструкциях с остатками 56-103 оболочечного белка вируса коровьего лейкоза (BLV) или с остатками 78129 трансмембранного белка ВИЧ (др 41), последовательности, гибридизованные с коровым антигеном HBV находились, очевидно, на поверхности частиц; причем сообщалось, что все они, т.е. антигенный, иммуногенный и Сконцевой богатые аргинином домены оказывают, по всей вероятности, незначительное негативное действие.Particles Determines Their Immunogenicity",J.Virol., 6, pp. 106-14 (1992 исследовали влияние положения гибрида на антигенность и иммунный ответ у инбредных мышей при присоединении пре-S1- или пре-S2-сегментов у аминоконца полноразмерного корового антигена HBV(либо непосредственно, либо посредством части предкоровой последовательности) или у карбоксиконца усеченного корового антигена HBV; дополнительная конструкция содержала пре-S1 сегмент между остатками 75 и 83 корового антигена HBV, а также пре-S2-фрагмент у усеченного карбоксиконца (пролин 156). Детальное исследование показало, что указанная пре-S1-последовательность, гибридизованная с аминоконцом корового антигена HBV посредством предкоровой последовательности,была антигенной, а указанная последовательность, присоединенная непосредственно к аминоконцу, не обнаруживала антигенности, и хотя обе они имели иммуногенность, аналогичную иммуногенности корового антигена HBV, однако, гибрид, образованный посредством предкоровой последовательности, стимулировал значительно более сильный анти-пре-S1-ответ. Пре-S2-последовательность у усеченного конца корового антигена HBV была в аналогичной степени антигенной и иммуногенной в обоих случаях, но пре-S1-последовательность, гибридизованная изнутри так, чтобы осуществлялась замена остатков 76-82 (которые включают главный эпитоп корового антигена HBV), была значительно более антигенной и гораздо более иммуногенной, чем в N-концевых гибридах. Как и ожидалось, HBV-коровая антигенность и иммуногенность была значительно снижена во внутренних гибридных белках. Замена внутренней последовательности корового антигена HBV(остатки 78-82) на фрагмент поверхностного антигена HBV, содержащий иммунодоминантный а-эпитоп, также приводила к получению продукта, обнаруживающего положительную HBV-коровую антигенность и иммуноген 15 ность. [G. Borisova et al., "Hybrid Hepatitis В Virus Nucleocapsid Bearing an ImmunodominantRegion from Hepatitis В Surface Antigen", J.Virol.,67, pp. 3696-3701 (1993)]. В качестве дополнительной альтернативы,или в качестве дополнения к гибридным белкам,описанным выше, иммуногенные компоненты могут быть присоединены к коровому антигенуHBV методом перекрестного сшивания. Наложение аминокислотной последовательности корового антигена HBV на физическую структуру, предложенное Bttcher et al.,(1997), позволяет объяснить низкую антигенность последовательностей, гибридизованных у карбоксиконца или возле карбоксиконца корового антигена HBV, поскольку такие последовательности, по-видимому, содержатся в частицах корового антигена HBV, тогда как N-концевые гибриды могут иметь некоторые преимущества благодаря гибким линкерным последовательностям, что позволяет дополнительно вынести иммуноген из относительно ограниченного пространства у основания "шипов". Локализация иммунодоминантного эпитопа корового антигена HBV [остатки 78-82; Salfeld et al. (1989)] на вершине шипа указывает на привлекательность этого положения для вставки или присоединения пептида-иммуногена, связывающегося с капсидом HBV. В принципе, все эти положения могут быть использованы одновременно с увеличением числа и/или разнообразия эпитопов,представляемых данной коровой антигенной частицей HBV. Пептиды, связывающиеся с капсидом HBV и используемые для присоединения иммуногенов к коровым антигенным частицам HBV Как было описано выше, нужные иммуногены могут быть присоединены к коровой частице HBV с использованием лиганда, который представляет собой пептид, связывающийся с капсидом HBV. Такие связывающиеся с капсидом HBV пептиды являются выделенными очищенными пептидами. Эти связывающиеся с капсидом HBV пептиды преимущественно ингибируют сборку HBV и препятствуют ей путем блокирования взаимодействия между коровым белком HBV и поверхностными белками HBV. Пептидами, связывающимися с капсидомHBV, предпочтительно являются пептиды, их фрагменты, аналоги и гомологи, которые имеют длину от около 2 до около 20 аминокислот. Более предпочтительно, если указанные пептиды имеют длину от около 3 до около 15 аминокислот. Такими пептидами являются пептиды, перечисленные в нижепривиденных таблицах, а также их фрагменты и аналоги. Используемый здесь термин "фрагмент" означает аминокислотную последовательность,которая является короче, чем пептид, от которого она происходит, и которая при этом сохраняет биологическую активность, в основном, аналогичную активности исходного пептида. Такой 16 фрагмент имеет длину по крайней мере в две аминокислоты. Используемый здесь термин "аналог" означает варианты аминокислотных последовательностей пептидов, которыми могут быть аналоги, в основном, отличающиеся приблизительно только одной-четырьмя аминокислотными заменами. Другими примерами аналогов являются пептиды, которые имеют небольшие аминокислотные отличия по сравнению с пептидами, проиллюстрированными в настоящем описании. В частности, в понятие "аналоги" входят пептиды, содержащие консервативные аминокислотные замены, т.е. замены, которые вводятся в семейство аминокислот, являющихся родственными по своим боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислотные: аспартат, глутамат; (2) основные: лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные: глицин, аспарагин, глутамин,цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин,триптофан и тирозин иногда вместе классифицируют как ароматические аминокислоты. Что касается пептидов, связывающихся с капсидомHBV, то может оказаться предпочтительным,чтобы в них была введена замена одной или нескольких аминокислот. Каждый специалист легко может оценить влияние такой замены. Термин "гомолог" включает пептидные фрагменты, которые имеют по крайней мере 60%-ную идентичность, а предпочтительно 75%-ную идентичность на аминокислотном уровне, и биологическую активность, в основном, аналогичную активности сравниваемого пептида. Указанные предпочтительные проценты идентичности отражают небольшой размер пептидов. Используемыми связывающимися с капсидом HBV пептидами являются пептиды, полученные на основе пептидов, описанных DysonMurray (1995). Такие пептиды были синтезированы путем рандомизированного мутагенеза остатков, фланкирующих пептид LLGRMK в гибридном фаге В 1, и повторного отбора против корового антигена HBV в реакции биопэннинга с получением производных, которые связываются с антигеном с улучшенной аффинностью. Высокоразрешающая электронная криомикроскопия показала, что такие связывающиеся с капсидом HBV пептиды присоединяются на вершинах "шипов" белковой оболочки сердцевины HBV. Ингибирующее действие этих пептидов на взаимодействие между белками корового антигена HBV и поверхностного антигенаHBV в инфицированных клетках оценивали посредством трансфекции проницаемых клеток гепатомы Hep G2 с помощью компетентной по репликации плазмидой, несущей димер типа 17 или отсутствии данного пептида. См. Bttcher и др. (1998). Пептиды, связывающиеся с капсидом HBV и несущие последовательность LLGRMK, способствуют снижению выхода HBV в трансфецированных клеточных культурах гепатомы дозозависимым способом и с относительной эффективностью, которая, для этих пептидов, выражается величинами IC50 при их ингибировании реакций между коровым антигеном HBV и поверхностным антигеном L-HBV в растворе. Пептиды, связывающиеся с капсидомHBV, предпочтительно имеют полумаксимальную концентрацию (IC50) менее чем около 10, а более предпочтительно менее чем 5, еще более предпочтительно менее чем около 2, а наиболее предпочтительно менее чем около 0,5 мкМ. Предпочтительными пептидами являются, но не ограничиваются ими,SLLGRMKG(-A)C,RSLLGRMKGA,HRSLLGRMKGA иRSLLGRMKGA(-A)С или происходящие от них пептиды. Альтернативно, таким пептидом может быть пептид ALLGRMKG, который ингибирует взаимодействие между длинным поверхностным антигеном вируса гепатита В (LHBsAg) и НВсАg, и имеет полумаксимальную концентрацию (IC50) 10,0 мкМ. Ниже представлены связывающиеся с капсидом HBV пептиды, где KDReI (нМ) означает относительную константу диссоциации для реакций между коровым антигеном HBV и гибридным фагом fd, несущим пептидные последовательности в аминоконцевой области белка Эти пептиды, которые имитируют цитоплазматические области L-HBsAg, были идентифицированы путем отбора из рандомизированной библиотеки гексапептидов, отображенной на нитчатом фаге, и их аффиности по отношению к коровому антигену HBV в растворе были определены в фагоассоциированной форме. Нижеследующие родственные пептиды (перечисленные ниже) также являются примерами пептидов, связывающихся с капсидом HBV, а величины IC50 мкМ представляют собой концентрацию пептида, необходимую для ингибирования полумаксимального связывания L 004497HBsAg с коровым антигеном HBV, N/D означает, что ингибирование не наблюдалось, а -A означает бета-аланин (См. DysonMurrayHBV, их фрагменты, аналоги и гомологи, которые могут служить в качестве лигандов для связывания с иммуногенами для коровых антигенных частиц HBV, предпочтительно синтезируют традиционными методами синтеза, например,методами химического синтеза. Альтернативно,каждый специалист может синтезировать любой из пептидов с использованием автоматического синтезатора пептидов стандартными методами химического синтеза, например, с использованием t-BOC-химии. См., например, L.A. Caprino,J.Am.Chem.Soc., 79, pp. 4427 (1957). Указанные пептиды могут быть также получены путем химического расщепления белков или другими методами. Пептиды выделяют так, чтобы они, в основном, не содержали предшественников химических соединений или других химических соединений, образующихся при химическом синтезе или полученных путем химического расщепления белка. Альтернативно, пептиды, связывающиеся с капсидом HBV, могут быть получены стандартными методами генной инженерии, например, с использованием техники рекомбинантных ДНК в клетках-хозяевах, трансформированных нуклеиновокислотной последовательностью, кодирующей данный пептид, путем клонирования и экспрессии в микроорганизме или в клетке-хозяине ДНК-фрагмента, несущего кодирующую последовательность для выбранного пептида. При продуцировании методами рекомбинантных ДНК в соответствующим образом трансформированных клетках, указанные пептиды могут быть выделены из клеточной культуральной среды, из клеток-хозяев, либо из тех и других стандартными методами. Рекомбинантные пептиды выделяют так, чтобы данный пептид, в основном, не содержал клеточного материала или культуральной среды, исполь 19 зуемой при продуцировании методами рекомбинантных ДНК. Кодирующие последовательности для указанных пептидов могут быть получены синтетически или продуцированы из вирусной РНК известными методами, либо они могут быть продуцированы из имеющихся кДНК-содержащих плазмид. Для использования в способах настоящего изобретения вышеописанные пептиды могут быть сконструированы с получением стандартных известных или альтернативных конструкций в целях повышения уровня продуцирования данного пептида или его связывания с коровым антигеном HBV. Так, например, данные пептиды могут быть, но необязательно, гибридизованы с белком или партнером по слиянию пептидов. Таким образом, каждый специалист может сконструировать пептид в ассоциации с выбранным партнером по слиянию, таким как другой пептид или другие пептиды или белки, которые придают ему нужные свойства. Системы для клонирования и экспрессии связывающихся с капсидом HBV пептидов в различных микроорганизмах и клетках, включая, например, E.coli, бациллы, стрептомицеты,сахаромицеты, клетки млекопитающих, дрожжи, клетки насекомых и растительные клетки и в подходящих для них векторах, являются известными и могут быть получены из частных и государственных лабораторий и депозитариев и от их коммерческих поставщиков. Независимо от того продуцировались ли указанные связывающиеся с капсидом HBV пептиды методами рекомбинантных ДНК или методами синтеза, они могут быть очищены стандартными методами очистки. Каждый специалист может легко определить соответствующий уровень чистоты, необходимый для нужного применения используемых пептидов. Следует отметить, что выбор пептидного линкера, связывающегося с капсидом HBV, до некоторой степени, зависит от природы, конкретного полипептида корового антигена HBV,образующего коровую антигенную частицуHBV. Так, например, для коровых антигенных частиц HBV, происходящих от различных исходных вирусных штаммов, могут потребоваться различные пептидные лиганды, связывающиеся с капсидом HBV, что обусловлено различием аминокислотных последовательностей,находящихся в лигандсвязывающих сайтах данного полипептида корового антигена HBV или возле этих сайтов. Присоединение пептидов, связывающихся с капсидом HBV, к иммуногенам Пептиды, связывающиеся с капсидомHBV, могут быть присоединены посредством пептидной связи к нужным иммуногенам с образованием связывающегося с капсидом иммуногена. Если этот иммуноген сам является пептидом, то обычно это может быть достигнуто стандартным методом путем простого синтеза 20 или путем экспрессии в трансформированных клетках соответствующей кодирующей последовательности пептида, содержащего последовательность, связывающуюся с капсидом HBV,и присоединенную к данной последовательности последовательность иммуногена и, в основном и предпочтительно это может быть осуществлено посредством двух-пяти (а в большинстве случаев трех) глициновых остатков, в целях придания соответствующей степени гибкости цепи между двумя компонентами этого удлиненного пептида. Альтернативно, эти пептиды могут быть перекрестно сшиты с данными иммуногенами. Ориентация связи между связывающим компонентом пептида и иммуногеном может влиять на эффективность конечного процесса перекрестного сшивания связывающегося с капсидом иммуногена с коровой антигенной частицей HBV. Альтернативно, для ряда связывающихся с капсидом иммуногенов, перекрестносшиваемых с коровой антигенной частицейHBV, данный иммуноген может быть помещен в аминоконец пептида, с которым он связывается, а другой иммуноген может быть помещен в карбоксиконец данного пептида, с которым он связывается. В некоторых случаях может оказаться предпочтительным вводить тот же самый или другой иммуноген в каждый конец данного пептида, связывающегося с капсидом HBV. Такое изменение в организации комплексов "связывающийся с капсидом HBV пептидиммуноген", перекрестно-сшиваемых с данной коровой антигенной частицей HBV, позволяет преимущественно получить в высокой степени многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы HBV. См. фиг. 1. Таким образом, ориентация связывающегося с капсидом иммуногена, перекрестносшиваемого с коровой антигенной частицейHBV, играет важную роль для конечной иммуногенности или мультивалентности полученной частицы. Более высокая степень иммуногенности или мультивалентности ожидается в том случае, когда данный иммуноген ориентирован по направлению к карбоксиконцу пептида, связывающегося с капсидом HBV. Такая ориентация, которая дает более высокую степень гибкости, также является предпочтительной для иммуногенов крупных размеров. Присоединение связывающихся с капсидом иммуногенов к коровой антигенной частицеHBV Связывающиеся с капсидом иммуногены могут быть перекрестно сшиты с коровой антигенной частицей HBV с использованием любого стандартного перекрестно-сшивающего агента. Такими перекрестно-сшивающими агентами являются, например, многофункциональные перекрестно-сшивающие агенты, например, глутаральдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксол. Другие перекрестно-сшивающие(1997). Другими перекрестно-сшивающими агентами являются такие агенты, как гидрохлорид этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимид (сульфо-NHS), которые связывают смежные первые амино- и карбоксильные группы с образованием амидной связи. При добавлении к смеси связывающегося с капсидом иммуногена/коровой антигенной частицы HBV, такие агенты ковалентно связывают присутствующий лизиновый компонент данного пептида с соседним аспартатом или глутаматом корового антигена HBV. При этом следует отметить, что в смеси,используемой для присоединения связывающегося с капсидом иммуногена к коровой антигенной частице HBV, соотношение различных иммуногенов, присоединенных к данной коровой антигенной частице HBV, может, разумеется,варьироваться по относительному количеству соответствующих иммуногенов. Терапевтические композиции настоящего изобретения Настоящее изобретение также относится к композициям, которые могут быть использованы для лечения или профилактики индивидуумов с применением мультикомпонентных или мультивалентных коровых антигенных частицHBV, описанных в настоящей заявке. Любой индивидуум, включая человека и других млекопитающих, а также любые животные могут быть подвергнуты лечению коровыми антигенными частицами HBV, описанными в настоящей заявке. Терапевтические композиции содержат фармацевтически эффективное количество коровых антигенных частиц HBV, т.е. количество, эффективное для иммунизации против одного или нескольких инфекционных агентов или для лечения одного или нескольких состояний у индивидуума, которому вводят данные композиции в течение определенного промежутка времени. Профилактические композиции содержат профилактически эффективное количество коровых антигенных частиц HBV,т.е. количество, эффективное для предупреждения одного или нескольких состояний у индивидуума, которому вводят данные композиции в течение определенного промежутка времени. В случаях, если коровые антигенные частицы HBV содержат множество иммуногенов различных типов, то композиции и вакцины,содержащие данные иммуногены, могут быть использованы для вырабатывания у индивидуума усиленного иммунного ответа к каждому из иммуногенных компонентов. В случаях, если коровые антигенные частицы HBV содержат множество иммуногенов одного типа, то композиции и вакцины, содержащие данные иммуногены, могут быть использованы для вырабатывания у индивидуума усиленного иммунного 22 ответа к общему иммуногену. Эти последние композиции и вакцины характеризуются более высокой моновалентностью и эффективностью по сравнению со стандартными композициями для монотерапии. Композиции, содержащие мультикомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения,могут быть введены отдельно или в виде части фармацевтического или профилактического препарата в сочетании с адъювантом или без него, и в числе таких композиций могут быть препараты с регулируемым высвобождением. Они могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители или разбавители,подходящие для введения в целях лечения указанных инфекций. Подходящие фармацевтически приемлемые носители являются физиологически инертными и/или нетоксичными. Многие носители известны специалистам и могут быть выбраны в зависимости от цели их применения. Примерами таких носителей являются, но не ограничиваются ими, стерильный физиологический раствор, лактоза, сахароза, фосфат кальция, желатин, декстрин, агар, квасцы, окись алюминия, гидроксид алюминия, пептин, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и вода. Кроме того, указанный носитель или разбавитель может включать материал для пролонгированного высвобождения, такой как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина,взятый отдельно или в сочетании с воском. Кроме того, могут быть использованы композиции на основе полимера для замедленного высвобождения, включая, например, растворимое стекло. Потенциально, композиции, содержащие многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы HBV, могут также содержать другие терапевтические или профилактические агенты. Так, например, такие композиции могут включать смесь из множества реагентов, используемых для лечения или предупреждения инфекций. Одна из таких смесей может включать другие реагенты, такие как интерфероны, нуклеозидные аналоги и/или Nацетилцистеин. Композиции, содержащие иммуногенные частицы корового антигена HBV, могут также содержать, но необязательно, модификаторы иммунной системы, такие как адъюванты или цитокины, которые могут быть использованы для дополнительного индуцирования гуморального и Т-клеточного ответов у пациента. Такими модификаторами являются стандартные адъюванты на основе квасцов, или мурамилдипептиды, консерванты, химические стабилизаторы или другие антигенные белки. Обычно для определения наилучшей композиции, эффективной для конкретного применения, стабилизаторы, адъюванты, консерванты и т.п. должны быть оптимизированы. В качестве подходя 23 щих консервантов могут быть использованы хлорил-бутинол, сорбат калия, сорбиновая кислота, диоксид серы, пропилгаллад, парабены,глицерин и фенол. Подходящие количества указанных композиций могут быть определены, исходя из уровня желаемого ответа. В основном, композиции,содержащие иммуногенные коровые антигенные частицы HBV, могут содержать от около 5 до около 200 мкг указанных частиц. Такие композиции могут быть введены одной или серией инокуляций, например, тремя инокуляциями через интервалы в два-шесть месяцев. Подходящие дозы могут быть также определены лечащим врачом с учетом таких факторов, как состояние здоровья пациента, его вес или возраст, а также с учетом стандартной дозы иммуногенного компонента, вводимого в качестве монотерапии. После улучшения состояния пациента или заметного увеличения уровня воздействия на данный патоген может быть введена, если это необходимо, поддерживающая доза композиции, содержащей иммуногенные частицы корового антигена HBV. Затем доза или частота введения, либо то и другое могут быть снижены до уровня, при котором сохраняется нужный эффект. На этой стадии лечение должно быть прекращено. Однако по прошествии длительного периода времени некоторым индивидуумам может потребоваться возобновление лечения из-за рецидива данного нежелательного состояния. Композиции, содержащие многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы HBV, могут быть введены подходящим способом, таким как, например, парентеральное введение, а в частности, внутримышечное или подкожное введение, а также пероральное введение. Могут быть использованы и другие способы введения, такие как, например, пульмонарное введение, введение через нос или ухо, анальное введение, чрезкожное введение, закапывание в глаза, внутривенное введение, интраартериальное введение, внутрибрюшинное введение, введение через слизистую, подъязычное введение, подкожное введение или внутричерепное введение. Иммуногенные частицы корового антигенаHBV настоящего изобретения могут быть использованы для активной терапии HBVинфицированных индивидуумов в целях ингибирования, снижения или замедления пролиферации вируса в организме. Терапевтические композиции включают иммуногенные частицы корового антигена HBV, способные к блокированию, ингибированию или предупреждению осуществления механизма сборки вируса. Указанные терапевтические композиции могут быть изготовлены так, чтобы они содержали носители или разбавители и один или несколько иммуногенных частиц корового антигена HBV настоящего изобретения. Такие носители и раз 004497 24 бавители обсуждались выше в связи с описанием других композиций и могут быть определены любым специалистом. Получение композиций или вакцин, содержащих иммуногенные частицы корового антигена HBV в качестве активных ингредиентов, может быть осуществлено в целях создания инъецируемых композиций или вакцин в виде либо жидких растворов, либо суспензий. Могут быть также получены твердые формы, подходящие для получения раствора или суспензии непосредственно перед инъекцией. В некоторых вариантах осуществления изобретения полученные препараты могут быть эмульгированы или инкапсулированы в липосомы или в растворимое стекло в целях постепенного высвобождения и/или пролонгированной доставки. Альтернативно, препараты могут быть получены в форме аэрозоля или спрея. Они могут быть также включены в пластыри для чрескожного введения. Активный ингредиент может быть смешан с любым числом наполнителей, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным(и) ингредиентом(ами). Такими наполнителями являются, например,неполный адъювант Фрейнда, бактериальные липополисахариды, ионоообменные смолы,окись алюминия, стеарат алюминия, мурамилдипептид, лецитин, буферные вещества, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. Вакцины, содержащие коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения, могут быть преимущественно изготовлены в виде комбинированных вакцин, содержащих ряд различных иммуногенов. Такими вакцинами являются, например, комбинированная вакцина, содержащая иммуногены против двух или более патогенов, выбранных из возбудителей дифтерии, столбняка, ацеллюлярного коклюша и haemophilus influenza (возбудителя гриппа), вирусов полиомиелита, кори, свинки, краснухи, ветряной оспы, гепатита В, гепатита А или пневмококка, вызывающего пневмонию. Другими вакцинами являются вакцины, которые могут быть использованы для прививки индивидуумов перед путешествиями за границу. Такими вакцинами являются, например, вакцины, содержащие иммуногены против двух или более патогенов, выбранных из вируса желтой лихорадки,вируса гепатита В, вируса гепатита А, возбудителя брюшного тифа, возбудителя менингококкового энцефалита или возбудителя холеры. Композиции, содержащие коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения,могут быть также использованы в иммунотерапевтических схемах для вырабатывания резистентности индивидуумов к одному или нескольким аллергенам, таким как аллергены животных, аллергены насекомых, растительные аллергены, аллергены окружающей среды и ингаляционные аллергены. 25 В соответствии с альтернативным вариантом осуществления изобретения, коровые антигенные частицы HBV могут быть использованы для вырабатывания антител против нужных иммуногенов в целях их использования в иммунотерапии или диагностике. Так, например, антитела, продуцированные у индивидуумов, инокулированных коровыми антигенными частицамиHBV, могут быть выделены и использованы в очищенной форме. Альтернативно, такие антитела или В-клетки, взятые от индивидуума, могут быть использованы для продуцирования моноклональных антител стандартными методами. Методы детекции в соответствии с настоящим изобретением Коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения могут быть также использованы в ряде анализов стандартного формата, а в частности, в иммуноанализах для диагностики инфекции или обработки инфекционными агентами. Такое применение может быть реализовано в том случае, если связывающиеся с капсидом HBV пептидные компоненты данных конструкций настоящего изобретения ассоциированы с диагностической меткой, химическим маркером, токсином или другим белком или пептидом. Так, например, связывающиеся с капсидом HBV пептиды могут быть ассоциированы со стандартными метками, которые способны, отдельно или в сочетании с другими композициями или соединениями, обеспечивать вырабатывание детектируемого сигнала, указывающего на присутствие мишени-аналита в образце после его обработки иммуногеном, присоединенным к пептиду, связывающемуся с коровым антигеном HBV. Указанные детектируемые метки могут быть выбраны из многочисленных композиций, которые известны специалистам и которые легко доступны специалистам по проведению диагностических анализов. Следовательно, настоящее изобретение не ограничивается выбором анализа конкретного формата, и очевидно, что в настоящем изобретении могут быть использованы анализы любых типов, известных специалистам. Для удобства проведения анализа могут быть использованы реагенты, поставляемые в виде наборов. Эти наборы включают микротитрационные планшеты, на которых были предварительно адсорбированы коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения; различные разбавители и буферы; меченные конъюгаты для детекции специфически связывающихся с капсидом пептидных иммуногенов; и другие генерирующие сигнал реагенты, такие как ферментные субстраты, кофакторы и хромагены. Другие компоненты могут быть легко определены самим специалистом. Альтернативно, коровые антигенные частицы HBV настоящего изобретения могут быть использованы в тестах для иммунологической 26 диагностики, применяемых в настоящее время для обнаружения патогена, а именно, радиоиммуноанализ или ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец, тестируемый на присутствие антител к различным иммуногенам, может быть подвергнут контакту с коровой антигенной частицей HBV, содержащей связывающиеся с капсидом HBV иммуногены,меченные детектируемой меткой и имеющие различные иммуногенные компоненты, в течение периода времени, достаточного для того,чтобы любые антитела, присутствующие в данном образце, образовывали комплекс с одним или несколькими связывающимися с капсидомHBV иммуногенами. Затем могут быть использованы средства для детекции комплекса, образованного между связывающимся(щимися) с капсидом иммуногеном(нами) и указанными антителами в указанном образце. После этого может быть проведен второй скрининг данного образца на каждый иммуногенный компонент в целях идентификации специфичности данных антител в указанном образце. В альтернативном варианте осуществления изобретения образец, тестируемый на присутствие антител к конкретному иммуногену, может быть подвергнут контакту с коровой антигенной частицей HBV, содержащей связывающиеся с капсидом HBV иммуногены, меченные детектируемой меткой и имеющие специфический иммуноген в качестве их иммуногенного компонента, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы антитела, присутствующие в данном образце, образовывали комплекс с одним или несколькими иммуногенами, связывающимися с капсидом HBV. Благодаря высокой валентности специфического иммуногена,представляемого коровой антигенной частицейHBV, такой диагностический анализ отличается более высокой чувствительностью, чем стандартные анализы. Примеры Для более полного понимания настоящего изобретения представлены нижеследующие примеры. При этом следует отметить, что эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Пример 1. Препараты корового антигенаHBV. Экспрессию корового антигена HBV (аа 3183) или усеченного по С-концу корового антигена HBV (аа 3-148) в E.coli и их очистку осуществляли, как описано в работе DysonMurray(1995). Препараты белков хранили при 4 С в виде фракций градиента сахарозы в буфере, содержащем TBS, сахарозу (20%) и NaN3 (0,02%). Препараты, полученные в этой форме, были стабильны в течение по крайней мере шести месяцев. 27 Химическое перекрестное сшивание связывающихся с капсидом HBV пептидов с коровым антигеном HBV Связывающийся с капсидом HBV пептидEdinburgh) перекрестно сшивали с коровыми антигенными частицами HBV с использованием гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS) (оба от фирмыPierce Europe B.V.). Эти реагенты связывают примыкающие первые амино- и карбоксильные группы с образованием амидной связи [Staros etof Water-Soluble Carbondiimide-Mediated Coupling Reactions", Analytical Biochem., 156, pp. 220-22 (1986)]. При добавлении к смеси "связывающийся с капсидом HBV пептид/коровый антиген HBV", эти реагенты должны ковалентно связывать лизин данного пептида с соседним аспартатом или глутаматом корового антигенаHBV, что приводит к увеличению его молекулярной массы. Более конкретно, усеченный коровый антиген HBV (15 мкг) инкубировали при комнатной температуре в буфере (30 мкл), содержащем фосфат калия (25 мМ, рН 7), NaCl (150 мМ), (1,8 мМ EDC) и сульфо-NHS (1,8 мМ), в присутствии или отсутствии пептида MHRSLLGRMKGA(1 мМ). Через 18 ч реакцию анализировали путем электрофореза в ДСН/ПААГ геле (15% мас./об.) как описано Sambrook и др. (1989)]. Добавление EDC и сульфо-NHS к комплексу"пептид - коровая антигенная частица HBV" приводит к соответствующему примерно 1 кДа смещению полосы, которая присутствует на ДСН-ПААГ для фракции корового антигенаHBV. Несмотря на проведение реакции в различных условиях, полученный выход составлял не более 50% от смещенной полосы белка. Это соответствует связыванию одного пептида с димером корового антигена HBV, расположенного возле локальной оси второго порядка, и таким образом, стерическому блокированию связывания другого пептида с родственным участком второго порядка. Пример 2. Препараты корового антигенаHBV. Помимо двух образцов корового антигенаHBV, полученных в примере 1, были также получены образцы коровых антигенов HBV с преS1-последовательностью 1-36 HBV или последовательностью 111-156 или 111-165 поверхностного антигена HBV, присоединенной к усеченному полипептиду корового антигена HBV(усеченному по остатку 144) посредством короткой линкерной пептидной последовательности, как описано StahlMurray (1989). 28 Химическое перекрестное сшивание связывающегося с капсидом HBV пептида с коровым антигеном HBV Нижеследующие связывающиеся с капсидом иммуногены, полученные путем твердофазного синтеза, были получены от Albachem, University of Edinburgh:AS-164: EQKLISEEDL GG GSLLGRMKGA,где последовательность GSLLGRMKGA представляет собой связывающийся с капсидом HBV пептид, последовательность LDPAFR представляет собой пpe-S1-эпитоп или иммуноген HBV,а последовательность EQKLISEEDL представляет собой эпитоп myc-онкогенный или иммуноген. Эти пептиды и основной связывающийся с капсидом HBV пептид GSLLGRMKGA были связаны с коровой антигенной частицей HBV отдельно или в комбинации, при различных концентрациях, и были перекрестно сшиты с помощью EDC или сульфо-NHS, как описано в примере 1. Свойства полученных коровых антигенных частиц HBV Полученные продукты были проанализированы путем электрофореза в акриламидных гелях в присутствии ДСН (ДСН-ПААГ) с последующим окрашиванием кумасси-синим и проведением Вестерн-блот-анализа с использованием моноклональных антител и поликлональной кроличьей сыворотки, вырабатываемой против коровых антигенных частиц HBV, или частиц денатурированного поверхностного антигена HBV. Имеются в распоряжении моноклональные антитела для каждого из пpe-S1 эпитопа HBV и эпитопа myc-онкогенного. Такими моноклональными антителами являются,соответственно, моноклональное антитело 18/7(1984)] и моноклональное антитело 9 Е 10 [Invitrogen, CatalogR950-25]. Эти эксперименты показали, что продукты всех реакций перекрестного сшивания обнаруживали положительные реакции с антителами против каждого из соответствующих эпитопов в данных компонентах реакции лигирования. Положительные реакции наблюдались с иммуногеном, связанным посредством амино- или карбоксиконца данного лигандного пептида. Как будет подробно описано ниже, препараты очищенных коровых антигенных частицHBV, полученные в результате реакций перекрестного сшивания с двумя или более различными иммуногенами, проводимых с использованием общего связывающегося с капсидомHBV пептидного лиганда, реагируют с антителами против всех иммуногенных компонентов. Кроме того, коровые антигенные частицы, осаждаемые антителом, специфичным для одного из данных иммуногенов, обнаруживают пере 29 крестную реактивность с антителами для другого(их) пептида(ов), включенного(ых) в процедуру перекрестного сшивания с лигандом. Продукты лигирования подвергали ультрацентрифугированию в градиентах сахарозы. Эти продукты осаждали одним из указанных антител, антителом против myc, а затем анализировали путем электрофореза в ПААГ с ДСН и Вестерн-блоттинга. Материал, осажденный одним из этих антител, например антителом против myc, обнаруживал сильную перекрестную реактивность как с антителом против myc, так и с антителом против пре-S1, в Вестерн-блот-анализе. Продукты, осажденные другим антителом, антителом против пpe-S1, давали тот же эффект. В реакциях, где два связывающихся с капсидом HBV пептида, несущих различные иммуногены, были смешаны в различных соотношениях для связывания и перекрестного сшивания с коровыми частицами, анализ, проводимый путем электрофореза в ПААГ с ДСН, и Вестернблот-анализ показали, что относительные интенсивности окрашивания двумя моноклональными антителами являются показателями соотношения двух иммуногенов в смеси, используемой для перекрестного сшивания. Эти эксперименты показали, что, по крайней мере, некоторые коровые частицы HBV,полученные в результате указанных реакций,содержали оба ковалентно связанных с ними иммуногена. Поскольку лигандный пептид связывается с вершинами коровых антигенных частиц HBV (нуклеокапсидов), то такие препараты будут обладать высоким иммуногенным потенциалом по отношению к обоим компонентам и должны, как ожидается, вырабатывать высокие титры антител у индивидуумов, которым они были введены. Несмотря на представленные варианты осуществления настоящего изобретения, очевидно, что основная конструкция может быть модифицирована в целях реализации других вариантов изобретения, в которых используется способ настоящего изобретения. А поэтому следует отметить, что объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, но не конкретными вариантами осуществления изобретения, которые были проиллюстрированы вышеприведенными примерами. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Коровая антигенная частица HBV,имеющая множественную иммуногенную специфичность, причем указанная частица содержит по крайней мере один связывающийся с капсидом иммуноген, который включает по крайней мере один связывающийся с капсидомHBV пептидный компонент и по крайней мере один иммуногенный компонент. 2. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный связывающийся с капсидом иммуноген ориентирован на указанной частице так, что это позволяет указанному иммуногенному компоненту вызывать иммунный ответ при введении указанной частицы индивидууму. 3. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством любого аминокислотного остатка указанного пептидного компонента, связывающегося с капсидом HBV. 4. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством любого аминокислотного остатка или 37 другого остатка указанного иммуногенного компонента. 5. Коровая антигенная частица HBV по п.4,где указанным другим остатком указанного иммуногенного компонента является углевод. 6. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством аминоконца указанного пептидного компонента, связывающегося с капсидом HBV. 7. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством карбоксиконца указанного пептидного компонента, связывающегося с капсидомHBV. 8. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный связывающийся с капсидом иммуноген перекрестно сшит с указанной частицей посредством перекрестно-сшивающего линкера. 9. Коровая антигенная частица HBV по п.1,где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом HBV пептидному компоненту либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 10. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный иммуногенный компонент присоединен к аминоконцу указанного связывающегося с капсидом HBV пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 11. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный иммуногенный компонент присоединен к карбоксиконцу указанного связывающегося с капсидом HBV пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 12. Коровая антигенная частица HBV по любому из пп.9-11, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом HBV пептидному компоненту посредством перекрестно-сшивающего линкера. 13. Коровая антигенная частица HBV по п.8, где указанным перекрестно-сшивающим линкером является многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер. 14. Коровая антигенная частица HBV по п.12, где указанным перекрестно-сшивающим линкером является многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер. 15. Коровая антигенная частица HBV по п.14, где указанный многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер выбран из группы, состоящей из гидрохлорида 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимида иNгидроксисульфосукцинимида. 16. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный иммуногенный компонент включает один или несколько эпитопов, вы 004497 38 бранных из группы, состоящей из иммуногенных эпитопов и антигенных эпитопов. 17. Коровая антигенная частица HBV по п.16, где указанные эпитопы выбраны из группы, состоящей из линейных эпитопов, конформационных эпитопов, одиночных эпитопов и смешанных эпитопов. 18. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из антигенов, аллергенов, антигенных детерминант, белков, гликопротеинов, антител, фрагментов антител, пептидов, пептидных мимотопов, имитирующих антиген или антигенную детерминанту, полипептидов, гликопептидов, углеводов, олигосахаридов, полисахаридов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов. 19. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный иммуногенный компонент нацелен на агент или происходит из агента, выбранного из группы, состоящей из вирусов, паразитов, микобактерий, бактерий, бацилл, грибов, простейших микроорганизмов, растений,фагов, клеток животных и клеток растений. 20. Коровая антигенная частица HBV по п.19, где указанный вирус выбран из группы,состоящей из ретровирусов, герпесвирусов, ортомиксовирусов, парамиксовирусов, гепаднавирусов, флавивирусов, пикорнавирусов, паповавирусов, аденовирусов, бакуловирусов, хантавирусов, парвовирусов, энтеровирусов, риновирусов, онковирусов, ДНК-вирусов, РНКвирусов, тогавирусов, рабдовирусов и поксвирусов. 21. Коровая антигенная частица HBV по п.20, где указанный вирус, выбран из группы,состоящей из вируса иммунодефицита человека типа 1, вируса иммунодефицита человека типа 2, вируса Т-клеточного лейкоза, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса,вируса Эпштейна-Барра, вируса гриппа А, вируса гриппа В, вируса гриппа С, респираторносинцитиального вируса, вируса псевдокори,вируса свинки, вируса парагриппа, вируса гепатита В; вируса гепатита С, вируса гепатита А,вируса гепатита Е, вируса желтой лихорадки,вируса малярии, вируса денге, вируса клещевого энцефалита, онковируса, вируса полиомиелита, папилломавируса, вируса коровой краснухи,рабивируса и вируса коровьей оспы. 22. Коровая антигенная частица HBV по п.19, где указанный иммуногенный компонент нацелен на бациллы, энтеробактерии, клостридии, листерии, микобактерии, псевдомонады, стафилококки, эубактерии, микоплазмы,хламидии, спирохеты, нейссерии или сальмонеллы, либо происходит от указанных бактерий. 23. Коровая антигенная частица HBV по п.19, где указанный иммуногенный компонент нацелен на дифтерию, столбняк, ацеллюлярный коклюш, грипп, вызываемый haemophilus influ 39enza, полиомиелит, корь, свинку, коревую краснуху, ветряную оспу, вирус гепатита В, вирус гепатита А, пневмонию, вызываемую пневмококком, желтую лихорадку, малярию, брюшной тиф, менингококковый энцефалит или холеру. 24. Коровая антигенная частица HBV по п.18, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из аллергенов животных, аллергенов насекомых, растительных аллергенов, аллергенов окружающей среды и ингаляционных аллергенов. 25. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанным коровым антигеном HBV является гибридный белок корового антигенаHBV. 26. Коровая антигенная частица HBV по п.25, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает иммуногенный или антигенный эпитоп. 27. Коровая антигенная частица HBV по п.26, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает эпитоп, иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп, присоединенный к коровому антигену HBV либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 28. Коровая антигенная частица HBV по п.26, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп, присоединенный к карбоксиконцу указанного корового антигена HBV либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 29. Коровая антигенная частица HBV по п.26, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп, присоединенный к аминоконцу указанного корового антигена HBV либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 30. Коровая антигенная частица HBV по п.25, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает усеченный коровый антиген HBV. 31. Коровая антигенная частица HBV по п.25, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает поверхностный антигенHBV или его части. 32. Коровая антигенная частица HBV по п.31, где указанный гибридный белок корового антигена HBV включает последовательность,выбранную из группы, состоящей из пpe-S1 области поверхностного антигена HBV, пpe-S2 области поверхностного антигена HBV, иммунодоминантной а-области поверхностного антигена HBV и их частей. 33. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанным коровым антигеном HBV является полноразмерный полипептид корового антигена HBV, или его фрагменты, усеченные варианты, мутированные варианты или 40 производные, способные к сборке в корпускулярную форму. 34. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный связывающийся с капсидомHBV пептидный компонент выбран из группы,состоящей изNO: 41). 35. Вакцина, содержащая профилактически эффективное количество коровой антигенной частицы HBV по п.1. 36. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество коровой антигенной частицы HBV по п.1. 37. Способ продуцирования иммунного ответа у индивидуума, включающий стадии введения указанному индивидууму коровой антигенной частицы HBV по п.1, в количестве,эффективном для продуцирования иммунного ответа. 38. Способ по п.37, где указанную коровую антигенную частицу HBV вводят указанному индивидууму парентерально. 39. Способ повышения иммуногенности иммуногена путем присоединения указанного иммуногена к коровой антигенной частице HBV посредством связывающегося с капсидом HBV пептида, охарактеризованного в п.34. 40. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген включает диагностическую метку или химический маркер. 41. Способ обнаружения присутствия антител против иммуногена в образце, включающий стадии(а) контактирования данного образца с коровой антигенной частицей HBV по п.40, в течение периода времени, достаточного для того,чтобы любые антитела, присутствующие в указанном образце, образовывали комплекс с указанным связывающимся с капсидом иммуногеном и(b) использования средств для обнаружения данного комплекса, образованного между связывающимся с капсидом иммуногеном и указанными антителами в указанном образце. 42. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген, включающий по крайней мере один связывающийся с капсидом HBV пептидный компонент и по крайней мере один иммуногенный компонент, где указанный им 41 муногенный компонент не представляет собой коровый антиген HBV. 43. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом HBV пептиду либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 44. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент присоединен к аминоконцу указанного связывающегося с капсидомHBV пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 45. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент присоединен к карбоксиконцу указанного связывающегося с капсидом HBV пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности. 46. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по любому из пп.42-44, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом HBV пептидному компоненту посредством перекрестно-сшивающего линкера. 47. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.46, где указанным перекрестно-сшивающим линкером является многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер. 48. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.47, где указанный многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер выбран из группы, состоящей из гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и N-гидроксисульфосукцинимида. 49. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент включает один или несколько эпитопов, выбранных из группы, состоящей из иммуногенных эпитопов и антигенных эпитопов. 50. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.49, где указанные эпитопы выбраны из группы, состоящей из линейных эпитопов, конформационных эпитопов,одиночных эпитопов и смешанных эпитопов. 51. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из антигенов, аллергенов, антигенных детерминант, белков, гликопротеинов, антител,фрагментов антител, пептидов, пептидных мимотопов, имитирующих антиген или антигенную детерминанту, полипептидов, гликопептидов, углеводов, олигосахаридов, полисахаридов,олигонуклеотидов и полинуклеотидов. 42 52. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент нацелен на агент или происходит из агента, выбранного из группы,состоящей из вирусов, паразитов, микобактерий, бактерий, бацилл, грибов, простейших микроорганизмов, растений, фагов, клеток животных и клеток растений. 53. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.52, где указанный вирус выбран из группы, состоящей из ретровирусов,герпесвирусов, ортомиксовирусов, парамиксовирусов, гепаднавирусов, флавивирусов, пикорнавирусов, паповавирусов, аденовирусов, бакуловирусов, хантавирусов, парвовирусов, энтеровирусов, риновирусов, онковирусов, ДНКвирусов, РНК-вирусов, тогавирусов, рабдовирусов и поксвирусов. 54. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.53, где указанный вирус, выбран из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека типа 1, вируса иммунодефицита человека типа 2, вируса Тклеточного лейкоза, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барра, вируса гриппа А, вируса гриппа В, вируса гриппа С, респираторно-синцитиального вируса, вируса псевдокори, вируса свинки,вируса парагриппа, вируса гепатита В; вируса гепатита С, вируса гепатита А, вируса гепатита Е, вируса желтой лихорадки, вируса малярии,вируса денге, вируса клещевого энцефалита,вируса полиомиелита, вируса коревой краснухи,рабивируса и вируса коровьей оспы. 55. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент нацелен на бациллы,энтеробактерии, клостридии, листерии, микобактерии, псевдомонады, стафилококки, эубактерии, микоплазмы, хламидии, спирохеты,нейссерии или сальмонеллы, либо происходит от указанных бактерий. 56. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент нацелен на дифтерию,столбняк, ацеллюлярный коклюш, грипп, вызываемый haemophilus influenza, полиомиелит,корь, свинку, коревую краснуху, ветряную оспу,вирус гепатита В, вирус гепатита А, пневмонию,вызываемую пневмококком, желтую лихорадку,малярию, брюшной тиф, менингококковый энцефалит или холеру. 57. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из аллергенов животных, аллергенов насекомых, растительных аллергенов, аллергенов окружающей среды и ингаляционных аллергенов. 58. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный свя 43 зывающийся с капсидом HBV пептидный компонент выбран из группы, состоящей изNO: 41). 59. Связывающийся с капсидом HBV пептидный иммуноген по п.42, где указанный связывающийся с капсидом HBV пептидный компонент является фрагментом или аналогомNO: 41). 60. Коровая антигенная частица HBV по п.1, где указанный связывающийся с капсидомHBV компонент является фрагментом или аналогомNO: 41). 61. Применение коровой антигенной частицы HBV по любому из пп.1-34 для производства лекарственного средства для вызова иммунного ответа у индивидуума. 62. Применение по п.61, где указанное лекарственное средство предназначено для парентерального введения указанному индивидууму.a Происхождение пептида(ов), гибридизованного с HBcAg. Числа в скобках означают аминокислотные последовательности. Некоторые авторы использовали ряд различных сегментов пpeS1 и пpeS2.b Положение(я) гибрида в HBcAg; N, N-конец; С, С-конец или усеченный у остатка, указанного в скобках. Внутренние гибриды указаны косыми линиями между двумя числами. с Общее число аминокислот в гибридном белке.M, морфология (электронная микроскопия); А, антигенность; I, продуцирование антитела; Т, пролиферация Т-клеток. е Некоторые комбинации включают дополнительный сегмент HBcS111-156 в указанном порядке, а в других случаях, он расположен у N-конца последовательности HBcAg