Биохимический синтез 1,4-бутандиамина

010179 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новому способу биохимического синтеза 1,4-бутандиамина(номер CAS 110-60-1; соединение обозначается также как тетраметилендиамин; в биохимической литературе чаще называется путресцином) в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной ативности по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности. Орнитиндекарбоксилазу ниже мы будем обозначать как ODC. Повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности ниже будем обозначать как повышенный уровень активности ODC. Известно, что,в основном, микроорганизмы, имеющие активность ODC, способны производить полиамины, такие как спермидин и спермин (общепринятые названия для продуктов N-(-3-аминопропил)-1,4-бутандиамин иN,N'-бис-(3-аминопропил)-1,4-бутандиамин, соответственно). Такие соединения, так же, как и сами различные короткие линейные диамины, такие, например, как 1,4-бутандиамин и 1,5-пентандиамин (называемый также кадаверином), в биохимических исследованиях часто называют полиаминами, хотя, исходя из точного химического определения полиаминов, следовало бы ожидать большего числа аминогрупп. Однако для целей настоящей патентной заявки будет применяться термин полиамины в его биохимическом значении, и таким образом, он включает 1,4-бутандиамин. Уровень техники Соединение 1,4-бутандиамин является важным исходным материалом для производства некоторых основных инженерных пластмасс: полиамида-4,6 эфира либо в форме гомополимера, или сополимеризованного, например, с 5% (по весу) полиамид-6 мономером (капролактам). Гомополимер полиамид-4,6(нейлон-4,6) был описан еще в 1938 году (US-A-2, 130948, Carothers). Он представляет собой продукт поликонденсации мономеров 1,4-бутандиамина и адипиновой кислоты. В настоящее время соединения полиамида-4,6 производятся и продаются, главным образом, в Нидерландах под торговым названиемSTANYL. Для синтеза 1,4-бутандиамина известен ряд химических путей. Все эти химические пути имеют недостаток, заключающийся в том, что стартовые материалы должны быть получены из источников, которые рассматриваются как невозобновляемые. Однако существует реальная потребность в обеспечении новыми и подходящими способами синтеза 1,4-бутандиамина из возобновляемых источников углерода и в применении биохимических способов (также называемых биотрансформацией) в живых клетках. В основном, полиамины рассматриваются как токсические соединения для любой клетки или микроорганизма, которые применяются в биохимическом производстве. Таким образом, до настоящего времени считали, что такие новые пути биохимического синтеза являются непривлекательными. Это, например, можно видеть из следующих ссылок: Fukuchi et al., J. Biol. Chem., т. 270 (1995), стр. 18831-18835; и Suzuki et al., Proc. Natl. Sci. USA, т. 91 (1994), стр. 8930-8934. Фукуши и соавт. четко описали снижение жизнеспособности клеток (и синтеза почти всех видов белков), обусловленное аккумуляцией спермидина в дефицитных по спермидинацетилтрансферазе клетках Е. coli (то есть в клетках, где нет ацетилтрансферазы SpeG). Необходимо отметить, что Лимсувум и соавт. (Limsuvum et al., J. Bacteriol. т. 182 (2000) стр. 5373-5380) показали, что при низких температурах таких проблем можно избежать за счет суперэкспрессии гена speG. Спермидин является продуктом, который в клетках производится из 1,4-бутандиамина, используемого в качестве интермедиата. Соответственно, биосинтез 1,4-бутандиамина неминуемо приводит к образованию спермидина. Сузуки и соавт., с одной стороны, также продемонстрировали (на клетках мышей), что суперпродукция ODC приводит к аккумуляции полиаминов, особенно спермидина, и что при добавлении малых количеств спермидина уже наблюдается смерть клеток, даже в клетках, которые не дефицитны по speG. Сузуки и соавт. (цитировано выше) предположили, что эта пониженная жизнеспособность клеток обусловлена недостаточным ингибированием ODC антиферментами по механизму обратной связи и это можно преодолеть путем сверхпродукции подходящего антифермента. Такая суперпродукция антиферментов будет затем снижать продукцию полиаминов в клетках и, таким образом, не является реально возможным для продукции 1,4-бутандиамина. Кроме того, как описали Кашиваги и соавт. (Kashiwagi et al., J. Bacteriol. т. 170 (1988) стр. 31313135), содержание полиаминов в Е. coli может быть изменено за счет суперэкспрессии гена, кодирующего ODC, в частности конститутивно экспрессируемого speC. Для этих экспериментов при клонировании была применена плазмида pODC, произведенная Бойлем и соавт. (Boyle et al., Methods in Enzymology, т. 94 (1983), стр. 117-121). Ясно, что суперпродукция ODC не привела к сильному увеличению уровня 1,4 бутандиамина в клетках. При 70-кратном увеличении уровня ODC наблюдалось не более чем 20% увеличение содержания 1,4-бутандиамина в клетках, независимо от количества орнитина, добавленного к клеткам. Однако, с другой стороны, было показано, что клетки, растущие в присутствии орнитина, демонстрируют повышенную секрецию 1,4-бутандиамина. При 70-кратном избытке в уровне ODC в итоге было обнаружено примерно в 8,5 раз более высокая продукция 1,4-бутандиамина (титр производимого 1,4-бутандиаминабыл приблизительно 20-25 мг/л в сумме для внутри- и внеклеточных концентраций, то есть экстремально низкая концентрация). Авторы предположили, что такая крайне низкая эффективность продукции 1,4-бутандиамина может быть обусловлена уменьшением концентрации орнитина, и попытались решить эту проблему путем подкармливания клеток орнитином снаружи, но добились лишь мини-1 010179 мального улучшения. Соответственно, могло бы показаться, что невозможно обеспечить способы биохимического синтеза для производства 1,4-бутандиамина до значительно более высоких уровней, чем 30 мг/мл. Более того, эти исследования, упомянутые выше, не были направлены на синтез полиаминов(включая 1,4-бутандиамин) как таковой, а пытались обеспечить большее понимание физиологических функций полиаминов на молекулярном уровне. При более высоком уровне орнитина в клетках вероятно также, что больше аргинина будет представлено в клетках. В соответствии с мнением Кашиваги такие более высокие количества аргинина должны оказывать значительный негативный эффект на образование 1,4-бутандиамина. До сих пор ЕР-А-0726240 является одним из немногих патентов, относящихся к биохимическому синтезу полиаминов, включая 1,4-бутандиамин. Однако он описывает, между прочим, продукцию 1,4-бутандиамина путем ферментации природных продуктов, включающих белки в качестве основного компонента. В названном способе природные продукты сначала обрабатывали, подвергая их частичной или полной деградации, а затем любые нежелательные соединения (например, Hg, Cr, As, Cd, Se и Pb), ингибиторы роста клеток, пестициды, антибиотики, детергенты, мыла, жиры, масла, цианиды и фенолы удаляли до стадии ферментации. Путресцин и другие диамины, произведенные таким путем, повторно применяются как удобрения, но включают такое большое количество других веществ, что они могут быть нежелательными в качестве исходного материала для продукции, например, полиамида-4,6. Соответственно, сохраняется потребность в эффективном альтернативном биосинтетическом пути для синтеза 1,4-бутандиамина со значительно более высокими титрами, чем примерно 30 мг/л, предпочтительно даже без потребности во внешнем подкармливании (дорогим) ортинином. Эта потребность в улучшении доступности 1,4-бутандиамина основана, главным образом, на намерении применять его в качестве стартового материала, например для производства полиамида-4,6. В основном, пути получения 1,4-бутандиамина, известные на сегодняшний день, достаточно трудоемки и хлопотливы и могут приводить к получению количества названного продукта, которое без дополнительной очистки трудно будет применять в производстве нейлонов. Известные химические способы получения 1,4-бутандиамина требуют относительно дорогих исходных материалов и реактантов (включая реактанты, с которыми трудно обращаться) и относительно жестких условий реакции (температура и давление) с многостадийным и многореакторным дизайном, а также применения дорогих систем катализа. Соответственно, сохраняется потребность в альтернативных способах получения 1,4-бутандиамина, предпочтительно из менее дорогих исходных материалов, и устранения проблем обращения с реактантами, подобными цианисто-водородной кислоте. Хорошо известно, что природные выращиваемые и, таким образом, возобновляемые материалы из сельскохозяйственной продукции являются основой для источников углерода, таких как глюкоза (или других подходящих источников углерода и их смесей), которые могут быть применены в ферментации. Такие возобновляемые материалы являются относительно дешевыми и доступными в больших количествах. В основном, рассматривается как очень выгодное, если возобновляемые материалы могут быть применены в качестве исходного материала для получения всех видов химических материалов. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных возможностей для крупномасштабного промышленного производства 1,4-бутандиамина путем биотрансформации. Раскрытие изобретения Неожиданно изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что эта цель достигается с применением нового способа биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень ODC активности по сравнению с нативным уровнем ODC активности, где в микроорганизме представлена также увеличенная активность образования N-ацетилглутамата по сравнению с исходным уровнем активности образования N-ацетилглутамата в микроорганизме, и что производимый 1,4-бутандиамин секретируется в среду ферментации и его извлекают из среды ферментации. Как предназначено в настоящей патентной заявке, термин биохимический синтез (термин, который в контексте этой патентной заявки альтернативно рассматривается как биотрансформация) включает не только способы, в которые вовлечены (кроме ряда чисто химических реакционных стадий) одна или более биокаталитическая реакция с применением целых клеток подходящих для продукции штаммов, но также чисто биохимические процессы, применяющие целые клетки подходящих для продукции штаммов. Такие чисто биохимические способы рассматриваются, соответственно, как относящиеся к ферментациям в случае, если биохимический синтез начинается с подходящего источника углерода, или рассматриваются как ферментации предшественника в случае, если биохимический синтез начинается от промежуточного продукта, уже имеющего углеродный скелет, из которого может быть получена молекула-мишень, которая должна быть синтезирована. Эти способы могут осуществляться либо в аэробных,либо в анаэробных условиях. Биокаталитические реакции в биохимических синтезах настоящего изобретения могут быть проведены либо in vivo, либо in vitro. В основном, способы in vivo являются способами, осуществляемыми в том случае, когда применяются живые клетки (термин живые клетки включает здесь также так называемые покоящиеся клетки); способы in vitro, с другой стороны, обычно проводятся с применением лизатов клеток или (частично) очищенных ферментов. В соответствии с настоящим изобретением биохимический синтез проводится в микроорганизме. Это может быть сделано с применением целых клеток, под-2 010179 ходящих для продукции штаммов, но также может осуществляться с применением пермеабилизованных клеток; дифференциация между in vivo и in vitro не имеет, однако, большого смысла для способов, проводимых с пермеабилизованными клетками или с иммобилизованными клетками-хозяевами. Однако будет очевидно, что индивидуальные биокаталитические стадии способа изобретения, когда они проводятся, например, с применением иммобилизованных ферментов, и т.п. рассматриваются как эквиваленты таких стадий в биохимическом синтезе, как предназначено в контексте настоящей заявки. Орнитиндекарбоксилазы (то есть ферменты, имеющие орнитиндекарбоксилазную активность, илиODC) являются ферментами, относящимися к классу КФ 4.1.1.17. При суперпродукции уровень активности орнитиндекарбоксилазы можно легко сравнить с исходным (то есть не сверхпродуцированным) уровнем активности орнитиндекарбоксилазы в стандартных условиях (при 37 С в присутствии орнитина и PLP) в бесклеточных экстрактах, с применением набора реактивов Sigma Diagnostics для обнаружения двуокиси углерода, анализ описан у Остермана и соавт. (Osterman, A.L. et al., 1994, Biochemistry 33, стр. 13662-12667). Специалист, соответственно, может легко установить, имеет ли применяемая орнитиндекарбоксилаза увеличенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ODC) по сравнению с нативным уровнем активности орнитиндекарбоксилазы у применяемого микроорганизма,измеряя содержание белка или определяя уровень РНК. Различные стандартные способы определения содержания белка, например колориметрический, а также спектроскопический, описаны у Лоттцпейха и Зорбаса (Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spekctrum Akademisher Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), главы 3, 5, 21, 22 и 24). Способы определения концентрации белка, а также уровня РНК, например Нозерн-гибридизация, обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция (RT-PCR) и многие другие методы, описаны Самбруком и совт. (J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecularcloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-879-309-6, 1989). Однако специалисту в этой аналитической области известны многие другие стандартные способы, и нет потребности об их упоминании здесь. Подходящей орнитиндекарбоксилазой, которая может быть применена в способе изобретения, являются все ферменты и мутанты этого, которые способны декарбоксилировать орнитин. Любой такой фермент может быть применен в способе изобретения при повышенном уровне активности, то есть в сверхпродуцированной форме. Такой повышенный уровень активности может быть достигнут любыми способами, известными специалисту, например посредством увеличения числа копий гена, или увеличением эндогенной активности или структуры фермента путем мутаций, или с применением дерегулированных ферментов. Однако наиболее предпочтительно это может быть достигнуто посредством суперэкспрессии гена орнитиндекарбоксилазы с повышенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Кроме того, необходимо отметить, что термин повышенный уровень активности, как он применяется здесь для любой специфически названной ферментативной активности, предназначен для включения таких ситуаций, где такая ферментивная активность, например орнитиндекарбоксилаза,вообще не представлена в природном источнике микроорганизма, где реакция имеет место, но вводится туда предположительно путем генетической модификации. В способе в соответствии с изобретением необходимо представить повышенный уровень активности образования N-ацетилглутамата (как дополнительно определяется здесь ниже, когда представлено обсуждение в отношении зависимых пунктов изобретения) по сравнению с исходным уровнем активности образования N-ацетилглутамата в микроорганизме. Сравнение увеличенного и исходного уровней образования N-ацетилглутамата может быть легко проведено, подобно такому определению активности орнитиндекарбоксилазы, с подходящими реакциями тестирования в стандартных условиях (анализ описан в Abadjieva, А., 2001, J. Biol. Chem., 276, стр. 42869-42880) в бесклеточных экстрактах с применением радиоизотопного анализа 1-[14 С]глутамата и ацетил-КоА в качестве субстратов. В соответствии с настоящим изобретением 1,4-бутандиамин производится в микроорганизме с увеличенными активностями орнитиндекарбоксилазы и образования N-ацетилглутамата посредством биотрансформации и секретируется в среду ферментации, окружающую микроорганизм. 1,4-Бутандиамин секретируется в и выделяется из среды ферментации. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается улучшенный биохимический способ синтеза 1,4-бутандиамина и полученный 1,4-бутандиамин является прекрасным исходным материалом для производства, например, полиамида-4,6. Образование 1,4-бутандиамина в больших количествах, как производится в соответствии с изобретением, является наиболее неожиданным из-за факта, что повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (вместе с увеличенной активностью образования N-ацетилглутамата) без каких-либо дополнительных мер, предпринятых для устранения негативных эффектов образования полиаминов на жизнеспособность клеток, могло бы привести к ожиданию смерти клеток. Как упоминалось выше, в способе изобретения может быть применен любой фермент орнитиндекарбоксилазы с увеличенной активностью, например, в суперпродуцированной форме. В соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все орнитиндекарбоксилазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65%, идентичность с орнитиндекарбоксилазным фермен-3 010179 том сравнения из Е. coli и способны катализировать орнитиндекарбоксилазную реакцию. Известны многие орнитиндекарбоксилазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с орнитиндекарбоксилазным ферментом сравнения из Е. coli. Определение процента идентичности с ферментом сравнения может быть выполнено способами,известными специалисту, например путем применения белковой последовательности фермента сравнения как фермента запросов для выполнения поиска в опубликованных базах данных, например идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут быть выполнены с применением программ BLAST (версия 2.2.) и параметров по умолчанию соответствующей программы. См.: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov. Предпочтительно, если увеличенная активность орнитиндекарбоксилазы достигается за счет суперэкспрессии генов speF и speC, кодирующих орнитиндекарбоксилазу (каждый фермент принадлежит к КФ 4.1.1.17), происходящих из одного из родов, выбранных из группы, включающей Escherichia,Shigella, Salmonella, Yersinia и Shewanella. Орнитиндекарбоксилаза speF является индуцибельной орнитиндекарбоксилазой, орнитиндекарбоксилаза speC является конститутивной орнитиндекарбоксилазой. Более предпочтительно, чтобы ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, происходил из одного из видов, выбранных из группы, включающей Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium,Yersinia pestis и Shewanella oneidensis. До сих пор в литературе меньше информации об исследовании гена speC, чем speF. Однако наиболее неожиданно и более предпочтительно, когда наилучшие результаты в соответствии с настоящим изобретением достигаются, если кодирующий орнитиндекарбоксилазу ген является геном speF, более точно speF, происходящим из одного из видов, выбранных из группы,включающей Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Shewanella oneidensis. При сравнении с результатами, полученными с суперэкспрессией конститутивной орнитиндекарбоксилазой, кодируемой геномspeC, безусловно, наилучшие результаты в соответствии с изобретением были достигнуты, когда применяли speF. В контексте настоящей заявки любой ген, будучи гомологичным любому из генов, кодирующих вышеназванные орнитиндекарбоксилазы, и кодирующий ферменты, имеющие активность орнитиндекарбоксилазы, достаточно сравнимую с показанной орнитиндекарбоксилазой, являются подходящими для способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть подходящим образом получены с помощью любой соответствующей стратегии клонирования, известной специалисту, например способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены орнитиндекарбоксилазы могут быть также получены путем целенаправленного конструирования. Термин активность образования N-ацетилглутамата отражает, в контексте настоящей патентной заявки, любую ферментативную активность, обусловленную единственным ферментом или комбинацией ферментов, способную приводить к образованию N-ацетилглутамата в клетке. В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены N-ацетилглутаматсинтазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45%, даже более предпочтительно по меньшей мере 65% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 75%, идентичность с N-ацетилглутаматсинтазой (ферментом сравнения) из Е. coli, которые способны катализировать реакцию образования N-ацетилглутамата. Известны многие N-ацетилглутаматсинтазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. coli. Предпочтительно, увеличенная активность образования N-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии либо гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу (КФ 2.3.1.1), и/или гена argJ, кодирующего N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазу (КФ 2.3.1.35). Очевидно, что любой ген, кодирующий фермент или мутант этого, имеющий такую же функциональность одного из ферментов, как упомянуто выше, будет рассматриваться как являющийся эквивалентом такого фермента в одном из классов КФ 2.3.1.1 или КФ 2.3.1.35. В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения увеличенная активность образования N-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу (КФ 2.3.1.1), происходящего из одного из родов, выбранных из группы, включающейEscherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Photorhabdus и Buchnera. Эти ArgA ферменты требуют присутствия (или источника) коэнзима А, чтобы быть активными в формировании N-ацетилглутамата. В этом воплощении повышенная активность образования N-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу, происходящего из одного из видов,выбранных из группы, включающей Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis,Photorhabdus luminescens и Buchnera aphidicola. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения повышенная активность образования N-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессиии гена argJ, кодирующего N2-ацетил-Lорнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазу (КФ 2.3.1.35), происходящую из одного из родов, выбранных из группы, включающей Bacillus, Listeria, Oceanobacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium,Mycobacterium, Thermobifida, Streptomyces и Bifidobacterium. Подходящие N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазы, которые могут быть примене-4 010179 ны в способе в соответствии с изобретением, являются N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазами, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 40%, идентичность с N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазой из Bacillus (фермент сравнения) и способны катализировать N2 ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазную реакцию. Известно, что многие N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазы имеют такой уровень идентичности с соответствующим ферментом сравнения из Bacillus. В противоположность ферментам ArgA, ферменты ArgJ вообще не требуют присутствия (или наличия источника) кофермента А, будучи активными при образовании N-ацетилглутамата. Соответственно,эти ферменты ArgJ являются явно более предпочтительными, нежели ферменты ArgA, для промышленного применения. В этом другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения повышенная активность образования N-ацетилглутамата достигается путем суперэкспрессии гена argJ, кодирующего N2-ацетилL-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтранферазу, происходящего из одного из видов, выбранного из группы,включающей Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis,Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium leprae, Thermobifidafusca, Streptomyces coelicor и Bifidobacterium longum. В контексте настоящей заявки любой ген, будучи гомологичным любой вышеупомянутой активности образования N-ацетилглутамата и кодирующий ферменты, имеющие активность образования N-ацетилглутамата, достаточно сравнимую с показанной активностью образования N-ацетилглутамата, является подходящим для способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть подходящим образом получены с применением любой стратегии клонирования, известной специалисту, например способами,описанными здесь в экспериментально части. Альтернативно такие эквивалентные гены образования Nацетилглутамата могут быть получены путем целенаправленного конструирования. В дополнительном предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина проводится в микроорганизме, где дополнительно посредством суперэкспрессии получена также увеличенная ферментативная активность для по меньшей мере двух других ферментов, либо:speB (КФ 3.5.3.11; обозначается также как ген, кодирующий агматинуреагидролазу); или(ii) аргининдекарбоксилазы, кодируемой геном speA (КФ 4.1.1.19), и агматиниминогидролазы, кодируемой геном aguA (КФ 3.5.3.12; обозначается также как ген, кодирующий агматиндеиминазу), и Nкарбамоилпутресцинамидогидролазы, кодируемой геном aguB (КФ 3.5.1.53), и при необходимости также агматиназы, кодируемой геном speB (КФ 3.5.3.11). Преимуществом этого дополнительного предпочтительного воплощения является то, что 1,4-диаминобутан образуется даже в больших количествах. Суперэкспрессия, как предназначено для использования здесь, может быть достигнута любым способом, известным специалисту; например путем увеличения транскрипционной и/или трансляционной эффективности соответствующего гена, но также любыми другими известными способами, такими как увеличение количества копий гена, или путем увеличения эндогенной активности или структуры ферментов за счет мутаций, или путем применения дерегулированных ферментов. Как предназначено в части (i) дополнительного предпочтительного воплощения, упомянутая здесь выше комбинация SpeA иSpeB предназначена для представления любой функциональной комбинации (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) SpeA и SpeB. Фактически эта комбинация может быть также обозначена как SpeAB. Часть (ii) этого отражает, что в таких комбинацияхSpeA и SpeB сама SpeB часть может быть заменена любой функциональной комбинацией (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) AguA и AguB. Яновиц и соавт. (Janowitz et al., FEBS Letters 544 (2003), 258-261) описали, что агматиндеиминазаal., Microbiology, 149 (2003), 707-714), что превращения, катализируемые SpeB, могут также катализироваться ферментами, имеющимися у растений, а именно комбинированным действием агматиндеиминазыAguA и N-карбамоилпутресцинамидогидролазы AguB. Соответственно, вместо этого, или даже в комбинации со SpeB, в контексте настоящего изобретения могут быть применены также AguA и AguB. Источниками таких aguA и aguB генов могут быть Arabidopsis thaliana и Lycopersicon esculentum, но сравнимые гены могут быть обнаружены у мутантов Pseudomonas aeroginosa. В контексте настоящей заявки любой ген, гомологичный любым вышеупомянутым аргининдекарбоксилазам, соответственно, агматиназам или агматиниминогидролазам или N-карбамоилпутресцинамидогидролазам, и кодирующий соответствующие ферменты, имеющие аргининдекарбоксилазную (соответственно, агматиназную, или агматиниминогидролазную, или N-карбамоилпутресцинамидогидролазную) активность, достаточно сравнимую с соответствующими ферментами (в зависимости от обстоятельств), является подходящим в этом дополнительном предпочтительном воплощении способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть получены соответствующим способом посредством любой-5 010179 подходящей стратегии клонирования, известной специалисту, например способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены могут быть также получены путем целенаправленного конструирования. Соответственно, в этом предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения применяются также дополнительные комбинации суперэкспрессированных генов, кодирующих: (i) аргинидекарбоксилазу и агматиназу или (ii) аргининдекарбоксилазу, и агматиниминогидролазу, и N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, и при необходимости агматиназу. В этом предпочтительном воплощении способа в соответствии с настоящим изобретением могут быть, в частности, применены все аргининдекарбоксилазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65%, идентичность с аргинидекарбоксилазой из Е. coli (фермент сравнения) и способны катализировать аргинидекарбоксилазную реакцию. Известно, что многие аргниндекарбоксидазы имеют такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. coli. Более того, в названном воплощении, в частности, могут быть применены все агматиназы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 60%, идентичность с агматиназой из Е. coli (фермент сравнения) и способны катализировать агматиназную реакцию. Известно, что многие агматиназы имеют такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. coli. Дополнительно, в названном воплощении способа, в частности, могут быть применены все агматиниминогидролазы и/или N-карбамоилпутерсцинамидогидролазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 40%, идентичность с агматиниминогидролазой и/или с N-карбамоилпутерсцинамидогидролазой из Pseudomonas (ферменты сравнения) и способны катализировать агматиниминогидролазную,соответственно, N-карбамоилпутерсцинамидогидролазную реакцию. Многие агматиниминогидролазы иN-карбамоилпутерсцинамидогидролазы имеют такой относительно высокий уровень идентичности с ферментами сравнения из Pseudomonas. Суперэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу в вышеуказанном предпочтительном воплощении изобретения, является предпочтительно геном аргининдекарбоксилазы speA, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, включающей Escherichia, Shigella, Salmonella,Yersinia, Pasteurella и Neisseria. Более предпочтительно ген, кодирующий суперэкспрессированную аргининдекарбоксилазу, является геном аргинидекарбоксилазы speA, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersiniapestis, Pasteurella multocida и Neisseria meningitidis. Более того, в этом предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий суперэкспрессированную агматиназу, предпочтительно является геном агматиназы speB, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, включающей Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio и Neisseria. Более предпочтительно ген, кодирующий суперэкспрессированную агматиназу, является геном агматиназы speB, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей Escherichia coli,Shigella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luninescens, Vibrio cholerae и Neisseria meningitidis. Кроме того, в этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий суперэкспрессированную агматиниминогидролазу и/или суперэкспрессированный ген, кодирующий Nкарбамоилпутресцинамидогидролазу, является предпочтительно геном агматининиминогидролазы aguA и/или геном N-карбамоилпутресцинамидогидролазы aguB, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, включающей Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium и Bacillus. Более предпочтительно ген, кодирующий суперэкспрессированную агматинимидогидролазу и/или суперэкспрессированную N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном агматинимидогидролазы aguA и/или геном N-карбамоилпутресцинамидогидролазы aguB, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, включающей Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans,Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans иBacillus cereus. Способ изобретения может проводиться в любом подходящем организме-хозяине. Хозяева могут быть выбраны из группы продуцирующих организмов (или клеток), в основном, известных специалисту в биосинтезе. Такие организмы могут быть эукариотической природы, или, что более предпочтительно,прокариотического происхождения. Эукариотические клетки, например, могут быть клетками растений или грибов и из различных других групп, коллективно называемых Протисты. В частности, предпочтительно, чтобы способ в соответствии с изобретением проводился в организме-хозяине, выбранном из группы, включающей Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. и Pichia sp. В способе изобретения особенно предпочтительно, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, был способен производить аминокислоты орнитин и/или аргинин. Для большей части природных микроорганизмов это требование удовлетворяется, поскольку обычно такая способность является ценной во всех штаммах дикого типа, так как аргинин является эссенциальной аминокислотой.-6 010179 Из этих видов Escherichia sp. является предпочтительным, поскольку с ним легко обращаться при генетических манипуляциях, для того чтобы обеспечить штаммы с желаемыми суперэкспрессированными ферментативными активностями. Более того, Escherichia sp. уже в природе включает все вышеупомянутые ферментативные активности (то есть, кроме генов agu из растений), так что большая часть суперэкспрессированных генов может быть применена как гомологичные гены. Также Corynebacterium sp. (хотя у него отсутствует природная орнитиндекарбоксилаза) является особенно предпочтительным, поскольку он является подходящим штаммом, производящим глутамат, с которым можно легко обращаться в ферментационных способах. В способе настоящего изобретения глутамат является очень подходящим предшественником. Соответственно, способ предпочтительно осуществляется в штамме хозяина, способном образовывать глутамат (например, Corynebacterium glutamicum). Наилучшие результаты достигаются, когда способ в соответствии с изобретением осуществляется в организме-хозяине из группы, включающей Saccharomyces cereviciae, Corynebacterium sp. и Escherichiasp., где в микроорганизме-хозяине кроме увеличенного уровня активности орнитиндекарбоксилазы и образования N-ацетилглутамата, по меньшей мере, увеличивается также уровень активности ферментов аргинидекарбоксилазы в сочетании с ферментами агматиназой и/или агматиниминогидролазой и N-карбамоилпутресцинамидогидролазы. Как обозначено здесь, для каждого из упомянутых выше ферментов повышенный уровень активности сравнивается с исходным уровнем активности соответствующей названной ферментативной активности в микроорганизме-хозяине. Будет ясно, что способ изобретения предпочтительно осуществляется в реакционных условиях, которые так же обычны, как условия ферментации. Способ может быть осуществлен как групповой, но также (если желательно) может быть осуществлен способ с подпитыванием культуры. Можно для удобства обеспечить, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, имел или обеспечивался подходящей системой для экспорта образованного 1,4-диаминобутана, предпочтительно, чтобы такой системой для экспорта была нативная система. Настоящее изобретение, конечно, в заключение включает также все векторы, плазмиды и хозяеваносители, несущие повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности (повышенная активностьODC) по сравнению с исходным уровнем активности орнитиндекарбоксилазы, и повышенную активность образования N-ацетилгутамата по сравнению с исходным уровнем образования N-ацетилглутамата. В частности, для предпочтительных воплощений настоящее изобретение относится также ко всем векторам, плазмидам и хозяевам, дополнительно несущим высокий уровень одного или более других вышеупомянутых ферментативных активностей в соответствии с прилагаемой формулой изобретения. Осуществление изобретения Изобретение будет теперь разъяснено посредством некоторых экспериментальных результатов, которые приводятся без намерения ограничить рамки изобретения. Экспериментальная часть Основные процедуры Были применены стандартные процедуры манипуляции с ДНК (Sambroock, J. et al. (1989), Molecularcloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New-York). ДНК была амплифицирована из хромосомной ДНК Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al. (2000), J. Bacteriol. 182, 4443-4452), Bacillus subtilis ATCC10783 или Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, если не указано другое. ПЦР-амплификация была выполнена с применением ферментов с редактирующей активностью SAW/ADY Pro-DNA-Polymerase (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Германия) или Platinum PfxDNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) в соответствии с протоколами производителей, в то время как верификация сконструированных штаммов была проведена путем ПЦР колоний с применением Taq полимеразы READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Германия). Рестрикционные сайты для последующего клонирования, а также дополнительные мутации были введены с олигонуклеотидами, купленными у фирмы MWG-Biotech (Ebersberg, Германия). Фрагменты ДНК были очищены с применением набораMinElute Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Приготовление плазмидной ДНК выполняли с применением набора QIAprep spin Miniprep (Qiagen, Hilden,Германия). Верификация сконструированных плазмид проводилась путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования (Agowa, Berlin, Германия). Для высокого уровня экспрессии генов был применен вектор pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986),Gene 48, 119-131), подходящий для продукции белка, индуцированной действием изопропил бета-Dтиогалактопиранозида (IPTG), основанной на индуцибельном под действием IPTG tac промоторе и lac репрессорной системе (laclQ). Конструирование плазмид(i) Конструирование плазмиды pDAB2 (pJF119EH-speF). Индуцибельный биодеградирующий ген speF E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), кодирующий орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH(Furste, J.P. et al. (1986), Gene 48, 119-131). Этот вектор позволяет обеспечить высокий уровень продукции белка, основанный на транскрипционном контроле клонированных генов IPTG индуцибельным tac-7 010179 промотором и lac репрессорной системой (laclQ). Для конструирования экспрессионной плазмиды pDAB2(pJF11EH-speF) кодирующий ген speF был клонирован с оригинальными сайтом связывания рибосомы(RBS), стартовым и стоп-кодоном. Фрагмент ДНК, включающий speF из 2247 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. coli(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Kpnl - курсивом) и 5'-TCG АТС TAG ACT GAC ТСА ТАА ТТТ ТТС ССС-3' [SEQ ID: No. 2](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом) В заключение фрагмент был модифицирован рестрикционными эндонуклеазами Kpnl и Xbal и лигирования в экспрессионный вектор pJF119EH, который был разрезан таким же образом. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB3 (pJF119EH speF, 7502 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(ii) Конструирование плазмиды pDAB4 (pJF119EH-speC). Конститутивный биосинтетический ген speC E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), кодирующий орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH (Furste,J.P. et al. (1986), Gene 48, 119-131), см. (i), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на транскрипционном контроле под IPTG индуцибельным tac промотором и lac репрессорной системой (laclQ). Таким образом, кодирующий ген был клонирован с оригинальным стартовым и стоп-кодоном. Поскольку для гена speC, применяемого в исследованиях in silico, не было определено консервативного RBS, на 7 п.о. выше стартового кодона speC с помощью точечного мутагенеза был введен оптимизированный RBS. Фрагмент ДНК из 2235 п.о., включающий speC, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. coli(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом) После заключительной модификации эндонуклеазами Xbal и Sphl продукт ПЦР был лигирован в плазмиду pJF119EH, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. coliDH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB4 (pJF119EH speC,7491 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(iii) Конструирование плазмиды pDAB1 (pJF119EH-argA). Ген ArgA E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см основные процедуры), кодирующий N-ацетилглутаматсинтазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986), Gene 48, 119-131),см. (i. Ген был клонирован с оригинальными RBS и стоп-кодоном. Однако старт трансляции был изменен с GTG на ATG. Фрагмент ДНК из 1365 п.о., кодирующий argA, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. coli(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт EcoRI - курсивом) и 5'-ТТТ TGG ТАС СТТ АСС СТА ААТ CCG ССА Т-3' [SEQ ID: No. 6](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Kpnl - курсивом) В заключение фрагмент был модифицирован рекстрикционными эндонуклеазами EcoRI и Kpnl и потом лигирован в экспрессионную плазмиду pJF119EH, которая была разрезана тем же способом. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDABl (pJF119EH-argA, 6627 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(iv) Конструирование плазмиды pDAB5 (pJF119EH-argA-speF). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeF и N-ацетилглутаматсинтазы ArgA, кодирующий ген speF E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры) был клонирован в argA-экспрессионный вектор pDAB1 (см. (iii. Фрагмент ДНК длиной 2225 п.о., включающий speF, был вырезан из сконструированной плазмидыpDAB2 (см. А.1) путем обработки эндонуклеазами Kpnl и Xbal и лигирован в плазмиду pDAB1, включающую argA (см. (iii, разрезанную подобным образом. После трансформации в клетки Е. coli DH5(Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром,включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB5 (pJF119EH-argA-speF,8841 п.о.) для параллельной продукции SpeF и ArgA после приготовления проводили путем рестрикционного анализа.(v) Конструирование плазмиды pDAB6 (pJF119EH-argA-speC). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeC и N-ацетилглутаматсинтазы ArgA, кодирующий ген speC E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры) был клонирован в argA-экспрессионный вектор pDAB1 (см. (iii. Путем расщепления сконструированной плазмиды pDAB4 (см. (ii эндонуклеазами Xbal и Sphl был отделен фрагмент размером 2225 п.о., включающий ген speC с оптимизированным RBS. Затем фрагмент был лигирован в плазмиду pDAB1 (см. (i, включающую argA, которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. После приготовления верификация полученной плазмиды pDAB6 (pJF119EH argA-speC, 8830 п.о.), позволяющая обеспечить параллельную экспрессию speC и argA, была проведена рестрикционным анализом и последующим секвенированием.pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986), см. (i. Таким путем была сохранена оригинальная структура оперона генов, а также RBS, старт- и стоп-кодоны. Фрагмент ДНК длиной 3079 п.о., включающий speAB, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. coli LJ110 (номер доступа АЕ 000377; нуклеотиды 1190-4247) с применением следующих олигонуклеотидов: 5'-АСА СТТ TCT AGA ATA ATT TGA GGT TCG СТА TG-3' [SEQ ID: No. 7](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом) После заключительной модификации рекстрикционными эндонуклеазами Xbal и Sphl ДНК-фрагмент был лигирован в экспрессионную плазмиду pJF119EH, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. coli DH5a (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB7 (pJF119EH-speAB, 8839 п.о.) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(vii) Конструирование плазмиды pDAB8 (pJF119EH-speF-speAB). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeF, аргининдекарбоксилазы SpeA и агматиназы speB, гены speAB E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры) был клонирован в speF-экспрессионный вектор pDAB2 (см. (i. Путем расщепления плазмиды pDAB7 (см. (vi рестрикционными эндонуклеазами Xbal и Sphl был отделен фрагмент размером 3067 п.о., включающий оперон генов speAB, и лигирован в плазмидуpDAB2 б, включающую speF (см. (i, которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды pDAB8(pJF119EH-speFAB, 10547 п.о.), позволяющей обеспечить параллельную продукцию SpeFAB, была проведена после приготовления рестрикционным анализом.(viii) Конструирование плазмиды pDAB10 (pJF119EH-argA-speF-speAB). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeF, аргининдекарбоксилазы SpeA, агматиназы speB и N-ацетилглутаматсинтазы ArgA, гены speAB E. coli LJ110 (Zeppenfeld,et al., см. основные процедуры) были клонированы в argA-speF-экспрессионный вектор pDAB5 (см. (iv. Путем расщепления плазмиды pDAB7 (см. (vi рестрикционными эндонуклеазами Xbal и Sphl был отделен фрагмент размером 3067 п.о., включающий оперон генов speAB, и лигирован в плазмидуpDAB5, включающую argA-speF (см. (iv, которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмидыpDAB8 (pJF119EH-ArgA-speFAB, 11886 п.о.), позволяющей обеспечить параллельную продукцию ArgA и SpeFAB, была проведена после приготовления рестрикционным анализом.(ix) Конструирование плазмиды pDAB37 (pJF119EH-argJBs-speF). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeF и N2-ацетил-Lорнитин:L-глутамат-N-ацетилтрансферазы ArgJ, кодируемой геном из Bacillus subtilis ATCC 10783, ко-9 010179 дирующий ген argJ В. subtilis был клонирован в speF-экспрессионный вектор pDAB5 (см. (iv путем замещения представленного гена argA. Ген был клонирован с оригинальным RBS и стоп-кодоном. ДНК-фрагмент, содержащий argJ размером 1279 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт EcoRI - курсивом) и 5'-СТТ CAT ТТС GGT ACC СТТ ТАТ ТАС GTG CGA TAG СТС-3' [SEQ ID: No. 10](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Kpnl - курсивом) Олигонуклеоиды были сконструированы в соответствии с последовательностью argJ, как представлено в геноме В. subtilis subsp. subtilis str.168. Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмида pDAB5 были обработаны рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и Kpnl. В случае pDAB5 были получены два фрагмента размером 1355 п.о. и 7486 п.о. Фрагмент размером 7486, включающий вектор pJH119EH и ген speF, был изолирован и лигирован с амплифицированньм фрагментом ДНК. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe,Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды pDAB8 (pJF119EH-argJBs-speC, 8749 п.о.), была проведена после приготовления рестрикционным анализом и последующим секвенированием. Секвенирование выявило, что argJ ген, клонированный из В. subtilis ATCC 10783, отличается от описанного ранее(х) Конструирование плазмиды pDAB38 (pJFl 19EH-argJCg-speF). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeF и N2-ацетил-Lорнитин:L-глутамат-N-ацетилтрансферазы ArgJ, кодируемой геном из Corynebacterium glutamicum, кодирующий ген argJ С. glutamicum ATCC 13022 был клонирован в speF-экспрессионный вектор pDAB5(см. (iv путем замещения представленного гена argA. Ген был клонирован с оригинальным RBS и стопкодоном. Фрагмент ДНК, включающий argJ размером 1219 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК С. glutamicum ATCC 13022 (номер доступа NC006958 (С. glutamicum ATCC 13022, полный геном); нуклеотиды 1466650-1467869) с применением следующих олигонуклеотидов: 5'АСА CAT CGA ATT CAG TAG GAG TTC CAC ATG G-3' [SEQ ID: No. 11](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт EcoRI - курсивом) и 5'-AGT GCT GGT АСС ТТТ ТАА GAG CTG TAC GC-3' [SEQ ID: No. 12](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Kpnl - курсивом) Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмида pDAB5 были обработаны рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и Kpnl. В случае pDAB5 были получены два фрагмента размером 1355 п.о. и 7486 п.о. Фрагмент размером 7486 п.о., включающий вектор pJH119EH и ген speF, был изолирован и лигирован с амплифицированным фрагментом ДНК. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen,Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды pDAB8 (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 п.о.) была проведена после приготовления рестрикционным анализом и последующим секвенированием.(xi) Конструирование плазмиды pDAB3 (pJF119EH-speCnRBS). Конститутивный биосинтетический ген speC E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), кодирующий орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH (Furste,J.P., et al. (1986), Gene 48, 119-131), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на транскрипционном контроле под IPTG индуцибельным tac промотором и lac репрессорной системой(laclQ). Таким образом, кодирующий ген speC был клонирован с оригинальным RBS, старт- и стоп-кодонами. ДНК-фрагмент, включающий speCnRBS, размером 2235 п.о. был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. coli LJ110 (номер доступа АЕ 000379; нуклеотиды 2650-4867) с применением следующих олигонуклеотидов: 5'-GAG CTC TAG АСС AGT TTG АСС CAT АТС Т-3' [SEQ ID: No. 13](мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом) После заключительной модификации с помощью эндонуклеаз Xbal и Sphl продукт ПЦР был лигирован в плазмиду pJF119EH, которая была разрезана таким же образом.- 10010179 После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, включающим 100 мг/л ампицилина. Верификация полученной плазмиды pDAB8 (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 п.о.) была проведена после приготовления рестрикционным анализом и последующим секвенированием. Сравнительный эксперимент А. Продукция 1,4-бутандиамина благодаря исключительно суперэкспрессии speC орнитиндекарбоксилазы с экспрессией гена, индуцированной IPTG (в колбе при покачивании). Влияние суперэкспрессии кодирующего орнитиндекарбоксилазу гена speC на продукцию 1,4-бутандиамина было исследовано в штамме-хозяине Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры),несущем плазмиду pDAB3 (см. (ix. Этот штамм был тестирован в экспериментах с покачивающейся колбой с применением минимальной солевой среды, включающей MgSO47 Н 2 О (300 мг/л), CaCl22 Н 2 О (15 мг/л), KH2PO4 (3 г/л), K2HPO4(3 мг/л), ZnSO47 Н 2 О (22,5 мг/л). Основной раствор глюкозы (500 г/л) был автоклавирован отдельно и добавлен к стерилизованной среде до конечной концентрации 10 г/л. В прекультуральную минимальную солевую среду, включающую 10 мг/л ампицилина, добавляли 15 мкл/мл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33 С и 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности 2 при 620 нм. 5 мл этой культуры впоследствии применяли для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33 С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при 620 нм (через 7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 50 мкМ IPTG. Для того чтобы наблюдать продукцию 1,4-бутандиамина во времени, при культивации через различные интервалы времени были отобраны образцы. После отделения клеток центрифугированием разведенный супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения. Включенные амины обнаруживали как производные ортофтальдиальдегида при длине волны света 230 нм на приборе Hewlett-Packard серии 1100 с применением С 18-обратнофазовой колонки (Nucleosil 120-5 C18,MachereyNagel, Duren, Германия), уравновешенной 50% буфером В (буфер А, 0,1 М ацетат натрия, рН 7,2; буфер В метанол). Для разделения был применен следующий градиент: 1-7 мин линейный градиент буфера В от 50 до 75% со скоростью 0,5 мл/мин, 7-13 мин от 75 до 85% буфера В со скоростью 0,5 мл/мин,13-14,5 мин от 85 до 50% буфера В со скоростью 1 мл/мин, 14,5-17 мин 50% буфера В со скоростью 15 мл/мин и 17-20 мин 50% буфер В со скоростью 0,5 мл/мин. С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 1), которые были верифицированы ЯМР-спектроскопией. Таблица 1 Образование 1,4-бутандиамина с применением суперпродукции орнитиндекарбоксилазы в Е. coli Примеры. Улучшение продукции 1,4-бутандиамина путем увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы в комбинации с увеличенной активностью образования N-ацетилглутамата. Пример 1. Продукция 1,4-бутандиамина с применением суперпродукции орнитиндекарбоксилазы, а также суперпродукции ArgA (в колбе при покачивании). Влияние параллельной работы N-ацетилглутаматсинтазы, катализирующей первую стадию биосинтеза орнитина, начиная с глутамата, и орнитиндекарбоксилазы SpeF или SpeC на продукцию 1,4-бутандиамина было исследовано на штамме-хозяине Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры),несущем плазмиду pDAB5 (см. (iv или pDAB6 (см. (v. Эти штаммы были тестированы в экспериментах с покачивающейся колбой в минимальной солевой среде (см. сравнительный эксперимент А). Поэтому в прекультуральную минимальную солевую среду,включающую 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33 С и 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности при 620 нм, равной 2. Затем 5 мл этой культуры применяли для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которая была инкубирована в течение 24 ч при 33 С и 180 об./мин. Как только клетки достигали величины оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после 7 ч), добавлением 10 мкМ IPTG была индуирована экспрессия гена. Для того чтобы наблюдать зависимую от времени продукцию 1,4-бутандиамина, через различные временные интервалы во время инкубации были взяты образцы. После отделения клеток путем центрифугирования супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разреше- 11010179 ния (см. сравнительный эксперимент А). С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 2). Таблица 2 Образование 1,4-бутандиамина с применением параллельной суперпродукции ArgA и орнитиндекарбоксилазы в Е. coli Пример 2. Продукция 1,4-бутандиамина с применением суперпродукции орнитиндекарбоксилазы, а также суперпродукции ArgJ (колба с покачиванием). Было исследовано влияние параллельной работы N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтрансферазы, кодируемой геном ArgJ либо из С. glutamicum, либо из В. subtilis, катализирующей образованиеspeC на продукцию 1,4-бутандиамина в штамме-хозяине Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), несущем плазмиду pDAB37 (см. (ix или pDAB38 (см. (х. Эти штаммы были тестированы в экспериментах с покачивающейся колбой в минимальной солевой среде (см. сравнительный эксперимент А). Поэтому в предварительную культуру с минимальной солевой средой, включающую 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33 С, 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности при 620 нм, равной 2. 5 мл этой культуры затем было применено для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33 С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после 7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 50 мкМ IPTG. Для наблюдения за продукцией 1,4-бутандиамина во времени в различные интервалы времени культивации были взяты образцы. После отделения клеток центрифугированием супернатант анализировали с применением ЯМР. Значение рН в образцах супернатанта культуры было доведено до 5,8, они были лиофилизированы и повторно растворены в D2O. H1 ЯМР при 600 МГц и 323 K показал ожидаемые спектры резонанса, и пики, полученные при добавлении небольших количеств 1,4-бутандиамина, подтвердили его присутствие. При применении для калибровки стандартных веществ были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 3). Таблица 3 Образование 1,4-бутандиамина с применением параллельной суперпродукции ArgJ и орнитиндекарбоксилазы в Е. coli(колба с покачиванием). Для демонстрации дополнительного улучшения образования 1,4-бутандиамина, начиная с орнитина, а также с аргинина, было исследовано влияние комбинированной суперпродукции орнитиндекарбоксилазы SpeF, аргинидекарбоксилазы SpeA и агматиназы SpeB. Кроме того, для обеспечения надлежащих запасов предшественника эти исследования сочетались с дополнительным экспериментом с суперпродукцией N-ацетилглутаматсинтазы ArgA, катализирующей первую стадию биосинтеза орнитина, начиная с глутамата. Таким образом, была проведена культивация в покачивающейся колбе в минимальной солевой среде (см. А.3) путем применения штамма-хозяина Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры),несущего плазмиды pDAB8 и pDAB10, соответственно (см. 2.2 и 2.3). Поэтому в предварительную культуру с минимальной солевой средой, включающую 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора микроорганизмов и инкубировали при 33 С, 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности при 620 нм, равной 2. 5 мл этой культуры затем было применено для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33 С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после 7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 10 мкМ IPTG. Для наблюдения за продукцией 1,4-бутандиамина во времени в различные интервалы времени культивации были взяты образцы. После отделения клеток центрифугированием супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (см. сравнительный эксперимент А). С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4 бутандиамина (см. табл. 4). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность орнитиндекарбоксилазы) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазы, характеризующийся тем, что в микроорганизме представлена также повышенная активность образования N-ацетилглутамата по сравнению с нативной активностью образования N-ацетилглутамата в микроорганизме, и тем, что 1,4-бутандиамин, производимый в микроорганизме, секретируется в среду ферментации и извлекается из среды ферментации. 2. Способ по п.1, где увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы достигают путем суперэкспрессии генов speF или speC (каждый принадлежит КФ 4.1.1.17), кодирующих орнитиндекарбоксилазу и происходящих из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella,Yersinia и Schewanella. 3. Способ по п.2, где ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, происходит из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersiniapestis, Schewanella oneidensis. 4. Способ по любому из пп.1-3, где ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном speF,происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Schewanella oneidensis. 5. Способ по любому из пп.1-4, где повышенной активности образования N-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии либо гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу (принадлежит к КФ 2.3.1.1), и/или гена argJ, кодирующего N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтрансферазу (принадлежит к КФ 2.3.1.35). 6. Способ по п.5, где повышенной активности образования N-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу и происходящего из одного из родов,выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Photorhabdus и Buchnera. 7. Способ по п.6, где повышенной активности образования N-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу и происходящего из одного из видов,выбранного из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis,Photorhabdus luminescens и Buchnera aphidicola. 8. Способ по п.5, где повышенной активности образования N-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена argJ, кодирующего N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтрансферазу (принадлежит к КФ 2.3.1.35), происходящего из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Bacillus,Listeria, Oceanobacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Thermobifida,Streptomyces и Bifidobacterium. 9. Способ по п.8, где повышенной активности образования N-ацетилглутамата достигают путем суперэкспрессии гена, кодирующего N2-ацетил-L-орнитин:L-глутамат-N-ацетилтрансферазу и происходящего из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium leprae, Thermobifida fusca, Streptomyces coelicor и Bifidobacteriumlongum. 10. Способ по любому из пп.1-9, где дополнительно получают также увеличенную ферментативную активность по меньшей мере для двух других ферментов посредством суперэкспрессии либо(ii) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежит к КФ 4.1.1.19), и гена aguA, кодирующего агматиниминогидролазу (принадлежит к КФ 3.5.3.12) и называемого также геном, кодирующим агматиндеиминазу, и гена aguB, кодирующего N-карбамоилпутресцинаминогидролазу (принадлежит к КФ 3.5.1.53), и при необходимости также гена speB, кодирующего агматиназу (принадлежит к КФ 3.5.3.11). 11. Способ по п.10, где суперэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном speA аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella и Neisseria. 12. Способ по п.11, где суперэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном speA аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, со- 13010179 стоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella multocida иNeisseria meningitidis. 13. Способ по п.10, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном speB агматиназы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio и Neisseria. 14. Способ по п.13, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном speB агматиназы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli,Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luninescens, Vibrio cholerae и Neisseria meningitidis. 15. Способ по п.10, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу и/или суперэкспрессированный ген, кодирующий N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном aguA агматинимидогидролазы и/или геном aguB N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium и Bacillus. 16. Способ по п.15, где суперэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу и/или суперэкспрессированный ген, кодирующий N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном aguA агматиниминогидролазы и/или геном aguB N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans,Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans иBacillus cereus. 17. Способ по любому из пп.1-16, где способ осуществляют в организме-хозяине, выбранном из группы, состоящей из Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. и Pichia sp. 18. Способ по любому из пп.1-17, где способ осуществляют в организме-хозяине, выбранном из группы Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp., Escherichia sp., и в котором, помимо увеличенного уровня активности орнитиндекарбоксилазы и образования N-ацетилглутамата, увеличен, по меньшей мере, также уровень активности аргининдекарбоксидазы в сочетании с агматиназой и/или агматиниминогидролазой и N-карбамоилпутресцинамидогидролазой. 19. Векторы, плазмиды и хозяева, несущие повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ODC) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности по любому из пп.1-4 и повышенный уровень активности образования N-ацетиглутамата по любому из пп.1 и 5-9. 20. Векторы, плазмиды и хозяева по п.19, дополнительно несущие повышенный уровень активности одной или более дополнительных ферментативных активностей по любому из пп.10-18.