Клеточная везикула, называемая “текзосома”, ее получение и применение для стимуляции иммунного ответа

1 Предметом изобретения является новый способ сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, новые средства для осуществления способа и новые мембранные везикулы, обладающие иммуногенными свойствами. С момента доказательства существования цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+, специфических к опухолевым антигенам, имеющихся в рамках молекул класса I (Rosenberg и др.,1996; Boon, 1992), несколько лабораторий смогли показать, что противоопухолевая иммунотерапия представляет собой эффективную стратегию лечения в случае используемых в качестве моделей животных (Pardoll, 1995). Принципом иммунотерапии является стимуляция эффективного иммунного ответа против специфических опухолевых антигенов. В настоящее время это может быть осуществлено различными способами. Прежде всего, опухолевые клетки, экспрессирующие рекомбинантные костимулирующие молекулы, и/или иммуномодуляторные цитокины, способны стимулировать противоопухолевые ответы, которые могут уничтожать[а]). Точно так же происходящие от опухолевых антигенов (или экзогенных антигенов, экспрессия которых осуществляется в опухолевых клетках) пептиды, инъецируемые в различных химических формах, включая использование липосом или вирусов (как, например, аденовирус или поксвирус) в качестве векторов, способны вызывать регрессию опухолей. Наконец,антигенпредставляющие специализированные клетки, как дендритные клетки, сенсибилизированные с помощью пептидов, происходящих от опухолевых антигенов, реинъецированные invivo, индуцируют эффективные противоопухолевые ответы, а также регрессию твердых опухолей, как установлено в случае мыши (Mayordomo и др., 1995). Иммунотерапия, основанная на использовании дендритных клеток, оказалась эффективной при исследованиях, проводимых на мыши. В связи с этим, эту терапию недавно перенесли для применения в клинике. В США в настоящее время проводятся испытания, чтобы показать,что дендритные клетки, содержащие опухолевые пептиды, значительно увеличивают частоту специфических цитотоксических Т-клеток(CTL). Первым ограничением этого подхода является сенсибилизация дендритных клеток пептидами, происходящими от опухолевых антигенов. В самом деле, в случае большинства опухолей, специфические антигены не идентифицированы. Специфические опухолевые антигены известны только в случаях опухолей, индуцированных вирусами (рак шейки матки), в случаях меланомы (антигены сами по себе, мутированные антигены, дифференцировочные антигены) или в небольшом проценте опухолей молочной железы (онкогены, или продукты ген 004300 2 супрессоров опухоли, которые были подвергнуты мутациям). Однако остается показать прямое вовлечение этих пептидов или опухолевых антигенов в процесс удаления опухолей у человека. Следовательно, оказываются необходимыми новые методы сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, таких как дендритные клетки. Целью этих методов является индуцирование специфических противоопухолевых ответов в отношении молекул класса I и класса(СМН). В случае большинства методов сенсибилизации дендритных клеток, применяемых в настоящее время, используют пептиды, соответствующие эпигонам, находящимся в ассоциации с молекулами класса I, и идентифицированные в опухолевых клетках благодаря клонам специфических клеток CTL опухоли. Однако эти методы, очевидно, не являются оптимальными, так как они не учитывают эпитопов, известных в рамках молекул класса II, которые являются определяющими для пролиферации вспомогательных Т-лимфоцитов, необходимых для получения оптимальных цитотоксических ответов. Более того, представляемые опухолевыми клетками эпитопы и представляемые антигенпредставляющими клетками (как, например,дендритные клетки) эпитопы, вероятно, не являются одними и теми же. Наконец, опухолевые пептиды, распознаваемые специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, имеются только у небольшого процента пациентов, обладающих молекулами класса I соответствующего гаплотипа. Идеальный метод сенсибилизации, который может быть применен к любой опухоли с минимальным риском иммуноселекции, не должен быть ограничен небольшим количеством идентифицированных опухолевых антигенов. Также в таком методе должны использоваться скорее интактные протеиновые антигены, чем пептиды, чтобы дендритная клетка могла их продуцировать и представлять адекватную комбинацию пептидов в ассоциации с молекулами класса I и класса II, и это для любого индивидуума. Недавно Gilboa и др. (Boczkowsky и др.,1996) смогли показать, что информационные РНК, полученные из биопсий опухолей, помещенные в дендритные клетки, могут оказывать противоопухолевое действие in vivo. Однако РНК очень нестабильны и потенциально представляющее интерес количество РНК, по сравнению с полной РНК, очевидно, очень незначительное. Zitvogel и др. (Zitvogel и др., 1996 [b]) показали, что опухолевые пептиды, полученные из кислотного элюата опухолей (кислотный пептидный элюат: ЕРА), могут быть использованы для введения в дендритные клетки. Эти таким образом нагруженные клетки, инъецированные 1 раз, обладают способностью вызывать 3 регрессию опухолей. Однако в случае опухолей,не экспрессирующих молекулы класса I (которые представляют собой большинство метастатических опухолей у человека), или в случае опухолей, которые не могут быть диссоциированы в виде клеточной суспензии, подход, при котором используют кислотные элюаты, не очень эффективен и не воспроизводим. Второе ограничение иммунотерапии, основанной на использовании дендритных клеток,связано с фенотипическими изменениями, которые могут происходить, когда эти клетки сохраняются в виде культуры или подвергаются различным обработкам. В самом деле, это может приводить к мало однородным и недостаточно охарактеризованным для терапевтического использования клеточным популяциям. Следовательно, существует реальная необходимость усовершенствования методов сенсибилизации антигенпредставляющих клеток,чтобы повышать эффективность этих подходов и расширять сферу их применения, так же, как разработки новых способов векторизации антигенов или других молекул. Настоящее изобретение относится к решениям этих проблем. В самом деле, предметом изобретения является разработка новых методов сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, в частности, дендритных клеток, а также идентификация, выделение и характеризация новых мембранных везикул, обладающих замечательными иммуногенными свойствами. Один из аспектов изобретения более конкретно относится к новому воспроизводимому способу сенсибилизации антигенпредставляющих клеток с помощью опухолевых антигенов. Один из других аспектов изобретения относится к новому воспроизводимому способу сенсибилизации антигенпредставляющих клеток с помощью опухолевых антигенов, в случае которого нет необходимости в том, чтобы опухолевые антигены были известны. Следующий из других аспектов изобретения относится к средствам, позволяющим составлять банк опухолевых антигенов. Другой аспект изобретения относится к липидным мембранным везикулам, продуцируемым опухолевыми клетками или дендритными клетками и обладающим иммуногенными свойствами, а также к их применению для получения банков антигенов, сенсибилизации антигенпредставляющих клеток или векторизации антигенов, в частности, в рамках иммунотерапевтических подходов. В этом отношении, первый предмет изобретения относится к везикуле, происходящей от опухолевых клеток и обладающей следующими характеристиками: она освобождена от своего естественного окружения; 4 она включает двойной липидный слой (называемый "поверхность"), который окружает цитозольную часть; и, в известных случаях,она имеет на своей поверхности молекулы класса I главного комплекса гистосовместимости (СМН) и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН), в известных случаях, содержащие антигенные пептиды и/или адгезивные молекулы, и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции, и/или она содержит в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы и/или иммуномодуляторы, и/или хемоатрактанты, и/или гормоны, и/или нуклеиновые кислоты. Секреция везикул клетками представляет собой явление, описанное в уровне техники (ретикулоциты, В-лимфоциты, макрофаги). Эти везикулы обычно обозначают родовым понятием "экзосома", которое отражает механизм их продуцирования путем экзоцитоза внутренних везикул. Однако физиологическая роль этих везикул реально не установлена. Более того,структурные характеристики, свойства и функции этих везикул находятся в зависимости от типа клеток, от которых они происходят. В настоящее время изобретатели неожиданно выявили, что опухолевые клетки способны секретировать везикулы, обладающие особенно интересными иммуногенными свойствами. Эти везикулы обычно соответствуют внутренней везикуле, содержащейся в эндосоме опухолевой клетки и выделяемой вышеуказанной опухолевой клеткой вследствие слияния наружной мембраны вышеуказанной эндосомы с цитоплазматической мембраной вышеуказанной опухолевой клетки. В соответствии с этим механизмом образования, их клеточным происхождением и их характеристиками и оригинальными функциональными свойствами, эти везикулы в дальнейшем обозначаются термином"текзосома". Выражение "освобожденная от своего естественного окружения" означает, что везикула физически отделена от клетки, из которой она происходит, или еще, что она частично выделена или очищена. Следовательно, везикула продуцируется клеткой за счет экзоцитоза, затем ее частично выделяют или очищают, чтобы получить обогащенную композицию. Это выражение также может означать, что везикула не только выделяется клеткой во время слияния мультивезикулярных эндосом с плазматической мембраной, но и то, что она более не окружена растворимыми компонентами, которые находятся в просвете эндосомы, или что она лишена интактных клеток. Выражение "происходящая от опухолевой клетки" означает, что везикула обладает структурными элементами опухолевой клетки. Эта везикула обычно является "производным" ("происходящей от") опухолевой клетки в том смысле, что она продуцируется, по крайней 5 мере частично, затем высвобождается опухолевой клеткой на данной стадии ее развития. Согласно предпочтительному варианту осуществления текзосомы согласно изобретению включают молекулы СМН, содержащие антигенные пептиды, и/или экспрессируют адгезивные молекулы и/или экспрессируют молекулы лимфоцитарной костимуляции, но лишены в своей цитозольной части антигенных опухолевых молекул и иммуномодуляторов и нуклеиновых кислот. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления текзосомы согласно изобретению являются такими, что молекулы СМН являются "порожними", т.е. не содержащими антигенных пептидов, и текзосомы включают в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы, иммуномодуляторы и/или нуклеиновые кислоты. Текзосомы, содержащие"порожние" молекулы СМН, могут быть получены либо из опухолевых клеток, в которых наблюдается, например, дефицит переносчика пептидов (ТАР), либо путем промывки текзосом или опухолевых клеток, чтобы элюировать пептиды, связанные с молекулами СМН. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения текзосомы согласно изобретению являются такими, что молекулы СМН содержат антигенные пептиды и/или экспрессируют адгезивные молекулы и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции, и текзосомы содержат в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы, иммуномодуляторы и/или нуклеиновые кислоты. Термин "опухолевые клетки" включает вообще любую клетку, происходящую от опухоли,например, твердой или жидкой опухоли, а также клетки, трансформированные или иммортализованные in vitro. Речь идет предпочтительно о твердой, асцитной или гематопоэтической опухоли. В качестве примера можно назвать клетки рака типа злокачественной меланомы (происходящие от первичных линий, полученных "exvivo", или же от диссоциированных клеток,происходящих из операционного препарата),которые экспрессируют на своей поверхности пептиды, такие как MART-1/Melan-А, в рамках СМИ-класс I/HLA-A 02-01 и содержат протеиновый антиген MART-1. Можно также назвать клетки, происходящие от рака почки (аденокарцинома с "прозрачными клетками") или лейкемии, клетки которых экспрессируют специфические продукты транслокации. Таким образом, антигенные пептиды, способные связываться с молекулами СМН, происходят, например, от следующих антигенов: антигены, происходящие от меланом, такие как MART-1, тирозиназа, MAGE-1/2/3, P53 6 указаны, например, в статье Rosenberg (Immunology Today, 18, 175 [1997]), включенной в настоящее описание в виде ссылки. Вообще можно назвать продукты слияния/транслокации онкогенов или антионкогенов или же дифференцировочные антигены или пептиды сами по себе или мутантные пептиды. Молекулами лимфоцитарной костимуляции называют, например, молекулы, которые придают Т-лимфоцитам сигналы, комплементарные сигналам, вызываемым во время взаимодействия комплексов молекула класса I и II пептид с рецептором Т-клеток. В качестве примера можно назвать CD80,CD86, ICAM, LFA, CD40, некоторые члены семейства TNF R и адгезивные или хемоатрактантные молекулы (позволяющие осуществлять контакт между специализированной антигенпредставляющей клеткой и эффекторными лимфоцитами, или специфическую внутриклеточную транспортировку/локализацию ("направленную миграцию/хоминг") других клеток в место прививки или воспаления). Антигенные опухолевые молекулы, содержащиеся в цитозоле или представляемые текзосомами, происходят от протеинов, экспрессируемых селективно и/или массово опухолевыми клетками. Иммуномодуляторы, которые могут присутствовать в цитозоле текзосом, представляют собой, например, следующие:C-CR (хемокины). Нуклеиновые кислоты, которые могут находиться в цитозоле текзосом, происходят от той же самой опухолевой клетки. Эти нуклеиновые кислоты находятся в цитозоле текзосом в прямом соответствии с их механизмом образования. Это могут также быть гетерологичные нуклеиновые кислоты. Более конкретными характеристиками текзосом согласно изобретению являются следующие: они представляют собой маленькие мембранные везикулы диаметром около 60-100 нм,чаще всего около 60-90 нм, в частности 60-80 нм, выделяемые опухолевыми клетками; они содержат молекулы, обычно присутствующие в эндосомах; они содержат опухолевые антигены, как,например, MART-1, в случае клеток меланомы; они лишены погибших клеток и/или клеточных остатков; они лишены загрязнений, таких как мембранные загрязнения, эндоплазматический ретикулюм, аппарат Гольджи, митохондрии или составляющие ядер; в своей мембране они содержат функциональные молекулы класса I/II, связанные с антигенными опухолевыми пептидами; 7 они могут стимулировать in vitro пролиферацию специфических Т-лимфоцитов; они могут сенсибилизировать in vivo и invitro дендритные клетки, способные затем активировать специфические к опухоли Т-клетки; они обладают способностью, когда они инокулированы in vivo, в частности, внутрикожно, вызывать регрессию развившихся твердых опухолей; они содержат молекулы лимфоцитарной костимуляции, такие как CD40 и CD80, и/или они содержат протеин ("heat-shock")HSP70; они лишены протеина gр 96; они содержат интерлейкины или хемоатрактанты или иммуномодуляторы. Другой интересной характеристикой текзосом является то, что они содержат фосфатидилсерин в своем наружном слое. Фосфатидилсерин (PS) представляет собой один из основных компонентов клеточных мембран, обычно присутствующий в очень большом количестве во внутреннем слое двойных липидных слоев. В некоторых условиях, как ранние этапы апоптоза, фосфатидилсерин перераспределяется по направлению к наружному слою. Наличие фосфатидилсерина в наружном слое цитоплазматической мембраны апоптотических клеток создает сигнал распознавания макрофагами. Для того чтобы определить, имеется ли фосфатидилсерин на поверхности текзосом, очищенные препараты экзосом из супернатантов клеток меланомы человека FON были проанализированы методом, описанным Aupeix и др. (J. Clin. Invest., 99,1546-1554 [1997]). Содержание фосфатидилсерина в наружном слое образцов FON (содержащих 390 мкг/мл протеинов), составляет 460 нмоль фосфатидилсерина. Экзосомы содержат,следовательно, значительные количества фосфатидилсерина в своем наружном слое. Тесты, позволяющие подтвердить, что текзосомы согласно изобретению содержат молекулы, обычно присутствующие в эндосомах,состоят в электронной микроскопии и иммуноимпритинге (вестерн-блоттинге). Эти тесты позволяют показать, что текзосомы согласно изобретению экспрессируют рецептор трансферина, молекулы LAMP ("lizosome associated membrane protein": мембранный протеин, ассоциированный с лизосомой), молекулы класса I/II, опухолевые антигены. Тест, позволяющий подтвердить, что текзосомы согласно изобретению лишены загрязнений, представляет собой электронную микроскопию и иммуноимпритинг с антителами к кальнексину, который находится в эндоплазматическом ретикулюме. Тест, позволяющий подтвердить, что текзосомы содержат в своей мембране функциональные молекулы класса I/II, связанные антигенными опухолевыми пептидами, состоит в антигенной презентации Т-лимфоцитам, специ 004300 8 фическим к антигенам соответствующей опухоли (тесты пролиферции Т-специфических клонов антигенов и молекул СМН класса I). Можно также использовать тест на секрецию цитокинов (IFN/GM-CSF, TNF) вышеуказанными Т-клонами. Тест, позволяющий подтвердить, что имеет место сенсибилизация in vivo и in vitro дендритных клеток, способных активировать специфические к опухоли Т-клетки, представлен на фиг. 7 (тест пролиферации и/или выделения цитокинов Т-специфическими клонами антигенов по методу перекрестной сенсибилизацииMART-1-, HLA-A2+). Тест, позволяющий подтвердить, что текзосомы обладают способностью, когда они инокулированы, в частности, внутрикожно, вызывать регрессию развившихся твердых опухолей,представлен на фиг. 6. В качестве примера осуществляют инъекцию 10-40 мкг текзосом опухоли внутрикожно с гомолатеральной стороны развившейся опухоли, начиная с 3-10 дней; наблюдают животное,являющееся носителем опухоли, и постепенное исчезновение развившейся опухоли за 7-10 дней(у грызунов типа мышей). Предпочтительная текзосома согласно изобретению представляет собой текзосому,такую как описанная выше, и имеющую на своей поверхности молекулы класса I и/или классаII СМН, в известных случаях связанную с антигенными пептидами и содержащую в своей цитозольной части антигенные опухолевые молекулы. Более конкретно предпочтительная текзосома включает также одну или несколько молекул лимфоцитарной костимуляции и/или протеин HSP70. В особом варианте осуществления текзосома лишена протеина gр 96. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к текзосоме, такой как описанная выше, экспрессирующей на своей поверхности молекулы классаI и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН) и/или характерные опухолевые антигены, и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции/адгезивные молекулы, и/или иммуномодуляторы, и/или хемоатрактанты, экзогенные по отношению к опухолевой клетке, от которой происходит экзосома, или содержащей опухолевые антигены, и/или иммуномодуляторы, и/или нуклеиновые кислоты или цитотоксические агенты, или гормоны, экзогенные по отношению к опухолевой клетке, от которой происходит экзосома. Изобретение также относится к способу получения текзосом, таких как указанные выше. Этот способ предпочтительно включает стадию получения биологического образца и стадию выделения текзосом из вышеуказанного образца. 9 Биологически образец предпочтительно образован мембранными фракциями, культуральными супернатантами или лизатами опухолевых клеток или же свежеприготовленными опухолевыми суспензиями. Биологический образец может происходить из операционных опухолевых препаратов после хирургической эксцизии (первый случай) или же из органов, несущих опухоль (удаленный хирургическим путем орган) (второй случай), которые подвергают обработке путем механического диссоциирования (первый случай) или путем замедленной перфузии (второй случай). Конечную клеточную суспензию обрабатывают таким же образом, как культуральные супернатанты. Речь может также идти о клетках, обработанных путем нескольких последовательных циклов замораживание/размораживание. Согласно предпочтительному варианту осуществления используемым в способе согласно изобретению биологическим образцом является образец эфферентной крови из вены изолированного опухолевого органа, или образец сыворотки или плазмы крови, циркулирующей в организме пациента, или продукт дренажа (физиологическая сыворотка, содержащая, в случае необходимости, дексаметазон, или цитотоксический агент, стимулирующий экзоцитоз текзосом) удаленного хирургическим путем органа и обработанный ex vivo путем цикла выделение/перфузия для дренажа опухоли, которая его содержит, или супернатант диссоциированногоin vitro опухолевого эксплантата. Образец эфферентной крови из изолированного опухолевого органа соответствует 20-50 мл эфферентной крови из главной вены опухолевого органа, отобранной до хирургического вмешательства. Продукт дренажа удаленного хирургическим путем органа и обработанный ех vivo путем цикла выделение/перфузия получают следующим образом. В случае органа, имеющего приносящую(афферентную) артерию и выносящую (эфферентную) вену, артерию катетеризуют с помощью пластмассовой трубки, соединенной с наклоненным вперед резервуаром, содержащим физиологическую сыворотку, в случае необходимости, с другими агентами. Орган подвергают дренажу и жидкость выводят по другой наклонной трубке, катетеризующей вену (например, в случае рака почки или церебральной глиобластомы). Целью дексаметазона, содержащегося в известных случаях в продукте дренажа, является повышение клеточного стресса и экзоцитоза текзосом вне опухолевой клетки. Супернатант диссоциированного in vitro опухолевого эксплантата получают следующим образом: осуществляют механическую диссо 004300 10 циацию опухоли, приводящую к образованию одноклеточной суспензии, содержащей опухолевые клетки, клетки опухолевой стромы и клетки иммунной системы, где эта суспензия может быть облучена и рекуперирована путем дифференциальных центрифугирований. Как указано выше, в особом варианте осуществления способа согласно изобретению биологический образец может быть обработан с помощью одного или нескольких агентов, стимулирующих продукцию текзосом. Эта обработка может включать добавление стероидных агентов (как, например, дексаметазон), фармакологических агентов (как, например, цитотоксические агенты, такие как таксаны, цисплатин и т.д.), агентов, способных увеличивать количество мультивезикулярных эндосом, и/или быть осуществлена путем облучения образца. Что касается облучения, оно должно быть достаточным, чтобы спровоцировать цитостатическую активность в отношении опухолевых клеток. Облучение опухолевых клеток может быть проведено до культивирования клеток или во время или после культивирования опухолевых клеток. Кроме того, облучать следует тогда,когда опухолевые клетки являются живыми, т.е. либо в случае удаленного органа, являющегося носителем опухоли, до перфузии, либо в случае культуры клеток, либо в случае механически диссоциированной клеточной суспензии; но во всех случаях до нарушения состояния ("страдания") опухолевых клеток вследствие гипоксии и/или некроза сосудов и/или дегидратации. Что касается обработки с помощью стероидов, она позволяет провоцировать клеточную активацию, приводящую к экзоцитозу текзосом. Что касается обработки с помощью фармакологических агентов, она позволяет модифицировать цитоскелет и реаранжировать внутриклеточные пространства для дерегуляции процессов интернализации и экзоцитоза; деполимеризовать микротрубочки. Что касается обработки с помощью агента,способного повышать количество мультивезикулярных эндосом, ее осуществляют во время культивирования клеток; в качестве агента можно назвать нокодазол (средство, позволяющее деполимеризовать микротрубочки), бафилюмицин (средство, ингибирующее вакуолярные аденозинтрифосфатазы) ("Bafilomycins: ANatl. Acad. Sci. USA, 85, 7972-7976 [1988]). Предпочтительный способ получения текзосом согласно изобретению осуществляют а) либо исходя из культур опухолевых клеток, и он включает- облучение с интенсивностью, достаточной, чтобы спровоцировать цитостатическую активность в отношении опухолевых клеток, и не превышающей 15000 рад, предпочтительно 11 примерно 1000 рад, опухолевых клеток до, во время или после их культивирования; или- обработку во время культивирования,опухолевых клеток с помощью стероидов, как,например, дексаметазон, или цитотоксических агентов, как, например, 5-фторурацил (5-Fu) или цисплатин, доцетаксел, антрациклин, митотический яд, антипиримидин, или с помощью интерлейкина, как, например, IL-10, IL-2, IL-15, GMCSF, или- обработку с помощью агента, способного повышать количество мультивезикулярных эндосом, как, например, нокодазол, (J. Gruenberg и др. "Characterization of the Early Endosome andCell Biology, 108, 1301-1316 [1989]) и, следовательно, увеличивать продукцию текзосом; б) либо исходя из образца физиологической сыворотки, отобранного путем дренажа удаленного хирургическим путем органа и обработки ех vivo с помощью цикла выделение/перфузия для дренажа опухоли, которая ее содержит; в) либо исходя из супернатанта опухолевого эксплантата, диссоциированного in vitro, и он включает обработку с помощью стероидов, как,например, дексаметазон, или цитотоксических агентов, как, например, 5-фторурацил (5-Fu),цисплатин, таксаны, или интерлейкина, как,например, IL-10, IL-2, GM-CSF. Стадия выделения текзосом может быть реализована различными способами, такими как центрифугирование, хроматография, электрофорез, нанофильграция, и т.д. Это может быть,например, дифференциальное центрифугирование мембранных фракций культуральных супернатантов или лизатов опухолевых клеток или свежеприготовленных опухолевых суспензий с рекуперацией фракции или фракций, содержащих вышеуказанные экзосомы (Raposo и др., J. Exp. Med., 183, 1161-1172 [1996]). В этом особом варианте осуществления мембранная фракция супернатантов представляет собой таковую, получаемую после центрифугирования при ускорении 100000 g. Речь может идти предпочтительно об электрофорезе в жидкой фазе,который позволяет осуществлять разделение биологических материалов по их заряду. В нижеследующих примерах показано, что этот способ предпочтительно может быть использован для выделения текзосом с хорошими выходами. Этот способ, кроме того, особенно предпочтителен в промышленном плане. Предметом изобретения также является способ получения текзосом, таких как указанные выше, кроме того, включающий либо генетическую модификацию опухолевых клеток с помощью экзогенных генов, кодирующих молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости 12 опухолевые антигены, и/или генов, кодирующих костимулирующие и/или адгезивные молекулы или хемокины-атрактанты, причем продукты этих экзогенных генов могут быть экспрессированы на поверхности текзосом и/или могут быть секвестрированы внутри текзосом; либо модификацию in vitro текзосом, продуцированных опухолевыми клетками, такую как введение (путем электропорации, путем слияния с синтетической липосомой, с помощью рекомбинантного вируса или химическим методом) протеинов или нуклеиновых кислот или фармацевтически определенных лекарственных средств в текзосомы и/или с текзосомами. Изобретение также относится к текзосомам, которые могут быть получены согласно вышеуказанному способу. Текзосомы опухолевых клеток, трансфицированные, как указано выше, получают и используют в качестве опухолевых вакцин. Текзосомы, модифицированные in vitro,как указано выше, предназначены для доставки экзогенного материала в клетку-мишень in vitro и in vivo. Что касается слияния с синтетической липосомой, этот способ осуществляют, например,как указано у Nabel и др. (1996) или у Walker и др. (Nature, 387, с. 61 и последующие [1997]). Изобретение относится также к антигенпредставляющим клеткам, в частности Влимфоцитам, макрофагам, моноцитам или дендритным клеткам, нагруженным вышеуказанными текзосомами. Предпочтительно это дендритные клетки. Дендритные клетки согласно изобретению имеют, в частности, следующие характеристики: в случае моделей опухолей, которые не экспрессируют молекулы класса I и которые, следовательно, не обладают способностью стимулировать Т-клетки CD8+, дендритные клетки,связанные с текзосомами опухолевых клеток,могут представлять эти опухолевые пептиды цитотоксическим Т-клеткам в рамках молекул класса I главного комплекса гистосовместимости (характеристика 1); связанные с текзосомами опухолевых клеток дендритные клетки,инъецированные внутривенно или подкожно,также являются очень эффективными (характеристика 2). Тест, позволяющий выявить характеристику 1, является следующим. В системе организма человека негативная текзосома класса I, инкубированная в присутствии позитивной дендритной клетки класса I,может вызывать стимуляцию антигенспецифических клонов CD8+T, содержащихся в текзосоме (см. фиг. 7). Тест, позволяющий выявить характеристику 2, является следующим. В системе организма мыши, где опухоль классифицирована как негативная I и где текзо 13 сомы сами также лишены молекул класса I, эти текзосомы, когда они инкубированы и связаны с дендритными клетками, могут медиировать противоопухолевый иммунный ответ, тогда как сами по себе одни, при внутрикожной инъекции, они не способны это делать. Изобретение также относится к способу получения антигенпредставляющих клеток, таких как указанные выше, включающему стадии инкубации антигенпредставляющих клеток в присутствии текзосом, таких как указанные выше, и стадию рекуперации вышеуказанных антигенпредставляющих клеток, связанных с вышеуказанными текзосомами. Изобретение также относится к представляющим клеткам, связанным с текзосомами и которые могут быть получены согласно вышеуказанному способу. Предметом изобретения является также применение текзосом, таких как указанные выше, для сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, в частности, В-лимфоцитов, макрофагов, моноцитов или дендритных клеток,или для стимуляции специфических Тлимфоцитов. Использование методов хроматографии и/или электрофореза и/или нанофильтрации составляет другой важный аспект настоящего изобретения, так как по сравнению с обычными методами можно достигать получения продукта улучшенного качества в количествах, адаптированных для промышленного (в частности, фармакологического) использования. В этом отношении изобретение также относится к способу получения мембранных везикул, включающему, по крайней мере, стадию разделения путем электрофореза, хроматографии или нанофильтрации. Более конкретно, этот способ адаптирован к получению мембранных везикул экзосомного типа, таких как текзосомы. В этом способе стадия разделения путем электрофореза или хроматографии может быть реализована непосредственно при использовании культурального супернатанта, клеточного лизата или предварительно очищенного препарата. Электрофорез более предпочтительно представляет собой электрофорез в жидкой фазе. Предметом изобретения также является применение текзосом, таких как указанные выше, или антигенпредставляющих клеток, таких как указанные выше. Для стимуляции и, в случае необходимости, амплификации in vitro антигенспецифических Т-лимфоцитов, содержащихся в вышеуказанных текзосомах или антигенпредставляющих клетках или В-лимфоцитов, и, в частности, для стимуляции и амплификации in vitro Тлимфоцитов. Изобретение относится также к применению текзосом, таких как указанные выше, или антигенпредставляющих клеток, таких как указанные выше, для отбора ex vivo набора Т 004300 14 лимфоцитов, способных распознавать специфические антигены, содержащиеся в вышеуказанных текзосомах или антигенпредставляющих клетках. Предметом изобретения также является лекарственное средство, содержащее в качестве действующего начала по крайней мере одну текзосому, такую как указанная выше, и/или антигенпредставляющую клетку, такую как указанная выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Изобретение предпочтительно относится к лекарственному средству, такому как указанное выше, для использования при лечении онкологических заболеваний, инфекционных заболеваний или паразитарных заболеваний. Более предпочтительно лекарственное средство включает текзосомы, такие как указанные выше. Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к лекарственному средству, такому как указанное выше, для применения: в целях лечения патологии типа аллергии, астмы или аутоиммунного заболевания. В качестве соответствующей галеновой формы, текзосомы или декзосомы могут содержаться в физиологической сыворотке, в ампуле или любом другом соответствующем средстве(шприц, резервуар и т.д.). Они могут быть приготовлены экстемпорально или храниться, например, в замороженном состоянии при температуре -80 С. Используемые растворы могут представлять собой солевые растворы, в случае необходимости, дополненные стабилизаторами и/или добавками. Стабилизаторами могут быть,в частности, протеины или молекулы с высокой молекулярной массой. Более конкретно можно назвать протеины, такие, как человеческий сывороточный альбумин, или молекулы, такие как,например, декстран или полоксамер. Композиции согласно изобретению могут также включать или быть использованными в ассоциации с одной или несколькими добавками. Более конкретно, добавка может представлять собой любой фармакологический иммуностимулирующий агент, такой как, например,цитокин (в частности, интерлейкин-12). Такие агенты обычно используют согласно клиническим протоколам лечения или в составах вакцин. Кроме того, добавка согласно изобретению также может представлять собой агент, способный стимулировать продукцию in vivo дендритных клеток. В качестве примера можно назвать соединение Flt13. Комбинированное использование этого типа агента позволяет повышать количество дендритных клеток и, следовательно, потенциально увеличивать эффективность композиций согласно изобретению. Другой предмет изобретения, следовательно, относится к ассоциации текзосом и добавки с целью одновременного, отдельного или разделенного во времени использования. 15 Соответствующий способ введения лекарственных средств согласно изобретению представляет собой способ введения путем инъекций и в частности внутрикожных или подкожных инъекций. Этот способ введения особенно адаптирован к случаям, когда действующее начало лекарственного средства представляет собой дендритные клетки, нагруженные текзосомами. Соответствующие дозировки составляют 0,01-10 мкг/кг и в частности 0,10-5 мкг/кг и еще более предпочтительно 0,15-2 мкг/кг массы тела и 10 мкг для внутрикожных реакционных тестов. Лекарственные средства согласно изобретению могут быть также использованы в количестве по 100 мкг для профилактических вакцинаций. Цели использования лекарственных средств согласно изобретению, являются следующими: замедленная гиперчувствительность (тесты в случае больных раком), или профилактическая терапия, или использование в рамках определения частоты специфических лимфоцитарных цитотоксических предшественников или секретеров интерферона по методу ограниченного разведения. Речь идет об использовании аутологичных или аллогеничных дендритных клеток, предварительно инкубированных с текзосомами согласно изобретению, в качестве мишеней периферических лимфоцитов у носителей опухоли до, во время или после противоопухолевой обработки (как классическая обработка или активная специфическая иммунизация). Изобретение также относится к применению текзосомы, такой как указанная выше, или антигенпредставляющей клетки, такой как указанная выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для обработки опухолей, в особенности твердых, асцитных и гематопоэтических опухолей. В качестве твердых опухолей можно назвать рак почки, молочной железы, ободочной кишки, легкого, желудка, печени; меланомы,саркомы и т.д. В качестве гематопоэтических опухолей можно назвать лейкозы, злокачественные лимфомы по Ходжкину и не по Ходжкину. Настоящее изобретение описывается далее более подробно с помощью нижеследующих примеров, которые нужно рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие объема охраны изобретения. Описание чертежей Таблица. Клетки опухолевых линий инкубировали в течение 24 ч при плотности 1 млн клеток на миллилитр. Текзосомы затем получали (см. пример) из культуральных сред путем дифференциального ультрацентрифугирования. Концентрацию текзосомальных протеинов оп 004300MZ-2 описан Traversari и др. (1992). Знакозначает, что различные первичные линии установлены и охарактеризованы в клинической биологической лаборатории Института Gustave Roussy и доступны по требованию. Фиг. 1 А и 1 В. Морфология мультивезикулярных эндосом и текзосом, происходящих от клеток TS/A. А. Ультратонкие срезы клеток TS/A, проанализированные с помощью электронного микроскопа. Часть цитоплазмы, показывающая эндосомальное пространство, содержащее везикулы диаметром 60-80 нм. В. Препарат текзосом клеток TS/A, проанализированных с помощью электронного микроскопа методом с использованием интактной везикулы (Raposo и др., 1966). Препараты текзосом содержат мажоритарную популяцию везикул диаметром 60-80 нм, по размеру и морфологии подобных внутренним везикулам мультивезикулярных эндосом, показанных в п.А. Фиг. 2. Наличие различных маркеров в текзосомах опухолевых клеток. А. 2 мкг текзосомальных протеинов (Exos) или 2 х 105 опухолевых клеток анализировали методом вестерн-блоттинга с помощью моноклональных антител, специфических к молекулам класса I CMH (Machold Robert P. и др.,"Peptide Influences the Folding and Intracellular(TfR) (антитело, соответствующее Н 68.4, описанное в Biochimica et Biophysica Acta, 1136(1),28-34 [1992]); Lamp 1 и 2 (моноклональные антитела крысы против мыши; Pharmingen) и кальнексину (Hebert Daniel N. и др., "GlucoseTrimming and Reglucosylation determine Glycoproteine Association with Calnexin in the Endoplasmic Reticulum" Cell, 81, 425-433 [1995]). В. 10 мкг текзосомальных протеинов линии клеток меланомы (FON) или 10 мкг полных протеинов тех же клеток анализировали путем вестерн-блоттинга с помощью антитела антиMART-1 (Marincola F. и др., "Analysis of expression of the melanoma associated antigens MART-1"in situ" lesions", Journal of Immunotherapy, 19,192-205 [1996]). С. Текзосомальные протеины линии клеток меланомы (FON) или полные протеины тех же клеток анализировали методом вестернблоттинга с помощью антитела анти-НSР 70.D. Текзосомальные протеины линии клеток меланомы (FON) или линии MZ-2 анализировали методом вестерн-блоттинга с помощью антитела анти-gр 96. 17 Фиг. 3. Текзосомы, происходящие от позитивной опухолевой линии MART-1 (FON), стимулируют специфический к MART-1 Т-клон. 20000 клеток Т-клона LT8 (или LT12, результаты не представлены) инкубировали с текзосомами, происходящими от FON (линии клеток MART-1 и HLA-A2+) или GIAM (клетки линии нефромы, MART-1-) в качестве отрицательного контроля, в течение 48 ч. ПродукциюTNF клетками Т-клона определяли путем биологического теста с клетками WEHI (Espavik и др.). Текзосомы индуцируют продукцию IFN Т-клоном, раскрывая таким образом присутствие комплексов НLА-А 2/пептид, происходящие от MART-1, на поверхности текзосом.LT8, инкубированным в присутствии текзосом,происходящих от опухолевых клеток GIAM;LT8, инкубированным в присутствии текзосом,происходящих от опухолевых клеток FON;LT8, инкубированным в присутствии текзосом,происходящих от опухолевых клеток FON. На оси абсцисс представлены определенные клетки, а на оси ординат указано продуцированное количество TNF (пг/мл). Фиг. 4. Текзосомы клеток Р 815, экспрессирующих Gal, стимулируют спленоциты мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Gal. Спленоциты (105) мышей BALB/c, иммунизированных за 2 месяца до этого с помощью 106 pfu (бляшкообразующих единиц) рекомбинантного аденовируса Gal, способствующие отторжению опухоли, экспрессирующей Gal,инкубировали с текзосомами, происходящими от клеток Р 815 (незаполненные четырехугольники ), или клетками Р 815-Gal (заполненные квадраты ). Не подвергнутые инкубации с текзосомами спленоциты создают фоновый шум,обозначенный закрашенными точками . После культивирования в течение 5 дней добавляли 1 микроКи тритиированного тимидина на лунку культуры. Включение трития в клеточную ДНК определяли спустя 18 ч. Результаты,значительно отличные от полученных по точному методу Фишера, маркированы знаком . На оси абсцисс представлено количество текзосом (Тех), происходящих от опухолевых клеток Р 815 (мкг/мл), а на оси ординат указано число импульсов в минуту (СРМ). Фиг. 5. Опухолевый антиген MART-1, содержащийся в текзосомах, может быть представлен Т-лимфоцитам дендритными клетками. Текзосомы в возрастающих дозах, происходящие от линий опухолевых клеток FON(20000 клеток на лунку 96-луночных микроплашек) LT12 (специфический к НLА 004300 18 А 2/пептид MART-1) в присутствии дендритных клеток HLA-A2+, происходящих от циркулирующих макрофагов (DCA2) (F. Sallusto и A.TNF", J. Exp. Med., 179, 1109-1118 [1994]). Выделение IFN, представленное на оси ординат (пг/мл), определяли в культуральных супернатантах спустя 2 дня. Текзосомы, происходящие от FON, так же, как текзосомы, происходящие от MZ2, индуцировали выделение IFN клетками LT12 и LT8 (результаты не представлены). Клетки FON также индуцировали сильное выделение IFN Т-клонами, тогда как клетки MZ2, которые не выражают адекватный гаплотип молекулы HLA (HLA-A2), не индуцировали продукцию IFN.LT12, инкубированным в присутствии дендритных клеток HLA-A2+;"LT12+DCA2+TexFON" соответствует Тклонам LT12, инкубированным в присутствии дендритных клеток, содержащих текзосомы,происходящие от опухолевых клеток FON;"LT12+DCA2+TexMZ2" соответствует Тклонам LT12, инкубированным в присутствии дендритных клеток, содержащих текзосомы,происходящие от опухолевых клеток MZ2. Фиг. 6 А и 6 В. Противоопухолевые эффекты текзосом in vivo. 100000 опухолевых клеток TS/A инъецировали мышам BALB/c (А) или Nude (В). Спустя 3 дня каждая мышь получала две последовательные инъекции, с интервалом 24 ч (представленные на фигуре как J3 и J4), 20-30 мкг текзосом внутрикожно. Размер опухоли затем определяли 2 раза в неделю. Были проведены статистические анализы точным методом Фишера (показатель 95% указан знаком ). А. Две группы по 5 мышей получали текзосомы, происходящие от TS/A (заполненные треугольники) или МСА 38 (незаполненные треугольники ) (линия клеток аденокарциномы ободочной кишки, происходящая от мышиC57BL/6), в качестве отрицательного контроля. Сами текзосомы, происходящие от TS/A, обладают противоопухолевым эффектом in vivo. В. Две группы мышей Nude параллельно получали такие же дозы тех же препаратов текзосом (: экзосомы TS/A; : экзосомы МС 38). Никакого противоопухолевого эффекта не наблюдали в случае мышей Nude. Тлимфоциты, следовательно, необходимы для противоопухолевых эффектов текзосом in vivo. На оси абсцисс указаны дни, а на оси ординат указан средний размер опухоли (мм 2). Фиг. 7. Дендритные клетки, происходящие от костного мозга, сенсибилизированные текзосомами, происходящими от опухолевых клеток, 19 вызывают полное удаление in vivo развившихся твердых опухолей. 500000 опухолевых клеток Р 815 инъецировали в правый бок мышей DBA/2 за 10 дней до обработки. Обработка состояла в разовой инъекции текзосом (10 мкг/мышь) в тот же бок, но на расстоянии от опухоли. Другой группе инъецировали внутривенно дендритные клетки (происходящие от костного мозга путем обработки в течение 5 дней с помощью GM-CSF + IL-4(Mayordomo и др., 1995), инкубированные предварительно в течение 3 ч с текзосомами Р 815. Опухоли измеряли и результаты анализировали,как показано на фиг. 6. Текзосомы Р 815 сенсибилизировали дендритные клетки для индуцирования отторжения развившихся опухолей. Микросомы не оказали значительного воздействия на рост опухоли. На вставке показан процент мышей без опухоли (по оси ординат); заштрихованный прямоугольник в виде бруска соответствует только группам животных типа,обозначенного заполненными квадратами; по оси абсцисс отложены дни. У этих мышей не происходило развития опухоли после повторной инъекции дубликата минимальной опухолевой дозы, показывающее, что у них выработался противоопухолевый иммунитет. Используемые на фигуре символы являются следующими:X: необработанные животные. На оси абсцисс указаны дни, а на оси ординат указан средний объем опухоли. Фиг. 8 А, 8 В и 8 С. Химиотерапевтические/цитотоксические агенты и облучение могут стимулировать экзоцитоз опухолевых текзосом. Использовали мышиную лейкемию L1210 и линию раковых клеток почки человека GIAM(фиг. 8 С). 2 млн опухолевых клеток инкубировали в присутствии возрастающих количеств 5Fu (для L1210) или цисплатина (CDDP) (дляGIAM) на мл в течение 16 ч. Супернатант рекуперировали, затем подвергали дифференциальным ультрацентрифугированиям, как указано в таблице.GIAM также инкубировали с IL-2 в количестве 1000 МЕ/мл или с дексаметазоном (10-6 моль) или облучали с помощью 10000 рад. Сильные дозы химиотерапевтических агентов и облучение являются хорошими примерами положительной регуляции экзоцитоза текзосом в случае этих животных, служащих в качестве моделей. Результаты воспроизводились также в случае других опухолей (фиг. 8 А и 8 В); в частности, оказалось, что облучение стимулирует экзоцитоз сильнее всего. Фиг. 8 А соответствует вышеописанной меланоме FON, а фиг. 8 В соответствует мыши 004300Ins., 48, 265-271 [1972]). На фиг. 8 А представлены клетки FON, инкубированные в различных условиях: 1) CM: базальная среда для культуры(декзосомы), продуцируемые дендритными клетками, сенсибилизированными опухолевыми антигенами меланом, эффективны для стимуляции специфических к этим меланомам Тлимфоцитов и их продукция регулируется цитокинами.LT8 (СМ) соответствует Т-клонам LT8,инкубированным в базальной среде для культуры, как указано на фиг. 8 А;DexTexNUN соответствует декзосоме,происходящей от дендритных клеток, содержащих текзосомы, происходящие от опухолевых клеток NUN;DexTexFON соответствует декзосоме, происходящей от дендритных клеток, содержащих текзосомы, происходящие от опухолевых клеток FON;TumFON соответствует опухолевым клеткам FON. А. Тесты пролиферации: текзосомы Fon(использованные согласно фиг. 3) инкубировали с дендритными клетками HLA-A2 в течение 3 ч,затем промывали 9%-ным солевым раствором после чего инкубировали в кислой среде с рН 6,3 в течение 18 ч. Мембранные везикулы дендритных клеток (декзосомы), таким образом, рекуперировали из супернатанта культуры вышеуказанных дендритных клеток HLA-2. Мембранные везикулы, происходящие от дендритных клеток, содержащих текзосомы(DexTex), затем инкубировали со специфическими к MART-1 клонами LT8, представленными в рамках HLA-A2 (текзосомы Fon содержат антиген MART-1). В качестве отрицательного контроля использовали текзосомы Nun (линия раковых клеток почки HLA-A2-; MART-1-). В качестве положительного контроля использовали облученную опухолевую линию FON (TumFON) или антитело анти-СО 3, предварительно адсорбированное на пластике (анти-СD3 Аb). Инкубацию DexTex с клонами LT8 продолжали 48 ч, затем в лунки объемом по 200 мкл добавляли 1 микроКи тритиированного тимидина. Лимфоцитарные пролиферации LT8 определяли спустя 18 ч. На оси ординат указано число импульсов в минуту. В. Следовали той же методике, но IFN определяли в супернатанте 48-часовой культуры с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На оси ординат указано содержаниеIFN (пг/мл). С. Декзосомы выделяли из супернатантов дендритных клеток после инкубации в течение 48 ч в присутствии или в отсутствие LPS (20 мкг/мл), IFN (100 МЕ/мл) или IL-10 (10 мкг/мл). Фиг. 10. Вид декзосом в иммуноэлектронной микроскопии. Декзосомы имеют сходный диаметр, составляющий от 50 до 90 нм, и интенсивно маркированы антителами анти-СD63(фиг. 10 А). Большая часть этих декзосом также маркирована антителами анти-МНС-I (с. 15,фиг. 10 В) и анти-МНС-II (с. 15, фиг. 10 С). Черточки: 250 нм. Фиг. 11. Определение количеств гаммаинтерферона, выделенных Т-лимфоцитами, которые инкубировали в присутствии декзосом,содержащих пептиды, или контрольных декзосом. Дендритные клетки (2 х 106 /мл) инкубировали в течение 3-12 ч либо в присутствии 10 мкг/мл антигенного пептида MART-1/Melan А(27-35), либо в присутствии 10 мкг/мл пептидаgp100(280-288) (контроль) в виде суспензии в растворе лимонной кислоты с рН 3,7, после чего выделяли декзосомы. Клетки клона LT12 (клон клеток CTL, ограниченный HLA-A2, специфический к MART-1(27-35) инкубировали (по 100000CTL на лунку) с возрастающими количествами декзосом или пептидов gp100 (контроль) на 96 луночных плашках в течение 5 дней. Выделение гамма-интерферона клетками затем определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (Genzyme). Фиг. 12. Анализ путем вестерн-блоттинга маркеров, присутствующих в декзосомах (1,4 и 10 мкг), продуцированных дендритными клетками, происходящими от костного мозга: Н-2 Кin vivo декзосом на модель опухоли мастоцитомы (Р 815). Dex-H2d-AEP-P815: декзосомы, происходящие от дендритных клеток костного мозга, содержащие кислотный пептидный элюат опухоли Р 815. Dex-H2d-AEP селезенок: декзосомы, происходящие от дендритных клеток костного мозга, содержащие кислотный, пептидный элюат селезенки. Фиг. 14. Противоопухолевое воздействиеin vivo декзосом, происходящих от дендритных клеток костного мозга, содержащих кислотный пептидный элюат опухоли на модели опухоли груди (TS/A). Легенда: см. фиг. 13. (А): Эксперимент, осуществляемый на иммунокомпетентных мышах. (В): Эксперимент, осуществляемый на мышах Nude. 22 Фиг. 15. Тест высвобождения радиоактивного хрома (51Cr). Этот тест позволяет показать,что декзосомы согласно изобретению вызываютYAC, нечувствительная к клеткам NK. Фиг. 16. Сравнительная эффективность декзосом и дендритных клеток. Эта фигура показывает, что декзосомы являются более эффективными, чем незрелые дендритные клетки, от которых они происходят, для удаления in vivo развившихся опухолей. 5000000 дендритных клеток, содержащих кислотный пептидный элюат селезенки (незаполненные квадраты) или опухоли Р 815 (незаполненные треугольники),вводили внутривенно или внутрикожно мышам,имеющим развившиеся опухоли Р 815 в день 810. Параллельно, супернатант этих клеток, после инкубации в течение 18 ч, объединяли с пептидами селезенки (незаполненные квадраты) или опухоли Р 815 (заполненные треугольники),ультрацентрифугировали и характеризовали в отношении содержания в нем декзосом. 5000000 дендритных клеток позволили получить 5-10 мкг декзосом, которые позволили иммунизировать 5 мышей путем внутрикожного введения вipsi-латеральную сторону. Единственное введение декзосом осуществляли в день 8-10. Размер опухолей определяли два раза в неделю, и он представлен на фигуре. Знакипредставляют собой результаты, означающие 95%, согласно точному методу Фишера, по сравнению с инъекциями солевого (физиологического) раствора(незаполненные квадраты) или пульсирующих дендритных клеток. На вставке представлены проценты мышей, иммунизированных против Р 815, показывающие полное отсутствие (исчезновение) опухоли в течение (день 21) и по окончании (день 60) эксперимента в различных группах по 5 мышей. Фиг. 17. Очистка декзосом путем электрофореза в жидкой фазе. Примеры 1. Продукция текзосом, осуществляемая линиями опухолевых клеток человека и мыши. Этот пример иллюстрирует способность опухолевых клеток продуцировать липидные везикулы. Мышиные или человеческие опухолевые клетки, происходящие от лейкемий или твердых опухолей (почки или меланомы ободочной кишки) (см. таблицу), инкубировали в течение 24 ч при плотности 1 млн клеток на миллилитр. Культуральную среду (среда RPMI, содержащая 10% зародышевой телячьей сыворотки) затем освобождали от клеток путем центрифугирования при ускорении 300g в течение 10 мин. Клеточные остатки затем удаляли путем двух последовательных центрифугирований в течение 15 мин, каждое при ускорении 800g (и путем возможного центрифугирования в течение 30 мин при ускорении 10000g). Наконец, текзосо 23 мы получали путем центрифугирования в течение 60 мин при ускорении 100000g, затем промывали 1 раз с помощью PBS в тех же условиях. Концентрацию протеинов в препаратах текзосом определяли по методу Bradford (BioRadProtein Assay [BioRad]). Все испытуемые, человеческие и мышиные, опухолевые линии (твердые или гематопоэтические, первичные или установленные в культуре или происходящие от свежих диссоциированных опухолей) продуцируют текзосомы (таблица). Однако эффективность продукции различна в различных линиях. Линии мышиных опухолевых клеток продуцируют 100200 мкг протеинов текзосом на 50 миллионов клеток за 24 ч. Человеческие линии меланомы и нефромы продуцируют 10-100 мкг протеинов текзосом на 20 млн клеток за 24 ч. 2. Везикулы, продуцируемые опухолевыми клетками, имеют эндоцитическое происхождение. Для того чтобы определить, имеют ли очищенные везикулы из супернатантов линий опухолевых клеток эндоцитическое происхождение, авторы осуществляли морфологическое исследование под электронным микроскопом одной из этих опухолевых линий, TS/A (линия карциномы молочной железы мыши) (Nanni P. и др. "TS/A: a new metastasizing cell line originatefrom a BALB/c sponteneous mammary adenocarcinoma", Clin. Exp. Matastasis, 1, 373-380 [1983]). Опухолевые клетки фиксировали и подготавливали для электронной микроскопии как описано выше. Текзосомы прямо помещали на сетку и анализировали. На фиг. 1 А представлены примеры внутриклеточных компартментов мультивезикулярного характера, наблюдаемые в опухолевых клетках. Эти эндоцитические компартменты имеют диаметр 200-300 нм (черточка внизу фиг. А и В означает 200 нм) и образованы наружной мембраной,окружающей многочисленные внутренние везикулы диаметром 68-80 нм. Препараты текзосом содержат мажорную популяцию везикул диаметром 60-80 нм (фиг. 1 В), в некоторых случаях агрегированных, и имеют морфологию, подобную внутренним везикулам мультивезикулярных эндосом, наблюдаемых внутри клеток (фиг. А). Эти результаты наводят на мысль, что текзосомы секретировались во внеклеточную среду после слияния наружной мембраны эндосом с цитоплазматической мембраной. В самом деле, такие профили экзоцитоза наблюдали в этих клетках (данные не представлены). Для того чтобы определить, имеют ли текзосомы действительно эндоцитическое происхождение, затем осуществляли анализ путем вестерн-блоттинга маркеров, находящихся, как определено ниже, в текзосомах, происходящих от опухолевых линий, TS/A и Р 815 (мастоцитома; согласно данным Т. Boon, Ludwig Institute, 004300 24 Брюссель, Бельгия) (мышиная мастоцитома). Для этого 2 мкг протеинов текзосом или клеточный лизат из 200000 клеток TS/A разделяли на полиакриламидном геле, затем переносили на мембрану из нейлона (Amersham). Возможное наличие различных маркеров затем определяли с помощью специфических антител. Текзосомы TS/A и Р 815 содержат молекулы класса I главного комплекса гистосовместимости, а также различные маркеры эндоцитического путиLamp 1 и 2) (фиг. 1 А). Напротив, характерный маркер эндоплазматического ретикулюма (ЭР),кальнексин, не присутствует в препаратах текзосом, что говорит о том, что мембраны ЭР не включаются в состав текзосом. 3. Текзосомы, продуцируемые линией меланомы, содержат опухолевый цитозольный антиген. Эти результаты показывают, что секретируемые опухолевыми клетками текзосомы соответствуют внутренним мембранам мультивезикулярных эндосом. Однако эти внутриэндосомальные везикулы образуются путем инвагинации, затем отпочковывания от наружной мембраны эндосом вторичных мембран во внутреннюю часть эндосомы. Эти внутриэндосомные везикулы и, следовательно, текзосомы, должны содержать цитозольную часть. Это особенно важно в рамках противоопухолевой иммунотерапии, так как некоторое количество опухолевых антигенов, включая MART-1 (один из наиболее изученных), представляет собой цитозольные протеины. Следовательно, тестировали наличие MART-1 в текзосомах. Для этого 10 мкг протеинов текзосом или клеточного лизата из 200000 клеток линии меланомы человека (М 10) (Т. Boon, Ludwig Institute, Брюссель, Бельгия) анализировали путем вестерн-блоттинга, как указано выше. Возможное присутствие MART-1 затем обнаруживали с помощью специфического антитела антиMART-1 (S. Rosenberg, NCI, Bethesda, USA). Текзосомы, секретируемые опухолевой линиейMART-1. Эксперименты по защите в отношении протеиназы К (Sigma) показали, что эпитопMART-1, распознаваемый этим моноклональным антителом, находится внутри текзосом (результаты не представлены). Эта первая часть работы показывает, что- опухолевые клетки продуцируют и секретируют везикулы;- эти везикулы представляют собой везикулы эндосомного происхождения, включающие наружную мембрану, где находятся различные мембранные молекулы (класса I CMH,различные маркеры эндосом);- эти везикулы содержат цитозольную часть, включающую цитозольные опухолевые антигены, такие как MART-1. Эти результаты привели к подтверждению следующих видов биологической активности везикул, называемых текзосомами. 4. Текзосомы могут стимулировать Тлимфоциты CD8 in vitro. Так как текзосомы содержат молекулы класса I на своей поверхности, тестировали их способность к стимуляции Т-лимфоцитов CD8. Использовали два Т-клона, LT8 и LT12, предоставленные Faure F., Институт Пастера, Париж,Франция, распознающие пептид, происходящий от MART-1, в ассоциации с HLA-A2 (Dufour и др., 1997). С этой целью, так как опухолевые клетки FON представляют собой HLA-A2, клетки Т-клонов LT8 и LT12 инкубировали с текзосомами, полученными из супернатантов FON,или, в качестве положительного контроля, с интактными клетками FON. Активацию Тлимфоцитов определяли по выделению TNF. Текзосомы FON индуцировали дозозависимое выделение TNF клетками LT8 и LT12 (фиг. 3). Клетки FON также индуцировали секрециюTNF, тогда как текзосомы, происходящие от опухолевых клеток, не экспрессирующихTNF (фиг. 3). Следовательно,комплексы НLА-А 2/ пептид MART-1 находятся на поверхности текзосом. Подобные результаты получали на мыши с Т-лимфоцитами селезенки мыши, иммунизированной -галактозидазой (-gal). Текзосомы получали из супернатантов клеток мастоцитомы Р 815 или клеток Р 815, экспрессирующих -gal (линии A. Albina, InstitutGustave Roussy, Villejuif, France), или клеток другой опухоли (L1210.) (мышиный лейкоз Н 2), не экспрессирующих -gal, L210. Возрастающие концентрации (от 0,3 до 20 мкг/мл) этих различных препаратов текзосом затем инкубировали в течение 4 дней с клетками селезенки мышей, иммунизированных -gal, экспрессируемой рекомбинантным аденовирусом. Сами текзосомы клеток Р 815 (при наиболее высокой концентрации 20 мкг/мл), экспрессирующих gal, индуцировали значительную пролиферацию(см. фиг. 4) (определяемую за счет включения тритиированного тимидина), хотя мало интенсивную, клеток селезенки. Эти результаты показывают, что текзосомы, продуцируемые клетками Р 815, экспрессирующими -gal, содержат на своей поверхности комплексы Н 2/пептиды,происходящие от -gal, и способны активировать мышиные Т-лимфоциты. 5. Текзосомы могут высвобождать цитозольные антигены, которые они содержат в антигенпредставляющих клетках, для представления Т-лимфоцитам. 26 Для этой цели использовали Т-клоны LT8 и LT12, специфически распознающие пептид,происходящий от MART-1 (MART-127-25 =HLA-A2. Показано, что текзосомы, продуцируемые линией меланомы человека FON (которая представляет собой HLA-A2), содержат опухолевый антиген MART-1 (см. фиг. 2) и способны непосредственно активировать клоныLT8 и LT12. Для того чтобы иметь в распоряжении текзосомы, содержащие также MART-1, но неспособные непосредственно стимулировать клоны LT12 и LT8, использовали линию меланомы MZ2 (Т. Boon, Ludwig Institute, Брюссель,Бельгия), положительный MART-1, но выражающую другой элемент рестрикции, чем HLAA2 (в данном случае HLA-A1). В самом деле,клетки MZ2, также как текзосомы, происходящие от этих клеток, не активируют клоны LT8 иLT12 (результаты не представлены), в противоположность клеткам FON и текзосомам, происходящим от этих клеток (фиг. 3). Напротив, когда эти же самые текзосомы, происходящие отMZ2, инкубировали в присутствии дендритных клеток, экспрессирующих HLA-A2, наблюдали стимуляцию Т-клонов LT12 и LT8, как в случае текзосом, происходящих от FON (фиг. 5). В случае текзосом, происходящих от MZ2,не может происходить активация Т-клонов, возникающая за счет комплексов HLA-A2/пептид,происходящих от предварительно существующих MART-1, так как они не экспрессируют адекватный элемент рестрикции (HLA-A2). Следовательно, речь может идти только об антигене, содержащемся в текзосомах, который продуцирован антигенпредставляющими клетками, разложен на пептиды, которые затем ассоциировались с молекулами HLA-A2 представляющей клетки. Текзосомы, следовательно,позволяют осуществлять перенос антигена между опухолевой клеткой и клеткой, представляющей антигены. Следовательно, текзосомы обладают функцией, подобной таковой "природных липосом". 6. Текзосомы индуцируют регрессию развившихся твердых опухолей in vivo. Наконец, так как текзосомы способны стимулировать Т-лимфоциты in vitro и сенсибилизировать дендритные клетки для активации специфических к опухолям Т-лимфоцитов, тестировали противоопухолевую активность текзосом in vivo. Для анализа такой противоопухолевой активности, мышам инъецировали в бок два раза(105) минимальную дозу онкогена опухолевых клеток опухоли молочной железы (клетки TS/A гаплотипа H2d, сингенные клеткам BALB/c). Спустя 3 или 4 дня животным, имеющим развившиеся опухоли, инъецировали 2 раза (день 3 и 4) текзосомы, полученные из супернатантов 27 клеток TS/A, или, в качестве отрицательного контроля, текзосомы клеток МС 38 (S. Rosenberg, NCI, Bethesda, USA) (опухолевая клетка гаплотипа H2b) или подобный объем PBS. Средний размер опухолей в группе мышей, инокулированных препаратами текзосом TS/A, сильно сократился по сравнению с группами контрольных мышей. Этот противоопухолевый эффект зависит от Т-клеток, так как мыши Nude (мутантные мыши, лишенные Т-лимфоцитов), несущие опухоль и инокулированные подобным образом препаратами текзосом, не показывают уменьшения опухолевой массы (фиг. 6 В). В этой же самой серии экспериментов наблюдали противоопухолевый эффект текзосом,полученных из клеток мастоцитомы Р 815 гаплотипа Н 2d, который позволяет полагать, что эти две опухоли выражают общие антигены. Подобные результаты получали с другой, очень иммуногенной моделью опухоли мастоцитомы Р 815 (сингенная мыши DBA/2 и гаплотипа H2d). На этой модели показано, что текзосомы, инъецируемые внутрикожно в бок мыши, несущей опухоли, установленные на 10-й день (опухоль размером 80-100 мм 2), обладают способностью приводить к удалению опухоли в более чем 60% случаев. Более того, эти мыши длительное время обладают противоопухолевым иммунитетом(результаты не представлены). В этой серии экспериментов наблюдали противоопухолевые эффекты текзосом, полученных из лимфоцитовL1210, выделенных из клеток лейкемии мышей гаплотипа H2d и клеток TS/A, что указывает на то, что общие эпитопы существуют также между этими тремя опухолями (между Р 815 и TS/A,мутированный р 53 является общим для обеих опухолей). Могут существовать два механизма противоопухолевого эффекта текзосом. Прежде всего, инъецированные один раз текзосомы могут активировать непосредственно Т-лимфоциты хозяина, специфические к опухоли. Таким образом, может иметь место клональная экспансия Т-лимфоцитов, специфических к опухоли, или "priming" Т-клеток. Вторая гипотеза предполагает прямое взаимодействие инъецированных текзосом с дендритными клетками хозяина. В этом случае возможна стимуляция противоопухолевого ответа. Для тестирования этой второй гипотезы наблюдали за ростом опухолей у мышей, инъецированных внутривенно с помощью дендритных клеток, происходящих от костного мозга, содержащих текзосомы опухолевых клеток. Мышам DBA/2 (IFFA CREDO,Орлеан, Франция) также вводили путем инъекции два раза (50 х 105) минимальную дозу онкогена клеток мастоцитомы Р 815. Спустя десять дней каждому животному инъецировали 5 х 105 дендритных клеток, содержащих и тем самым сенсибилизованных 9 мкг текзосом. Средний размер опухолей в этих условиях значительно уменьшается по сравнению с группами мышей, 004300 28 инъецированных с помощью PBS или с помощью дендритных клеток, содержащих текзосомы клеток контрольной опухоли МС 38. В самом деле, более 60% обработанных животных в конце эксперимента больше не имеют опухоли. Более того, в течение длительного периода времени не наблюдали рецидивов (в 80-100% случаев). Представляет интерес констатация того,что такая субоптимальная доза текзосом, инъецированная внутрикожно, не оказывает действия, что наводит на мысль о том, что дендритные клетки могут продуцировать декзосомы,содержащие опухолевые антигены, намного более эффективно, чем дендритные клетки дермы или клетки Лангерганса. Подобные результаты получили с моделью клеток опухоли молочной железы TS/A. Результаты, полученные в рамках изобретения, показывают, что текзосомы эффективно сенсибилизируют дендритные клетки. Эти клетки, сенсибилизованные таким образом, обладают способностью индуцировать интенсивные противоопухолевые ответы in vivo в случае различных опухолей. Эти результаты наводят на мысль о том, что противоопухолевые эффекты,наблюдаемые после прямой инокуляции текзосом in vivo, возникают вследствие сенсибилизации дендритных клеток хозяина. Примечательно, что эффект наблюдали после одноразовой инъекции сенсибилизированных дендритных клеток. Большинство обработанных мышей показывают полную регрессию опухоли или пролонгированное выживание (60 дней против 20 дней в случае контроля) вследствие регрессии опухоли. Метод сенсибилизации представляющих клеток согласно изобретению обладает различными преимуществами по отношению к методам уровня техники:i) он не требует предварительного распознавания опухолевых антигенов: это особенно важно, так как опухолевые антигены в огромном большинстве опухолей не известны;ii) способ согласно изобретению может быть применен к любой опухоли, продуцирующей текзосомы; на более чем 15 линий опухолевых клеток, тестированных на сегодняшний день, только одна не продуцирует текзосомы(одна из шести тестированных линий меланомы);iii) этот метод не зависит от гаплотипа СМН пациента и опухолевых клеток, так как опухолевые антигены, присутствующие в текзосомах, снова продуцируются и представляются Т-лимфоцитам молекулами СМН антигенпредставляющих клеток пациента;iv) способ согласно изобретению в принципе может быть эффективно использован в случае опухолей различного происхождения,так как существуют общие опухолевые антигены не только в особом типе опухоли (например,MART-A в меланоме), но и также общие анти 29 гены в совершенно различных опухолях (как молекулы, принимающие участие в онкогенезе,например, р 53);v) использование текзосом также может оказаться эффективным при лечении опухолей,экспрессирующих незначительные количества молекул класса I СМН или совсем их не экспрессирующих (эти опухоли представляют 4050% метастазирующих онкологических заболеваний человека). В самом деле, текзосомы позволяют осуществлять перенос интактных антигенов между опухолевыми клетками и дендритными клетками, причем эти антигены затем представляются Т-лимфоцитам молекулами СМН дендритной клетки. Предварительные результаты показывают, что текзосомы позволяют индуцировать удаление опухолей мыши, экспрессирующих незначительные количества молекул класса I СМН (как МСА 101; S.Rosenberg,NCI, Bethesda, USA). Это, вероятно, происходит вследствие того, что степени экспрессии молекул СМН, необходимые для индуцирования эффективного иммунного ответа, намного более высокие, чем таковые, требующиеся во время эффекторной фазы (клеточная цитотоксичность);vi) взятые индивидуально текзосомы за счет своей иммуногенной способности сами по себе представляют собой новую и эффективную форму профилактической или терапевтической вакцинации. 7. Характеризация мембранных везикул,продуцируемых дендритными клетками. Способность дендритных клеток продуцировать мембранные везикулы прежде всего была подтверждена при использовании дендритных клеток, получаемых из человеческих предшественников - моноцитов, и линии мышиных дендритных клеток D1. Клеточная линия D1 и условия созревания этой линии описаны Winzler и др. (J. Exp. Med.,185, 317 [1997]). Дендритные клетки, происходящие от человеческих предшественников - моноцитов,получали из адгезивной фракции мононуклеарных клеток, выделяемых от здоровых людей,инкубировали в течение 7-8 дней в среде AIMV,содержащей L-Glu, антибиотики, 1000 МЕ/млrhGM-CSF и rhIL-4 (Schering Plough, Kenilworth,NJ, USA). После культивирования в течение 8 дней слабоадгезивные клетки и суспендированные клетки имеют типичную морфологию дендритных клеток, экспрессирующих большие количества молекул СМН класса I и II, так же какCD40 и CD86. Большая часть этих клеток положительна для CD1a и CD11b и отрицательна дляCD2, CD3, CD14, CD19 и CD83. Анализы, сделанные с помощью микроскопии, этих клеток показали присутствие мембранных везикул, обогащенных молекулами СМН классов I и II. Эти везикулы выделяли путем центрифугирований и анализировали с по 004300 30 мощью иммуноэлектронной микроскопии. Более конкретно, супернатанты культур дендритных клеток объединяли, центрифугировали при ускорении 300g в течение 20 мин, затем при ускорении 10000g в течение 30 мин при температуре 4 С для удаления клеток и клеточных остатков. Декзосомы затем выделяли путем центрифугирования при ускорении 100000g в течение 1 ч при температуре 4 С, затем путем промывки в забуференном фосфатом физиологическом растворе в тех же условиях (центрифугирование при ускорении 100000g в течение 1 ч при температуре 4 С). Концентрацию протеинов в препаратах декзосом определяли по методу Bradford (BioRad Protein Assay [BioRad]). Полученные результаты показывают (фиг. 10) однородную популяцию везикул, имеющих диаметр около 60-90 нм. Кроме того, более 95% декзосом маркированы антителами к CD63,CD82, MHC-I и МНС-II. Эти результаты подтверждают, что дендритные клетки продуцируют мембранные везикулы, содержащие антигенпредставляющие молекулы, а также молекулы лимфоцитарной костимуляции. Список литературы (ссылки)Experimental Medicine 183, 87-97 [b]. Таблица Продукция текзосом человеческими и мышиными линиями опухолевых клеток Линии опухолевых Текзосомы,клеток мкг/2107 клеток/18 ч Мышиные МСА 101 172 Р 815 163 МС 38 120 32 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Везикула, называемая текзосомой, освобожденная от своего естественного окружения,отличающаяся тем, что она происходит от опухолевой клетки, тем, что она включает липидный бислой, окружающий цитозольную фракцию, содержащую опухолевые антигенные молекулы и/или иммуномодуляторы, и/или хемоаттрактанты, и/или гормоны, и/или нуклеиновые кислоты, тем, что она имеет на своей поверхности молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости(СМН), тем, что она содержит протеин HeatShock HSP 70, и тем, что она имеет диаметр приблизительно от 60 до 100 нм. 2. Везикула по п.1, имеющая на своей поверхности молекулы класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости. 3. Везикула по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что, кроме того, она имеет на своей поверхности адгезивные молекулы и/или молекулы лимфоцитарной костимуляции. 4. Везикула по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что, кроме того, она имеет на своей поверхности антигенные пептиды. 5. Везикула по п.4, отличающаяся тем, что антигенные пептиды ассоциированы с молекулами класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости. 6. Везикула по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она секретирована эндоцитными везикулярными компартментами опухолевых клеток, причем указанные эндоцитные везикулярные компартменты имеют диаметр от 200 до 300 нм. 7. Везикула, называемая текзосомой, освобожденная от своего естественного окружения,отличающаяся тем, что (i) она происходит от опухолевой клетки, (ii) она включает липидный бислой, окружающий цитозольную фракцию,(iii) она имеет на своей поверхности молекулы класса I и/или класса II главного комплекса гистосовместимости (СМН), (iv) она содержит антигенные пептиды, происходящие из опухолевой клетки, (v) она содержит молекулы CD40 или CD80, (vi) она содержит протеин HeatShock HSP70, (vii) она содержит фосфатидилсерин и (viii) она имеет диаметр приблизительно от 60 до 100 нм. 8. Везикула по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что она лишена протеина gр 96. 9. Способ получения везикул, называемых текзосомами, по любому из пп.1-8, включающий следующие стадии: получение биологической пробы, содержащей опухолевые клетки, причем указанную пробу выбирают из пробы крови, плазмы, опухолевой клетки, культуры опухолевых клеток,биопсии опухоли или производного препарата,содержащего опухолевые клетки, и 33 выделение везикул из указанной пробы способом, включающим по меньшей мере одну стадию центрифугирования, электрофореза,хроматографии и/или нанофильтрации. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой мембранные фракции, супернатанты культур или лизаты опухолевых клеток, или свежеприготовленные суспензии опухолевых клеток. 11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что биологический образец подвергают одной или нескольким стимулирующим обработкам, выбираемым среди обработок с помощью стероидных агентов, фармакологических агентов, агентов, способных увеличивать количество мультивезикулярных эндосом и/или путем облучения. 12. Применение текзосом по любому из пп.1-8 для сенсибилизации антигенпредставляющих клеток. 13. Способ сенсибилизации антигенпредставляющих клеток, включающий инкубацию антигенпредставляющих клеток в присутствии одной или нескольких текзосом по любому из пп.1-8 в условиях, позволяющих сенсибилизировать антигенпредставляющие клетки, и отбор полученных сенсибилизированных антигенпредставляющих клеток. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что он включает стадию отбора везикул, секретируемых сенсибилизированными антигенпредставляющими клетками. 15. Применение текзосом по любому из пп.1-8 для стимуляции и, в случае необходимо 004300in vitro Т-лимфоцитов. 16. Применение антигенпредставляющих клеток, полученных способом по пп.13 и 14, для стимуляции и, в случае необходимости, амплификации in vitro антигенспецифических Тлимфоцитов, содержащихся в вышеуказанных антигенпредставляющих клетках, или Влимфоцитов, и, в частности, для стимуляции и амплификации in vitro Т-лимфоцитов. 17. Лекарственное средство, включающее в качестве действующего начала одну или несколько текзосом по любому из пп.1-8 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 18. Лекарственное средство, включающее в качестве действующего начала одну или несколько антигенпредставляющих клеток, полученных способом по п.13 или 14, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 19. Лекарственное средство по п.17 или 18 для лечения раковых, инфекционных и паразитарных заболеваний. 20. Лекарственное средство по п.17 или 18,отличающееся тем, что оно дополнительно включает стабилизатор. 21. Композиция, включающая текзосомы по любому из пп.1-8 и иммуностимулирующую добавку, для одновременного, раздельного или разнесенного во времени применения.