Способ приготовления очищенных конъюгатов лекарственных средств

013327 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу приготовления конъюгатов высокой чистоты и стабильности, где конъюгаты представляют собой связывающий клетки агент, химически присоединенный к лекарственному средству. Уровень техники изобретения Методы лечения рака быстро прогрессируют с появлением фармацевтических препаратов, которые более эффективно уничтожают раковые клетки. Так, поверхностные клеточные рецепторы и антигены,избирательно экспрессируемые раковыми клетками, были использованы для создания лекарственных средств на основе антител, которые связывают опухолеспецифичные или опухолеассоциированные антигены. Для этого цитотоксичные молекулы, такие как бактериальные и растительные токсины, радионуклиды и некоторые химиотерапевтические лекарственные средства, были химически сшиты с моноклональными антителами, которые способны связывать опухолеспецифичные или опухолеассоциированные антигены (см., например, международные заявки на патенты WO 00/02587, 02/060955 и 02/092127, патенты США 5475092, 6340701 и 6171586, публикацию заявки на патент США 2003/0004210 А 1 иGhetie et al., J. Immunol. Methods, 112: 267-277 (1988. Такие соединения обычно называют конъюгатами токсинов, радионуклидов и лекарственных средств соответственно. Часто они называются также иммуноконъюгатами, радиоиммуноконъюгатами и иммунотоксинами. При связывании лекарственного конъюгата с опухолевой клеткой и последующем высвобождении или/и активации цитотоксической активности лекарственного средства клетка погибает. Такие конъюгаты позволяют селективно воздействовать на опухолевые клетки, что сводит к минимуму токсичность лекарственного средства для нормальных клеток, тем самым улучшая переносимость лекарственного средства пациентом. Способы конъюгации антител с сульфгидрилсодержащими цитотоксичными агентами, такими как майтансиноиды, были ранее описаны (см., например, патенты США 5208020, 5416064 и 6441163). Например, в патентах США 5208020 и 5416064 сообщается о процессе приготовления конъюгата антителомайтансиноид, в котором антитело вначале модифицируется гетеробифункциональным реагентом, как описано в патентах США 4149003, 4563304 и публикации заявки на патент США 2004/0241174 А 1. В патентах США 5208020 и 5416064 далее описана конъюгация модифицированных антител с избытком сульфгидрилсодержащего цитотоксичного агента при рН 7, с дальнейшей очисткой на хроматографической колонке Sephadex G25. Очистка конъюгата антитело-лекарственное средство путем гельпроникающей хроматографии (ГПХ) также описана ранее (см., например, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 93: 8618-8623 (1996) и Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992. Способы приготовления конъюгата антитело-лекарственное средство, описанные ранее, сложны,поскольку содержат стадии, сложные для получения или приготовления иммуноконъюгатов, причем последние удается получить менее чистыми и менее стабильными, чем было бы желательно. Например, рН 6,0-6,5 не является оптимальным при проведении конъюгации для получения чистого и стабильного продукта. Кроме того, реакции, в которые вступают конъюгаты, протекают в этих условиях, в общем, медленно и неэффективно, что требует дополнительного расхода времени и материалов. Было бы желательно модифицировать способ или исключить одну или более стадий приготовления без потерь качества продукта, таких как чистота и/или стабильность. Далее было бы желательно иметь дополнительные возможности очистки продукта, кроме тех, что уже предложены, поскольку с определенными комбинациями связывающих клетки реагентов, линкеров и лекарств будут эффективны различные методы. Принимая во внимание вышеизложенное, в данной области существует необходимость в разработке улучшенных способов приготовления конъюгатов, связывающих с клетками агент-лекарственное средство, которые имели бы высокую чистоту и в то же время высокую стабильность. Данное изобретение предоставляет такую возможность. Эти и другие преимущества изобретения, равно как и дополнительные характеристики изобретения будут очевидны из описания изобретения, приводимого ниже. Краткая сущность изобретения Изобретение обеспечивает способ получения конъюгата высокой чистоты и стабильности, содержащего химически сшитые с лекарственным средством связывающиеся с клетками агенты. Способ включает приготовления конъюгата антитело-цитотоксический агент, включающий следующие стадии:(а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры;(b) очистку первой смеси тангенциальным проточным фильтрованием, селективным осаждением, адсорбционным фильтрованием или адсорбционной хроматографией с получением очищенной первой смеси, содержащей антитела и связанные с ними линкеры; (с) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в очищенной первой смеси путем взаимодействия антитела,несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5 с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ii) свободный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС 1065; и (d) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбци-1 013327 онного фильтрования или адсорбционной хроматографии для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси. В ещ одном варианте изобретение обеспечивает способ приготовления конъюгата антителоцитотоксический агент, включающий следующие стадии: (а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры; (b) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН от примерно 4 до примерно 9 с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ii) свободный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, образованные на стадии (b), где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС 1065; и (с) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии или их комбинации для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом; при условии, что первую смесь не подвергают очистке путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования,адсорбционной хроматографии. Подробное описание изобретения Изобретение предоставляет собой способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент высокой чистоты и стабильности. Благодаря высокой чистоте и стабильности конъюгатов такие соединения могут быть использованы для лечения заболеваний. Составы, включающие связывающийся с клетками агент, такой как антитело, химически присоединенный к лекарственному средству, такому как майтансиноид, описаны, например, в публикации заявки на патент США 2004/0241174 А 1. В данном случае считается, что препарат обладает высокой чистотой, если (а) более 90%, а лучше более 95% частиц конъюгата присутствуют в виде мономеров и/или (b) количество свободного лекарственного средства в препарате конъюгата менее 2% (относительно общего количества лекарственного средства). Таким образом, способ по изобретению включает (а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры; (b) очистку первой смеси тангенциальным проточным фильтрованием, селективным осаждением, адсорбционным фильтрованием или адсорбционной хроматографией с получением очищенной первой смеси, содержащей антитела и связанные с ними линкеры; (с) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в очищенной первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5 с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ii) свободный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, где цитотоксический агент выбран из группы,состоящей из майтансиноида, таксанов и СС 1065; и (d) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования или адсорбционной хроматографии для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси. В ещ одном варианте способ по изобретению включает (а) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры; (b) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН от примерно 4 до примерно 9 с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ii) свободный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, образованные на стадии (b), где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС 1065; и (с) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии или их комбинации для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом; при условии, что первую смесь не подвергают очистке путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии. На стадиях очистки предпочтительно использовать тангенциальную проточную фильтрацию (ТПФ,также известную как перекрестная проточная фильтрация, ультрафильтрация и диафильтрация) и/или смолы для адсорбционной хроматографии. Однако, если на первой стадии очистки (стадия b) используется ТПФ, то на стадии (с) конъюгацию проводят при рН 6,0-6,5, и смола для адсорбционной хроматографии используется на второй стадии очистки (стадия d), предпочтительно использовать неионобмен-2 013327 ную смолу для адсорбционной хроматографии. В других вариантах осуществления изобретения на каждой стадии очистки используется ТПФ или смолы для адсорбционной хроматографии. Возможно использование смолы для адсорбционной хроматографии на первой стадии очистки и ТПФ на второй стадии. Также на первой и второй стадиях возможно использование комбинации ТПФ и смолы для адсорбционной хроматографии. Может быть использована любая подходящая система ТПФ, например система типа Pellicon (Millipore, Billerica, MA), система Sartocon Cassette (Sartorius AG., Edgewood, NY), и система типа Centrasette(Pall Corp., East Hills, NY). Может быть использована любая подходящая адсорбционная хроматография. Предпочтительно использовать гидроксиапатитную хроматографию, гидрофобную хроматографию с индуцированным градиентом (HCIC), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию смешанного типа, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла (IMAC), хроматографию с окрашенным лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и их комбинацию. Примеры подходящих гидроксиапатитных смол: керамический гидроксиапатит (СНТ Type I and Type II, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA), НА Ultrogel hydroxiapatite (Pall Corp., East Hills, NY), керамический фторапатит (CFT Type I and Type II, Bio-Rad laboratories,Hercules, CA). Примером подходящей HCIC смолы является МЕР Hypercel (Pall Corp., East Hills, NY). Примеры подходящих HIC смол включают бутилсефарозу, гексилсефарозу, фенилсефарозу и октилсефарозу (все от GE Healthcare, Piscataway, NJ), а также смолы макро-преп-метил и макро-преп-трет-бутил(BioRad Laboratories, Hercules, CA). Примерами подходящих ионообменных смол являются смолыSP-сефароза, СМ-сефароза, Q-сефароза (все от GE Healthcare, Piscataway, NJ) и смола Unosphere S (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих смол смешанного типа включают смолу BakerbondABx (JT Baker, Phillipsburg, NJ). Примеры подходящих IMAC смол включают хелатированную смолу сефарозу (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и смолу Profinity IMAC (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих смол для лиганда красителя включают сефарозу Blue (GE Healthcare, Piscataway,NJ) и аффигель Blue (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих смол для аффинной хроматографии включают А-белок сефарозу (например, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), где связывающим клетки агентом является антитело, и лектин-аффинные смолы, например Lentil Lectin сефароза (GE Healthcare, Piscataway, NJ), в которых связывающий клетки агент содержит подходящие сайты связывания лектина. Возможно также использование антител, специфичных к связывающему клетки агенту. Такие антитела могут быть иммобилизованы, например, на Sepharose 4 Fast Flow смоле (GEHealthcare, Piscataway, NJ). Примеры подходящих сорбентов для хроматографии с обращенной фазой включают смолы С 4, С 8 и С 18 (Grace Vydac, Hesperia, CA). В соответствии со способом по изобретению первая смесь включает антитела, несущие присоединенные к ним линкеры, а также исходные реагенты и побочные продукты. Отделение модифицированного антитела от других реагентов и побочных продуктов реакции производится путем проведения очистки первой смеси. На этой стадии первая смесь может быть очищена с использованием тангенциального проточного фильтрования (ТПФ), например мембранного тангенциального проточного фильтрования, адсорбционной хроматографии, адсорбционного фильтрования или селективного осаждения, или любого другого подходящего способа очистки, равно как и комбинации таковых. Данная первая стадия очистки позволяет получить очищенную первую смесь, т.е. увеличить концентрацию антитела, несущего связанные с ним линкеры, и снизить концентрацию непрореагировавшего бифункционального сшивающего агента в сравнении с содержанием их в первой смеси до очистки в соответствии с изобретением. После очистки первой смеси с целью получения очищенной первой смеси антител, несущих связанные с ними линкеры, лекарственное средство, представляющее собой цитотоксический агент, конъюгируют антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой очищенной смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ним линкеры, с лекарственным средством в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5, с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное с цитотоксическим агентом через линкеры, (ii) свободное лекарственное средство и (iii) побочные продукты реакции. Процесс конъюгации проводится при рН от примерно 4 до примерно 9, реакцию лучше проводить при рН примерно 6 или ниже, либо при рН примерно 6,5 или выше, наиболее предпочтительно при рН от примерно 4 до примерно 6 или от примерно 6,5 до примерно 9 и особенно при значениях рН от 4 до менее чем 6 или от свыше 6,5 до 9. Пока стадия конъюгации проводится при рН 6,5 или выше, некоторые сульфгидрилсодержащие лекарственные средства могут подвергаться димеризации с образованием дисульфидных связей. Для эффективного проведения реакции в этих условиях может потребоваться удаление следов металла и/или кислорода из реакционной смеси, а также необязательно дополнительное введение в реакцию антиоксидантов или использование линкеров с более реакционноспособными уходящими группами, или добавление лекарственного средства в количестве более одной аликвоты. Необязательно стадия очистки модифицированного антитела может быть опущена. В таком случае лекарственное средство, представляющее собой цитотоксический агент, может быть добавлено одновременно со сшивающим реагентом или несколько позже, например 1, 2, 3 или более часов спустя, после добавления сшивающего реагента к антителу.-3 013327 Способ по изобретению может необязательно включать добавление сахарозы на стадии конъюгации, использованной в данном методе для повышения растворимости и выхода конъюгатов лекарственного средства с атителом. Желательно добавлять сахарозу в количестве от примерно 0,1 до примерно 20% (вес./об.) (например, примерно 0,1, 1, 5, 10, 15 или 20% (вес./об Предпочтительно вводить сахарозу в концентрациях от примерно 1 до примерно 10% (вес./об.) (например, примерно 2, примерно 4, примерно 6 или примерно 8% вес./об.). Кроме того, реакция конъюгирования может включать добавление буферного агента. Может быть введен любой известный подходящий буферный агент. Такими агентами,например, являются цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер. После конъюгации вторая смесь подвергается очистке. В данном случае вторая смесь может быть очищена с использованием тангенциального проточного фильтрования (ТПФ), например мембранного тангенциального проточного фильтрования, адсорбционной хроматографии, абсорбционного фильтрования, селективного осаждения или любого другого подходящего процесса очистки, равно как и комбинации таковых. После второй стадии очистки получается очищенная вторая смесь, то есть связывающийся с клетками агент, химически связанный через линкер с лекарственным средством, в более высокой концентрации и остальные компоненты второй смеси в более низкой концентрации в сравнении с содержанием их во второй смеси до очистки в соответствии с изобретением. Термин антитело, используемый в данном описании, обозначает любой иммуноглобулин, любой фрагмент иммуноглобулина, такой как Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, диатела, триатела или химерные иммуноглобулины, которые могут связываться с антигеном на поверхности клетки (например, содержащие гипервариабельный участок (CDR. В качестве связывающегося с клетками агента могут быть использованы любые подходящие антитела. Выбор антител зависит от типа популяции целевых клеток. В этом отношении, тип и количество молекул на поверхности клетки, селективно экспрессируемых конкретной клеточной популяцией (т.е. антигенов) - обычно и предпочтительнее пораженной клеточной популяцией будет определять выбор подходящего антитела для использования в настоящем изобретении. Профиль экспрессии на поверхность клеток известен для широкого круга типов клеток, включая раковые клетки,или, если он не известен, то может быть определен с использованием обычных методов молекулярной биологии и гистохимии. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, но предпочтительно использовать моноклональные антитела. Как используется в настоящем описании, под термином поликлональные антитела понимаются гетерогенные популяции молекул антител, обычно содержащиеся в сыворотке иммунизированных животных. Термин моноклональные антитела относится к гомогенной популяции молекул антител, специфичной к конкретному антигену. Моноклональные антитела обычно продуцируются единственным клоном В-лимфоцитов (В-клеток). Моноклональные антитела могут быть получены с использованием различных методик, включая стандартную гибридомную технологию (см., например, Khler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) и С.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, NewYork, NY (2001. Вкратце, стандартный гибридомный метод получения моноклональных антител обычно включает инъекцию любого подходящего животного, обычно и более предпочтительно мыши, антигеном (т.е. иммуногеном). Затем животное умерщвляют, и В-клетки, выделенные из его селезенки,смешивают с клетками человеческой миеломы. Полученные гибридные клетки (т.е. гибридома), которые пролиферируют неограниченно и непрерывно секретируют высокий титр антител с желаемой специфичностью in vitro. Для идентификации клеток гибридомы, продуцирующих антитела требуемой специфичности, может быть использован любой подходящий метод, известный в данной области. Например, такими методами могут являться твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), анализ с помощью вестерн-блота и радиоиммунологический анализ. Популяция гибридом скринируется для изоляции индивидуальных клонов, каждый из которых секретирует единственный тип антител к данному антигену. Поскольку каждая гибридома является производным единственной В-клетки, все получаемые молекулы антител идентичны по структуре, включая изотип и сайт связывания антигена. Моноклональные антитела также могут быть получены с использованием другого подходящего метода, включая метод EBV-гибридом (см., например, Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2): 361-67 (1984) и Roderet al., Methods Enzymol., 121: 140-67 (1986, системы экспрессии на основе бактериофагов (см., например, Huse et al., Science, 246: 1275-81 (1989 или библиотеки фаговых дисплеев, включающие фрагменты антител, такие как Fab и scFv (одноцепочечный вариабельный участок) (см., например, патент США 5885793 и 5969108 и международные патентные заявки WO 92/01047 и 99/06587). Моноклональные антитела могут быть выделены или продуцированы в организме любого подходящего животного, но предпочтительно получать их в организме млекопитающих, предпочтительно мыши или человека, а наиболее предпочтительно человека. Методы получения антител в организме мыши хорошо известны и описаны в настоящем описании. Что касается человеческих антител, в данной области известно, что поликлональные антитела могут быть выделены из сыворотки, полученной из человеческого организма, вакцинированного или иммунизированного соответствующим антигеном. Другой метод позволяет получить человеческие антитела с применением известных методов продукции человеческих антител в нечеловеческих организмах, например в мыши (см., например, патенты США-4 013327 5545806, 5569825 и 5714352 и публикацию заявки на патент США 2002/0197266 А 1). Человеческие антитела и особенно человеческие моноклональные антитела обычно получить сложнее, чем мышиные моноклональные антитела, хотя они являются идеальным объектом для терапевтического применения на людях. Мышиные моноклональные антитела, однако, будучи введены человеку,вызывают быстрый иммунный ответ у хозяина, что может снижать терапевтический и диагностический потенциал конъюгата антитело-лекарственное средство. Чтобы избежать вышеуказанного осложнения,использовались те моноклональные антитела, которые обычно не воспринимаются как чужие иммунной системой человека. С этой точки зрения для производства антител может быть использован фаговый дисплей. В данном случае фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязывающие вариабельные (V) домены молекулы иммуноглобулина, могут быть получены стандартными молекулярно-биологическими методами и методами рекомбинантных ДНК (см., например, Sambrook et al., (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001. Фаги, кодирующие вариабельный участок желаемой специфичности, выбираются для специфического связывания желаемого антигена, и воспроизводится полная молекула человеческого иммуноглобулина, включающая выбранный вариабельный фрагмент. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая выбранное антитело, вводится в подходящую клеточную линию, такую как клетки миеломы, используемые для продукции гибридом, так что клеткой секретируются человеческие антитела, имеющие свойства моноклональных антител (см., например, Janeway et al. выше, Huse et al. выше и патент США 6265150). Возможно также получение молоклональных антител из мышей, трансгенных по специфическим человеческим генам тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Такой метод известен и описан, например, в патентах США 5545806 и 5569825 иJaneway et al. выше. Более предпочтительно использовать гуманизированные антитела. В настоящем описании использованы гуманизированные антитела, в которых гипервариабельные участки (CDR) мышиных моноклональных антител, которые образуют антигенсвязывающую петлю антитела, встроены в структуру молекулы человеческого иммуноглобулина. Благодаря сходству мышиных и человеческих иммуноглобулинов, в общем, считается, что этот подход позволяет получить моноклональные антитела, которые антигенно идентичны человеческим иммуноглобулинам, но связывают тот же антиген, что и мышиные антитела, из которых были получены последовательности CDR. Методы получения гуманизированных антител хорошо известны и детально описаны в Janeway et al. выше, патентах США 5225539, 5585089 и 5693761. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием метода восстановления антител, описанного в патенте США 5639641 и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235: 959-973 (1994). Если антитела, использованные в конъюгате патентоспособной композиции, предпочтительно являются гуманизированными моноклональными, вышеописанные человеческие и мышиные моноклональные антитела также находятся в рамках изобретения. Фрагменты антител, имеющие по крайней мере один антигенсвязывающий сайт и, следовательно,узнающие по крайней мере один антиген или рецептор, присутствующий на поверхности целевой клетки, также находятся в рамках изобретения. В этом отношении, протеолитическое расщепление интактной молекулы иммуноглобулина может приводить к получению ряда фрагментов, каждый из которых сохраняет способность узнавать и связывать антиген. Например, ограниченный гидролиз молекулы иммуноглобулина под действием протеазы папаина обычно ведет к образованию трех фрагментов, два из которых идентичны и относятся к Fab фрагментам, поскольку они сохраняют способность связывать антиген,присущую исходной молекуле иммуноглобулина. Расщепление иммуноглобулина ферментом трипсином обычно приводит к образованию двух фрагментов антитела, один из которых содержит обе антигенсвязывающие области исходной молекулы, и потому относится к F(ab')2 фрагменту. Восстановление F(ab')2 фрагмента дитиотреитолом или меркаптоэтиламином приводит к образованию фрагмента, являющегосяFab' фрагментом. Фрагмент sFv, являющийся частью одноцепочечного вариабельного участка, который состоит из усеченного Fab фрагмента, включающего вариабельный (V) домен тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, связанного с V доменом легкой цепи через синтетический пептид, может быть получен использованием стандартной технологии рекомбинантной ДНК (см., например, Janeway et al. выше). Сходно, дисульфидно-стабилизированные фрагменты вариабельного участка (dsFv) могут быть получены с применением метода рекомбинантных ДНК (см., например, Reiter et al., Protein Engineering, 7: 697704 (1994. В контексте данного изобретения, однако, фрагменты иммуноглобулинов не ограничиваются описанными типами фрагментов молекул. В данном случае может быть использован любой подходящий фрагмент молекулы иммуноглобулина, который узнается и связывается с желаемым рецептором на поверхности клетки. Далее фрагменты антител описаны, например, в Parham., J. Immunol., 131: 2895-2902(1960). Связывание антитело-антиген может быть детектировано с использованием любого подходящего метода, известного в данной области, например радиоиммунологического анализа (RIA), ELISA, вестернблота, иммунопреципитации и метода конкурентного ингибирования (см., например, Janeway et al. выше,публикацию заявки на патент США 2002/0197266 A1). Помимо этого, антитело может представлять собой химерную молекулу иммуноглобулина или ан-5 013327 тигенсвязывающего фрагмента. Понятие химерный в данном случае означает, что молекула иммуноглобулина состоит по крайней мере из двух различных молекул иммуноглобулинов или их фрагментов,полученных или выделенных из по крайней мере двух различных видов животных (два разных иммуноглобулина, например вариабельный фрагмент молекулы человеческого иммуноглобулина и константный фрагмент мышиного). Антитело также может являться доменспецифичным антителом (dAb) или его антигенсвязывающим фрагментом, таким как, например, верблюжьи антитела (см., например, Desmyter etal., Nature Struct. Biol. 3: 752 (1996 или антитела акулы, такие как, например, новый антигенный рецептор (IgNAR) (см., например, Greenberg et al., Nature, 374: 168 (1995), Stanfield et al., Science, 305: 17701773 (2004. Любое подходящее антитело может быть использовано в контексте изобретения. Например, моноклональные антитела J5 являются мышиными антителами IgG2a, которые специфичны к антигенному маркеру острого лимфобластного лейкоза (CALLA) (Ritz et al., Nature, 283: 583-585 (1980 и могут быть использованы с целевыми клетками, экспрессирующими CALLA (например, клетки острой лимфобластной лейкемии). Моноклональные антитела MY9 являются мышиными IgG1 антителами, которые специфично связывают CD33 антиген (Griffin et al., Leukemia Res., 8: 521 (1984, и могут быть использованы с целевыми клетками, которые экспрессируют CD33 (например, клетки острой миелогенной лейкемии (AML. Аналогично, моноклональные антитела анти-В 4 (также называемые В 4) являются мышиными IgG1 антителами, которые связываются с CD19 рецептором на В-клетках (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244250 (1983 и могут быть использованы для работы с В клетками или клетками, которые экспрессируютCD19 (например, клетки лимфомы не-Ходжкина или хронической лимфобластной лейкемии). N901 мышиные моноклональные антитела, которые связывают CD56 (молекула адгезии нейронных клеток) антиген, найденный на поверхности клеток нейроэндокринного происхождения, включая мелкоклеточную опухоль легких, который может быть использован для направления конъюгата целевых лекарственных средств к клеткам нейроэндокринного происхождения. J5, My9 и В 4 антитела предпочтительно восстанавливают поврежденную поверхность или гуманизируются прежде, чем входят в состав конъюгата. Восстановление и изменение антител описаны, например, в Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 969-73 (1994). Кроме того, моноклональное антитело С 242 связывается с CanAg антигеном (см., например, патент США 5552293) и может быть использовано для направления конъюгата на CanAg экспрессирующие опухоли. Такими являются колоректальная, панкреатическая, немелкоклеточная карцинома легкого и гастральные раковые опухоли. HuC242 является гуманизированной формой моноклонального антитела С 242 (см., например, патент США 5552293). Гибридома, из которой образуются HuC242, зарегистрирована в ЕСАСС под идентификационным номером 90012601. HuC242 могут быть получены с использованием технологии CDR-привития (см. патент США 5585089, 5593761 и 5693762) или технологии восстановления поврежденной поверхности (см., например, патент США 5639641). HuC242 могут быть использованы для направления конъюгата к опухолевым клеткам, экспрессирующим CanAg антиген, таким как,например, колоректальная, панкреатическая, немелкоклеточная карцинома легкого и гастральные раковые клетки. Анти-MUC1 антитела могут быть использованы при работе с клетками опухолей яичников и простаты в качестве связывающего клетки агента в составе конъюгата. Анти-MUC1 антитела включают, например, анти-HMFG-2 (см., например, Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981, hCTM01(см., например, Van Hof et al., Cancer Res., 56: 5179-5185 (1996 и DS6. Раковые клетки простаты также могут быть атакованы конъюгатом антипростатспецифичного мембранного антигена (PSMA) как агента,связывающего клетки, такие как J591 (см., например, Liu et al., Cancer Res., 57: 3629-3634 (1997. Кроме того, раковые клетки, экспрессирующие Her2 антиген, такие как рак молочной железы, простаты и яичников, могут быть атакованы антителами трастузумаба. Анти-IGF-IR антитела, которые связывают рецептор инсулинподобного фактора роста, также могут быть использованы для создания конъюгата. Особенно предпочтительными антителами являются гуманизированные моноклональные антитела,примерами которых являются huN901, HuMy9-6, huB4, huC242, трастузумаб, биватузумаб, сибротузумаб, ритуксимаб (см., например, патенты США 5639641 и 5665357, предварительную заявку на патент США 60/424332 (которая связана с публикацией заявки на патент США 2005/0118183 А 1), международную заявку на патент WO 02/16401, Pedersen et al. выше, Roguska et al. выше, Liu et al. выше, Nadler etal. выше, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995),Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994) и Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997. Наиболее предпочтительно использование гуманизированных моноклональных антител huN901 или huMy9-6. Другие предпочтительные антитела включают CNTO95, huDS6, huB4 и huC242. Другие гуманизированные моноклональные антитела также известны в рамках изобретения и могут быть использованы в связи с изобретением. Хотя связывающимся с клетками агентом предпочтительно является иммуноглобулин, неиммуноглобулины также могут быть использованы. Подходящими молекулами-неиммуноглобулинами являются,например, интерфероны (например, альфа-, бета- или гамма-интерферон), лимфокины (например, интер-6 013327 лейкин-2 (IL-2, IL-3, IL-4 или IL-6), гормоны (например, инсулин), факторы роста (например, EGF, TGF-, FGF и VEGF), колониестимулирующие факторы (например, G-CSF, M-CSF, GM-CSF (см., например, Burgess,Immunology Today, 5: 155-158, 1984, соматостатин и трансферрин (см., например, O'Keefe et al., J. Biol.Chem., 260: 932-937 (1985. Например, GF-CSF, который связывается миелоидными клетками, может быть использован как связывающийся с клетками агент при атаке клеток острой миелогенной лейкемии. Кроме того, IL-2, который связывается с активированными Т-клетками, может быть использован для предотвращения отторжения трансплантата для терапии и профилактики заболеваний трансплантатпротив-хозяина и для лечения острой Т-клеточной лейкемии. Эпидермальный фактор роста (EFG) может быть применен для атаки сквамозных клеток, таких как при раке легких, раке головы и шеи. Соматостатин может быть использован для терапии клеток нейробластомы и других типов опухолевых клеток. Конъюгат может включать любое подходящее лекарственное средство, обычно цитотоксичный агент. В данном случае термин цитотоксичный агент относится к любому соединению, которое вызывает гибель клетки, индуцирует гибель клетки или снижает ее жизнеспособность. Подходящими цитотоксичными агентами являются, например, майтансиноиды и аналоги майтансиноидов, таксоиды,СС-1065 и аналоги СС-1065, доластатин и аналоги доластатина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения цитотоксичным агентом является майтансиноид, включая майтансинол и аналоги майтансинола. Майтансиноиды - соединения, ингибирующие образование микротрубочек и потому высокотоксичные для клеток млекопитающих. Примерами подходящих аналогов майтансинола являются такие, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, а также имеющие модификации в других положениях. Такие майтансиноиды описаны, например, в патентах США 4256746, 4294757, 4307016,4313946, 4315929, 4322348, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4424219, 4371533, 4450254, 5475092,5585499, 5846545 и 6333410. Примерами аналогов майтансинола с модифицированным ароматическим кольцом являются (1) С-19 дехлоро (патент США 4256746) (получаемый LAH восстановлением анзамитоцина Р 2), (2) С-20-гидрокси (или С-20 деметил) С-19-дехлоро (патент США 4361650 и 4307016) (получаемый деметилированием с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорированием с использованием LAH) и (3) С-20-деметокси, С-20 ацилокси (-OCOR) дехлоро (патент США 4294757) (получаемый ацилированием с использованием ацилхлоридов). Примерами аналогов майтансинола, имеющими модификации в других положениях, являются (1)(деметокси/CH2OR) (патент США 4331598), (3) С-14-гидроксиметил или -ацилоксиметил (CH2OH или СН 2 ОАс) (патент США 4450254), (получаемый из Nocardia), (4) С-15 гидрокси/ацилокси (патент США 4364866) (образующийся при конверсии майтансинола Streptomyces), (5) С-15 метокси (патенты США 4313946 и 4315929) (выделяемый из Trewia nudiflora), (6) C-18-N-деметил (получаемый деметилированием майтансинола Streptomyces) (патент США 4362663 и 4322348), (7) 4,5-деокси (патент США 4371533)(получаемый восстановлением майтансинола трихлорид титана/LAH). В предпочтительном варианте осуществления изобретения в составе конъюгата используется тиолсодержащий майтансиноид DM1,также известный как N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансин, как цитотоксичный агент. Структура DM1 представлена формулой (I)-7 013327 В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат включает тиолсодержащий майтансиноид DM4, также известный как N2'-деацетил-N2'-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансин, как цитотоксичный агент. Структура DM4 представлена формулой (II) Другие майтансины также могут быть использованы в рамках данного изобретения, например тиоли дисульфидсодержащие майтансиноиды, имеющие моно- или диалкилзамещения у атома углерода, связанного с атомом серы. Особенно целесообразным является использование майтансиноида, имеющего в С-3 положении:(b) ацилированную аминокислотную группу в боковой цепи с ацильной группой, несущей блокированную сульфгидрильную группу, где углеродный атом ацильной группы, несущий тиольную функцию,имеет один или два заместителя, такие как СН 3, C2H5, линейный или разветвленный алкил или алкенил,имеющие от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и дополнительно, где один из заместителей может представлять собой атом Н и где ацильная группа содержит линейную цепь длиной по меньшей мере 3 атома углерода между карбонильной группой и атомом серы. Дополнительно в рамках данного изобретения могут быть использованы майтансины, включающие соединения, представленные формулой (III) где Y' представляет собой (CR7R8)l(CR9=CR10)pCCqAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBr(CR3R4)nCR1R2SZ; где R1 и R2, каждый независимо, представляют собой СН 3, С 2 Н 5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и где, кроме того, R2 может быть также атомом Н; где А, В, D представляют собой циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода,простой или замещенный арил, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12, каждый независимо, представляют собой Н, СН 3, С 2 Н 5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где l, m, n, о, р, q, r, s и t представляют собой, каждый независимо, 0 или целое число от 1 до 5, при условии, что по крайней мере два индекса из l, m, n, о, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно, и где Z представляет собой Н, SR или COR, где R представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы. В предпочтительном варианте соединения формулы (III) включают соединения общей формулы(III), где (a) R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил и Z представляет собой Н, (b) R1 и R2 представляют собой метил и Z представляет собой Н, (с) R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил и Z представляет собой -SCH3, (d) R1 и R2 представляют собой метил и Z представляет собой-SCH3. Такие майтансины также включают соединения, представленные формулой (IV-L), (IV-D) или где Y представляет собой (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ; где R1 и R2, каждый независимо, представляют собой CH3, С 2 Н 5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, и где R2 также может быть Н; где R3, R4, R5, R6, R7 и R8, каждый независимо, представляют собой Н, СН 3, C2H5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где l, m и n, каждый независимо, являются целыми числами от 1 до 5, кроме того, n может быть равно 0; где Z представляет собой Н, SR или COR, где R представляет собой линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, и где May представляет собой майтансиноид, который имеет в боковой цепи гидроксиметил в С-3 и С-14 положениях, С-15 гидрокси или С-20 десметил. Предпочтительные варианты формул (IV-L), (IV-D) и (IV-D,L) включают соединения формул(IV-L), (IV-D) и (IV-D,L), где (а) R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил, каждый R5, R6,R7 и R8 представляют собой Н, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z представляет собой Н, (b) R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7 и R8 представляют собой Н, l и m равны 1, n равно 0, Z представляет собой Н, (с) R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил, каждый R5, R6, R7 и R8 представляют собой Н, каждый l и m равен 1, n равно 0, Z представляет собой -SCH3 или (d) R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7 и R8 представляют собой Н, l и m равны 1, n равно 0, Z представляет собой -SCH3. Предпочтительный в рамках данного изобретения цитотоксичный агент представлен общей формулой (IV-L). Дополнительные предпочтительные майтансины представлены формулой (V) где Y представляет собой (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ; где R1, R2, каждый независимо, представляет собой СН 3, С 2 Н 5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, кроме того, R2 может быть атомом Н; где R3, R4, R5, R6, R7 и R8 представляют собой, каждый независимо, СН 3, С 2 Н 5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,-9 013327 содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где l, m и n, каждый независимо, являются целыми числами от 1 до 5, кроме того, n может быть равно 0 и где Z представляет собой Н, SR или COR и R представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы. Предпочтительные варианты формулы (V) включают соединения общей формулы (V), где (a) R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил, каждый R5, R6, R7 и R8 представляют собой Н; каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z представляет собой Н, (b) R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5,R6, R7 и R8 представляют собой Н, l и m равны 1, n равно 0 и Z представляет собой Н, (с) R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил, каждый R5, R6, R7 и R8 представляют собой Н, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z представляет собой -SCH3, или (d) R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7 иR8 представляют собой Н, l и m равны 1, n равно 0, Z представляет собой -SCH3. Другие предпочтительные майтансины включают соединения, представленные общей формулой где Y2 представляет собой (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2; где R1 и R2, каждый независимо, представляют собой CH3, С 2 Н 5, линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, кроме того, R2 может быть атомом Н; где R3, R4, R5, R6, R7 и R8, каждый независимо, представляют собой Н, CH3, С 2 Н 5, линейный циклический алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где l, m и n независимо являются целыми числами от 1 до 5, кроме того, n может быть равно 0; где Z2 представляет собой SR или COR и R представляет собой линейный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, где May представляет собой майтансиноид. Другие предпочтительные майтансины включают соединения, представленные общей формулойR1R2SZ2, где R1 и R2 представляют собой, каждый независимо, СН 3, С 2 Н 5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы, и, кроме того, R2 может быть атомом Н; А, В и D представляют собой, каждый независимо, циклоалкил или циклоалкенил, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 представляют собой, каждый независимо, Н, СН 3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющие от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил- 10013327 или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы; где l, m, n, о, р, q, r, s и t являются, каждый независимо, 0 или целым числом от 1 до 5, при условии,что по крайней мере два индекса из l, m, n, о, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно и где Z2 представляет собой SR или -COR, где R представляет собой линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикалы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединения формулы (VII) включают соединения, где R1 представляет собой Н, R2 представляет собой метил. В дополнение к майтансиноидам цитотоксичный агент, используемый при приготовлении конъюгата, может являться таксаном или его производным. Таксаны - семейство соединений, которое включает паклитаксел (Taxol), цитотоксичное природное соединение и доцетаксел (Taxotere), полусинтетическое производное, которые широко применяются при лечении рака. Таксаны - яды митотического веретена, ингибирующие деполимеризацию тубулина, что приводит к гибели клетки. Доцетаксел и паклитаксел являются полезными препаратами при лечении раковых заболевания, их антиопухолевая активность ограничена, поскольку они обладают также неспецифичной токсичностью к нормальным клеткам. Кроме того, соединения, подобные паклитакселу и доцетакселу, сами по себе недостаточно активны для использования в конъюгатах агентов, связывающих клетки. Предпочтительный таксан для приготовления цитотоксичного конъюгата представляет собой таксан формулы (VIII) Методы синтеза таксанов, которые могут быть использованы в контексте изобретения, вместе с методами конъюгации таксанов с клеточносвязывающими агентами, такими как антитела, описаны в патентах США 5416064, 5475092, 6340701, 6372738, 6436931, 6596757, 6706708 и 6716821 и в публикации заявки на патент США 2004/0024049 А 1. Цитотоксичными также могут быть СС-1065 или его производные. СС-1065 - эффективный антиопухолевый антибиотик, выделенный из культуры streptomyces zelesins в жидкой среде. СС-1065 примерно в 1000 раз более эффективен in vitro, чем обычно применяемые антираковые препараты, такие как доксорубицин, метотрексат и винкристин (Bhuyan et al., Cancer Res., 42: 3532-3537 (1982. СС-1065 и его аналоги были раскрыты в патентах США 5585499, 5846545, 6340701 и 6372738. Цитотоксичные свойства СС-1065 корреллируют с его алкилирующей активностью и его ДНК-связывающей и ДНК-интеркалирующей активностью. Две эти активности относятся к разным частям молекулы. В этом отношении алкилирующая активность сосредоточена в циклопропапирролоиндольной (CPI) субъединице, а ДНК-связывающая активность сосредоточена в двух пирролоиндольных субъединицах СС-1065. Несколько аналогов СС-1065 известны в данной области и могут быть использованы в конъюгате в качестве цитотоксического агента (см., например, Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31: 590-603 (1988. Был получен ряд аналогов СС-1065, в которых CPI фрагмент был замещен циклопропабензиндолфрагментом (CBI) (Boger et al., J. Org. Chem., 55: 5823-5833 (1990) и Boger et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.,1: 115-120 (1991. Эти аналоги СС-1065 сохраняют in vitro активность исходного лекарственного средства, но не вызывают у мышей запаздывающей токсичности. Как и СС-1065, эти соединения являются алкилирующими агентами, которые ковалентно связываются с малой бороздкой ДНК и таким образом вызывают гибель клетки. Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть значительно улучшена изменением его внутриклеточного распределения in vivo путем направленного транспорта к опухолевому центру, что привело к снижению токсичности по отношению к нераковым тканям и, таким образом, более низкой системической токсичности. С этой целью были получены конъюгаты аналогов и производных СС-1065 с клеточносвязывающими агентами, которые специфически воздействуют на раковые клетки (см., например, патенты США 5475092, 5585499 и 5846545). Эти конъюгаты обычно демонстрируют высокую специфическую цитотоксичность in vitro и антиопухолевую активность в модельных ксенотрансплантатных человеческих опухолях в мышах (см., например, Chari et al., Cancer Res., 55: 4079-4084 (1995.- 11013327 Методы синтеза аналогов СС-1065 детально описаны в патентах США 5475092, 5585499, 5846545,6534660, 6586618 и 6756397 и публикации заявки на патент США 2003/0195365 А 1. Такие лекарственные средства, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, калихеамицин, тубулизин и аналоги тубулизина, дуокармицин и аналоги дуокармицина, доластатин и аналоги доластатина могут быть использованы в рамках изобретения. Соединения доксарубицин и даунорубицин (см., например, патент США 6630579) могут быть также использованы в качестве лекарственных средств. Конъюгаты лекарственных средств могут быть получены методами in vitro. Для того чтобы связать лекарственное средство или пролекарство с антителом, используется связывающая группа. Подходящими связывающими группами, хорошо известными в данной области, являются дисульфидные группы,лабильные кислые группы, фотолабильные группы, пептидные лабильные группы и эфирные лабильные группы. Предпочтительными связывающими группами являются дисульфидные. Например, конъюгаты могут быть образованы с использованием реакции дисульфидного обмена между антителом и лекарственным средством или пролекарством. Молекулы лекарственного средства также могут быть связаны со связывающим клетки агентом через промежуточную линкерную молекулу, например сывороточный альбумин. В соответствии с изобретением связывающийся с клетками агент модифицируется путем взаимодействия бифункционального сшивающего реагента со связывающимся с клетками агентом с образованием ковалентной связи между линкерной молекулой и связывающимся с клетками агентом. Использованный в настоящем описании термин бифункциональный сшивающий агент представляет собой любую химическую частицу, которая ковалентно связывает агент, связывающийся с клетками, с лекарственным средством, таким как лекарственные средства, описанные в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления изобретения часть связующего фрагмента предоставляется лекарственным средством. В этом отношении лекарственное средство включает связывающий фрагмент, который является частью большой линкерной молекулы, которая используется для присоединения связывающегося с клетками агента к лекарственному средству. Например, для образования майтансиноида DM1 боковая цепь в С-3 положении гидроксильной группы майтансина модифицируется с образованием свободной сульфидрильной группы (SH). Эта тиольная форма майтансиноида может реагировать с модифицированным связывающимся с клетками агентом с образованием конъюгата. Поэтому полученный линкер состоит из двух компонентов, один из которых представляет собой сшивающий агент, а другой - боковую цепь DM1. Любой подходящий бифункциональный сшивающий агент может быть использован в связи с изобретением, поскольку линкерный агент предусматривает сохранение терапевтической активности, например цитотоксичности, и направляющих свойств лекарственного средства и связывающегося с клетками агента соответственно. Предпочтительно, чтобы линкерная молекула присоединяла лекарственное средство к агенту, связывающемуся с клетками, через химические связи (как описано выше), так что лекарственное средство и связывающийся с клетками агент будут связаны друг с другом химически (т.е. ковалентно). Предпочтительно, чтобы связывающий агент являлся расщепляемым линкером. Более предпочтительно, чтобы линкер расщеплялся в мягких условиях, например в условиях, соответствующих внутриклеточному состоянию, чтобы лекарственное средство не было затронуто. Примерами подходящих линкерных молекул являются дисульфидные линкеры, кислотные лабильные линкеры, фотолабильные линкеры, пептидазные лабильные линкеры и сложноэфирные лабильные линкеры. Дисульфидсодержащие линкеры представляют собой линкеры, расщепляемые через дисульфидный обмен, который может происходить в физиологических условиях. Кислотные линкеры представляют собой линкеры,расщепляемые при кислых рН. Например, некоторые внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, имеют кислые рН (рН 4-5) и обеспечивают подходящие условия для расщепления кислотных линкеров. Фотолабильные линкеры полезны для использования на поверхности тела и в полостях тела, доступных для проникновения света. Кроме того, инфракрасный свет может проникать в ткани. Пептидазные лабильные линкеры могут быть использованы для расщепления определенных пептидов внутри или снаружи клетки (см., например, Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 626-629 (1982) иUmemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989. Предпочтительно, чтобы лекарственное средство было связано со связывающим клетки агентом через дисульфидные связи. Линкерная молекула содержит активную химическую группу, которая может взаимодействовать со связывающим клетки агентом. Предпочтительно активной химической группой в данной реакции с агентом, связывающимся с клетками, являются N-сукцинимидильные сложные эфиры и N-сульфосукцинимидильные сложные эфиры. Кроме того, линкерная молекула содержит активную химическую группу, предпочтительно дитиопиридильную группу, которая может взаимодействовать с лекарственным средством с образованием дисульфидной связи. В частности, предпочтительными линкерными молекулами являются, например, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см.,например, Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978, N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат(см., например, CAS регистрационный номер 341498-08-6) и другие активные линкерные молекулы, опи- 12013327 санные в патенте США 6913748. Хотя в изобретении предпочтительно использование расщепляемых линкеров, нерасщепляемые линкеры также могут быть использованы для получения вышеописанных конъюгатов. Нерасщепляемые линкеры представляют собой любые химические компоненты, способные к связыванию лекарственного средства, такого как майтансиноид, таксан или аналог СС-1065 со связывающим клетки агентом стабильным ковалентным образом. Так, нерасщепляемые линкеры весьма устойчивы к кислотному расщеплению, световому расщеплению, пептидазному расщеплению, сложноэфирному расщеплению и расщеплению дисульфидной связи, в условиях, когда лекарственное средство и связывающий клетки агент сохраняют свою активность. Подходящие сшивающие агенты, которые образуют нерасщепляемые линкеры между лекарственным средством и связывающимся с клетками агентом, хорошо известны в рамках изобретения. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, содержащие N-сукцинимидильный сложный эфир или N-сульфосукцинимидильную эфирную группу для реакции со связывающим клетки агентом, а также малеимидо- или галогенацетил-фрагмент для реакции с лекарственным средством. Сшивающий агент, содержащий малеимидный фрагмент, включает N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является "длинноцепочечным" аналогом SMCC (LC-SMCC), N-сукцинимидильный эфир -малеимидоундеканоевой кислоты (KMUA), N-сукцинимидильный эфир -малеимидобутировой кислоты (GMBS), N-гидроксисукцинимидный эфир -малеимидокапроновой кислоты (EMSC), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), N-(-малеимидоацетокси)сукцинимидный эфир (AMAS), сукцинимидил-6-(-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH),N-сукцинимидил 4-(парамалеимидофенил)бутират (SMPB) и N-(парамалеимидофенил)изоцианат (PMPI). Сшивающие агенты, содержащие галогенацетил-фрагмент, включают N-сукцинимидил-4-(йодацетил)аминобензоат(SIAB), N-сукцинимидил йодацетат (SIA), N-сукцинимидил бромацетат (SBA) и N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP). Другие сшивающие агенты, не содержащие атома серы, образующего нерасщепляемые линкеры,также могут быть использованы в настоящем изобретении. Такие линкеры могут быть получены из фрагментов дикарбоксильной кислоты. Подходящие фрагменты дикарбоксильной кислоты включают, но не ограничиваются, ,-дикарбоксильными кислотами общей формулы (IX) где X представляет собой линейный или разветвленный алкил, алкенил или алкинил, имеющие от 2 до 20 атомов углерода, Y представляет собой циклоалкильную или циклоалкенильную группы, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, Z представляет собой замещенную или незамещенную ароматическую группу, имеющую 6-10 углеродных атомов, или замещенную или незамещенную гетероциклическую группу, где гетероатом выбирают из N, О или S и где каждый l, m и n равен 0 или 1, при условии,что l, m и n одновременно не равны нулю. Многие из нерасщепляемых линкеров, описанных в настоящем описании, детально описаны в заявке на патент США 10/960602, который соответствует публикации заявки на патент США 2005/0169933 А 1. Кроме того, как описано в патенте США 6441163 В 1, лекарственное средство может быть вначале модифицировано введением активной эфирной группы, подходящей для взаимодействия со связывающимся с клетками агентом. Реакция таких майтансиноидов, содержащих активированную линкерную часть, со связывающимся с клетками агентом представляет другой способ получения расщепляемого или нерасщепляемого конъюгата, связывающегося с клетками агента и майтансиноида. Дополнительная информация касательно майтансиноидов, цитотоксических агентов, включая конъюгаты лекарственных средств и связанные с ними методы получения, описаны в заявке на патент США 11/352121 и заявке на патент США 10/849136, которая соответствует публикации заявки на патент США 2004/0235840 A1. Следующие примеры иллюстрируют изобретение, однако, безусловно, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его пределы. Пример 1. Данный пример демонстрирует очистку антител, модифицированных гетеробифункциональным модифицирующим реагентом с использованием TFF. Моноклональные антитела huN901 (конечная концентрация 8 мг/мл) были инкубированы с Nсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноатом (SPP, 5,6-кратный молярный избыток) в течение приблизительно 180 мин при 20 С в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 50 мМ NaCl, 2 мМEDTA и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена с использованием колонки со смолой Sephadex G25F, уравновешенной и промытой 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 50 мМ NaCl и 2 мМ EDTA. Во второй группе реакционная смесь была очищена с использованием Pellicon XL TFF системы (Millipore, Billerica, MA) и антитела были диафильтрованы (5 об.) в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6,5), содержащем 50 мМ NaCl и 2 мМ EDTA с использованием отрезной мембраны с молекулярным весом 10000 (Ultracel регенерируемая целлюлозная мембрана Millipore,Billerica, MA). Оба образца были конъюгированы с DM1 (1,7-кратный молярный избыток по отношениюEDTA и DMA в конечной концентрации 3%. В обеих группах выходы были определены спектрофотометрически (длина волны 280 нм) в целом для стадий модификации и очистки. Соотношения линкер/антитело были также определены обработкой дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1 см-1 при 343 нМ. Соотношение лекарственное средство/антитело было определено спектрофотометрически(длина волны 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. Кроме того, очистка от SPP-производных малых молекул было измерена с помощью Hisep HPLS. Таблица 1 Методы очистки для модифицированного huN901 с использованием G-25F и TFF Как видно из табл. 1, при использовании TFF продукт (конъюгат лекарственного средства) образуется, по крайней мере, в эквивалентном качестве по сравнению с использованием неадсорбционной хроматографии (G25), в то время как сам процесс более удобный и гибкий. Пример 2. Данный пример демонстрирует метод очистки антител, модифицированных гетеробифункциональным модифицирующим реагентом с помощью адсорбционной хроматографии. Антитела huB4 были модифицированы N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноатом (SPDB,5,4-кратный молярный избыток) в течение 120 мин при комнатной температуре в растворе 50 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5), содержащем 50 мМ NaCl, 2 мМ EDTA и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена на колонке со смолой Sephadex G25F, как описано в примере 1. Во второй группе реакционную смесь пропускали через колонку с керамическим гидроксиапатитом (СНТ, BioRad Laboratories, Hercules, CA), которая была уравновешена 12,5 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5) и элюировалась 80 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5). В обеих группах выход и соотношение линкер/антитело были определены так же, как описано в примере 1. В первой группе выход был равен 91% и соотношение линкер/антитело было равно 4,2. Во второй группе выход был равен 89% и соотношение линкер/антитело - 4,2. Антитела CNTO95 (конечная концентрация 10 мг/мл) были модифицированы с помощью N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноатом (SPDB, 4,5-кратный молярный избыток) в течение 120 мин при 20 С в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 2,7% сахарозу и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена на Sephadex G25F в 12,5 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6,6), содержащем 12,5 мМ NaCl и 0,5 мМ EDTA. Во второй группе реакционную смесь пропускали через колонку с SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ), которая была уравновешена 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,5) и элюировалась 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,5),содержащим 50 мМ NaCl. В обеих группах выход и соотношение линкер/антитело были определены, как описано в примере 1. В первой группе выход был равен 96% и соотношение линкер/антитело составляло 4,0. Во второй группе выход был равен 97% и соотношение линкер/антитело составляло 4,1. Данные, полученные в этом примере, показывают, что адсорбционная хроматография может быть использована для очистки антител, модифицированных гетеробифункциональным модифицирующим реагентом. Пример 3. Данный пример демонстрирует преимущества конъюгации модифицированного антитела с лекарственным средством при рН свыше 6,5. В первом опыте антитела CNTO95 были модифицированы и очищены, как описано в примере 2. Модифицированные антитела были затем разделены на две группы. В первой группе конъюгация проводилась в 12,5 мМ фосфате калия при рН 6,5, содержащем 12,5 мМ NaCl, 0,5 мМ EDTA, 3% DMA и 1,7-кратный молярный избыток лекарственного средства по отношению к линкеру при 20 С. Во второй группе реакцию конъюгирования проводили при рН 7,5. Конъюгированные антитела были очищены на колонке NAP-10.- 14013327 Соотношение лекарственное средство/антитело было определено для обеих групп. Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2 Соотношение лекарственное средство/антитело в реакции конъюгации при рН 6,5 и 7,5 Как показывают данные, приведенные в табл. 2, процесс конъюгации при рН 7,5 протекает быстрее,чем при рН 6,5. Во втором эксперименте гуманизированные моноклональные антитела huB4 были модифицированы либо (а) 4,9-молярным избытком SPDB по отношению к антителам, или (b) 4,8-молярным избыткомSPDB по отношению к антителам. В обоих случаях реакция проводилась в буфере, содержащем 50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида калия и 2 мМ EDTA (рН 6,5) в 5% этаноле в течение 120 мин при комнатной температуре. Образец (а) был очищен на колонке Sephadex G25F, уравновешенной 50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ EDTA при рН 6,5. Образец (b) был очищен аналогичным образом, но рН буфера был доведен до 7,5. Оба образца были конъюгированы с DM4 (1,7-кратный молярный избыток по отношению к связанному линкеру) в течение 18 ч при комнатной температуре до конечной концентрации диметилацетамида (DMA) 3%. Таким образом, образец (а) был конъюгирован при рН 6,5, а образец (b) при рН 7,5. Затем образцы были очищены на колонке Sephadex G25F, уравновешенной 9,6 мМ фосфата калия и 4,2 мМ хлорида натрия при рН 6,5. Оба образца были инкубированы при 4 С в течение 7 месяцев, в течение которых был несколько раз определен выход свободного лекарственного средства. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Высвобождение свободного лекарственного средства со временем из образцов, конъюгированных при рН 6,5 и 7,5 Как показывают данные, приведенные в табл. 3, высвобождение свободного лекарственного средства происходит заметно медленнее из образца (b), который был конъюгирован при рН 7,5 по отношению к образцу (а), который был конъюгирован при рН 6,5. Соответственно, конъюгат, полученный при рН 7,5, оказывался более стабильным по сравнению с конъюгатом, полученным при рН 6,5, судя по высвобождению свободного лекарственного средства со временем. Конъюгация при рН 7,5 также показала лучшее включение лекарственного средства, чем при рН 6,5, что означает, что для проведения реакции требуется меньшее количество лекарственного средства. Пример 4. Данный пример демонстрирует положительные стороны конъюгации модифицированного антитела с лекарственным средством при рН ниже 6,0. Моноклональное антитело huN901 (конечная концентрация 8 мг/мл) было инкубировано сN-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноатом (SPP, 5,6-кратный молярный избыток) в течение примерно 180 мин при 20 С в растворе 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 50 мМ NaCl,2 мМ EDTA и 5% этанол. В первой группе реакционная смесь была очищена на колонке со смолойSephadex G25F, уравновешенной 50 мМ буфером натрий-цитрата (рН 5,0), содержащего 50 мМ NaCl,2 мМ EDTA. Во второй группе реакционную смесь очищали на колонке со смолой Sephadex G25F,уравновешенной 50 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 50 мМ NaCl, 2 мМ EDTA. Оба образца были конъюгированы с DN4 (1,7-кратный молярный избыток) в течение 3, 19, 25, 48 и 120 ч при- 15013327 комнатной температуре при конечной концентрации диметилацетамида (DMA) 3%. Так, первая группа образцов была конъюгирована в 50 мМ натрий-цитратном буфере (рН 5,0), содержащем 50 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, а вторая группа образцов была конъюгирована в 50 мМ натрийфосфатном буфере (рН 6,5), содержащем 50 мМ NaCl и 2 мМ EDTA. Затем образцы очищали на колонке со смолой Sephadex G25F, уравновешенной и элюированной 50 мМ калий-фосфатным буфером(рН 6,5), содержащим 50 мМ NaCl. В обеих группах соотношение линкер/антитело было определено обработкой дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1 см-1 при 343 нм. Соотношение лекарственное средство/антитело было определено спектрофотометрически (длина волны 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. В первой группе соотношение линкер/антитело оказалось равным 4,3. Во второй группе соотношение линкер/антитело оказалось равным 4,3. Изменение соотношения лекарственное средство/антитело с течением времени для двух групп приведено в табл. 4 Таблица 4 Уровень включения DM1 в SPP-модифицированные huN901 в зависимости от рН реакции конъюгации Как видно из данных, приведенных в табл. 4, при проведении конъюгации модифицированных антител с лекарственным средством при рН 5,0 уровень связанного лекарственного средства оказывается выше и достигает более стабильного уровня в процессе конъюгации, чем при проведении реакции при рН 6,5. Кроме повышенной стабильности, результаты показывают, что при рН 5,0 достигается более высокий уровень отношения лекарственное средство/антитело, чем при конъюгации того же количества лекарственного средства при рН 6,5, свидетельствуя, таким образом, о более эффективном протекании реакции при рН 5,0. В обеих группах количество мономерного конъюгата было определено в зависимости от времени. Полученные данные приведены в табл. 5. Таблица 5 Влияние рН конъюгации на уровень мономерного конъюгата при протекании конъюгации SPP-модифицированных huN901 с DM1 Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 5, конъюгат, полученный при реакции модифицированных антител с лекарственным средством при рН 5,0, имеет более высокий уровень конъюгированного мономера, чем при рН 6,5. Пример 5. Этот пример демонстрирует прочие преимущества конъюгации модифицированного антитела с лекарственным средством при рН ниже 6,0. Антитела BIWA 4 были модифицированы SPP (молярный избыток SPP показан в табл. 6) в течение 120-140 мин при комнатной температуре в 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,5), содержащего 50 мМ NaCl, 2 мМ EDTA и 5% этанол. Аликвоты модифицированных антител были очищены на колонках NAP 25, уравновешенных буферами с различными значениями рН (рН 4,6-6,5). Буферы с рН 4,6-5,9 состояли из 35 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 2 мМ ЭДТА. Буфер с рН 6,5 представляет собой PBS с 2 мМ ЭДТА. Модифицированные антитела при каждом значении рН были конъюгированы с DM1 (1,7-кратный молярный избыток по отношению к линкеру) в диметилацетамиде (DMA, конечная концентрация 3%).- 16013327 После инкубации в течение 17-18 ч при комнатной температуре образцы конъюгированных антител были очищены хроматографией на колонках NAP35, уравновешенных PBS (рН 6,5). Соотношения линкер/антитело (L/A в табл. 6) были определены с помощью обработки дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1 см-1 при 343 нм. Соотношение лекарственное средство/антитело было определено спектрофотометрически (длина волны 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. Мономер конъюгата, высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты были определены SEC-HPLC на TSKG3000SWXL колонках, уравновешенных и проявленных в 0,2 М калийфосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,2 М хлорида калия и 20% изопропанола. Результаты анализа представлены в табл. 6. Таблица 6 Характеристики продукта конъюгата лекарственного средства в зависимости от рНDM1 протекала эффективно при рН ниже 6,0, по сравнению с конъюгацией при рН 6,5. Количество линкера и лекарственного средства, а именно SPP линкера и DM1, требуемое для достижения итогового соотношения лекарственное средство/антитело, было меньше при более низких значениях рН. Кроме того,уровни мономерного конъюгата, высокомолекулярных компонентов и низкомолекулярных компонентов были оптимальны, и выход продукта увеличивался при низких значениях рН. Пример 6. Данный пример показывает, что стадия очистки модифицированных антител может по желанию быть опущена. Лекарственное средство может быть добавлено в реакционную смесь одновременно с бифункциональным модифицирующим реагентом или несколько позже. В данном примере добавления лекарственного средства после модифицирующего реагента гуманизированные моноклональные антитела CNTO95 в концентрации 20 мг/мл были модифицированы бифункциональным модифицирующим реагентом SPDB при молярном избытке SPDB по сравнению с антителами в 4,6 раза в течение 120 мин при 20 С. Модифицирующий буфер: 44 мМ фосфатный буфер(рН 7,5), содержащий 5,3% сахарозу и 5% этанол. Одна аликвота модифицированных антител была очищена на смоле Sephadex G25F (стандартный 4-стадийный процесс), уравновешенной и промытой 12,5 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 12,5 мМ NaCl, и затем конъюгирована с DN4(1,7-кратный молярный избыток) до конечной концентрации модифицированных антител 10 мг/мл в 12,5 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержавшем 12,5 мМ NaCl и 10% DMA в течение 20 ч при комнатной температуре. Вторая аликвота модифицированных антител была введена в реакцию конъюгации немедленно по истечении 120 мин реакции модификации (3-стадийный процесс), без дальнейшей очистки. Концентрации белка и буфера в реакционной смеси были подобраны с тем, чтобы обеспечить выход модифицированного белка 10 мг/мл. Состав буфера: 28 мМ фосфата калия (рН 7,5), содержащий 5,9 мМ NaC и 2,7% сахарозы. Затем в реакционную смесь был введен DM4 (1,7-кратный избыток по отношению к исходному SPDB) и конечная концентрация DMA была доведена до 10%. После 20 ч инкубации при комнатной температуре обе аликвоты конъюгированных антител были очищены на колонке со смолой Sephadex G25F, уравновешенной 10 мМ гистидином и 10% сахарозой при рН 5,5. Соотношения линкер/антитело (L/A) были определены обработкой дитиотреитолом с освобождением пиридин-2-тиона, коэффициент экстинкции которого 8,080 М-1 см-1 при 343 нм. Соотношение лекарственное средство/антитело (D/A) было определено спектрофотометрически (длины волн 280 и 252 нм) для стадии конъюгации. Количество мономера было определено с помощью SEC-HPLC. Количество свободного лекарственного средства было определено с помощью SEC-HPLC на колонке Hisep. Результаты приведены в табл. 7.- 17013327 Таблица 7 Возможность исключения стадии очистки для модифицированных антител Как свидетельствуют результаты, приведенные в табл. 7, стадия очистки модифицированных антител может быть опущена в контексте изобретения. Пример 7. Данный пример демонстрирует улучшенный способ очистки антител, модифицированных бифункциональным модифицирующим реагентом и затем конъюгированных с майтансиноидом. Антитела huN901, модифицированные SPP (7-кратный молярный избыток) и очищенные на колонке со смолой Sephadex G25F, как описано в примере 1, были конъюгированы с майтансиноидом DM1(1,7-кратный молярный избыток) по отношению к линкеру, растворенным в диметилацетамиде DMA в конечной концентрации 3%. Первый образец конъюгата был очищен с использованием стандартной хроматографии на колонке со смолой Sephadex G25F, уравновешенной фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 6,5). Второй образец конъюгата был очищен на Pellicon XL TFF (Millipore, Billerica, MA), как описано в примере 1. Третий образец конъюгата был очищен с использованием колонки МЕР Hypercell, уравновешенной 50 мМ Tris (рН 8,0), и элюирован 50 мМ ацетатом натрия (рН 4,0). Четвертый образец конъюгата был очищен с использованием колонки со смолой UNOsphere S,уравновешенной 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5), и элюирован 0,2 М NaCl и 50 мМ фосфатом натрия(рН 6,5). Пятый образец конъюгата был очищен с использованием колонки со смолой СНТ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) уравновешенной 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5), и элюирован 0,3 М NaCl и 50 мМ фосфатом натрия (рН 6,5). Шестой образец конъюгата был очищен с использованием колонки со смолой SP Sepharose, уравновешенной 35 мМ цитратом натрия, 10 мМ хлоридом натрия (рН 5,0), и элюирован 0,25 М NaCl, 35 мМ цитратом натрия (рН 5,0). Мономер конъюгата был детектирован с помощью SEC-HPLC на колонке со смолойTSKG3000SWXL, уравновешенной 0,2 М калий-фосфатным буфером при рН 7,0, содержащим 0,2 М хлорида калия и 20% изопропанола. Выход стадии конъюгации был определен нормированием выхода конъюгированных антител на количество модифицированных антител, введенных в реакцию (определялось спектрофотометрически при длине волны 280 нм). Результаты данного анализа представлены в табл. 8. Таблица 8 Сравнение стадии очистки конъюгации Результаты, приведенные в табл. 8, показывают, что методы очистки, предложенные в данном изобретении (группы 2-6), дают результаты, подобные полученным для контрольного образца (группа 1). Каждый хроматографический метод в данном изобретении давал улучшение в уровне мономерного конъюгата и может быть использован широкомасштабно. Кроме СНТ (керамический гидроксиапатит), CFT (керамический фторапатит) также может быть использован в подобных хроматографических условиях. И СНТ, и CFT могут быть использованы в неадсорбционном методе, поскольку целевой продукт (в основном мономерный конъюгат) не удерживается смолой, в то время как высокомолекулярные компоненты смеси удерживаются, что приводит к отделе- 18013327 нию целевого продукта. Хотя стандартный буфер/растворитель для конъюгата содержит 3% DMA, 50 мМ фосфата калия,50 мМ NACl и 3 мМ ЭДТА при рН 6,5 (как показано в примере 1), есть более совместимые с некоторыми из хроматографических процедур, описанных в настоящем описании, составы, и они имеют некоторые преимущества по сравнению со стандартными. Например, конъюгация может быть осуществлена в 3%DMA, 12,5 мМ фосфате калия, 12,5 мМ NaCl и 0,5 мМ ЭДТА при рН 6,5. В этих условиях количество включенного DM4 по сравнению с количеством линкера, включенного в huB4 антитела, было примерно на 10% выше, чем в стандартных условиях. Кроме того, эти условия больше подходят для нанесения на смолу, такую как СНТ или катионообменные смолы. Все ссылки, включая публикации, патентные применения и патенты, цитируются в настоящем описании и таким образом включены посредством ссылок в равной степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и специфично приведена в данном документе. Термины "включающий", "обладающий", "содержащий в себе" должны быть истолкованы как неограниченные (т.е. подразумевающие включая, но не ограничиваясь), если не указано обратное. Перечисление диапазонов значений используют для краткого обозначения конкретных индивидуальных значений. Все описанные в настоящем описании методы могут быть реализованы в любом подходящем порядке, если другое не указано здесь или не опровергается напрямую в тексте. Вышеприведенные рамки использования терминов представляют собой не более чем методологические указания для каждого объекта, находящего в пределах списка объектов, если не указано другое. Все описанные методы могут быть использованы в любом порядке, если не указано другое. Использование любых грамматических конструкций, ссылающихся на конкретные примеры (например такой как), приведенные в тексте, ставит целью исключительно иллюстрацию изобретения и не ограничивает рамки использования изобретения,если не указано другое. Ничто в описании изобретения не должно быть рассмотрено как указание на какой-либо не описанный здесь элемент, необходимый для использования изобретения. Предпочтительные способы реализации изобретения приведены ниже, включая способ, оптимальный с точки зрения авторов. В процессе ознакомления с вышеприведенным описанием варианты предпочтительных способов реализации могут быть очевидны для специалистов в данной области. Авторы предполагают, что в случае необходимости практикующие специалисты применят указанные способы реализации; в целом же изобретение предполагается использовать в соответствии с представленным в данном патенте методом. Соответственно, изобретение включает все варианты и эквиваленты объекта изобретения, изложенные в формуле изобретения, прилагаемой ниже, в соответствии с законодательством. Кроме того, любые комбинации вышеописанных элементов во всех возможных вариантах охватываются изобретением, если иное не указано или не следует со всей очевидностью из контекста. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ приготовления конъюгата антитело-цитотоксический агент, включающий следующие стадии:(a) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры;(b) очистку первой смеси тангенциальным проточным фильтрованием, селективным осаждением,адсорбционным фильтрованием или адсорбционной хроматографией с получением очищенной первой смеси, содержащей антитела и связанные с ними линкеры;(c) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в очищенной первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН менее 6 или при рН более 6,5 с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ii) свободный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС 1065; и(d) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования или адсорбционной хроматографии для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси. 2. Способ по п.1, в котором адсорбционная хроматография выбрана из группы, включающей гидроксиапатитную хроматографию, гидрофобную хроматографию с индуцированным градиентом (HCIC),хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), ионнообменную хроматографию, ионнообменную хроматографию смешанного типа, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла(IMAC), хроматографию с окрашенным лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и комбинацию этих методов. 3. Способ по п.1, в котором тангенциальное проточное фильтрование используют на стадиях (b) и (d). 4. Способ по п.1 или 2, в котором адсорбционную хроматографию используют на стадиях (b) и (d).- 19013327 5. Способ по п.1 или 2, в котором если тангенциальное проточное фильтрование используют на стадии (b),то адсорбционную хроматографию не используют на стадии (d). 6. Способ по п.1 или 2, в котором адсорбционную хроматографию используют на стадии (b) и тангенциальное проточное фильтрование используют на стадии (d). 7. Способ по любому из пп.1-6, в котором раствор на стадии (с) имеет рН от примерно 4 до менее 6. 8. Способ по любому из пп.1-6, в котором раствор на стадии (с) имеет рН от более 6,5 до примерно 9. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором раствор на стадии (с) содержит сахарозу. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором раствор на стадии (с) дополнительно содержит буферные агент,выбранный из группы, включающей цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер. 11. Способ приготовления конъюгата антитело-цитотоксический агент, включающий следующие стадии:(a) взаимодействие антитела с бифункциональным сшивающим агентом для ковалентного присоединения линкера к антителу с образованием первой смеси, содержащей антитела и связанные с ним линкеры;(b) конъюгацию цитотоксического агента с антителами, несущими связанные с ним линкеры, в первой смеси путем взаимодействия антитела, несущего связанные с ними линкеры, с цитотоксическим агентом в растворе при рН от примерно 4 до примерно 9 с образованием второй смеси, содержащей (i) антитело, химически связанное через линкер с цитотоксическим агентом, (ii) свободный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, образованные на стадии (b), где цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноида, таксанов и СС 1065; и(с) очистку второй смеси путем тангенциального проточного фильтрования, селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии или их комбинации для очистки антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом, от остальных компонентов второй смеси и таким образом получение очищенной второй смеси антител, химически связанных через линкеры с цитотоксическим агентом; при условии, что первую смесь не подвергают очистке путем тангенциального проточного фильтрования,селективного осаждения, адсорбционного фильтрования, адсорбционной хроматографии. 12. Способ по п.11, где первую смесь не подвергают очистке. 13. Способ по п.11 или 12, в котором адсорбционная хроматография выбрана из группы, включающей гидроксиапатитную хроматографию, гидрофобную хроматографию с индуцированным градиентом (HCIC), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), ионнообменную хроматографию, ионнообменную хроматографию смешанного типа, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла (IMAC), хроматографию с окрашенным лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и комбинацию этих методов. 14. Способ по любому из пп.11-13, в котором раствор на стадии (b) имеет рН от примерно 4 до примерно 6. 15. Способ по любому из пп.11-13, в котором раствор на стадии (b) имеет рН от примерно 6,5 до примерно 9. 16. Способ по любому из пп.11-13, в котором раствор на стадии (b) имеет рН менее 6 или более 6,5. 17. Способ по любому из пп.11-16, в котором раствор на стадии (с) содержит сахарозу. 18. Способ по любому из пп.11-17, в котором раствор на стадии (b) дополнительно содержит буферный агент, выбранный из группы, включающей цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер. 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором антителом является моноклональное антитело. 20. Способ по п.19, в котором антителом является гуманизированное моноклональное антитело. 21. Способ по п.20, в котором антитело выбирают из группы, состоящей из huN901, huMy9-6, huB4,huC242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, CNTO95, huDS6 и ритуксимаба. 22. Способ по любому из пп.1-21, в котором цитотоксическим агентом является майтансиноид. 23. Способ по п.22, в котором майтансиноид содержит тиольную группу. 24. Способ по п.23, в котором майтансиноид представляет собой DM1. 25. Способ по п.23, в котором майтансиноид представляет собой DM4. 26. Способ по любому из пп.1-25, в котором антитело химически связано с цитотоксическим агентом через химические связи, выбранные из группы, включающей дисульфидные связи, кислотные лабильные связи, фотолабильные связи, пептидазные лабильные связи, простые тиоэфирные связи и сложноэфирные лабильные связи.