Микроорганизмы amycolatopsis, способные превращать нитрил в амид, фермент с нитрилгидратазной активностью, полученный из указанных микроорганизмов, и способы их использования

006444 Настоящее изобретение относится к новым микроорганизмам рода Amycolatopsis, а также к новому способу получения амидов с использованием этих микроорганизмов, соответственно с использованием экстракта ферментов этих микроорганизмов. Для получения амидов, таких, как, например, амид никотиновой кислоты, который является важным для животных и людей витамином комплекса витаминов В, уже известны многочисленные биотехнологические способы. Широко известно, что содержащие нитрилгидратазу микроорганизмы превращают нитрилы в соответствующие амиды. Так, в ЕР-А 0188316 описан способ получения амида никотиновой кислоты из 3-цианпиридина с использованием микроорганизмов родов Rhodococcus, Arthrobacter или микобактерий. Недостатком этого способа является то, что эти микроорганизмы обладают лишь незначительной активностью в отношении превращения 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты. В ЕР-А 0307926 описано превращение 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты с помощью микроорганизмов вида Rhodococcus rhodochrous J1. Для того, чтобы эти микроорганизмы катализировали требуемое превращение, их необходимо индуцировать. Еще одним недостатком этого способа является то, что Rhodococcus rhodochrous J1 имеет красную окраску и вследствие этого происходит окрашивание продукта. Кроме того, этот микроорганизм обладает лишь незначительной теплостойкостью и ингибируется, например, субстратом 3-цианпиридином. Еще один способ получения амида никотиновой кислоты из 3-цианпиридина с помощью микроорганизмов вида Rhodococcus rhodochrous J1 описан в ЕР-А 0362829. Для повышения удельной активности содержащих нитрилгидратазу микроорганизмов в среду для культивирования в качестве индуктора добавляют мочевину или производное мочевины. При использовании этого способа, равно как и способа,описанного выше, происходит окрашивание продукта. Далее в WO 95/17505 описан способ получения ароматических амидов из соответствующих нитрилов с помощью микроорганизмов вида Rhodococcus rhodochrous M33. Недостатком этого способа является красная окраска Rhodococcus rhodochrous M33, а также высокое значение KM для субстрата 3 цианпиридина. Задачей настоящего изобретения является устранение этих недостатков и разработка такого способа получения амидов, который обеспечивал бы получение соответствующих амидов с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Указанная задача решается с помощью новых микроорганизмов, а также с помощью способа с их использованием. Суть способа по изобретению заключается в том, что используемый в качестве субстрата нитрил превращают в соответствующий амид с помощью микроорганизмов рода Amycolatopsis, с помощью экстракта ферментов этих микроорганизмов или с помощью очищенной нитрилгидратазы из микроорганизмов рода Amycolatopsis. Применяемые для биотрансформации нитрилы, такие, как, например, 3-цианпиридин, представляют собой имеющиеся в продаже соединения. Микроорганизмы по изобретению обладают способностью превращать используемые в качестве субстрата нитрилы в соответствующие амиды. Предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы обладали способностью расти на средах, содержащих нитрилы или амиды в качестве единственных источников углерода и/или азота. Микроорганизмы по изобретению получают путем соответствующего отбора, например, из образцов почвы, ила или сточных вод с помощью обычных микробиологических методов. Целесообразно осуществлять отбор микроорганизмов путем выращивания в среде, содержащей нитрилы или амиды предпочтительно в качестве единственных источников углерода и азота, в присутствии ионов кобальта. Пригодные для осуществления отбора нитрилы и амиды представляют собой прежде всего нитрилы, которые также применяют в качестве субстрата для последующей биотрансформации, и соответствующие получаемые из них амиды. Пригодные для роста среды также известны специалисту в данной области; например, может использоваться среда, представленная в табл. 1. Как правило, микроорганизмы до осуществления собственно биотрансформации культивируют(выращивают) в одних и тех же условиях, при этом применяют указанные выше среды. Как известно специалистам, нитрилгидратаза образуется только тогда, когда среда для роста содержит ионы кобальта в качестве кофактора. Пригодными "кобальтовыми соединениями, образующими ионы кобальта" являются соли, содержащие Со 2+ или Со 3+. Примерами содержащих Со 2+ или Со 3+ солей являются хлорид кобальта, сульфат кобальта и ацетат кобальта. В качестве кобальтового соединения целесообразно применять соль, содержащую Со 2+, такую, как,например, CoCl2. Выращивание можно также осуществлять в присутствии витамина В 12 вместе с металлическим кобальтом или другими кобальтовыми соединениями, которые in situ дают ионы кобальта. Целесообразно применять кобальтовое соединение в количестве от 1 до 10 мг/л, предпочтительно от 1 до 3 мг/л.-1 006444 Как правило, выращивание осуществляют при температуре от 20 до 50 С и при значении рН в диапазоне от 5 до 8, предпочтительно при температуре от 30 до 45 С и значении рН в диапазоне от 5,5 до 7,5. Собственно биотрансформацию можно осуществлять с помощью микроорганизмов рода Amycolatopsis, с использованием экстракта ферментов этих микроорганизмов или с использованием очищенной нитрилгидратазы из этих микроорганизмов. Целесообразно осуществлять биотрансформацию с использованием микроорганизмов, относящихся к видам Amycolatopsis NE 31 и Amycolatopsis NA40, или их функционально эквивалентных вариантов и мутантов. Особенно предпочтительно применять микроорганизмы, относящиеся к виду Amycolatopsis NA40. Микроорганизмы указанных видов в соответствии с Будапештским договором были депонированы 03.06.1997 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b,D-38124, Брауншвейг, Германия) под названиями Amycolatopsis NE 31 и Amycolatopsis NA40 и получили регистрационные номера DSMZ 11616 и соответственно DSMZ 11617. Оба эти микроорганизма были более точно идентифицированы и отнесены к еще не описанным в литературе видам рода Amycolatopsis. Таким образом, изобретение также относится к микроорганизмам рода Amycolatopsis, которые обладают способностью превращать амид в нитрил, прежде всего к микроорганизмам, имеющим названиеAmycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) и Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616). Под "функционально эквивалентными вариантами и мутантами" подразумеваются микроорганизмы, происходящие из вышеуказанных организмов-предшественников и обладающие в основном такими же свойствами и функциями, что и последние. Такие варианты и мутанты могут возникать случайно,например, в результате облучения ультрафиолетовым светом, или под действием вызывающих мутации химических веществ. 30% ДАП диаминопимелиновая кислота АРА арабиноза ГАЛ галактоза МАД мадуроза КСИ ксилоза ГЛЮ глюкоза РИБ рибоза Типы сахаров даны согласно Lechevalier и др., 1971 Типы жирных кислот даны согласно Kroppenstedt, 1985 и 1992 9/4 МК-9 (Н 4) 9/6 МК-9 (Н 6) 9/8 МК-9 (H8) МК миколовые кислоты ФЭ фосфатидилэтаноламин ОН-ФЭ гидрокси-ФЭ мет-ФЭ фосфатидилметилэтаноламин ФХ фосфатидилхолин ФГА фосфатидилглюкозамин-3 006444 ФИ фосфатидилинозитол ФИМ фосфатидилинозитолманнозид ФГ фосфатидилглицерин ДФГ дифосфатидилглицерин ГЛ гликолипид Жирные кислоты изо-16 изогексадекановые кислоты или 14-метилпентадекановые кислоты 10-Ме-18 туберкулостеариновая кислота 2-ОН-16 2-гидроксипальмитиновая кислота Экстракт ферментов может быть получен путем хорошо известного специалистам разрушения микроорганизмов, например, с помощью ультразвука, с помощью пресса типа Френч или с использованием лизозима. Очевидно, что для осуществления способа этот экстракт ферментов, равно как и целые клетки микроорганизмов, могут быть иммобилизованы на пригодном носителе, представляющем собой полимер, или абсорбирован на пригодном носителе. Ферменты по изобретению, обладающие нитрилгидратазной активностью, могут быть получены из микроорганизмов рода Amycolatopsis, прежде всего из штамма Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617), и они обладают способностью превращать нитрил в амид. Основными свойствами этих ферментов являются следующие: а) рН-оптимум составляет 6,51,0; б) температурный оптимум при рН 7,0 находится между 35 и 40 С; в) значение KM для субстрата 3-цианпиридина составляет 41,77,7 мМ (20 С, 45 мМ фосфатный буфер, рН 7,0),прежде всего ферменты имеют г) молекулярную массу 105 кДа, что может быть определено, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. В качестве субстрата для биотрансформации могут применяться в принципе любые нитрилы. Целесообразно применять либо алифатические нитрилы, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, при необходимости замещенные, например, гидрокси-, аминогруппой, галогеном или карбоксигруппой, либо замещенные или незамещенные ароматические нитрилы, содержащие от 4 до 10 атомов углерода в ароматической кольцевой системе. В качестве алифатических нитрилов, содержащих от 1 до 10 атомов углерода, могут применяться динитрилы, гидроксинитрилы, аминонитрилы, такие, как, например, ноктаннитрил, циануксусная кислота, изокапронитрил, н-валеронитрил, адипонитрил, глутаронитрил,сукцинонитрил, себаконитрил, пропионитрил, кротонитрил, акрилнитрил, метакрилнитрил, нитрил нмасляной кислоты или азеланитрил. В качестве ароматических нитрилов, содержащих от 4 до 10 атомов углерода, могут применяться нитрилы общих формул где R1 и R2 обозначают атом водорода, атом галогена или С 1-С 4 алкил. Атом галогена может представлять собой F, Cl, Вr или J. С 1-С 4 алкил может представлять собой метил, этил, пропил, изопропил, трет-пропил, бутил, изобутил или трет-бутил. Пригодными представителями ароматических нитрилов общей формулы I или II являются 2-, 3- или 4-цианпиридин, бензонитрил, фтор-, хлор-, бромбензонитрил, например, орто-, мета-,пара-хлорбензонитрил или 2-хлор-3-цианпиридин. Предпочтительно в качестве ароматического нитрила,содержащего от 4 до 10 атомов углерода, применять 3-цианпиридин. Биотрансформацию с применением однократной или непрерывной загрузки субстрата целесообразно проводить таким образом, чтобы концентрация субстрата не превышала 40 мас.%, предпочтительно 30 мас.%. Способ целесообразно осуществлять с использованием покоящихся (не растущих) клеток. В качестве сред для биотрансформации пригодны обычные в данной области техники среды, такие,как, например, низкомолярный фосфатный буфер, буфер HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2 этансульфоновая кислота), цитратный буфер, боратный буфер, среды, состав которых представлен в таблицах 1-3, или их модифицированные формы, такие как, например, среда, описанная в примере 8(1), или буфер трис-HCl. Биотрансформацию целесообразно проводить при температуре от 0 до 50 С и при значении рН в диапазоне от 4,5 до 10, предпочтительно при температуре от 20 до 40 С и при значении рН в диапазоне от 4,5 до 10,0.-4 006444 В особенно предпочтительном варианте осуществления биотрансформацию можно проводить в присутствии С 1-С 4 спиртов. В качестве С 1-С 4 спиртов могут применяться метанол, этанол, пропанол или бутанол. Предпочтительно применяют метанол. По завершении превращения соответствующие амиды могут быть выделены с помощью обычных методов переработки, например, с помощью кристаллизации. Примеры Пример 1. Культивирование микроорганизмов родов Actinomadura и Amycolatopsis. а) В различные образцы почвы, помещенные в обогатительную среду, состав которой приведен в табл. 1, вносили различные нитрилы или амиды в качестве источников углерода и азота и инкубировали в течение 7-10 дней при 37 С или 45 С. После этого культуры пересевали в такую же среду и еще раз культивировали в течение 7-10 дней при 37 С. Весь процесс повторяли трижды. После этого культуры разжижали и высевали на планшеты для получения отдельных колоний. Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37 С. После этого различные колонии тестировали на требуемую активность. Таким путем выделяли штаммы Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) и Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) и затем выращивали их в оптимизированной среде (табл. 3) при встряхивании в течение 90-100 ч при 37 С. Для Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616), Actinomadura spadix E3733 и Actinomadura spadix E3736 в качестве источника углерода и азота использовали адипонитрил, для Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) и Actinomadura spadix 45 А 32 в качестве источника углерода и азота использовали азеланитрил, для Actinomadura spadix 4501 в качестве источника углерода и азота использовали н-октанитрил, а для Actinomadura spadix C15 в качестве источника углерода и азота использовали циануксусную кислоту. б) Штамм Amycolatopsis NA40 культивировали в среде, состав которой представлен в табл. 3. Культивирование осуществляли в субкультурах (в пробирках объемом 4 мл) и в "основной культуре" (в колбах объемом 500 мл) в аэробных условиях при температуре 37 С в течение 2, соответственно 3-4 дней. Рост клеток измеряли турбидиметрическим методом при длине волны 610 нм и сухую массу клеток подсчитывали следующим образом: масса сухих клеток (в мг/мл) = ОП 610 нм х 0,277. Таблица 1-5 006444 Пример 2. Биотрансформапия с использованием микроорганизмов родов Actinomadura и Amycolatopsis.(1) Для определения нитрилгидратазной активности реакционную смесь (2 мл), содержащую 3 цианпиридин (1,0 М, 1,0 мл), калий-фосфатный буфер (рН 7,0, 0,1 М, 0,5 мл) и 0,5 мл суспензии клеток,инкубировали при перемешивании при 20 С в течение 30 мин. Реакцию прекращали путем добавления 0,2 мл 3 н. НСl. После кратковременного центрифугирования определяли содержание образовавшегося никотинамида с помощью ЖХВР (система типа Shimadzu SPD 6 А с C18-колонкой (Develosil ODS-HG-5,4,6 х 250 см); растворитель: 10 мМ KН 2 РO4/Н 3 РO4 (рН 2,8)/ацетонитрил (в объемном соотношении 9:1); скорость потока: 1 мл/мин; абсорбцию измеряли при 230 нм). Удельную активность выражали в виде количества (в мкмолях) образовавшегося никотинами-да/мл/мин/ОП 610 нм. Скорости превращения алифатических нитрилов в обогатительной среде (табл. 1) с использованием выделенных бактерий представлены в табл. 5, влияние индукторов и кофакторов, внесенных в основную среду (табл. 2), представлено в табл. 4, а сравнение активности Amycolatopsis и Rhodococcus в основной среде (табл. 2) представлено в табл. 6. Данные из табл. 4 свидетельствуют о том, что нитрилгидратаза изAmycolatopsis NA40 экспрессируется конститутивным образом, однако для проявления активности в качестве кофактора необходим кобальт.(2) Влияние температуры на рост штамма NA40. Субкультуры (2 мл) инкубировали в среде, представленной в табл. 3, в течение 2 дней при 37 С, затем их пересевали в 20 мл среды, представленной в табл. 3 и содержащейся во встряхиваемых колбах. Культивирование проводили при 37, 40, 45, 50 и 55 С в течение 3-4 дней при встряхивании. Измеряли рост клеток и оценивали нитрилгидратазную активность при 20 С. В табл. 7 представлены данные о влиянии температуры на нитрилгидратазную активность и рост клеток. Таблица 4. Влияние индукторов и кофакторов на удельную активность в основной среде Таблица 5. Скорости превращения алифатических нитрилов при использовании выделенных бактерий(3) Для определения активности штамма NA40 в отношении других субстратов клетки с сухой массой 0,0388 мг инкубировали в описанном выше буфере. Реакцию начинали путем добавления соответствующего субстрата и смесь инкубировали при встряхивании в течение 10 мин при 20 С. Реакцию прекращали, добавляя 0,2 мл 2 н. НСl, и реакционную смесь центрифугировали в течение короткого промежутка времени. Надосадочную жидкость анализировали с помощью ЖХВР или газовой хроматографии. В табл. 8 приведены условия опытов по определению специфичности в отношении субстрата, а в табл. 9 представлены данные по специфичности покоящихся клеток штамма NA40 в отношении различных субстратов. Соответствующие условия опытов обобщены в табл. 8, а результаты - в табл. 9. Таблица 7. Влияние температуры выращивания на нитрилгидратазную активность и на рост клеток Таблица 8. Условия опытов для определения специфичности в отношении субстрата-7 006444 Таблица 9. Специфичность нитрилгидратазы штамма NA40 в отношении субстрата(4) Температурный оптимум покоящихся клеток и их теплостойкость. Реакцию проводили в течение 10 мин в стандартной реакционной смеси. Температурный оптимум находился в диапазоне от 35 до 40 С (фиг. 5). После этого клетки инкубировали в течение 30 мин при различных температурах и оценивали активность в стандартных реакционных условиях. Как видно из фиг. 4, теплостойкость сохранялась приблизительно до 40 С.(5) рН-оптимум и рН-стабильность покоящихся клеток. Для определения этих характеристик проводили реакцию в течение 10 мин в стандартной реакционной смеси, в которой калий-фосфатный буфер заменяли различными 0,1 М буферами. Как видно из фиг. 6, оптимальное значение рН находится в диапазоне от 4,5 до 10. После инкубации клеточной суспензии в течение 30 мин при 20 С при различных значениях рН клетки центрифугировали. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 0,1 М калий-фосфатном буфере с рН 7,0. Реакцию проводили в течение 10 мин в стандартных условиях при добавлении 3-цианпиридина. Фермент оставался стабильным при значениях рН в диапазоне от 4,5 до 10,0 (фиг. 7).(6) Накопление никотинамида. получаемого из 3-цианпиридина с использованием штамма NA40. Реакцию проводили в реакционной смеси (30 мл), содержащей 500 мМ 3-цианпиридин, 40 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,0) и покоящиеся клетки (сухая масса 2,3 мг). В ходе реакции 7 раз добавляли 3-цианпиридин (500 мМ) по мере израсходования предыдущей порции. Таким образом, в течение 15 ч было внесено 4,0 моля 3-цианпиридина, в результате образовывалось 3,89 моля (475 г/л) никотинамида,что соответствует выходу 97,3%. Никотиновая кислота не образовывалась. Пример 3. Идентификация микроорганизмов рода Amycolatopsis. Идентификация основывалась на использовании следующих 5 хемотаксономических маркеров: 1. Диагностическая аминокислота пептидогликана: мезодиаминопимелиновая кислота. 2. Диагностические сахара: арабиноза и галактоза. 3. Миколовые кислоты: миколовые кислоты отсутствуют. 4. Менахинон: МК-9 (H4). 5. Спектр жирных кислот: изо/антеизо-разветвленные и 2-гидроксижирные кислоты, кроме того,выявлены незначительные количества 10-метилразветвленных жирных кислот. Такой спектр жирных кислот обнаружен у всех представителей рода Amycolatopsis (спектр жирных кислот 3f). Комбинация этих химических признаков достаточна для обнаружения всех видов рода Amycolatopsis. Характеристики жирных кислот обеих культур сравнивали с информацией, находящейся в банке данных жирных кислот, с использованием анализа основных компонентов. С помощью этого метода оказалось возможным отнести как штамм NE31, так и штамм NA40 к роду Amycolatopsis, однако осуществить видовую идентификацию оказалось невозможным, так как коэффициент корреляции был слишком низким. Однако на основе сравнения спектра жирных кислот обоих штаммов было установлено, что они представляют собой два штамма, относящиеся к различным видам. Этот факт был подтвержден результатами анализа последовательности 16S-рДНК. В этом случае также была установлена принадлежность к роду Amycolatopsis, однако не была установлена принадлежность ни к одному из описанных видов рода Amycolatopsis. С помощью этого метода путем прямого секвенирования была определена последовательность 16S-рДНК, полученная в результате амплификации с использованием ПЦР гена 16S-рДНК. Диагностическую часть последовательности 16S-рДНК сравнивали с последовательностями типичных представителей видов рода Amycolatopsis и родственных таксонов. Результаты показали, что штамм принадлежит к роду Amycolatopsis. Было обнаружено наибольшее-8 006444 сходство с Amycolatopsis methanolica, составляющее для штамма NA40 96,9% и для штамма NE31 96,1%. Сходство последовательностей обоих штаммов между собой составляло 99,0%. Исследования заявителей, проведенные на представителях рода Amycolatopsis, свидетельствуют о том, что для надежной идентификации видов коэффициент корреляции должен быть выше 99,5%. Поскольку величина 96,9% существенно меньше 99,5%, то можно предположить, что оба изолята не относятся к представителям известных видов Amycolatopsis. На основе представленных результатов изоляты не могут быть отнесены к какому-либо из известных видов Amycolatopsis. Заявители исходили из того, что NA40 и NE31 представляют собой штаммы двух новых, до сих пор не описанных видов рода Amycolatopsis. Пример 4. Очистка нитрилгидратазы из микроорганизма штамма NA40. Штамм культивировали при 37 С в течение 3 дней в среде, состав которой приведен в табл. 3. Клетки 2-литровой культуры собирали центрифугированием и затем ресуспендировали в 0,85%-ном растворе NaCl. После этого клетки переносили в 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 44 мМ н-масляную кислоту, и обрабатывали ультразвуком. Экстракт клеток центрифугировали и отделяли клеточный дебрис. Этот экстракт применяли для очистки фермента.-9 006444 На протяжении всей очистки применяли калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 44 мМ нмасляную кислоту. Как видно из табл. 10, фермент после трех стадий очистки достигал гомогенного состояния. Таблица 10. Очистка нитрилгидратазы из штамма NA40 Примечание: 1 единица соответствует количеству фермента, которое катализирует образование никотинамида со скоростью 1 мкмоль/мин при 20 С. Пример 5. Изучение свойств нитрилгидратазы.(1) Определение молекулярной массы, структуры субъединид и содержания ионов кобальта. С помощью хроматографии на колонках типа G3000 SW (0,75 х 60 см) с TSK-гелем с использованием 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с добавлением 0,2 М KСl и 44 мМ н-масляной кислоты было установлено, что молекулярная масса равна 106 кДа. Было обнаружено, что фермент состоит из 2 различных субъединици , молекулярные массы которых соответственно равны 30000 и 26000 Да. На фиг. 1 показана диаграмма определения молекулярной массы с помощью хроматографии на колонке G3000 SW с TSK-гелем. На фиг. 2 показана диаграмма определения молекулярной массы с помощью электрофореза в ДСНПААГ. На фиг. 3 показан спектр поглощения очищенного фермента. Была обнаружена широкая полоса поглощения при 300-400 нм.(2) Специфичность очищенного фермента в отношении субстрата. Определение специфичности в отношении субстрата проводили аналогично примеру 2(1). Результаты представлены в табл. 11. Таблица 11. Специфичность очищенной нитрилгидратазы в отношении субстрата- 10006444 В реакционную смесь (2,0 мл) добавляли 1,7 единицы фермента. Реакционная смесь содержала соответствующий субстрат в 45 мМ фосфатном буфере (рН 7,0).(3) Определение значения KM. Значение KM, которое определяли на основе диаграммы Lineweaver-Burk, для 3-цианпиридина составляет 41,7 мМ, а для акрилнитрила 3,7 мМ. Сравнение со штаммом Rhodococcus rhodochrous J1, у которого значение KM для 3-цианпиридина составляет 200 мМ, показывает, что данный параметр у штаммаNA40 имеет существенно меньшую величину. Это является одним из основных преимуществ штамма(4) Теплостойкость и температурный оптимум. Очищенный фермент инкубировали при различных температурах в течение 30 мин при рН 7,0 и затем в течение 1 мин при 20 С оценивали превращение 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты. При температуре выше 40 С фермент терял активность. Теплостойкость, как и в случае покоящихся клеток, сохранялась приблизительно до 40 С, температурный оптимум находился в диапазоне от 35 до 40 С(5) рН-оптимум и рН-стабильность. Для определения этих характеристик проводили реакцию превращения 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты при 20 С в реакционной смеси (2,0 мл), содержащей различные буферы (42,5 мМ),1,71 единицы очищенного фермента и 500 мМ 3-цианпиридин. рН-Оптимум составлял приблизительно 6,51,0 (фиг. 8). Для оценки рН-стабильности инкубировали 4,2 единицы очищенного фермента в течение 1 ч при 20 С в различных буферах (45 мМ). Часть инкубированного раствора (1,71 единицы) добавляли в стандартную реакционную смесь (ср. пример 2(1. Оценивали сохранившуюся активность. Фермент сохранял стабильность при значениях рН в диапазоне от 5 до 9. Результаты представлены на фиг. 9.(6) Ингибиторы. Оценивали влияние различных ингибиторов. Результаты обобщены в табл. 12. Таблица 12. Влияние различных ингибиторов на активность очищенного фермента Пример 6. Влияние метанола на покоящиеся клетки штамма NA40. Реакцию проводили в течение 10 мин в присутствии различных концентраций (0-20 об.%) метанола в реакционных смесях, состав которых приведен в табл. 13. Как видно из табл. 14, активность повышается при добавлении 5-15% метанола. Примечание:КФБ обозначает калий-фосфатный буфер. Таблица 14. Влияние метанола на активность штамма Amycolatopsis NA40 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Микроорганизм Amycolatopsis sp.NA31 (DSM 11616), а также его варианты и мутанты, способные превращать нитрил в амид. 2. Микроорганизм Amycolatopsis sp.NA40 (DSM 11617), а также его варианты и мутанты, способные превращать нитрил в амид. 3. Фермент с нитрилгидратазной активностью, полученный из микроорганизмов родаAmycolatopsis, характеризующийся а) оптимумом активности при рН 6,50,1,б) оптимумом активности при температуре между 35 и 40 С при рН 7,0,в) константой KM 41,77,7 ммоль при использовании в качестве субстрата 3-цианпиридина. 4. Фермент по п.3, полученный из микроорганизма по п.1. 5. Фермент по п.3, полученный из микроорганизма по п.2. 6. Экстракт с нитрилгидратазной активностью из микроорганизмов, содержащий фермент по любому пп.3-5. 7. Применение микроорганизмов рода Amycolatopsis для превращения нитрила в амид. 8. Применение по п.7, где микроорганизмы являются микроорганизмами по п.1. 9. Применение по п.7, где микроорганизмы являются микроорганизмами по п.2. 10. Применение экстракта по п.6 для превращения нитрила в амид. 11. Способ получения амидов, предусматривающий инкубирование смеси, содержащей в качестве субстрата нитрил, с а) микроорганизмами рода Amycolatopsis, способными превращать нитрил в амид, или б) ферментсодержащим экстрактом с нитрилгидратазной активностью из вышеуказанных микроорганизмов по п.6, или в) ферментом с нитрилгидратазной активностью по пп.3-5. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют необязательно замещенный гидрокси, амино, галогеном или карбокси алифатический нитрил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют необязательно замещенный галогеном или С 1-С 4 алкилом алифатический нитрил, содержащий от 4 до 10 атомов углерода в ароматической кольцевой системе. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что ароматический нитрил выбирают из соединений общих формул где R1 и R2 обозначают атом водорода, атом галогена или С 1-С 4 алкил. 15. Способ по любому из пп.11-14, отличающийся тем, что инкубирование осуществляют при температуре от 0 до 50 С и при значении рН от 4,5 до 10. 16. Способ по пп.11-15, в котором используют микроорганизм по п.1. 17. Способ по пп.11-16, в котором используют микроорганизм по п.2. 18. Способ по пп.11-17, в котором используют ферментсодержащий экстракт по п.6.