Полипептиды, содержащие домены протеина gax, участвующие в подавлении транскрипции и/или взаимодействующие с другими протеинами, соответствующие нуклеиновые кислоты и их применение

1 Настоящее изобретение относится к области терапии. В частности, оно относится к новым терапевтическим молекулам и к их применению для лечения сердечно-сосудистых патологий. Постангиопластический рестеноз является локализованным гиперпролиферативным нарушением, которое развивается вследствие нехирургического вмешательства на уровне атеросклеротических бляшек. Таким образом, следствием лечения атеросклероза ангиопластикой очень часто (до 50% случаев согласно некоторым исследованиям) является рестеноз, возникающий в результате механического повреждения стенок артерий. Пролиферация гладких мышечных клеток(ГМК) в стенках сосудов является ключевым явлением в развитии атеросклероза, в постангиопластическом рестенозе, а также в неудачах при коронарном шунтировании. В норме ГМК стенок сосудов находятся в состоянии покоя, но в результате повреждения сосудистого эндотелия они оказываются в контакте с кровяными факторами роста. В отличие от кардиомиоцитов и клеток скелетных мышц, ГМК могут, в ответ на действие различных факторов роста, подвергаться дедифференцировке и снова вступать в цикл пролиферации. Эти фенотипические изменения ГМК происходят в результате глубоких изменений на уровне экспрессии множества генов. Так, например, экспрессия ранних генов,участвующих в пролиферации клеток, таких какc-fos или с-mус, существенно возрастает, в то время как экспрессия других структурных генов, таких как ГИК-специфичного альфаактина, а также некоторых изоформ миозина подвергается отрицательной регуляции. Несмотря на то, что ясно показана роль факторов транскрипции, т.н. миогенных, таких как Myo-D, в конечной дифференцировке клеток скелетных мышц, в настоящее время известна лишь незначительная часть факторов,участвующих в обратимой дифференцировке ГМК. Недавние исследования выявили наличие факторов транскрипции, имеющих гомеобокс в различных тканях сердечно-сосудистой системы. Такие факторы распознают, благодаря своим гомеобоксам, специфические последовательности ДНК в промоторных участках соответствующих генов и таким образом могут участвовать в регуляции клеточной дифференцировки, пролиферации или миграции клеток. Экспрессия одного из этих факторов, gах(Growth-Arrest-Specific Homeobox), осуществляется в различных тканях сердечно-сосудистой системы, в т.ч. в ГМК стенок сосудов. Ген gах изначально был идентифицирован в банке кДНК аорты крысы. Он кодирует протеин из 303 аминокислот. Была определена его последовательность и клонирована его кДНК (Gorski и др., Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Ген gах человека также был клонирован и секвенирован 2 540). Он кодирует протеин из 302 аминокислот. Ген gах обладает некоторыми свойствами, близкими к таковым генов gas и Gadd, поскольку он также, по-видимому, контролирует переходgах сокращается в ГМК сосудов крысы в 10 раз после 2 ч контакта с PDGF (Gorski и др., Mol.gах, таким образом, подавляется в ходе митогенного ответа ГМК сосудов. Другая особенность гена gах заключается в специфичности экспрессии. Так, у взрослой крысы экспрессия гена gах осуществляется исключительно в сердечно-сосудистой системе (аорта, сердце).Northern Blot не обнаруживал мРНК в печени, в мозге, в желудке и в скелетных мышцах. С другой стороны, ген gах принадлежит к семейству гомеотических генов. Эти гены кодируют факторы транскрипции, которые содержат консенсусные последовательности (или гомеодомены),распознающие специфические участки ДНК(или гомеобоксы) (Gehring и др., Cell. 78: 211223, 1994). Гомеодомен протеина gах крысы расположен между аминокислотами 185 и 245. Интересен тот факт, что гомеотические гены,определенные на данный момент, участвуют в контроле дифференцировки/роста клеток "в ходе эмбриогенеза; это увеличивает терапевтический потенциал гена gax (Lawrence и Morata Cell 78: 181-189, 1994; Krumlauf, Cell 78: 191-201,1994). Одной из особенностей GAX является то,что он подвергается отрицательной регуляции с момента начала пролиферации ГМК как in vitro в виде ответа на действие факторов роста, так иin vivo, вследствие повреждения эндотелия стенок сосудов. Эта репрессия является обратимой,поскольку, когда ГМК возвращаются в состояние покоя в отсутствие поступления сыворотки,in vitro, экспрессия GAX возобновляется. В результатах работ нашей лаборатории недавно было показано, что суперэкспрессия GAX в ГМК с помощью аденовирусного вектора блокирует их пролиферацию FR 95/04234(ST95022). Постангиопластический рестеноз, развивающийся в результате механических повреждений, представляет собой наиболее частую причину неудач таких операций (по некоторым данным, 50% случаев). Поскольку ключевую роль здесь играет пролиферация ГМК, ген gax является, благодаря своей роли регулятора пролиферации, отличным терапевтическим геном,подходящим для превентивной обработки стенок сосудов после проведения ангиопластики(FR 95/04234 (ST95022. Однако механизм действия GAX остается пока слабо задокументирован. Остается определить последовательности ДНК, на которые воздействует гомеобокс GAX. Кроме того, пока не проведены исследования функции различных участков GAX. Наконец, важным разделом ис 3 следований является определение функциональных партнеров GAX, что позволило бы определить молекулярный каскад, от которого зависит GAX, или источником которого он является. В настоящем изобретении была поставлена задача собрать необходимую информацию на этот счет. В ходе этой работы были использованы различные аналитические подходы для определения молекул, взаимодействующих с GAX, для того, чтобы определить домен GAX, ответственный за это взаимодействие, и чтобы изучить значение различных доменов в функциях GAX. Для этого использовали двойную гибридную систему, полученную на основе банка легкого человека, чтобы выявить протеины, взаимодействующие с GAX. Такой подход позволил опредeлить различные молекулы, одна из которых, антиген Ki,представляет особый интерес. Антиген Ki представляет собой протеин (примерно, 32 кДа). Впервые он был определен как ядерный аутоантиген, распознаваемый элементами сыворотки,выделенной от больных эритематозной красной волчанкой (Nikaido и др., 1989, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79, 209-214). Недавние работы показали, что суперэкспрессия Ki происходит в клетках, находящихся на стадии пролиферации или трансформированных каким-либо онкогенoм (Nikaido и др., 1989, Exp. Cell Res. 1989,182, 284-289). Эксперименты по соиммунопреципитации (Takeushi и др., abstract 1995 JuntendoUniversity, Tokyo, Japan) показали, что Ki существует в виде комплекса, который он образует с РCNА, маркерoм пролиферации (Almendral и дp., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 15751579). Функцию GAX также изучали в опытах по транзитной трансфекции клеток млекопитающих, используя GAX, слитый с доменом связывания с гетерологичной ДНК, и генную систему-репортер, позволяющую получать информацию о транскрипционной активностиGAX после делеции в различных участках молекулы. Таким образом было показано, чтоGAX действует главным образом как репрессор транскрипции. Такое действие связано, в частности, с 32 первыми аминокислотами GAX. Кроме того, этот репрессорный домен находится в участке (1-222) GAX, ответственном за взаимодействие с Ki в дрожжах. Возможное использование репрессорного характера GAX и его взаимодействие с Ki будут описаны далее. Таким образом, в своем первом аспекте изобретение относится к фрагментам протеинаGAX, обладающим биологическими свойствами. В другом аспекте изобретение относится к доменам GAX, участвующим в биологической активности GAX. Это могут, например, быть домены, участвующие во взаимодействии GAX 4 с другими молекулами, или домены, отвечающие за биологическую активность. Изобретение также относится к химерным молекулам, включающим в себя функциональный домен GAX. Оно также относится к применению GAX для подавления экспрессии генов, а также к применению соединений, ингибирующих взаимодействие GAX с некоторыми клеточными партнерами для управления активностью GAX. Оно также относится к методу просеивания и/или идентификации клеточных партнеров GAX. Как указано выше, ген gах обладает выгодными свойствами, требуемыми для применения в генной терапии гиперпролиферативных нарушений, в частности, рестеноза и других патологий, связанных с пролиферацией ГМК. В заявке FR 95/04234 (ST95022) было показано,что перенос гена gах in vivo позволяет существенно уменьшить пролиферацию ТМК и таким образом ингибировать сужение диаметра сосудов. В заявке FR 95/12871 (ST95057) было также показано, что ген gах при его экспрессии в опухолевых клетках препятствует трансформации клеток. Эти данные демонстрируют терапевтический потенциал гена gах. В настоящей заявке описывается определение функциональных доменов GAX, конструкция производных GAX, обладающих биологической активностью, определение партнеров протеина GAX и осуществление методов, позволяющих находить других партнеров и определять соединения, способные оказывать воздействие на активность этих партнеров. В частности, заявителем показано, что протеин GAX действует как репрессор транскрипции. Также показано, что эта активность связана с определенными участками протеина GAX, в частности,с N-концевым участком. Кроме этого, результаты, представленные в примерах, показывают,что функциональные домены GAX участвуют также во взаимодействиях GAX с клеточным протеином Ki. Из литературных источников известно, что Ki взаимодействует с PCNA(Takeushi и др., adstract 1995 Juntendo University,Tokyo, Japan) и что этот последний является кофактором ДНК-полимер азы, необходимым для репликации ДНК (Fukuda и др. 1995, J. Biol.Chem. 270, 22527-22534). В примерах показано,что GAX взаимодействует с PCNA, поэтому желательно, чтобы GAX мог также входить в состав репликационных комплексов клетки. Первый объект изобретения относится, в частности, к полипептиду, отличающемуся тем,что он представляет собой, полностью или частично, фрагмент протеина GAX, обладающий репрессорной активностью в отношении транскрипции и/или оказывающий позитивное или негативное влияние на репликацию ДНК. Предпочтительно полипептид по изобретению содержит, по меньшей мере, остатки 1-32 протеина GAX человека. 5 Согласно другому способу осуществления полипептид по изобретению содержит, по меньшей мере, остатки 104-230 протеина GAX человека. В качестве частных примеров полипептидов по изобретению можно назвать полипептиды, содержащие фрагменты 1-32, 33-302 и 1-104 протеина GAX человека. Дальнейшие примеры показывают, что такие полипептиды способны ингибировать транскрипцию генов и, следовательно, сохраняют присущие GAX свойства репрессора транскрипции. Предпочтительно этот полипептид содержит кроме фрагмента протеина GAX по изобретению также фрагмент другого происхождения. Под фрагментом другого происхождения подразумевают полипептидный фрагмент, полученный не из протеина GAX. Это может быть синтетический, искусственный фрагмент, фрагмент протеина и т.д. Этот фрагмент другого происхождения может выполнять различные функции. Например, он может являться маркером,позволяющим обнаруживать полипептид и,возможно, перемещать его in vivo. Таким маркером может быть, например, эпитоп, узнаваемый моноклональными антителами. Для этого могут применяться описанные в литературе и обычно используемые маркерные последовательности, т.н. последовательности Tag. Можно указать последовательность tag-myc. Этим фрагментом также может быть фрагмент со стабилизирующими свойствами. В этом качестве можно использовать протеин с большим периодом полужизни в плазмиде или его часть. Наконец, это может быть элемент распознавания мишени, позволяющий полипептиду быстрее и/или более избирательно попадать в особые компартменты клетки. Предпочтительно таким элементом является сигнал ядерной локализации (NLS), полипептид, чье действие осуществляется, главным образом, в ядре клетки. В литературе описаны различные сигналы NLS,например, сигнал антигена Т вируса SV 40 сигнал р 53 и т.д. Фрагмент другого происхождения может,кроме того, придавать полипептиду свойства,соответствующие какой-либо дополнительной биологической функции, или усиливать активность репрессорного домена. В качестве особенно предпочтительного примера можно назвать протеинный домен, способный специфически связывать ДНК. Этот тип химерной молекулы позволяет, таким образом, связывать ДНК в особых участках и ингибировать транскрипцию генов, расположенных в этих участках. В качестве особого примера можно назвать домен связывания с ДНК дрожжевого протеина GAL4. Такие конструкции описаны в примерах. Они могут быть использованы для регуляции экспрессии генов у дрожжей или генов, контроли 003694 6 руемых сигналом экспрессии, включающим сайт связывания протеина GAL4. Другими протеинными доменами связывания с ДНК могут быть, например, Lex А, домен связывания с ДНК ядерного рецептора, такого как рецептор эстрогена, или любой другой, относящийся к этому семейству и т.д. Это также может быть пептид, осуществляющий, с одной стороны,секрецию GAX или его части, а также его целенаправленный транспорт к мембранным рецепторам, которые осуществляют его интернализацию, увеличивая таким образом его способность к диффузии и область активности GAX, за счет эффекта Bystander. В этом качестве можно, в частности, использовать трансферин или его часть, или фрагмент молекулы внеклеточного матрикса, который может распознавать интегрины на поверхности ГМК. Полипептиды по изобретению представляют особый интерес в терапевтическом плане и в плане прикладных исследований. Терапевтическая активность заявляемых полипептидов связана, в частности, с их способностью к подавлению транскрипции или к влиянию на репликацию ДНК, по аналогии с протеином GAX, и, следовательно, с их способностью к регуляции экспрессии других протеинов. В силу сказанного в настоящем изобретении рассматривается возможность применения протеина GAX или такого фрагмента, как указано выше, для подавления транскрипции гена и/или осуществления положительной или отрицательной регуляции репликации ДНК. В силу того что их действие аналогично действию протеина GAX, они могут быть использованы вместо него для подавления транскрипции. С другой стороны, поскольку они включают в себя, полностью или частично,только тот домен протеина GAX, который отвечает за подавление транскрипции, можно предположить, что они будут менее чувствительны к различным воздействиям, которым подвергается протеин GAX. Таким образом, эти протеины или их производные могут сильнее проявлять репрессорные свойства в отношении транскрипции, чем натуральный протеин GAX. Их можно также использовать для выявления новых партнеров GAX. В этой связи объектом настоящего изобретения также является способ просеивания и/или идентификации полипептидов, взаимодействующих с протеиномGAX или с доменом GAX, отличающийся тем,что в нем используют полипептид по изобретению. Предпочтительно, этот полипептид выбирают из фрагментов 1-32 и 33-302 протеинаGAX. При этом заявитель неожиданно обнаружил, что домен протеина GAX может специфически взаимодействовать с другим клеточным протеином, протеином Ki. Как было сказано выше, Ki является аутоантигеном, появляю 7 щимся в случае аутоиммунных заболеваний,таких как эритематозная красная волчанка. Он описан как ядерная молекула, экспрессия которой возрастает в ходе пролиферации клеток, а также в фибробластах, измененных каким-либо онкогеном. Нам удалось показать, что в дрожжах Nконцевая часть GAX отвечает за взаимодействие с Ki. Рекомбинантный протеин Ki специфически узнает GAX, перенесенный из полиакриламидного денатурирующего геля на фильтр из нитроцеллюлозы. Настоящее изобретение также относится в числе прочего к полипептиду, отличающемуся тем, что он представляет собой фрагмент протеина GAX, способный взаимодействовать с протеином Ki. Таким фрагментом является, предпочтительно, фрагмент 1-32 или 104-223 протеинаGAX. Также заявителем было показано, что один из доменов протеина GAX может специфически взаимодействовать с маркером пролиферацииPCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Этот фактор необходим для репликации ДНК, а также играет роль в явлениях восстановления ДНК. Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептиду, отличающемуся тем,что он представляет собой фрагмент протеинаKi может, таким образом, взаимодействовать одновременно с GAX и PCNA, образуя, по меньшей мере, двухчастный комплекс с тем или другим из этих протеинов и предпочтительно трехчастный комплекс. Образование этих комплексов играет важную роль в развитии клеточного цикла (активирование или ингибирование). Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается также полипептид, отличающийся тем, что он представляет собой фрагмент протеина GAX, способный взаимодействовать сKi и/или PCNA и образовывать, по меньшей мере, двухчастный или, по меньшей мере, трехчастный комплекс с этими протеинами. Другой объект настоящего изобретения относится к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, описанный выше. Это могут быть последовательности натурального или искусственного происхождения и, в частности,геномная ДНК, кДНК, мРНК, гибридные последовательности, или синтетические, или полусинтетические последовательности. Эта нуклеиновая кислота может происходить от человека, животного, растения, бактерии, вируса и т.д. Она может быть получена любым известным специалисту способом, в частности, просеиванием банков, химическим синтезом или смешанными методами, включающими химическое или энзиматическое изменение последовательностей, полученных просеиванием банков. 8 Они могут быть встроены в векторы, такие как плазмидные векторы. Предпочтение отдают кДНК. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть использованы для получения зондов или антисмысловых молекул, позволяющих путем гибридизации обнаружить присутствие или экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, которые содержат репрессорные домены по изобретению, или ингибировать экспрессию таких полипептидов. Зонды включают в себя, предпочтительно, более 10 оснований,лучше всего, от 10 до 300 оснований. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть использованы для экспрессии и/или получения полипептидов in vivo, in vitro или exvivo для целей генной или клеточной терапии. Таким образом, изобретение относится к кассетам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, как она определена выше, под контролем промотора, осуществляющего ее экспрессию. В рамках настоящего изобретения могут быть использованы различные промоторы. Ими являются последовательности, способные осуществлять экспрессию нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих. Промотор выбирают, предпочтительно, из функциональных промоторов клеток человека. В частности, таким промотором является промотор, способный осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в гиперпролиферативной клетке (раковой, рестенозной и т.д.). В этом качестве могут быть использованы разные промоторы. Так, это может быть любой промотор или производная последовательность, стимулирующая или подавляющая, специфически или нет, индуктивно или нет, в сильной или слабой степени, транскрипцию какого-либо гена. Можно, в частности, назвать промоторные последовательности эукариотических или вирусных генов. Например,это могут быть промоторные последовательности, полученные из генома целевых клеток. Среди эукариотических промоторов можно, в частности, использовать убиквитарные промоторы (промотор генов HPRT, PGK, альфаактина, тубулина, DHFR и т.д.), промоторы промежуточных филаментов (промотор геновGFAP, десмина, виментина, нейрофиламентов,кератина и т.д.), промоторы терапевтических генов (например, промотор генов MDR, CFTR,Фактора VIII, АроАI и т.д.). тканеспецифические промоторы (промотор гена пируваткиназы,виллина, интестинального протеина связывания жирных кислот, альфа-актина гладких мышц и т.д.), клеточно-специфические промоторы делящихся клеток, таких как раковые клетки или промоторы, отвечающие на стимул (рецептор стероидных гормонов, рецептор ретиноевой кислоты, рецептор глюкокортикоидов и т.д.) или т.н. индукционные. Таким же образом мож 9 но использовать промоторные последовательности, полученные из генома вируса, такие как,например, промоторы генов ElA и MLP аденовирусов, ранний промотор CMV или промоторLTR вируса RSV и т.д. Кроме того, эти промоторные участки могут быть изменены добавлением последовательностей активации, регуляции или отвечающих за тканеспецифичную или мажоритарную экспрессию. Настоящее изобретение предусматривает создание новых терапевтических агентов, которые в силу их способности к подавлению транскрипции могут позволить воздействовать на многие клеточные дисфункции. С этой целью нуклеиновые кислоты или кассеты по изобретению могут быть введены непосредственно в то место, которое должно быть обработано, или инкубированы вместе с клетками, подлежащими разрушению или обработке. Было показано, что голые нуклеиновые кислоты могут проникать в клетки без помощи специального вектора. Однако в рамках настоящего изобретения предпочтительно использование вектора введения,улучшающего (i) эффективность проникновения в клетку, (ii) эффективность поиска цели и (iii) вне- и внутриклеточную стабильность. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеиновую кислоту или кассету встраивают в вектор экспрессии. Используемый вектор может иметь химическое (липосома, наночастица, белковый комплекс, катионные липиды или полимеры и т.д.), вирусное (ретровирус, аденовирус, вирус герпеса, AAV, вирус оспы и т.д.) или плазмидное происхождение. Использование вирусных векторов основано на естественной способности вирусов к трансфекции. Так, можно использовать, например, аденовирусы, герпесвирусы, ретровирусы и аденоассоциированные вирусы. Эти векторы оказываются особенно эффективными в плане трансфекции. Поэтому предпочтительным объектом изобретения в этой связи будет дефектный рекомбинантный ретровирус, геном которого включает в себя определенную выше нуклеиновую кислоту. Вектором по изобретению может быть также невирусный агент, способный выступать в роли промотора переноса и экспрессии нуклеиновых кислот в эукариотических клетках. Химические или биохимические, синтетические или природные векторы являются удачной заменой природным вирусам, в частности, из соображений удобства, безопасности, а также изза теоретически неограниченного размера ДНК,трансфекцию которой они могут осуществлять. Эти синтетические векторы выполняют две основные функции: компактизацию нуклеиновой кислоты, подлежащей трансфекции, и ее фиксацию в клетке, а также ее проведение через клеточную мембрану, и, возможно, через две ядерные мембраны. Чтобы компенсировать не 003694 10 достатки полианионной природы нуклеиновых кислот, все невирусные векторы содержат поликатионные участки. Нуклеиновая кислота или вектор по изобретению могут быть сконструированы с учетом пути введения: топического, перорального,парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутриглазного, чрескожного и т.д. Предпочтительно нуклеиновую кислоту или вектор используют в форме, адаптированной для инъекций. Они могут быть, следовательно, смешаны с любым фармацевтически приемлемым носителем, подходящим, в частности, для получения составов для прямых инъекций в области органов, подлежащих лечению. Это могут быть, в частности,стерильные, изотонические растворы или сухие композиции, в частности, лиофилизованные,которые при добавлении в зависимости от конкретного случая стерилизованной воды или физиологической сыворотки образуют растворы для инъекций. Используемые дозы нуклеиновой кислоты могут быть выбраны в зависимости от различных параметров, в частности, от используемых гена, вектора, пути введения, вида патологии или продолжительности лечения. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, как она описана выше. Оно также относится к фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере,один вектор, как он определен выше. В силу их антипролиферативных свойств,фармацевтические композиции по изобретению особенно подходят для лечения гиперпролиферативных нарушений, таких как рак и рестеноз. В рамках настоящего изобретения разработана особенно эффективная методика разрушения клеток, в частности гиперпролиферативных клеток. Ее можно использовать и применительно к опухолевым клеткам или к клеткам гладких мышц стенок сосудов (при рестенозе) для их разрушения. Она особенно хорошо подходит для лечения раковых заболеваний. В качестве примера можно упомянуть аденокарциномы ободочной кишки, рак щитовидной железы,карциномы легкого, лейкемии костного мозга,рак прямой кишки, рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, эзофагиальный рак, лимфомы В, рак яичников, рак мочевого пузыря,глиобластомы, рак кости, кожи, поджелудочной железы, а также рак почек и предстательной железы, рак пищевода, рак гортани, раковые заболевания головы и шеи, аногенитальныеHPV-положительные раковые заболевания,EBV-положительные раковые заболевания носоглотки и т.д. С другой стороны, настоящее изобретение относится к применению соединений, ингибирующих активность протеина Ki или PCNA для 11 ингибирования пролиферации гладких мышечных клеток. Также настоящее изобретение относится к применению соединений по изобретению для получения двух- или трехчастного комплекса с протеинами Ki и/или PCNA для осуществления положительной или отрицательной регуляции развития клеточного цикла. Описание настоящего изобретения дополняют нижеследующие примеры и фигуры, которые можно считать отражением отдельных частных случаев осуществления изобретения. Описание фигур Фиг. 1. Анализ с помощью Northern blotting экспрессии протеина Ki на мРНК, выделенной из различных тканей. Фиг. 2. Выявление локализации KiHA в ядрах клеток методом иммунофлюоресценции. Фиг. 3. Взаимодействие in vitro протеиновB) Far Western Blotting. Фиг. 4. А) Конструкция гена Reporter,осуществляющего экспрессию бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) под контролем искусственного промотора. В) Количественное определение ферментной активности CAT в экстрактах клеток после трансфекции с векторами экспрессии, включающими, соответственно, ER, GAL VP16 и ERGAL VP16. Фиг. 5. Сравнение конструкций различных мутантов делеции GAX по отношению к целому(1-302) протеину GAX. Фиг. 6. Количественное определение ферментной активности CAT с различными химерами GAL-GAX:URA3-pGAL1/10-LacZ, HIS3: :GAL7BLE) использовали в качестве средства для просеивания банка сплавления легкого системой двойных гибридов. Штамм культивируют в следующих культуральных средах: полная среда YPD: экстракт дрожжей (10 г/л) (Difco); бактопептон (20 г/л) (Difco); глюкоза (20 г/л) (Merck). Эту среду отверждают добавлением 20 г/л агара (Difco). Минимальная среда YNB: Yeast Nitrogen 12 Эта среда может быть отверждена добавлением 20 г/л агара (Difco). Для обеспечения роста в этой среде ауксотрофных дрожжей необходимо добавить аминокислоты или азотированные основания из расчета 50 мг/мл. 2) Используемые штаммы бактерий. Штамм TG1 Escherichia coli генотипа supE,hsdD5, thi, D(lac-proAB), F'[traD36 pro A+В+ lacIqlacZDM15] использовали для амплификации и выделения используемых рекомбинантных плазмид. Для получения рекомбинантных протеинов используют бактерии E.coli BL-21, полученныеPhannacia. E.coli. Они имеют генотип F-ompTBL-21 является наилучшим штаммом для получения рекомбинантных протеинов, поскольку не содержит протеаз и имеет хрупкую мембрану, легко разрушаемую ультразвуком.E.coli BL-21 имеет систему подавления Т 7 РНКполимеразы. Это подавление может быть инактивировано с помощью IPTG, что позволяет контролировать работу генов, находящихся после сайта связывания Т 7 РНК-полимеразы. Готовят культуру бактерий в 2 мл среды LB (NaCl 5 г/л/ Tryptone 10 г/л. Экстракт дрожжей 5 г/л) в смесителе при 37 С в течение ночи. 1 мл этой предкультуры используют для получения культуры в 50 мл среды 2 хYТ (NaCl 5 г/л, Tryptone 16 г/л. Экстракт дрожжей 10 г/л) при 37 С до достижения оптической плотности бактерий(D.O.) от 0,4 до 600 нм (экспонентная фаза роста). Культуру бактерий охлаждают на льду. Бактерии центрифугируют при 3300 об/мин в течение 20 мин. Бактерии E.coli, пригодные для получения рекомбинантных протеинов, получают, используя метод хлорида кальция. Для этого готовят 0,1 М раствор бактерий в 5 мл CaCl2. Бактерии повторно центрифугируют при 3300 об/мин,после чего снова помещают в 0,1 М раствор 1 млCaCl2, содержащий 17,5 % глицерола. Этот раствор делят на равные части и хранят при -80 С. 3) Используемые плазмиды. Используемыми плазмидами являются: векторы серии pGBT и pAS. (Clontech),челночные плазмиды, содержащие сайты начала репликации, полученные от бактерий и дрожжей, что позволяет им реплицироваться в этих двух микроорганизмах в большом количестве. Эти плазмиды содержат множественный сайт клонирования, расположенный после последовательности, кодирующей домен связывания ДНК GAL4 и раньше стоппера; такая структура позволяет получить протеин слияния. Они также содержат ген TRP1 S.cerevisiae, что позволяет добавить trp1 в генотип дрожжей для их селекции в минимальной среде, лишенной триптофана. Эти векторы содержат ген устойчивости к ампициллину, что позволяет осуществлять 13 селекцию содержащих их бактерий в среде, содержащей ампициллин; векторы серии pGAD, (Clontech), векторы,осуществляющие экспрессию в дрожжах, протеинов слияния между доменомтрансактиватором GAL4 и протеином, используемым по изобретению или кодируемым кДНК, полученной из банка легкого, встроенной в сайт EcoRI XhoI; векторы серии рЕТ 29 (Novagen), векторы,осуществляющие экспрессию рекомбинантных протеинов в coli, слитых с tagS; векторы серии pGEX (Pharmacia), векторы,осуществляющие экспрессию рекомбинантных протеинов в coli, слитых с глутатион-3 трансферазой (GST); векторы серии Bluescript. (Stratagene), векторы, позволяющие осуществить клонирование,а также серии pIC (J. Lawrence Marsh и др.,Gene, 1984, 32, 481-485) и pMTL (Steve P.Chambers и др., Gene, 1998, 68, 139-149). Плазмида pGEX-2T-hGAX является плазмидой, используемой для преобразования Е.Coli BL-21. Эта плазмида была получена на основе плазмиды pGEX-2T и предоставлена доктором K. Walsh из St. Elizabeth's Medical Center,Бостон. Базовая плазмида pGEX-2T (Pharmacia) позволяет получить протеин GAX, слитый с глутатион-S-трансферазой (GST), протеином,обладающим высоким сродством к глутатиону. Слияние GST-GAX облегчает очистку GAX,использующую сродство к глутатиону по спаренным агарозным структурам. Кроме того, существует сайт разрыва тромбином, который позволяет позднее разделить химерную структуру между GST и GAX. кДНК hGAX контролируется гибридным промотором tac и оператором lac. Penpeccop lacI, присоединяясь к операторуlac,мешает продвижению РНКполимеразы. Это подавление снимается аналогом лактозы, изопропилD-тиогалактозидомlacI-ИПТГ не может присоединяться к оператору lac, поэтому исчезает препятствие для РНКполимеразы. 4) Протеин Ki. Получение и очистка. Провели клонирование гена протеина Ki,слитого с эпитопом myc в плазмиде рЕТ-29(Novagen), используя плазмиду pGAD, содержащуюся в дрожжах. Плазмида рЕТ-29 продуцирует протеин, слитый с эпитопом, называемым S-Tag, который позволяет провести очистку KI за счет сродства к S-протеину по спаренным агарозным структурам. Химера SmycKI контролируется промотором Т 7 и операторомGST-GAX, их помещают в культуру до получения оптической плотности от 0,7 до 600 нм. Затем индуцируют экспрессию SmycKI с помощью 0,1 мМ ИПТГ и Т 7 РНК-полимеразы, про 003694 14 дуцируемой BL-21. Бактерии обрабатывают ультразвуком. Супернатант затем очищают по следующей методике. Очистка SmycKI проходит за счет сродства к S-протеину по спаренным агарозным структурам. Методика аналогична той, которая используется в случае GST-GAX,за исключением того, что смолу промывают в растворе, содержащем 20 мМ Tris рН 7,5, 0,15 МNaCl и 0,1% Triton X-100. Элюирование и диализ проводят так же, как для GST-GAX. В) Методы. Классические методы молекулярной биологии хорошо известны специалистам и широко описаны в литературе [Maniatis Т. и сотр., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y., 1982; Ausubel F.M. и сотр., Current Protocols in Molecular Biology, John WilleySons,New York, 1987]. 1) Двойная гибридная система. Эта система представляет собой метод клонирования за счет взаимодействия in vivo вSaccharomyces cerevisiae, принцип которого основан на модульной структуре дрожжевого фактора транскрипции GAL4 (7). Активатор транскрипции GAL4 содержит два независимых домена, выполняющих разные функции. Домен связывания с ДНК (GALDB для GAL DNABinding) позволяет GAL4 фиксироваться на специфической последовательности ДНК на уровне промоторного участка гена. В этом случае GAL4 оказывается пространственно близок к транскрипционному механизму и благодаря своему домену-трансактиватору (GALTA) увеличивает частоту инициации транскрипции на прилегающем гене, вероятно, за счет взаимодействия с РНК-полимеразой или с ассоциированными протеинами. Принцип двойной гибридной системы заключается в том, что GALDB и GALTA по отдельности сращивают с двумя различными протеинами Х и Y, которые, при взаимодействии, образуют активный транскрипционный комплекс. 2) Просеивание дрожжей по технологии ПЦР (полимеразной цепной реакции). Просеивание осуществляют непосредственно на дрожжах. Каждую колонию дрожжей помещают в раствор в 10 мкл воды с 0,08%Tween 20. Tween представляет собой неионный детергент, который позволяет усилить лизис дрожжей на первой стадии нагревания до 95 С. На следующих стадиях Tween 20 действует как агент защиты Taq ДНК-полимеразы. Конечный объем дрожжевой суспензии доводят до 20 мкл при следующих конечных количествах или концентрациях: 10 пикомоль затравки 1, 10 пикомоль затравки 2, 1 единица Taq ДНКполимеразы, 75 мМ Tris рН 9, 20 мМ (NH4)2SO4,0,01% Tween 20, 2/5 мМ MgCl2 и 125 мкМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидов (дАТФ,дТТФ, дГТФ и дЦТФ). На выходе из ПЦР одну фракцию смеси анализируют на геле агарозы. 15 Таким образом можно узнать, для каждой заданной пары затравок и для каждого клона дрожжей, является ли данная последовательность ДНК уже идентифицированной. 3) Получение плазмидных ДНК. Большие количества ДНК получают, используя комплект для быстрого получения ДНК(Promega). Малые количества ДНК получают следующим образом: бактерии, содержащие плазмиды, культивируют в течение, по меньшей мере, 4 ч в 2 мл среды LB в смесителе. Затем их центрифугируют в течение 2 мин при 14000 об./мин в пробирках Эпендорфа, после чего осадок суспендируют в 100 мкл раствора I (50 мМ глюкозы, 25 мМ буфера Tris HCl рН 8, 10 мМ EDTA рН 8), лизируют с помощью 200 мкл раствора II (0,2 М NaOH, 1% SDS). Лизирующий раствор затем нейтрализуют с помощью 150 мкл раствора III (3M ацетата калия, 11,5% (об./об.) ледяной уксусной кислоты). После взбалтывания пробирок и образования осадка в виде хлопьев добавляют 150 мкл смеси фенол/хлороформ (50% фенола и 50% хлороформа, насыщенных водой) и взбалтывают 30 с. После центрифугирования в течение 2 мин при 14000 об./мин, собирают водную фазу, содержащую ДНК. Затем ДНК осаждают добавлением 0,5 объема изопропанола, центрифугируют 5 мин при 14000 об./мин и высушивают на воздухе, после чего помещают в 20 мкл ТЕ РНКполимеразы (раствор Tris-HCl (10 мМ) и EDTA(1 мМ) с 50 мг/мл РНК-полимеразы). 4) Синтез и ферментативная амплификация ДНК или ПЦР. Реакции ПЦР проводят в конечном объеме 100 мкл в присутствии ДНК-матрицы, дНТФ(0,2 мМ), буфера ПЦР (Tris-HCl рН 8,5 10 мМ,МgСl2 1 мМ, КСl 5 мМ, желатин 0,01%), 0,5 мкг каждого олигонуклеотида и 2,5 UI Ampli Taq ДНК-полимеразы (Perkin Elmer) с формамидом(5%) или без него. Смесь покрывают 2 каплями парафинового масла для уменьшения испарения. Используют аппарат Crocodile II (Appligene). Использовали следующие температуры: температура денатурации 90 С, температура гибридизации олигонуклеотидов на матрице на 5-10 С ниже температуры разделения олигонуклеотидов и температура ферментативной элонгации 72 С. Фрагменты, полученные с помощью ПЦР и предназначенные для клонирования, после каждого клонирования повторно секвенируют для выявления мутаций, которые могут возникать в ходе амплификации. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезируют химическими методами согласно методике фосфорамидитов, используя -цианоэтильные защитные группы (Sinha 1984). По окончании синтеза защитные группы удаляют с помощью обработки нашатырным спиртом, а двукратное осаждение бутанолом 16 позволяет осуществить очистку и концентрирование олигодезоксинуклеотидов (Sawadogo,1991). Концентрацию ДНК определяют по оптической плотности, которая составляет 260 нм. 5) Сшивание. Все реакции сшивания проводят при +14 С в течение ночи в конечном объеме 10 мкл в присутствии 100-200 нг вектора, 0,5-2 мкг вставок,40 UI фермента Т 4 ДНК-лигазы (Biolabs) и сшивочного буфера (Tris-HCl 50 мМ рН 7,8; MgCl2 10 мМ; АТФ 1 мМ). Отрицательный контроль проводят с помощью сшивания вектора в отсутствие вставки. В случае заполнения 5'-концов оно происходит перед сшиванием с помощью фрагментаKlenow ДНК-полимеразы I Е. Coli (Biolabs) согласно инструкции производителя. Разрушение 3'-концов происходит в присутствии ДНКполимеразы фага Т 4 (Biolabs), используемой согласно инструкции производителя. 6) Трансформация бактерий. Трансформацию бактерий с помощью плазмиды проводят согласно следующему протоколу: используют весь объем среды для сшивания (10 мкл) для трансформации бактерийTG1, которые делают компетентными по методуChung и др., (PNAS, 1988 86, 2172-2175). Готовят культуру бактерий TG1 в жидкой среде LB в течение нескольких часов в термостате при 37 С и при взбалтывании до получения оптической плотности от 0,6 до 600 нм. После этого среду центрифугируют при 6000 об./мин в течение 10 мин. Бактерии делают компетентными, помещая представленный бактериями осадок в один объем TSB (средаLB+100 г/л PEG 4000, 5% DMSO, 10 мМ MgCl2,10 мМ MgSО 4), соответствующий 1/10 объема среды первоначальной культуры. После инкубации при 4 С в течение 30-60 мин, 200 мкл бактерий вводят в контакт с продуктами сшивания на 15 мин на льду. После добавления 200 мкл LB бактерии инкубируют 30 мин при 37 С,затем помещают на среду LB+ампициллин. 7) Разделение и экстракция ДНК. ДНК разделяют электрофорезом по их размеру. Для этого используют различные гели,выбираемые в зависимости от размера разделяемых фрагментов: 1% гель агарозы (Gibco BRL) в буфере ТВЕ (Tris основной 90 мМ; борат 90 мМ; EDTA 2 мМ) для разделения крупных фрагментов ДНК (более 500 пар оснований) 2% гель агарозыBioproducts) в буфере ТВЕ для разделения мелких фрагментов (менее 500 пар оснований). Миграцию на геле агарозы или на полиакриламидном геле осуществляют в буфере ТВЕ и в присутствии маркера молекулярной массы (1EDTA), после чего помещают на гель. После 17 миграции при 100 В и окрашивания бромидом этидия (в концентрации 0,5 мкг/мл геля) полосы становятся видимыми в УФ. Экстракцию ДНК из геля агарозы осуществляют электроэлюированием следующим образом. Кусочек геля, содержащего фрагмент ДНК вырезают скальпелем и помещают в диализную спираль, закрытую с помощью двух зажимов и содержащую от 100 до 500 мкл ТВЕ. Все вместе помещают в кювету для электрофореза и воздействуют электрическим полем 100 В. После извлечения из геля ДНК очищают двукратной экстракцией с помощью смеси фенол/хлороформ, затем двукратной экстракцией хлороформом, затем осаждают в присутствии ацетата натрия 0,3 М и 2,5 объема абсолютного этанола. После центрифугирования (5 мин при 14000 об./мин) осадок ДНК высушивают, затем помещают в 20 мкл воды. 8) Флюоресцентное секвенирование плазмидных ДНК. Секвенирование проводят по методуSanger, используя 4 дидезоксирибонуклеотида,содержащих различные флюоресцентные маркеры. Встраивание одного из этих дидезоксирибонуклеотидов приводит к остановке репликации Taq-полимеразой секвенируемой ДНК. В результате этой реакции получают фрагменты ДНК разных размеров, каждый из которых заканчивается на 3'-конце одним из этих 4 дидезоксирибонуклеотидов. 1 мкг плазмиды и 4 пикомоль праймера добавляют к 9,5 мкл премикса, поставляемогоApplied Biosystems под маркой Prismc. Конечный объем должен составлять 20 мкл для проведения 25 циклов ПЦР, каждый из которых делится на этап денатурации при 96 С в течение 30 с, этап гибридизации при 50 С в течение 15 с и этап элонгации при 60 С в течение 4 мин. Фрагменты ДНК, полученные после амплификации, очищают на эксклюзионной колонке (Chromaspin-30, Clontech), затем высушивают на Speed Vac и отбирают в 5 мкл смеси,состоящей из 24 мкл EDTA (50 мМ) и 120 мкл дезионизованного формамида. После денатурации в течение 3 мин при 96 С помещают от 3 до 5 мкл на гель для электрофореза. Различные фрагменты ДНК разделяют в соответствии с их размером и проводят считывание лазером на аппарате 370 DNA sequencer (AppliedBiosystems), который определяет различные флюоресцентные участки. 9) Получение плазмид из банка легкого(Clontech). Банк слияния кДНК легкого продается в форме бактерий. Этот банк происходит от клонирования на уровне сайта EcoRI-XhoI плазмиды pGAD424 (Материалы и Методы) кДНК,соответствующей всем РНК клеток легкого человека. После проверки титров банка 2 мкл бактерий банка слияния легкого в 8 мл LB помещают 18 на твердую среду, таким образом, чтобы избежать их слияния и сохранить репрезентативность банка. Таким образом были подготовлены 16 плашек по 770 см 2, содержащие средуLB+ампициллин. Полученные колонии собирают из каждой плашки с помощью 30 мл жидкой среды LB+ампициллин. Полученные суспензии помещают в Erlen и инкубируют в шейкере при 37 С в течение 3 ч. ДНК экстрагируют из штаммов по технологии Maxiprep. Концентрация ДНК составляет 260 нм оптической плотности. 10) Трансформация дрожжей с помощью плазмиды. Дрожжи культивируют в 100 мл жидкой среды и после центрифугирования при 3000 об./мин в течение 3 мин суспендируют в 1 мл стерильной воды. После центрифугирования при 3000 об./мин в течение 3 мин клеточный осадок ресуспендируют в 1 мл стерильной воды,после чего опять центрифугируют. Эту операцию опять повторяют для удаления всех следов культуральной среды. Затем дрожжи помещают в 1 мл раствора для трансформации I (LiAc 0,1 М, Tris-HCl pH 7,5 10 мМ, EDTA 1 мM), затем центрифугируют при 3000 об./мин в течение 3 мин. Клеточный осадок снова помещают в 1 мл раствора для трансформации I. К 50 мкл этой дрожжевой суспензии добавляют 50 мкг ДНК спермы лосося и от 1 до 5 мкг плазмидной ДНК. После этого добавляют 300 мкл раствора для трансформации II (LiAc 0,1 М, Tris-HCl pH 7,5 10 мМ/ EDTA 1 мМ в 40% PEG4000), затем все вместе инкубируют при 28 С в течение 30 мин. Затем трансформационную смесь подвергают термическому шоку на водяной бане при 40 С в течение 15 мин, затем ее центрифугируют при 15000 об./мин в течение 1 мин и собирают клеточный осадок. Этот осадок помещают в 200 мкл воды, затем выкладывают на минимальную среду с добавленным агар-агаром, не содержащую аминокислот, соответствующих маркерам, содержащимся в трансформирующих плазмидах. После этого дрожжи культивируют в течение 72 ч при 28 С. В частном случае трансформации дрожжей с помощью банка кДНК легкого действуют следующим образом. Используемые дрожжи содержат плазмидуpGAL4DB-GAX, осуществляющую экспрессию протеина GAX, слитую с доменом связывания с ДНК GAL4. Их культивируют в 250 мл минимальной среды YPG при 28 С и при взбалтывании до получения плотности 107 клеток/мл. Клетки отбирают центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин и помещают в 250 мл воды. После повторного центрифугирования клеточный осадок помещают в 100 мл воды и центрифугируют снова. Осадок собирают в 10 мл раствора для трансформации I и инкубируют в течение 1 ч при 28 С при взбалтывании. После центрифугирования клетки снова собирают в 2,5 19 мл раствора для трансформации I, 100 мкл банка кДНК легкого и 20 мл раствора для трансформации II, затем инкубируют в течение 1 ч при 28 С при взбалтывании. Проводят термический шок этой трансформационной смеси при 42 С в течение 20 мин. Центрифугирование (3000 об./мин в течение 5 мин) проводят 3 раза подряд, каждый раз собирая осадок в 10 мл стерильной воды. Третий раз осадок собирают в 2,5 мл PBS. Таким образом удаляют токсичный для клеток PEG, 2,4 мл этой суспензии используют для высевания на 250 мл минимальной среды,содержащей аминокислоты His, Lys, Met и основания Ura и Ade, и культивируют в течение ночи в шейкере при 28 С. Оставшиеся 100 мкл этой суспензии используют для проверки эффективности трансформации, для этого готовят разведения 10-2, 10-3 и 10-4 этой суспензии. Культуру, выращенную за ночь, центрифугируют (3000 об./мин в течение 5 мин) и промывают стерильной водой 2 раза подряд. Затем осадок собирают в 2,5 мл воды, 2,4 мл объем которых доводят до 10 мл добавлением стерильной воды,используют для высеивания в 10 плашек по 435 см 2,содержащих средуHis+Ade, которые затем инкубируют в течение 3 суток. Оставшиеся 100 мкл используют в тех же операциях, как и при определении степени амплификации, для определения степени амплификации числа колоний в ходе культивации в течение ночи. 11) Получение ДНК (геномных и плазмидных) дрожжей. Количество, соответствующее среднему значению статистической кривой, клона дрожжей помещают в 200 мкл раствора TELT (2%pH 8, EDTA 1 мМ) в присутствии 3 г стеклянных шариков диаметром 450 мкм и 200 мкл смеси фенол/хлороформ. Эту смесь перемешивают в аппарате Vortex в течение 15 мин, затем центрифугируют в течение 2 мин при 14000 об./мин. Собирают супернатант, не трогая слой протеинов, и осаждают ДНК, содержащуюся в этой фазе, с помощью 2,5 объема абсолютного этанола. После центрифугирования в течение 2 мин при 14000 об./мин, осадок ДНК высушивают и собирают в 20 мкл ТЕ-ДНК-полимеразы. Этот раствор ДНК, соответствующий смеси геномной и плазмидной ДНК, непосредственно используют для трансформации бактерий. Только плазмидная ДНК способна реплицироваться в бактериях и может быть подвергнута анализу по технологии Miniprep. 12) Тестирование активности -галактозидазы. Лист нитроцеллюлозы заранее поместили на чашку Петри, содержащую индивидуализированные клоны дрожжей. Благодаря явлению абсорбции, получают точную картину размещения клонов. Затем этот лист погружают на 30 с в жидкий азот, чтобы разрушить дрожжевые 20 клетки и высвободить активную галактозидазу. После размораживания лист нитроцеллюлозы помещают таким образом, чтобы колонии находились с верхней стороны, в другую чашку Петри, содержащую кусок листа ватмана, предварительно пропитанный 1,5 мл раствора PSB (60 мМ Na2HPO4, 40 мМ NaH2PO4,10 мМ КСl, 1 мМ MgSO4, pH7) и от 10 до 30 мклX-Gal (5-бром-4-хлор-3-индоил-b-D-галактозид) в N,N-диметилформамиде в концентрации 50 мг/мл. Чашку помещают в термостат при 37 С и накрывают крышкой во избежание высыхания. Время проявления синего цвета может сильно варьировать, от нескольких минут до многих часов. Этот тест нужно проводить всегда в присутствии положительного контрольного образца, степень взаимодействия которого известна и который быстро окрашивается в синий цвет. 13) Конструкция векторов экспрессии и гена-репортера. а) Векторы экспрессии. кДНК рецептора эстрогена (ER) получают обратной транскрипцией (RT) с помощью стандартного набора (first strand cDNA syntesis Kit,Pharmacia), используя полный экстракт РНК из матки мыши, и последующей амплификацией в ПЦР. Использовали пару специфичных гибридизующихся праймеров, 5'-конец которых содержал 20 первых нуклеотидов ER; при этом вводили сайт EcoRI непосредственно перед первым кодоном (5'-gagcgaattcATGACCATGACCCTTCACAC SEQ ID No 6, нуклеотиды, обозначенные наклонным шрифтом, соответствуют сайту EcoRI, а подчеркнутые - первому кодону); на 3'-конце возвратный праймер начинается со стоп-кодона ER; при этом также вводят сайтEcoRI, а подчеркнутые - стоп-кодону). Полученный фрагмент ПЦР очищали, расщепляли с помощью EcoRI, затем клонировали на месте в векторе экспрессии pCDNA3 (Invitrogen). Этот вектор был назван pCMV-ER. Различные делеционные мутанты GAX, слитые с доменом связывания с ДНК GAL4 (pCMV-GALDB/GAX, см. пример 9) также были клонированы в вектореpCDNA3. б) Ген-репортер. Ген-репортер был сконструирован согласно стратегии, описанной Martinez и др. (Martinez и др., Mol. Cell. Biol. 11, 2937-2945), с тем отличием, что в качестве вектора клонирования использовали pGSCAT (Clontech, САТ= Хлорамфениколацетилтрансфераза). Был синтезирован двухцепочечный олигонуклеотид (см. ниже),содержащий два специфичных сайта (выделенных жирным шрифтом), из которых один распознается доменом связывания с ДНК GAL4 (Gаl17 мер, Саrеу и др. 1989, J. Mol. Biol. 209, 423432), а другой представляет собой консенсусную последовательность ERE (Estrogen Re 21sponsive Element) (Beato M. 1989, Cell 56, 335344), которая связывает рецептор с эстрогенами. Этот олигонуклеотидный адаптер содержит на 5'-конце протрузивный сайт XhoI, а на 3'-конце сайт XbaI, который позволяет провести клонирование в сайтах XhoI и XbaI pG5CAT.(pEREG1CAT, фиг. 4, пример 11) основан на том факте, что ER является активатором транскрипции, обладающим в случае мышиного ER конституционной активностью, которая возрастает в ответ на действие своего природного лиганда - эстрадиола 17-. Эта система была использована Martinez и др. для изучения синергизма ER и второго фактора транскрипции NF1, у которого домен-активатор транскрипции был слит с доменом связывания с ДНК дрожжевого протеина GAL4 (GALDB). Этот репортер позволяет, таким образом, учитывать степень транскрипции, проходящей исключительно за счет одного или другого из этих факторов транскрипции или их совместного действия, без учета влияния эндогенных молекул. Эта система позволяет, таким образом, изучить транскрипционную активность всего или части протеинаGAX, слитого с GALDB (фиг. 5, 6 и примеры 12, 13). Сконструировали плазмиду, отвечающую за экспрессию гена люциферазы под контролем промотора CMV (pCMV-Luc). Эта конструкция была получена после клонирования фрагмента ПЦР (фланкированного на 5'- и 3'-концах сайтом BamHI), содержащего промотор CMV вектора pCDNA3 (Invitrogen), в сайте BglII вектораpGL3-Basic (Promega). Эта плазмида служила внутренним стандартным образцом во всех нижеследующих опытах по транзитной трансфекции. 14) Опыты по транзитной котрансфекции. Все исследования проводили на фибробластах эмбриона мыши NIH-3T3 (АТСС). Эти клетки содержались, как обычно, в DMEM(GIBCO), куда было добавлено 100 U/мл пенициллина (GIBCO), 100 мкг/мл стрептомицина(GIBCO), 2 мМ L-глутамина (GIBCO) и 10% зародышевой телячьей сыворотки (SVF,GIBCO). Эту среду обозначают аббревиатуройDMEM-GPS/SVF. Для проведения опытов по транзитной трансфекции NIH-3T3 высеивают с плотностью 100000 клеток на лунку в 24-лунковую плашку(Falcon) в объеме 1 мл DMEM-GPS/SVF. Через 1620 ч после распределения и укоренения клеток клетки промывают 0,5 мл DMEM-GPS (без SVF),затем помещают в 0,5 мл DMEM-GPS. Добавляют 50 мкл на лунку трансфекционной смеси. Получение этой смеси приведено в табл. 3.pCDNA3 используют для дополнения каждой смеси до общих 10 мкг 2 мкг/мл липофектамина (gibco) используют в отношении 8/1 (липофектамин/ ДНК). Клетки вводят в контакт с разными трансфекционными смесями на 4 ч при 37 С в стандартных условиях работы с культурами. ЗатемDMEM-GPS заменяют вместе с трансфекционной смесью на 1 мл DMEM-GPS/SVF, после чего клетки оставляют в культуре на 24 ч. Каждую трансфекционную смесь вводят минимум в 4 лунки. По истечении 24 ч клетки промывают с помощью 0,5 мл Dulbecco's PBS (GIBCO), затем собирают в 0,5 мл 0,2% раствора трипсина вPBS (GIBCO). Трипсин нейтрализуют с помощью 10 мкл SVF. Эту клеточную суспензию центрифугируют в течение 2 мин при 10000g,удаляют супернатант, клетки ресуспендируют в 150 мкл 0,25 М Tris-HCl, pH 7,8. 50 мкл этой суспензии используют для измерения активности люциферазы с комплектом luciferase AssayLUMAT LB 9501 (EGG Berthold). Цитозольные протеины клеток в оставшихся 150 мкл экстрагируют 5 циклами замораживания/оттаивания (жидкий азот, 37 С). Эти экстракты, нормализованные по отношению к люциферазной активности, используют далее для измерения активности CAT согласно методике, описаннойGAX. Его проводят по методике Far-WesternBlotting. В то время как Western Blotting заключается в электрофоретическом разделении протеинов на денатурирующем геле с последующим электропереносом протеинов на нитроцеллюлозную мембрану и прямой или непрямой иммунодетекцией. Far-Western Blotting представляет собой Western Blotting, к которому добавляется стадия взаимодействия протеин-протеин 23 между фиксированным на нитроцеллюлозной мембране протеином-мишенью и растворенным фактором. а) Электрофорез. Образцы нагревают до 95 С в течение 10 мин в буфере для денатурации протеинов, содержащем 50 мМ Tris pH 6,8, 2% SDS (Натрийдодецилсульфат), 10% глицерина, 300 мМ bмеркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. 10 мл образцов помещают на 14% акриламидный Tris-глициновый гель (Tris-GlycineGels, Novex). Миграция протекает в течение 1 ч при постоянном напряжении 120 В в буфере для разделения протеинов (35 мМ SDS, 1,92 М глицина и 85 мМ Tris pH 8,3). Молекулярную массу протеинов определяют по параллельной миграции окрашенного подвижного контрольного образца с известной молекулярной массой(MultiMarkTM Multi-Colored Standart, Novex). Этот гель готовят в двойном экземпляре, чтобы иметь возможность параллельно окрашивать один из двух голубым Кумасси (метанол 30%,вода 60%, уксусная кислота 10%, голубой Кумасси 0,1%). Окрашивание длится 1 ч. Обесцвечивание проводят в течение нескольких часов,несколько раз меняя обесцвечивающий раствор(метанол 30%, уксусная кислота 10%, вода 60%). Порог чувствительности этого метода составляет 50 нг протеина. Этот окрашенный гель позволяет, таким образом, визуально обнаруживать все отложившиеся протеины. Другой гель используют для Far-Western Blotting. б) Полусухой перенос на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозную мембрану (Hybond С.Amersham) и гель помещают между 3 листами ватмана, предварительно погруженными в буфер переноса (150 мМ глицина, 25 мМ Tris, 20% метанола, воды qs до 1 л, pH 8,3). Перенос осуществляют в течение 40 мин при 2,5 мА/см 2 геля(аппарат MilliblotTM-Graphite Electroblotter II,Millipore). в) Взаимодействие протеин-протеин. Мембрану насылают в течение 30 мин при взбалтывании и при комнатной температуре вPBS, содержащем 5% (вес/об.) порошкового обезжиренного молока (Gloria), 0,2% (об./об.)Tween 20. Затем ее погружают на 1 ч при взбалтывании и при комнатной температуре в 5 млPBS, содержащего 5% (вес/об.) обезжиренного порошкового молока (Gloria), 0,2% (об./об.)Tween 20 и 75 мкг KI. По окончании инкубации мембрану промывают 3 раза в течение 10 мин вPBS, содержащем 0,2% (об./об.) Tween 20. Для визуального наблюдения взаимодействия междуGST-GAX, фиксированным на нитроцеллюлозной мембране и mycKi, этот последний проявляют, как GST-GAX, с помощью моноклональных антител мьши, направленных к эпитопу 24 Примеры Пример 1. Конструирование вектора экспрессии протеина слияния GAX с доменом связывания с ДНК GAL4. Просеивание банка с использованием двойной гибридной системы требует, чтобы протеин GAX был слит с доменом связывания с ДНК протеина-трансактиватора GAL4. Экспрессия этого протеина слияния происходит благодаря вектору pGBT10 (см. материалы и методы), в который введен, в одной рамке считывания с последовательностью, соответствующей домену связывания с ДНК GAL4GAX или его часть. Особый фрагмент содержит фрагмент EcoR1-Sal1, полученный от phGAX и который встроен на уровне сайта EcoR1-Sal1pGBT10, благодаря чему получают плазмиду рСМ 199. Проводят секвенирование этой конструкции, чтобы убедиться, что протеин GAX действительно находится в одной открытой фазе считывания с фрагментом, соответствующимGAL4DB. Пример 2. Просеивание банка слияния легкого. Просеивание банка слияния позволяет установить клоны, продуцирующие протеины,слитые с доменом-трансактиватором GAL4, которые могут взаимодействовать с протеиномGAX или с доменами этого протеина. Это взаимодействие позволяет создать трансактиватор,способный индуцировать экспрессию геновURA3, BLE и LaicZ в штамме YCM79. Для этого просеивания был выбран банк слияния, собранный на основе кДНК из легкого человека. Поскольку этот банк был поставлен в форме бактерий, в первую очередь провели очистку плазмидной ДНК этого банка. 2.1) Получение плазмидной ДНК банка слияния. Плазмидную ДНК банка кДНК легкого экстрагировали в соответствии с протоколомClontech (см. материалы и методы, 10). Важно было в процессе получения сохранить репрезентативность банка, т.е. сохранить число составляющих его независимых плазмид (7106). Во избежание потерь плазмид из банка в ходе этого получения, использовали число изолированных колоний бактерий, в три с небольшим раза превосходящее репрезентативность банка, т.е. 25106. 2.2) Трансформация с помощью банка легкого и селекция с помощью тестирования активности бета-галактозидазы. В ходе просеивания необходимо сохранить вероятность того, что каждая независимая плазмида банка слияния присутствует, по меньшей мере, в одной колонии дрожжей одновременно с плазмидой GAL4DB-GAX. Для сохранения такой вероятности важно, чтобы трансформация 25 дрожжей была эффективной. Для этого был выбран метод трансформации, при котором эффективность трансформации составляет 105 трансформированных клеток на 1 мкг ДНК. Кроме того, поскольку котрансформация дрожжей двумя разными плазмидами снижает эту эффективность, было решено использовать дрожжи, предварительно трансформированные с помощью плазмиды pGAL4DB-GAX. Этот дрожжевой штамм трансформировали с помощью 100 мкг плазмидной ДНК банка слияния. Это количество ДНК позволило получить по подсчетам (см. материалы и методы) 4,2107 трансформированных клеток, что составляет число, превосходящее число независимых плазмид в банке. На основании этого результата можно предположить, что практически все плазмиды банка участвовали в трансформации дрожжей. Селекцию трансформированных клеток, способных составлять функциональный трансактиватор GAL4, проводили на средеYNB+Lys+Met+His+Ade. В результате этой селекции получили 190 клонов с фенотипом Ura+ и bGal+. Пример 3. Идентификация вставок селекционированных плазмид. Выявление взаимодействия с Ki. Плазмиды экстрагировали из дрожжевых клеток, ввели в бактерии, затем их получали так, как описано в разделе "Материалы и методы". Секвенирование начинали с комплементарного олигонуклеотида GTATTCGATGATGAL4 ТА, который находится вблизи сайта встраивания банка кДНК легкого, на расстоянии 52 пар оснований от сайта EcoRI. Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка данных GENBank иEMBL (European Molecular Biology Lab) показало, что одна из идентифицированных плазмид содержит кДНК, идентичную фактору Ki, определенному в качестве аутоантигена у больных красной волчанкой. Эту плазмиду назвали рСМ 282. Эта плазмида, в случае ее котрансформации в дрожжах вместе с рСМ 199, способна активировать их референтные гены, как это показано в табл. 1. Эта таблица также показывает специфичность активации, которая означает,что Ki способен специфически взаимодействовать с GAX. Таблица 1 Векторы Активность бета-galpGBT10+pGAD424 0 Пример 4. Конструирование вектора экспрессии в дрожжах протеина слияния различных мутантов делеции GAX с доменом связывания с ДНК GAL4. 26 В этом примере описывается конструирование векторов, кодирующих различные варианты протеина GAX и используемых для определения структуры/функции этого протеина, и в частности, для выявления активных доменов и доменов, отвечающих за взаимодействие с протеином Ki. Для осуществления делеции 153 Сконцевых аминокислот плазмиду рСМ 199 расщепляют с помощью Eag1-Sal1, затем удаляют малый фрагмент, дефосфорилируют концы с помощью обработки Klenow и соединяют их. Полученная плазмида называется рСМ 238. Она кодирует протеин, содержащий остатки 1-104 протеина GAX. Полное расщепление рСМ 199 с помощью Вg12 и Sal1, последующая обработка Klenow и связывание с вектором позволяют сохранить 32 первые аминокислоты GAX. Получаемая плазмида называется рСМ 244. Она кодирует протеин, содержащий остатки 1-32 протеина GAX. Полное расщепление рСМ 199 с помощью Вg12 и Sal1 позволяет выделить фрагменты размером примерно 270 пар оснований и 572 пары оснований. Первый фрагмент клонируют вpGBTll в сайте Bamhl-Sal1 и получают плазмиду рСМ 245, с помощью которой можно осуществить слияние 79 С-концевых аминокислот сGAL4DB. Второй фрагмент клонируют вpGBT10 в сайте Bamh1 и получают плазмиду рСМ 246, с помощью которой можно осуществить слияние аминокислот 33-222 с GAL4DB. Плазмиду рСМ 280 получили путем расщепления рСМ 246 с помощью Dra3 и pst1. После обработки Т 4-полимеразой плазмида принимает замкнутую форму. Она кодирует протеин, содержащий остатки 33-63 GAX. Плазмиду рСМ 199 расщепляют с помощью Nde1 и Pst1. Вставочный фрагмент клонируют в плазмиде pAS1 и получают плазмиду рСМ 301. Эта плазмида осуществляет экспрессию протеина GAX, потерявшего в результате делеции первые 32 аминокислоты и слитого сGAL4DB. Она кодирует протеин, содержащий остатки 33-302 протеина GAX. Структура протеина слияния, экспрессию которого осуществляют эти различные векторы,представлена на фиг. 1. Пример 5. Расположение области взаимодействия GAX с KI. Дрожжевой штамм уСМ 79 подвергают трансформации с помощью различных векторов, описанных в примерах 1 и 4, одновременно с рСМ 282 и pGAD424. Активность бетагалактозидазы определяют, как описано в разделе "Материалы и методы". Полученные результаты представлены в табл. 2. Эти результаты позволяют выявить участок GAX, который взаимодействует с фактором Ki (табл. 2). Действительно, можно предположить, что участки, при отсутствии которых активность пропадает, являются необходимыми,но не достаточными. Так, участки 1-32 и 104223 имеют, по-видимому, важное значение для взаимодействия с Ki. То обстоятельство, что рСМ 238 не дает положительного сигнала бетагалактозидазной активности, позволяет предположить, что существует С-концевой участок 104-302 протеина GAX, который является необходимым для взаимодействия в дрожжах. Пример 6. Профиль экспрессии мРНК в различных тканях и ядерная локализация протеина, экспрессия которого осуществляется транзитно. Для определения партнеров GAX трансформировали имеющийся дрожжевой двойной гибридный штамм, уже содержащий плазмиду,осуществляющую экспрессию белка слиянияGAL-GAX (1-302) в качестве антигена, с помощью банка кДНК легкого, слитого с GAL4 ТА,который имелся в лаборатории (пример 2). К моменту амплификации получили более 41 миллиона независимых клонов и только 190 клонов, в которых проходила экспрессия всех трех селекционируемых генов (ген URA3, генLacZ и ген BLE). В этих 190 клонах удалось определить 9 кДНК, кодирующих различные протеины. Особый интерес был направлен к кДНК, кодирующей антиген Ki. Ген Ki является убиквитарным, судя по анализу с помощью Northern blotting (фиг. 1) его экспрессии на основе мРНК, экстрагированной из различных тканей (Human Multiple TissuNorthern Blots, Clontech), в котором выявляется мРНК размером около 3 т.п.н. Можно отметить присутствие одной формы мРНК, которая иначе проходит созревание (1,4 т.п.н.) в сердце и скелетных мышцах. Вектор экспрессии протеина Ki, слитого с 28 следующим образом: фрагмент Nco1-Xho1 плазмиды рСМ 282 встроили в плазмиду pAS1 на уровне сайтов Nco1-Xho1 и получили плаэмиду рСМ 322. Затем фрагмент EcoR1-Dra1 плазмиды рСМ 322 встроили в вектор экспрессии pCDNA3 на уровне сайтов EcoRI-EcoRV. Полученная плазмида рСМ 323 осуществляет экспрессию протеина Ki, слитого с tag НА в клетках млекопитающих. С помощью непрямой иммунофлюоресценции было показано, что KiHA имеет ядерную локализацию в клетках, трансфицированных этой химерой (фиг. 2). Пример 7. Экспрессия и очистка протеинаKi, слитого с tag S и tag myc. Нижеследующие олигонуклеотиды гибридизировали вместе, фосфорилировали, затем соединяли с рЕТ 29 В, предварительно расщепленным с помощью Nco1.No 3). Полученную плазмиду назвали рСМ 320. Ген, кодирующий протеин Ki, амплифицировали с олигонуклеотидами(SEQ ID No 5). Полученный фрагмент расщепили с помощью Bamh1 Xho1, затем, после соединения,ввели в сайты bamH1-Xho1 плазмиды pBCks и получили плазмиду рСМ 305. Затем эту плазмиду расщепили с помощью Bamh1 Xho1. Таким образом выделенный вставочный фрагмент соединили с сайтом Bamh1 и Xho1 плазмиды рСМ 320 и получили плазмиду рСМ 321. Экспрессию и очистку рекомбинантного протеина проводят согласно указаниям производителяGAX, слитого с GST. Колонии BL-21, трансформированные с помощью плазмиды pGEX-2T-h-GAX, помещают на ночь в первичную культуру в 30 мл LB с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 С. 5 мл этой культуры помещают в культуру в 500 мл LB с ампициллином при 37 С до получения оптической плотности от 0,7 до 600 нм. ЭкспрессиюGST-GAX индуцируют с помощью 0,1 мМ IPTG в течение 2 ч при 30 С. Культуру центрифугируют при 6000 об./мин в течение 10 мин. Осажденные бактерии помещают в раствор в 10 мл холодного PBS, затем распределяют в 10 пробирок Эппендорфа. Бактериальные протеины экстрагируют с помощью обработки ультразвуком в течение 10 мин с циклами по 12 с и с паузами 24 с и последующего центрифугирования при 15000 об./мин в течение 15 мин. Собирают су 29 пернатанты, составляющие растворимую фракцию, которая будет использована при очистке. Осадок составляет нерастворимую фракцию. Очистку GAX осуществляют благодаря сродству GST на спаренных агарозных структурах к глутатиону. Супернатант, полученный после обработки бактерий ультразвуком, инкубируют со смолой в течение 1 ч на вращательном взбалтывателе при комнатной температуре. Затем смолу, с которой связывается протеин, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют, а смолу промывают 3 раза, используя каждый раз 50 мл PBS, содержащего 1% TritonX-100, в течение 20 мин на вращательном взбалтывателе. GST-GAX можно отделить от смолы элиюрованием с помощью гуанидинтиоцианата. Элюирование проводят, используют 1,5 объема (от объема смолы) 2 М гуанидинтиоцианата, 20 мМ Tris pH 7,5, 0,15 М NaCl и 0,1%Triton X-100, на вращательном взбалтывателе в течение 30 мин. Проводят диализ элюата с PBS в течение ночи для удаления гуанидинтиоцианата. Протеин консервируют в PBS при 4 С. К препарату протеина добавляют, в количестве 1/200 от количества этого препарата, коктейль ингибиторов протеаз в равных количествах(лейпептин 1 мг/мл, пепстатин 1 мг/мл, апротинин 1 мг/мл, бензамидин 500 мМ). Пример 9. Взаимодействие in vitro протеинов Ki и GAX. Для изучения взаимодействия GAX и Ki invitro в Escherichia Coli получили два рекомбинантных химерных протеина. GST-GAX очищали на смоле, сцепленной с глутатионом благодаря каталитическому сайту глутатион-Sтрансферазы (GST); при этом SmycKi содержит эпитоп mуc, а эпитоп S позволяет осуществить очистку на смоле, сцепленной с протеином S. Указанные количества бычьего альбумина,протеина GST или GST-GAX после расщепления тромбином (сайт, созданный между GST иGST-GAX разделили на денатуриующем полиакриламидном геле, затем окрашивали голубым Кумасси (фиг. 3 А). Протеины из геля, идентичного используемому в случае А, переместили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали последовательно в присутствии SmycKi в растворе, содержащем моноклональные мышиные антитела к эпитопу myc (Santa Cruz), и, наконец,в растворе для определения антител анти-mус. Результаты ясно показывают, что Ki специфически распознает GST-GAX, причем это зависит от дозы, в то время как с бычьим альбумином или GST не наблюдается никакой реакции. Следует подчеркнуть, что Ki взаимодействует с GAX даже после расщепления тромбином (фиг. 3 В). Пример 10. Конструирование векторов экспрессии в клетках млекопитающих протеина 30 слияния различных делеционных мутантов GAX и домена связывания с ДНК GAL4. 10.1. Конструирование плазмидных векторов. Плазмиды рСМ 199 и рСМ 301 расщепляют с помощью HindIII. Вставочные фрагменты клонируют в правильном направлении вpCDNA3 (invitrogen) в сайте HindIII и получают,соответственно, плазмиды рСМ 291 и рСМ 327,осуществляющие экспрессию протеинов слияния в клетках млекопитающих. Плазмиды рСМ 238, рСМ 244, рСМ 301,рСМ 246 и рСМ 280 расщепляют с помощьюHindIII и NaeI. Вставочные фрагменты клонируют в правильном направлении в pCDNA3 (invitrogen) в сайте HindIII-EcoRV и получают соответственно плазмиды рСМ 292, рСМ 326,рСМ 327, рСМ 294 и рСМ 295, осуществляющие экспрессию протеинов слияния в клетках млекопитающих. 10.2. Конструирование вирусных векторов. В одном из своих аспектов изобретение относится к конструированию и использованию вирусных векторов переноса и экспрессии invivo нуклеиновых кислот, определенных выше. В частности, среди аденовирусов были изучены различные серотипы с не сильно варьирующими структурой и свойствами. Среди этих серотипов предпочтение в рамках настоящего изобретения отдают аденовирусам человека типа 2 или 5 (AD 2 или Ad 5) или аденовирусам животных (см. заявку WO 94/26914). Среди аденовирусов животных, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, можно назвать аденовирусы собак, крупного рогатого скота, мышей (пример: Mavl. Beard и др., Virology 75 (1990) 81), овец, свиней, птиц или обезьян (пример: SAV). Предпочтительно в качестве аденовируса животных используют аденовирус собак, преимущественно аденовирус(АТТС VR-800)]. Предпочтительно в рамках изобретения используют аденовирусы человека или собаки, или смешанные. Предпочтительно, дефектные аденовирусы по изобретению содержат ITP, последовательность, контролирующую инкапсидирование и нуклеиновую кислоту по изобретению. Еще лучше, если, по меньшей мере, участок Е 1 генома аденовирусов по изобретению является нефункциональным. Рассматриваемый вирусный ген можно сделать нефункциональным любым известным специалистам способом, в частности, общей супрессией, замещением, частичной делецией или добавлением в один или несколько таких генов одного или нескольких оснований. Такие модификации могут быть получены in vitro (на выделенной ДНК) или in situ,например, методами генной инженерии или обработкой мутагенными агентами. Другие участки также могут быть модифицированы, в частности, это относится к участку Е 3 (WO 31 95/02697), Е 2 (WO 94/28938), Е 4 (WO 94/28152,WO 94/12649, WO 95/02697) и L5 (WO 95/02697). Согласно одному из предпочтительных способов осуществления делеция имеет место в участках Е 1 и Е 4 аденовируса по изобретению. Согласно другому предпочтительному способу осуществления делеция происходит в участке Е 1, на уровне которого встраивают участок Е 4 и последовательность нуклеотидов по изобретению (см. FR 94 13355). В вирусах по изобретению делеция в участке Е 1 предпочтительно распространяется с нуклеотидов 4553329 на последовательность аденовируса Ad5. Дефектные рекомбинантные аденовирусы по изобретению могут быть получены любым известным специалистам способом (Levrero и др., Gene 101 (1991) 195, ЕР 185 573; Graham,EMBO J. 3 (1984) 2917). В частности, они могут быть получены методом гомологичной рекомбинации между аденовирусом и плазмидой, содержащей, в числе прочих, последовательность нуклеотидов или комбинацию последовательностей нуклеотидов по изобретению. Гомологичная рекомбинация происходит после котрансфекции указанных аденовируса и плазмиды в соответствующую линию клеток. Используемая линия клеток должна предпочтительно (i) быть способной к трансформации указанными элементами и (ii) содержать последовательности,которые могут быть комплементарными к части генома дефектного аденовируса, предпочтительно, в интегрированном виде во избежание рекомбинации. В качестве примера линии клеток можно назвать линию клеток почки эмбриона человека 293 (Graham и др., J. Gen. Virol. 36(1977) 59), которая содержит, в частности, интегрированной в геном, левую часть генома аденовируса Ad5 (12%) или линии, способные содержать элементы, комплементарные функциям Е 1 и Е 4, такие, как описано, в частности, в заявкахWO 94/26914 и WO 95/02697 или вYen и др., J. Virol. 70 (1996) 559). Далее размноженные вирусы собирают и очищают обычными методами молекулярной биологии. Среди аденоассоциированных вирусов(ААВ) используют ДНК-содержащие вирусы относительно малых размеров, которые устойчиво и сайт-специфически встраиваются в геномы инфицируемых ими клеток. Они могут инфицировать широкую гамму клеток, не оказывая эффекта на рост, морфологию или дифференцировку клеток. Кроме того, они, повидимому, не участвуют в развитии патологий у человека. Геном ААВ клонировали, секвенировали и охарактеризовывали. Он включает в себя около 4700 оснований и содержит на каждом конце повторяющийся обращенный участок(ITR) размером около 145 оснований, который выполняет функции участка начала репликации вируса. Остальная часть генома подразделяется на два основных участка, выполняющих функ 003694cap, кодирующий протеины капсида вируса. Использование векторов от ААВ для переноса генов in vitro и in vivo было описано в литературе (см. в частности WO 91/18088; WO 93/09239; US 4 797 368, US 5 139941, ЕР 488 528). В этих заявках описаны различные конструкции, полученные на основе ААВ, в которых гены rep и/или cap подверглись делении и были замешены нужным геном, и их применение для переноса in vitro (на культуру клеток) или invivo (непосредственно в организм) указанного нужного гена. Дефектные рекомбинантные ААВ по изобретению могут быть получены котрансфекцией в линии клеток, инфицированной вспомогательным вирусом человека (например,аденовирусом), плазмиды, содержащей последовательность нуклеотидов или комбинацию последовательностей нуклеотидов по изобретению между двумя повторяющимися обращенными участками (ITR) ААВ, и плазмиды, несущей гены инкапсидирования (гены rep и cap) ААВ. Используемой линией клеток может быть,например, линия 293. Другие системы для получения описаны, например, в заявках WO 95/14771; WO 95/13365; WO 95/13392 или WO 95/06743. Полученные рекомбинантные ААВ очищают обычными способами. В отношении вирусов герпеса и ретровирусов, получение рекомбинантных векторов было широко описано в литературе (см., в частности, Breakfield и др., New Biologist 3 (1991) 203; ЕР 453 242, ЕР 178 220, Bernstein и др.,genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 и т.д. В частности, ретровирусы являются интегративными вирусами, избирательно инфицирующими делящиеся клетки. Таким образом, использование этих вирусов в качестве векторов представляет интерес для лечения рака. Геном ретровирусов включает,главным образом, два LTR, одну последовательность инкапсидирования и три кодирующих участка (gag, pol и env). В рекомбинантных векторах - производных ретровирусов гены gag, pol и env обычно подвергаются делеции, полностью или частично, и обычно бывают замещены нужной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Эти векторы могут быть получены на основе различных типов ретровирусов, в частности, MoMuLV (murine Moloneyvirus); RSV (Rous sarcoma virus) или вируса Френда. Для получения рекомбинантных ретровирусов по изобретению, содержащих последовательность нуклеотидов или комбинацию последовательностей нуклеотидов по изобретению, конструируют плазмиду, содержащую, в 33 частности, LTR, последовательность инкапсидирования и указанную последовательность нуклеотидов, затем ее используют в трансфекции т.н. инкапсидирующей линии клеток, способной поставлять в плазмиду, в трансположении, дефектные функциональные вирусные участки. Т.е. инкапсидирующие линии клеток обычно способны к экспрессии генов gag, pol иenv. Такие инкапсидирующие линии описаны в уровне техники, в частности, линия РА 317 (US 4 861 719); линия PsiCRIP (WO 90/02806) и линияGP+envAm-12 (WO 89/07150). Кроме этого, LTR рекомбинантных ретровирусов могут быть модифицированы для подавления транскрипционной активности, а последовательности инкапсидирования могут быть увеличены и содержать часть гена gag (Bender и др., J. Virol. 61 (1987) 1639). Полученные рекомбинантные ретровирусы очищают обычными способами. 10.3. Химические векторы. Нуклеиновые кислоты или плазмидные векторы экспрессии, описанные в предыдущих примерах, могут быть введены в чистом виде invivo или ex vivo. Действительно, было показано,что чистые нуклеиновые кислоты могут проникать в клетки. Однако для повышения эффективности переноса предпочтительно использовать в рамках настоящего изобретения вектор переноса. Это может быть вирусный вектор(пример 9.2.) или синтетический агент трансфекции. Среди разработанных синтетических векторов предпочтение в рамках настоящего изобретения отдают катионным полимерам типа полилизина, (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098), полиэтиленимина (WO 96/02655) и DЕАЕдекстрана, а также катионным липидам или липофектантам. Они способны конденсировать ДНК и способствовать ее соединению с клеточной мембраной. Среди последних можно назвать липополиамины (липофектамин, трансфектам и т.д.), различные катионные или нейтральные липиды (DOTMA,DOGS, DOPE и т.д.), а также пептиды ядра. Кроме того, была разработана концепция трансфекции, согласно которой трансфекция осуществляется при участии рецептора, использующего принцип конденсации ДНК благодаря катионному полимеру и при этом направляющего процесс фиксации комплекса на мембране за счет химического связывания с лигандом мембранного рецептора на поверхности того или иного типа прививаемых клеток. Так было описано распознавание рецепторов трансферина,инсулина или рецепторов азиалогликопротеинов гепатоцитов. Композиция по изобретению, в которой используют такой химический вектор,может быть получена любым известным специалистам способом; обычно ее получают обычным смешиванием различных составляющих. Пример 11. Использование методики изучения транскрипционной активности GAX. 34 Использовали систему транзитной трансфекции для изучения собственной транскрипционной активности протеинов слияния GALDBGAX, а также эффекта, оказываемого ими на активаторы транскрипции, такие как рецептор эстрогенов (ER) или домен кислотной активации протеина VP16 вируса Herpes simplex, слитого с GALDB. Для количественного определения транскрипционной активности каждого из или комбинации нескольких факторов был создан ген-мишень (Репортер), осуществляющий экспрессию бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) под контролем искусственного промотора. Этот промотор содержит бокс ТАТА, взятый из гена Е 1 В аденовирусаAd2 (E1B ТАТА) перед сайтом инициации транскрипции гена CAT (фиг. 4 А). Протеин ТВР комплекса TFIID распознает бокс ТАТА и вставляет комплекс преинициации (TFIID+-TFIIII (PolII), которая затем выступает инициатором транскрипции гена CAT. Перед этим базовым промотором вставили сайт связывания GALDBGALDB-GAX или GALDB-VP16. Также выше 17 мера клонировали элемент ответа на эстрогены (ERE), с которым связывается ER для активации транскрипции. Этот репортер позволяет изучить различные схематичные комбинации,учитывая изменения количества CAT в клетке,которые соответствуют активации или подавлению транскрипции. Количественное измерение ферментной активности CAT в клеточных экстрактах после трансфекции используют при оценке транскрипционного эффекта.ER и GAL4-VP16 представляют собой очень сильные активаторы транскрипции. ER усиливает активность CAT более чем в 100 раз,а GAL4-VP16 - примерно в 85 раз. СоэкспрессияER и GAL4-VP16 приводит к усилению активности CAT в более чем 300 раз по сравнению с активностью неактивированного репортера,причем этот эффект оказывается больше суммы эффектов обоих активаторов по отдельности. Это позволяет прийти к выводу, что ER иGAL4-VP16, несмотря на их большие пространственные размеры, могут присоединяться к одному и тому же промотору и активировать его(фиг. 4 В). Пример 12. Изучение транскрипционной активности протеинов слияния GALDB-GAX и определение домена-репрессора транскрипции. Ген gax кодирует протеин, который у человека имеет размер 302 аминокислоты. В первичной структуре этого протеина различают различные домены, функция которых неизвестна. GAX принадлежит к семейству т.н. гомеобоксовых генов. Гомеобокс необходим для узнавания и связывания этих протеинов с специфическими последовательностями ДНК в промоторах генов-мишеней, экспрессию которых они контролируют. На сегодняшний день ни 35 одна последовательность ДНК, узнаваемая протеином GAX, не была идентифицирована. GAX имеет в N-концевой части участок, богатый остатками гистидина (HIS), функция которого не установлена. Для понимания функции GAX подвергли делеции различные участки гена gax человека,чтобы получить протеины, усеченные как в Nконцевой, так и в С-концевой части, числа показывают позицию первой и последней аминокислоты каждого делеционного мутанта по отношению к целому GAX 1-302 (фиг. 5). В отсутствие сведений о последовательностях ДНК, естественным образом узнаваемых GAX, были созданы химерные конструкции из различных делеционных мутантов и домена связывания с гетерологичной ДНК (слитого с их Nконцевыми частями), полученного от транскрипционного фактора дрожжей(GALDB). Были созданы векторы экспрессии для осуществления транзитной экспрессии различных химер в культуре клеток млекопитающих. Осуществляли экспрессию различных химер GAL-GAX, отдельно или в присутствии ER,для изучения их воздействия, соответственно,на базовую транскрипцию или на транскрипционную активность ER. Цельный GAX в контексте слияния GALGAX 1-302 снижает более чем в 8 раз активность CAT по отношению к неактивированному репортеру. Этот эффект подавления слабо изменяется при отсутствии 32 N-концевых аминокислот GAX (GAL-GAX 33-302), но полностью исчезает при дополнительной делеции Сконцевой части GAX (GAL-GAX 33-222). Присутствия этих 32 аминокислот достаточно в контексте GAL-GAX 1-32, чтобы уменьшить активность CAT (фиг. 6 А). Соэкспрессия GAL-GAX 1-302 и ER приводит к снижению активности CAT более чем в 25 раз по сравнению с активностью, показанной только с ER. Этот эффект подавления связан,как и в А с 32 первыми аминокислотами GAXER только в 2 раза (сравнит. GAL-GAX 1-32,GAL-GAX 1-104) и требуют, по меньшей мере,присутствия остатков 33-222 для максимальной активности (фиг. 6 В). Исследовали последовательности, в отсутствие которых пропадала активность, что позволило прийти к выводу об их необходимости для взаимодействия, но не достаточности. Представленные результаты показывают,что GAX подавляет транскрипцию используемого гена-репортера. Этот эффект подавления связан, главным образом, с N-концевым пептидом (1-32), оптимальная активность которого требует присутствия участка 33-222 протеина 36 Используя различные варианты делецииGAL4, определили в дрожжах (с помощью двойной гибридной системы, пример 5) участкиGAX, имеющие важное значение для взаимодействия с Ki. Таким участком является Nконцевая часть до остатка 222. Этот участок содержит, как было показано выше, доменрепрессор. Пример 13. Взаимодействие in vitro междуCell Nuclear Antigen человека (PCNA) и получение рекомбинантного протеина. Клонирование кДНК PCNA осуществляют с помощью обратной транскрипции и ПЦР. Первый этап обратной транскрипции (RT) осуществляют, используя набор First Strand cDNAsynthesis (Pharmacia). Общую РНК экстрагируют из клеток гладкой мускулатуры человека в первичной культуре (Clonetics) по методу, описанному Р. Chomczynski и N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159). 10 мкг этой общей РНК нагревают в 20 мкл воды в течение 10 мин при 65 С, охлаждают на льду, затем смешивают с 11 мкл Bulk First Strand reaction mix из набора для RT (Cloned, FPLCpure, Murine ReverseTranscriptase, Rnase/Dnase-Free BSA, dATP,dCTP, dGTP and dTTP), 1 мкл DTT и 1 мкл затравки pD(N)6. Реакционную среду RT инкубируют 1 ч при 37 С. Реакцию останавливают нагреванием в течение 5 мин при 90 С, затем среду охлаждают на льду. Второй этап заключается в амплификации в ПЦР кДНК PCNA. Для этой реакции ПЦР используют следующие затравки: Обе затравки несут сайт EcoRI (подчеркнутые строчные буквы). Аминокислоты PCNA,содержащиеся в затравках, отмечены буквенными кодами (заглавные буквы) под соответствующими кодонами.означает стоп-кодонPCNA. 8 мкл реакционной среды RT, описанной выше, доводят до конечного объема 50 мкл с следующими конечными содержаниями или концентрациями: 50 пикомоль затравки 1, 50 пикомоль затравки 2, одна единица Taq ADNполимеразы (Perkin Elmer), 5 мкл МgСl2 (25 мМ), 2 мкл смеси 200 мМ всех 4 дезоксинуклеотидов (дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ) и 5 мкл десятикратно концентрированного буфера ПЦР(Perkin Elmer). Амплификацию в ПЦР проводят в пробирках Micoamp (Perkin Elmer) при помощи термоциклера РТС-100 (MJ Research, Inc.). Эта амплификация состоит из этапа денатурации при 95 С в течение 2 мин и 30 циклов, вклю 37 чающих этап денатурации продолжительностью 15 с при 95 С, этап гибридизации продолжительностью 30 с при 55 С и этап удлинения цепи продолжительностью 1 мин при 72 С. За этими тридцатью циклами следует дополнительный этап удлинения цепи продолжительностью 5 мин, затем продукт реакции ПЦР консервируют при 10 С. Клонирование PCNA в векторе PCRII (Invitrogen) осуществляют, используя Original ТАCloning Kit (Invitrogen). 3 мкл продукта ПЦР,1 мкл буфера сшивания 10 Х, 2 мкл вектораPCRII (25 нг/мкл), 3 мкл воды и 1 мкл Т 4 ДНКлигазы инкубируют при 16 С в течение 16 ч. 2 мл этой среды сшивания используют для трансформации вышеописанных компетентных бактерий TG1. Затем бактерии культивируют при 37 С в течение 16 ч на твердой среде LB,содержащей 1,5% агара, 100 мкг/мл ампициллина в присутствии X-gа 1 для селекции по цвету рекомбинантных клонов (альфа-комплементация -галактозидазы). Рекомбинантные клоны (белые колонии) помещают в 10 мкл воды и подвергают обработке в условиях, идентичных вышеописанным условиям ПЦР, за исключением того, что к среде добавляют Triton Х-100 в конечной концентрации 0,01% об./об. Несколько положительных клонов используют для получения небольших количеств ДНК,в которых часть 5' вставочного фрагментаPCNA находится после сайта EcoRV pCRII и которые секвенируют и оставляют для использования на этапе последующего клонирования. Клонирование PCNA в плазмиде рЕТ 29 осуществляют следующим образом: фрагментPCNA EcoRV-HindIII, полученный из PCRIIPCNA, встраивают на уровне сайта EcoRVHindIII рЕТ 29. Эту плазмиду потом используют для получения химерного рекомбинантного протеина S-PCNA. Этапы трансформации, получения и очистки S-PCNA идентичны этапам получения антигена Ki, слитого с эпитопом mуc. 13.2. Изучение взаимодействия in vitroGAX с PCNA. Исследование проводят по методу, использованному в примере 9 для изучения взаимодействия рекомбинантных протеинов GST-GAX иSmycKi. Возрастающие количества рекомбинантного GST и химеры GST-GAX (50, 250, 500 и 750 нг) разделяют на 14% полиакриламидном денатурирующем геле (Novex). Протеины переносят с геля на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем инкубируют в растворе, содержащем рекомбинантный протеин S-PCNA, после чего проводят мечение PCNA с помощью моноклональных антител к PCNA (Santa Cruz). На фиг. 7 показано слабое взаимодействиеGST с PCNA исключительно при высоких дозах 38 Это специфичное взаимодействие GAX иPCNA позволяет предположить, что антипролиферативная активность GAX опосредована захватом PCNA. Тот факт, что Ki может взаимодействовать одновременно с GAX и с PCNA говорит в пользу образования двух- или трехчастных комплексов, которые могут играть важную роль (активация или ингибирование) в развитии клеточного цикла. Описание последовательностей 1) Общая информацияii) Название изобретения: Полипептиды,содержащие домены протеина, участвующего в подавлении транскрипции и/или взаимодействующего с протеинами, соответствующие нуклеиновые кислоты и их применение. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Полипептид, отличающийся тем, что он представляет собой фрагмент протеина GAX(Growth-Arrest-Specific Homeobox) человека,содержащий, по меньшей мере, остатки 1-32 протеина GAX и обладающий репрессорной активностью в отношении транскрипции и/или оказывающий положительное или отрицательное влияние на репликацию ДНК. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем,что он дополнительно содержит остатки 140-230 протеина GAX человека. 3. Полипептид, отличающийся тем, что содержит, по меньшей мере, один фрагмент, выбранный из фрагментов 1-32, 33-302 и 1-104 протеина GAX человека и обладающий репрессорной активностью в отношении транскрипции и/или оказывающий положительное или отрицательное влияние на репликацию ДНК. 4. Полипетид, отличающийся тем, что он содержит, по меньшей мере, один фрагмент,выбранный из фрагментов 1-32 и 104-223 протеина GAX и способный взаимодействовать с протеином Ki. 5. Полипептид по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что он способен взаимодействовать с PCNA. 6. Полипептид по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что он способен взаимодействовать с Ki и/или PCNA и образовывать, по меньшей мере, двухчастный или, по меньшей мере,трехчастный комплекс с этими протеинами. 7. Полипетид, отличающийся тем, что кроме фрагмента протеина GAX, обладающего репрессорной активностью в отношении транскрипции, он дополнительно содержит, по меньшей мере, один фрагмент другого происхождения. 8. Полипептид по п.7, отличающийся тем,что фрагмент другого происхождения обладает биологической активностью и является маркером или элементом для определения мишени. 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по одному из пп.1, 2, 5 или 6. 10. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по одному из пп.3, 5 или 6. 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по одному из пп.4-6. 12. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.7. 13. Нуклеиновая кислота по одному из пп.9-12, отличающаяся тем, что она представляет собой кДНК. 14. Кассета экспрессии, включающая в себя нуклеиновую кислоту по одному из пп.9-13 под контролем промотора. 41 15. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по одному из пп.9-13 или кассету экспрессии по п.14. 16. Вектор по п.15, отличающийся тем, что он является вирусным вектором. 17. Вектор по п.16, отличающийся тем, что он представляет собой аденовирус. 18. Вектор по п.16, отличающийся тем, что он представляет собой ретровирус. 19. Применение полипептида по одному из пп.1-7 для подавления транскрипции генов и/или оказания положительного или отрицательного влияния на репликацию ДНК. 20. Применение полипептида по одному из пп.1-7 для получения двух- или трехчастного комплекса с протеинами Ki и/или PCNA и ока 003694 42 зания положительного или отрицательного влияния на развитие клеточного цикла. 21. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, один полипептид по одному из пп.1-7. 22. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит вектор по одному из пп.15-18. 23. Способ просеивания и/или определения полипептидов, взаимодействующих с протеином GAX или одним из доменов GAX, отличающийся тем, что используют полипептид по одному из пп.1-7. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что полипептид выбирают из фрагментов 1-32 и 33302 протеина GAX.