Пептиды с цитопротекторной активностью и фармацевтическая композиция

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЗАМЕРТОН ХОЛДИНГС ЛИМИТЕД (CY) Изобретение относится к медицине и касается пептидов, обладающих цитопротекторной активностью, выбираемых из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-AspGlu-NH-СН 2-СН 3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, Ala-Asp-Glu,Lys-Asp-Glu и Asp-Glu-Gly, при этом пептиды являются химически стабильными при хранении. Также предложена фармацевтическая композиция, содержащая в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-GluNH-СН 2-СН 3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, Ala-Asp-Glu,Lys-Asp-Glu или Asp-Glu-Gly. Выраженное цитопротекторное действие позволяет использовать фармацевтическую композицию в пищевой, косметологической и фармацевтической промышленности. Изобретение относится к медицине и касается биологически активных пептидов, обладающих цитопротекторой активностью, и фармацевтической композиции на их основе. Уровень техники Известен ряд коротких пептидов, содержащих в своей структуре производные дипептида Y-L-GluL-Asp-X и имеющие свойства межклеточных медиаторов [патенты РФ 2177802; 2161501; 2301074; 2304444; 2155063]. Недостатком этих соединений является их химическая неустойчивость и склонность к самопроизвольным перегруппировкам. В случае, если X - остаток глицина, происходит самопроизвольная миграция этого остатка от -карбоксила аспарагиновой кислоты к -карбоксилу. И хотя это превращение может происходить в случае любой аминокислоты, скорость этой реакции сильно зависит от стерических препятствий [Pharmactutical Research, Vol. 11,5, 1994, p. 751-758; Pharmactutical Research,Vol. 7,8, 1990, p. 787-793]. В случае, если X - остаток пролина или любое другое органическое соединение с вторичной аминогруппой, то происходит самопроизвольный разрыв связи между этими остатками [Synthetic peptides, Sec. ed., Gregory A. Grant, Oxford Univ. Press 2002, p. 283]. Следует отметить, что эти превращения приводят к частичной рацемизации остатка аспарагиновой кислоты. Раскрытие изобретения Авторами настоящего изобретения впервые предложены пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NHCH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH. Пептиды, предлагаемые в соответствии с настоящим изобретением, оказывают выраженное цитопротекторное действие, при этом являются химически стабильными при хранении. Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием, содержащая в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-ОСН 3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH или H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом HAsp-Glu-NH-CH2-CH3 (DENHEt); фиг. 2 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидомAc-Asp-Glu-OH (AcDE); фиг. 3 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом HAsp-Glu-OCH3 (DEOMe); фиг. 4 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом HVal-Asp-Glu-OH (VDE); фиг. 5 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом HLeu-Asp-Glu-OH (LDE); фиг. 6 - количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом HAla-Asp-Glu-Arg-OH (ADER); фиг. 7 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3 (DENHEt); фиг. 8 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом Ac-Asp-Glu-OH (AcDE); фиг. 9 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe); фиг. 10 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом VDE; фиг. 11 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом LDE; фиг. 12 - уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ADER; фиг. 13 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-NH-СН 2-СН 3 (DENHEt) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина; фиг. 14 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-NH-СН 2-СН 3 (DENHEt) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина; фиг. 15 - протективное действие пептида Ac-Asp-Glu-OH (AcDE) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина; фиг. 16 - протективное действие пептида Ac-Asp-Glu-OH (AcDE) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина; фиг. 17 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина; фиг. 18 - протективное действие пептида H-Asp-Glu-OCH3 (DEOMe) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина; фиг. 19 - протективное действие пептида H-Val-Asp-Glu-OH (VDE) на клетки NIH3T3 в присутст-1 020866 вии капмтотецина; фиг. 20 - протективное действие пептида H-Val-Asp-Glu-OH (VDE) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина; фиг. 21 - протективное действие пептида H-Leu-Asp-Glu-OH (LDE) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина; фиг. 22 - протективное действие пептида H-Leu-Asp-Glu-OH (LDE) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина; фиг. 23 - протективное действие пептида H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH (ADER) на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина; фиг. 24 - протективное действие пептида H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH (ADER) на клетки HeLa в присутствии капмтотецина. Осуществление изобретения Настоящее изобретение впервые обеспечивает биологические активные пептиды, обладающие цитопротекторной активностью и выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3,H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, причм пептиды являются химически стабильными при хранении. Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, обладающую цитопротекторным действием, содержащую в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей AcAsp-Glu-OH, H-Asp-Glu-ОСН 3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH или HAla-Asp-Glu-Arg-OH. Обнаруженный цитопротекторный эффект позволяет использовать предложенную фармацевтическую композицию в пищевой, косметологической или фармацевтической промышленности. Примером ацетилированного на N-конце пептида является пептид Ac-Asp-Glu-OH (AcDE). Примеры, иллюстрирующие соединения со сложноэфирной связью на С-конце, являются пептиды H-Asp-GluОСН 3. Примером соединения с амидной связью на С-конце является пептид Н-Asp-Glu-NH-СН 2-СН 3. Синтез пептидов осуществляют с использованием общепринятых в химии биологически активных пептидов методических приемов [А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Химический синтез пептидов. Киев, Наукова думка, 1992 г.; Пептиды, основные методы образования пептидных связей. Москва, "Мир", 1983 г.],как представлено в примерах 1-6. Условные сокращения:HeLa (ATCC Number - CCL-2.2, subclone S3) - клетки аденокарциномы матки человека эпителиальной морфологииEDTA - этилендиаминтетраацетат. Исследование стабильности пептидов при хранении осуществляли в соответствии с примером 7. Представленные результаты (табл. 1) свидетельствуют о том, что пептиды в соответствии с изобретением хорошо хранятся в растворах при различных значениях рН. Исследование биологической активности пептидов было проведено с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека: NIH3 Т 3 и HeLa S3 соответственно (пример 8). Биологическая активность каждого пептида была определена по следующим параметрам: влияние на пролиферативную активность клеток и способность вызывать апоптоз и некроз. Для этого были исследованы следующие показатели: доля погибших (с поврежденной плазматической мембраной) клетокNIH3 Т 3 при обработке пептидами от общего количества клеток (результаты представлены на фиг. 1-6), и уровень апоптотической гибели клеток. Апоптотическую гибель клеток оценивали по доле клеток HeLa S3 с гиподиплоидным содержанием ДНК. Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагментированная ДНК, которая удаляется из клеток во время обработки раствором HCl. Результаты определения апоптотической гибели клеток HeLa S3 после инкубации с пептидами представлены на фиг. 7-12. Протекторные свойства пептидов были продемонстрированы в экспериментах по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека: NIH3 Т 3 и HeLa S3 (пример 9). Апоптоз - программируемая клеточная гибель, являющаяся результатом реализации генетической программы или ответом на внешние факторы и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул. Апоптоз сопровождается появлением характерных цитологических признаков (маркеров апоптоза) и молекулярных процессов. В живых клетках, в частности, наблюдается асимметричное распределение различных фосфолипидов между внутренним и наружным монослоями цитоплазматической мембраны: фосфолипиды, содержащие холин, такие как фосфатидилхолин и сфингомиелин, локализованы в основном в наружном монослое, а фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин (аминофосфолипиды) - во внутреннем. В процессе апоптоза цитоплплазматическая мембрана претерпевает изменения, одним из которых является переход фосфатидилсерина из внутреннего ее монослоя в наружный, где фосфатидилсерин оказывается доступным для связывания с Annexin-V, кальцийзависимым, фосфолипидсвязывающим белком с мол. массой 35-36 кДа, обладающим высоким сродством к фосфатидилхолину(Kд равна 510-10 М). Annexin-V-связывающий анализ основан на быстром и высокоспецифическом выявлении клеток, содержащих фосфатидилхолин в наружном монослое цитоплазматической мембраны,т.е. клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза. Данные процентного содержания апоптотических и некротических клеток в популяциях HeLa S3 иNIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях представлены в табл. 2. На гистограммах(фиг. 13-24) представлено процентное содержание апоптотических и некротических клеток в популяцияхHeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях. Из приведенных гистограмм и данных, представленных в табл. 2, видно, что исследуемые пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 400 нг/мл оказывают выраженное защитное действие на клетки HeLaS3 и NIH3T3, т.е. обладают цитопротективной активностью. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена в виде таблеток, капсул с использованием фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и приемов, традиционных для данной области техники, а также может быть выполнена в виде раствора для инъекций. Кроме того, композиция может быть выполнена в виде капель, или раствора для приема внутрь, или в виде спрея назального или капель назальных, аэрозоля подъязычного или орального, или в виде порошка, или в виде лиофилизата для приготовления раствора. Перечисленые формы фармацевтической композиции получают известными методами. Композицию согласно изобретению вводят перорально или парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно). Для получения фармацевтической композиции согласно изобретению используют любые фармацевтически приемлемые носители или растворители. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков и тому подобного. Таблетки, содержащие различные наполнители, например цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция или любые другие фармацевтически приемлемые наполнители, применяются вместе с различными дезинтеграторами, например крахмалом, предпочтительно картофельным крахмалом или тапиокой, сложными силикатами или любыми другими фармацевтически приемлемыми дезинтеграторами,вместе со связывающими веществами, например поливинилпирролидоном, сахарозой, желатином, аравийской камедью, любыми другими фармацевтически приемлемыми связывающими веществами. Кроме того, часто применяются скользящие вещества, например стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк для таблетирования или любые другие фармацевтически приемлемые вещества. Композиции согласно изобретению также применяются в мягких и твердых заполненных желатиновых капсулах; предпочтительные в этом случае материалы включают, например, лактозу или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высоким молекулярным весом. Если для перорального введения желательны водные суспензии и/или эликсиры, соединения этого изобретения могут сочетаться с различными подслащивающими средствами, улучшающими вкус и запах, подкрашивающими веществами, эмульгирующими веществами и/или суспендирующими средствами, а также растворителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различные подобные их комбинации. Для парентерального введения могут использо-3 020866 ваться растворы в кунжутном или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле, так же как и стерильные водные растворы соответствующих водорастворимых солей. Такие водные растворы могут быть соответственно буферными, если необходимо, и водный растворитель сначала изотонируют с помощью достаточного количества раствора соли или глюкозы. Эти водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи используемые водные среды легко можно получить с помощью стандартных методик, хорошо известных специалистам. Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит в эффективном количестве пептиды, выбираемые из группы, включающей Ac-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-OCH3, H-Asp-Glu-NH-CH2-CH3, HVal-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH или H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция согласно предложенному изобретению содержит пептид(ы) от 10 до 95 мас.%. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Синтез пептида Ac-Asp-Glu-OH (AcDE).Boc-Asp(OBzl)-Glu (OBzl)-Obzl. К охлажденному до -20 С раствору 48,5 г (150 ммоль) Boc-Asp(Bzl)-OH в 300 мл ДМФ добавляли 16,5 мл (150 ммоль) NMM и 19,5 мл (150 ммоль) изобутилхлороформиата и перемешивали в течение 15 мин. Смесь перемешивали при той же темпиратуре 20 мин. Далее прибавляли охлажденный до -20 С раствор 74,5 г (155 ммоль) аминокомпонента H-Glu(Bzl)-OBzlTos в 200 мл ДМФ, содержащий 17 млNMM (155 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -10 С, в течение 2 ч при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате (500 мл) и последовательно промывали 5% NaHCO3, H2O, 2% H2SO4, H2O (дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопропиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 500 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 89 г (89%) хроматографически однородного продукта. 12,64 г (20 ммоль) защищенного дипептида 1 растворяли в 100 мл хлороформа и к полученному раствору при 0 С прибавляли 100 мл трифторуксусной кислоты, смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и растворители упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 300 мл этилацетата и промывали 5% раствором бикарбоната 3 раза по 200 мл. Органический слой отделяли, сушили над безводнымNa2SO4 и этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 300 мл диметилформамда и к полученному раствору прибавляли 3,6 г (20 ммоль) паранитрофнилового эфира уксусной кислоты. Смесь оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток растворяли в этилацетате и промывали 5% водным раствором аммиака до исчезновения следов паранитрофенола (контороль по ТСХ), водой до рН 6-7, органический слой отделяли, сушили и этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Pd/C при комнатной темпиратуре. После завершения гидрирования катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 300 мл воды, повторно упаривали до половины объема и лиофилизовали. Получили 5,2 г (85,8%) целевого ацильного производного дипептида. По данным ВЭЖХ чистота продукта больше 95%. В спектре ПМР:Z-Asp(OBut)-Glu(OBut)-OCH3. 10,0 г (46,3 ммоль) H-Glu(OBut)-OCH3 растворяли в 300 мл диметилфорамида и при комнатной температуре прибавляли 19,7 г ( 47 ммоль) Z-Asp(OBut)-ONSu. Через 12 ч (контроль - ТСХ в системе хлороформ:метанол:уксусная кислота - 9:1:0.5 "Б") реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали последовательно 2% серной кислотой, водой, сушили над Na2SO4, упаривали. Остаток растворяли в 100 мл эфира. Вещество кристаллизуется при 4 С. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Получено 20 г (80,3%) хроматографически однородного вещества. 20 г (37 ммоль) полученного выше соединения растворяли в 100 мл хлороформа и к раствору прибавляли 100 мл трифторуксусной кислоты. Смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Растворители упаривали. Остаток растворяли в этилацетате и промывали водой, 1-2% раствором бикарбоната натрия и снова водой. Органический слой отделяли, сушили и растворитель упаривали. Остаток растворяли в 10% водном метиловом спирте и гидрировали над 5% Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывали, метанол упаривали. Продукт высаживали эфиром. Твердый осадок отфильтровывали и сушили на воздухе. Получено 9,6 г (94%) искомого метилового эфира. В спектре ПМР:Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)-NH-CH2-CH3. К охлажденному до -20 С раствору 6,46 г (20 ммоль) Вос-Asp(OBzl)-OH в 100 мл диметилформамида добавляли 2,22 мл (20 ммоль) N-метилморфолина и 2,6 мл (20 ммоль) изобутилхлороформиата,перемешивали в течение 15 мин и прибавляли охлажденный до -20 С раствор 5,0 г (21 ммоль) аминокомпонента H-Glu(Bzl)-NHEt в 40 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -10 С, в течение 2 ч при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате(дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопропиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 50 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 9,9 г (85%) хроматографически однородного продукта. 5,86 г (10 ммоль) защищенного дипептида, полученного, как описано выше, растворяли в 50 мл хлороформа и к полученному раствору при 0 С прибавляли 50 мл трифторуксусной кислоты, смесь выдерживали 1 ч при комнатной температуре и растворители упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 100 мл этилацетата и промывали 5% раствором бикарбоната 3 раза по 200 мл. Этилацетат упаривали. Остаток растворяли в 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Pd/C при комнатной температуре. После завершения гидрирования ( контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали,остаток растворяли в 300 мл воды, повторно упаривали до половины объема и лиофилизовали. Получили 2,57 г (95%) целевого дипептида. По данным ВЭЖХ чистота продукта больше 95%. В спектре ПМР:Z-Glu(OtBu)-ArgOH. К раствору 104,4 г (228 ммоль) Z-Glu(OtBu)-ONP в 0,5 л диметилформамида прибавляли 38,3 г (228 ммоль) H-Arg-OH. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 ч. Затем выдерживали при температуре 4 С 4 ч, образовавшийся осадок отфильтровывали и промывали на фильтре 0,4 л смеси диметилформамид-эфир (1:2), 0,45 л эфира, 0,4 л гексана. Сушили. Выход: 91,7 г (82,3%) хроматографически однородного Z-Glu(OtBu)ArgOH, контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислотаZ-Asp(OBu)-Glu(OBu)-Arg-OH. Раствор 90,6 г (185 ммоль) Z-Glu(OtBut)-ArgOH в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5%Pd/C. После окончания гидрирования (контроль по ТСХ в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота,5:3:1) катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 75,9 г (185 ммоль) ZAsp(OtBu)-ONP, реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 ч до завершения реакции (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносили на колонку с силикагелем (400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали (контроль в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, растворители упаривали. К остатку проливали 400 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получили 103 г (84%) хроматографически однородного защищенного трипептида. Раствор 100 г (150 ммоль) Z-Asp(Bu)-Glu(OtBut)-ArgOH в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5% Pd/C. После окончания гидрирования (контроль по ТСХ в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1) катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 51,6 г (150 ммоль) Z-Ala-ONp. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 ч до завершения реакции (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносили на колонку с силикагелем (примерно 400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали (контроль в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, 5:3:1). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, растворители упаривали. К остатку проливали 400 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и сушили. Получили 95 г (86%) хроматографически однородного защищенного тетрапептида. Полученный продукт растворяли в 500 мл трифторуксусной кислоты и смесь выдерживали 2 ч при комнатной температуре. Кислоту упаривали, к остатку приливали 1000 мл диэтилового эфира, образовавшийся аморфный осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром два раза по 150 мл и сушили. Вещество растворяли в 1500 мл смеси воды с этиловым спиртом и гидрировали в токе водорода над 10% Pd/C. По окончании гидрирования (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали и растворители упаривали до масла, растворяли в 300 мл воды и наносили на колонку с SP-сефадексом. Колонку промывали двумя объемами 0,05 М пиридин-ацетатного буфера и смывали вещество тем же 0,2 М буфером. Фракции, содержащие продукт, объединяли, растворители упаривали, повторно упаривали с водой для удаления остатков пиридин-ацетата и лиофилизовали. Получили 60 г (82%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%. В спектре ПМР:Z-Val-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2. 10 г (15,8 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2 растворяли в 200 мл TFA, выдерживали 1 ч при комнатной температуре, кислоту упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого DMF и прибавляли порциями Na2CO3 до прекращения выделения СО 2. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл DMF, прибавляли 3,33 мл (30 ммоль) N-метилморфолина и 5,57 г (16 ммоль) Z-Val-ONSu, оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали на 80%, к образовавшемуся сиропообразному остатку прибавляли 800 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 ч при +4 С, осадок отфильтровывали,промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход 10,3 г (82%) продукта. 10,3 г (13,4 ммоль) защищенного трипептида при нагревании до +50 С растворяли в 1000 мл АсОН + 100 мл воды до полного растворения осадка и гидрировали, периодически подогревая реакционную смесь. После окончания реакции (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали до консистенции жидкого масла и прибавляли 800 мл изопропилового спирта. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Вещество растворяли в деионизированной воде, упаривали остатки изопропилового спирта и лиофилизировали. Получали 4,4 г (92%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%. В спектре ПМР:Z-Leu-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2. 12,6 г (20,0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)2 растворяли в 200 мл TFA, выдерживали 1 ч при комнатной температуре, кислоту упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого DMF и прибавляли порциями Na2CO3 до прекращения выделения СО 2. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл DMF, прибавляли 3,33 мл (30 ммоль) N-метилморфолина и 5,0 г (20 ммоль) Z-Leu-ONSu, оставляли на 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали на 80%, к образовавшемуся сиропообразному остатку прибавляли 800 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 ч при +4 С, осадок отфильтровывали,промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход: 13,3 г (84%) продукта. 13 г (16,7 ммоль) защищенного трипептида при нагревании до +50 С растворяли в 1000 мл АсОН + 100 мл воды до полного растворения осадка и гидрировали, периодически подогревая реакционную смесь. После окончания реакции (контроль по ТСХ) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали до консистенции жидкого масла и прибавляли 800 мл изопропилового спирта. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Вещество растворяли в деионизированной воде, упаривали остатки изопропилового спирта и лиофилизировали. Получали 5,5 г (87%) целевого продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%. В спектре ПМР:Glu - 4.20 (-СН); 1.97, 1.78 (-СН 2); 2.26 (-СН 2); 8.19 (NH). Пример 7. Исследование стабильности пептидов при хранении. Пептиды растворяли в 0,05 М ацетатаммонийном буфере с рН 4.5 и рН 7.5 с таким расчетом, чтобы их концентрация была примерно 1 мг/мл. Растворы стерильно фильтровали и хранили в стерильных, хорошо закупоренных флаконах. По истечении срока хранения вещества анализировали методом ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Стабильность пептидов при хранении Представленные результаты анализов свидетельствуют о том, что продукты хорошо хранятся в растворах при различных значениях рН. Пример 8. Исследование биологической активности пептидов в условиях стандартного культивирования клеток. Было проведено изучение биологической активности синтезированных пептидов в пяти различных концентрациях (400, 200, 100, 10 и 1 нг/мл) с использованием в качестве модельной системы культивируемых клеток мыши и человека NIH3 Т 3 и HeLa S3. Биологическая активность каждого пептида была определена по следующим параметрам: влиянию пептидов на пролиферативную активность клеток и способность пептидов вызывать апоптоз и некроз. Для этого были исследованы действие пептидов на фибробласты NIH3 Т 3 (определение доли погибших клеток после инкубации с пептидами и общего количества клеток) и уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3 после инкубации с пептидами. Культивирование клеток и обработка пептидами. Культивирование фибробластов NIH3 Т 3 проводили в полной питательной среде DMEM (Панэко,РФ), содержащей 10% эмбриональной сыворотки (Панэко), гентамицин 2 ед./мл (Панэко), глютамин 29,2 мкг/мл (Панэко), в СО 2-инкубаторе. Для культивирования использовали флаконы фирмы SPL (Южная Корея) с площадью 25 и 175 см 2. Пересев клеток осуществляли в соотношении 1:5 - 1:7. По достижении примерно 50% конфлюэнтности во флаконы добавляли пептиды в указанных выше конечных концентрациях. В каждом эксперименте использовали по два флакона с одинаковой концентрацией каждого пептида. В контрольные флаконы добавляли соответствующий объем полной среды без пептидов. С каждым пептидом проведено по два независимых эксперимента (по два повтора в каждом). Через 24 ч инкубации с пептидами клетки извлекали из культурального флакона с помощью обработки в смеси трипсина и версена (1:3, Панэко). Клетки из каждого флакона помещали в одинаковый объем забуференного физиологического раствора (0,01 М PBS, рН 7,2). Суспензию клеток делили на 3 равные части для исследования перечисленных выше показателей. Культивирование клеток HeLa выполняли сходным образом за исключением того, что пересев клеток осуществляли в соотношении 1:3-1:4. Исследование показателей осуществляли с помощью проточной цитометрии. Использовали проточный цитофлуориметр-сортировщик FACS Vantage (Becton Dickinson, США). Перед проведением каждой серии анализов прибор тестировали и калибровали по стандартным микросферам (Polyscience) в соответствии с методикой, рекомендованной фирмой-изготовителем. Определение общего количества клеток во флаконе и доли погибших клеток. К суспензии клеток, полученной, как описано выше, добавляли йодистый пропидий (prodium iodide-PI, Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл и калибровочные частицы Calibrite (Becton Dickinson, США), меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦем). Конечную концентрацию калибровочных частиц определяли с помощью камеры Горяева. Инкубировали 10-12 мин и немедленно анализировали на проточном цитометре по 4 параметрам - прямое светорассеяние, боковое светорассеяние, флуоресценция PI, флуоресценция ФИТЦа. В каждом образце анализировали по 20 тыс. клеток. Данные записывали в файл. Затем проводили компьютерную обработку данных с помощью программы CellQuestPro(Becton Dickinson, США). Определяли долю PI+ клеток с поврежденной плазматической мембраной (погибшие клетки). Уровень гибели в контрольных флаконах (15-20 шт.) усредняли и принимали за 100%. Возможное влияние пептидов оценивали по соотношению с контролем. В каждом файле выявляли ФИТЦ+ калибровочные частицы и определяли их количество. Затем по показателям светорассеяния идентифицировали клетки и находили их количество в тех же файлах. Рассчитывали соотношение клеток/калибровочных частиц в каждом файле (образце), по которому судили о количестве клеток во флаконе. Соотношение клеток/калибровочных частиц в контроле принимали за 100%. Количество клеток в опытных флаконах оценивали в процентах по сравнению с контролем. Ре-7 020866 зультаты представлены на фиг. 1-6. Определение гибели клеток путем апоптоза. Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагментированная ДНК, которая удаляется из клеток во время обработки раствором HCl. Затем оставшуюся в клетках ДНК окрашивают специфическими красителями, например PI (пропидиум йодид), и определяют поклеточное содержание ДНК. Апоптотическую гибель клеток оценивают по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК. Суспензию клеток, полученную, как описано выше, охлаждали до +4 С. К суспензии клеток добавляли охлажденный этанол в объемном соотношении 1:3 при постоянном перемешивании. Клетки хранили 1-2 недели до анализа. При помощи центрифугирования удаляли этанол из образцов, затем удаляли фрагментированную ДНК из клеток с помощью 0,6 М HCl (37 С, 10 мин). Далее клетки отмывали PBS и окрашивали в 0,3 мл раствора PI (50 мкг/мл) в PBS, выдерживали 15 мин при комнатной температуре и анализировали на проточном цитометре. PI в данной концентрации позволяет проводить определение поклеточного содержания ДНК и выявлять фракцию клеток с фрагментированной ДНК с высоким разрешением. Для измерения флуоресценции PI использовали узкополосные фильтры 585/42 нм, мощность лазера составляла 57 мВт. В каждом образце анализировали 5103 клеток, затем проводили компьютерную обработку с использованием программы CellQuestPro (Becton Dickinson, США). На первом этапе анализа выделяли регион клеток по светорассеянию, затем в этом регионе оценивали флуоресценцию PI. Маркер гиподиплоидного содержания ДНК выставляли по контрольным образцам. Результаты определения апоптотической гибели клеток HeLa S3 после инкубации с пептидами представлены на фиг. 7-12. Пример 9. Изучение протекторных свойств пептидов. В экспериментах по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз использовали набор реагентовApoTarget Annexin-V FITC Apoptosis Kit (Invitrogen, США). Помимо Annexin-V, меченного флуоресцентным красителем FITC, набор реагентов ApoTarget Annexin-V FITC Apoptosis Kit содержит краситель пропидиум йодид (PI). PI обладает способностью проникать только в те клетки, у которых нарушена целостность цитоплазматической мембраны, что является одним из характерных признаков поздних стадий апоптоза или некроза. Проникнув в клетки с поврежденной клеточной мембраной, PI связывается с ДНК."Красная" флуоресценция образовавшихся комплексов выявляется с помощью поточного цитофлуориметра. Таким образом, используя процедуру двойного окрашивания клеток (Annexin-V FITC плюс PI) и метод поточной цитофлуорометрии можно различать 3 популяции клеток и определять их процентное соотношение: 1) неапоптотические клетки (Annexin-V-негативные и PI-негативные), 2) клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза (Annexin-V-позитивные и PI-негативные), 3) некротические клетки или клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза (Annexin-V-позитивные и PI-позитивные). По увеличению доли апоптотических и некротических клеток можно судить о степени влияния добавляемых в среду культивирования соединений на упомянутые процессы. В качестве контроля в экспериментах использовали рекомендуемое производителем соединение камптотецин (Camptothecin, Sigma, США), обладающее ярко выраженной способностью вызывать апоптоз и некроз клеток, в особенности опухолевых. Растворы пептидов в стерильном PBS с концентрациями 1 мг/мл готовили непосредственно перед проведением экспериментов по изучению влияния пептидов на апоптоз и некроз. Для изучения пролиферативной активности использовали те же растворы, которые после приготовления хранили в стерильных пробирках при +4 С. В день проведения каждого эксперимента готовили рабочие разведения пептидов в среде культивирования клеток. Для этого использовали стерильный пластиковый 96-луночный планшет(Corning, США). Разведения готовили таким образом, чтобы при внесении 25 мкл каждого рабочего разведения в экспериментальную лунку с культивируемыми клетками конечные концентрации пептидов составляли 400, 200, 100 и 50 нг/мл. Культивируемые клетки. Для культивирования клеток HeLa S3 и NIH3 Т 3 использовали реагенты компании Invitrogen (США) и пластиковые флаконы, планшеты, пипетки и фильтры компании Corning (США). Клетки культивировали в среде DMEM, приготовленной из сухого концентрата, растворенного в апирогенной дистиллированной воде (Millipore, США). Среда содержала 10% FBS, 2 мМ глутамина и пенициллин-стрептомицин(разбавленный в соответствии с рекомендациями производителя). HeLa S3 и NIH 3 Т 3 выращивали во флаконах Т 150 при +37 С в атмосфере 5,6% СО 2. Клетки постоянно поддерживали в логарифмической фазе роста, для чего рассеивали их не реже 2 раз в неделю, используя трипсин для снятия прикрепленных клеток с поверхности культуральных флаконов. Подсчт живых клеток проводили в гемацитометре после окрашивания аликвоты суспензии трипановым синим. Клетки HeLa S3 и NIH3 Т 3 снимали с поверхности культуральных флаконов, подсчитывали, доводили концентрацию до 105 кл/мл и рассеивали полученные суспензии по 1 мл в лунки 24-луночных культуральных планшетов. На следующий день, убедившись, что клетки прикрепились к поверхности планшетов, среду культивирования во всех лунках меняли на свежую. В контрольные лунки (положительный контроль - стимуляция апоптоза и некроза) добавляли камптотецин до конечной концентрации 50 мкМ, которая была определена в предварительных экспериментах с клетками NIH3 Т 3 и HeLa S3. В контрольные лунки (отрицательный контроль) добавляли 25 мкл свежей среды культивирования в экспериментальные лунки добавляли по 25 мкл рабочих разведений пептидов (каждое рабочее разведение - в 2 повторах) и камптотецин в той же конечной концентрации. Инкубацию проводили при +37 С. Через 24 ч после начала инкубации клетки снимали с поверхности 24-луночных планшетов, переносили из каждой лунки в отдельную центрифужную пробирку объмом 1,5 мл, промывали 1 мл рабочего раствора буфера для связывания красителя Annexin-V FITC и осаждали клетки центрифугированием (Sysmex Platelet Centrifuge PC-810). Супернатант сливали, к клеточному осадку добавляли 5 мкл красителя Annexin-V FITC и 10 мкл красителя пропидиум йодид (PI) и инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре (+25 С). Затем в каждую пробирку добавляли 300 мкл рабочего раствора буфера для связывания Annexin-V FITC и измеряли интенсивности зелной и красной флуоресценции. В полученных распределениях выделяли две популяции - Annexin-Vпозитивные и PI-негативные (клетки, находящиеся в стадии апоптоза) и Annexin-V-позитивные и PIпозитивные клетки (клетки, находящиеся в стадии некроза). На гистограммах (фиг. 13-24) и в табл. 2 представлены данные процентного содержания апоптотических и некротических клеток в популяцияхHeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях. Таблица 2 Процентное содержание апоптотических и некротических клеток в популяциях HeLa S3 и NIH3T3 в присутствии пептидов в 4 различных концентрациях Из приведенных гистограмм и данных, представленных в табл. 2, видно, что исследуемые пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 400 нг/мл оказывают выраженное защитное действие на клетки HeLaS3 и NIH3T3, т.е. обладают цитопротективной активностью. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что лекарственное средство, предлагаемое в соответствии с настоящим изобретением, обладает выраженным цитопротекторным действием и может быть использовано в пищевой, косметологической й фармацевтической промышленности. Пример 10. Приготовление форм композиции. Приготовление раствора для инъекций. Инъекционные растворы получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 510-543). 180 г субстанции пептида растворяют при перемешивании и барботаже азотом в 0,8 л воды для инъекций, добавляют воду для инъекций до общего объема 1,0 л. Проводят стерилизующую фильтрацию полученного раствора и в асептических условиях, осуществляют под азотом его розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Заполненные ампулы запаивают под азотом. Приготовление капсул. Капсулы получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 400-413). Для приготовления капсул смешивают ингредиенты из расчета состава одной капсулы: пептид - 200 мг; вспомогательные вещества (целлюлоза микрокристаллическая, кальция стеарат) - в количестве, достаточном до получения содержимого капсулы массой 300 мг. Состав капсул: красители, желатин. Приготовление таблеток. Таблетки получали общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, т. 2, МТК - Книга; изд-во НФАУ, 2002 г., стр. 335-368). Для приготовления таблеток смешивают ингредиенты из расчета состава одной таблетки: пептид - 250 мг; кремния диоксид коллоидный - 2,5 мг; тальк - 5 мг; лактозы моногидрат - 90 мг; крахмал кукурузный - 102,5 мг. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью, выбираемые из группы, включающей HAsp-Glu-NH-CH2-CH3, H-Val-Asp-Glu-OH, H-Leu-Asp-Glu-OH и H-Ala-Asp-Glu-Arg-OH, или их фармацевтически приемлемые соли. 2. Фармацевтическая композиция, обладающая цитопротекторным действием и содержащая в эффективном количестве пептиды по п.1. 3. Применение пептидов H-Asp-Glu-ОСН 3 и Ac-Asp-Glu-OH в качестве цитопротекторного средства. Фиг. 1 Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом DENHEt Фиг. 2 Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом AcDE Фиг. 3 Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом DEOMe Фиг. 4 Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом VDE Фиг. 5 Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом LDE Фиг. 6 Количество клеток во флаконе и доля погибших PI+ клеток после инкубации с пептидом ADER Фиг. 7 Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом DENHEt Фиг. 8 Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом AcDE Фиг. 9 Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом DEOMe Фиг. 10 Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом VDE Фиг. 11 Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом LDE Фиг. 12 Уровень апоптотической гибели клеток HeLa S3, оцениваемый по доле клеток с гиподиплидным содержанием ДНК, через 24 ч после инкубации с пептидом ADER Фиг. 13 Протективное действие пептида DENHEt на клетки HeLa в присутствии капмтотецина Фиг. 14 Протективное действие пептида DENHEt на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина Фиг. 15 Протективное действие пептида AcDE на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина Фиг. 16 Протективное действие пептида AcDE на клетки HeLa в присутствии капмтотецина Фиг. 17 Протективное действие пептида DEOMe на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина Фиг. 18 Протективное действие пептида DEOMe на клетки HeLa в присутствии капмтотецина Фиг. 19 Протективное действие пептида VDE на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина Фиг. 20 Протективное действие пептида VDE на клетки HeLa в присутствии капмтотецина Фиг. 21 Протективное действие пептида LDE на клетки HeLa в присутствии капмтотецина Фиг. 22 Протективное действие пептида LDE на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина Фиг. 23 Протективное действие пептида ADER на клетки NIH3T3 в присутствии капмтотецина Фиг. 24 Протективное действие пептида ADER на клетки HeLa в присутствии капмтотецина