Реконструированные сурфактанты, обладающие улучшенными свойствами

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Настоящее изобретение относится к восстановленному сурфактанту, содержащему липидный носитель, полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-C и полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-B. Изобретение также относится к его фармацевтическим композициям и его применению для лечения или профилактики RDS (респираторного дистресссиндрома) и других респираторных расстройств. 015802 Настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему липидный носитель и комбинацию конкретного полипептидного аналога нативного сурфактантного белка SP-C с конкретным полипептидным аналогом нативного сурфактантного белка SP-B. Изобретение также относится к его фармацевтическим композициям и его применению для лечения или профилактики RDS (респираторного дистресс-синдрома) и других респираторных расстройств. Предшествующий уровень техники Легкое человека составлено из большого количества маленьких воздушных мешочков, называемых альвеолами, в которых происходит газообмен между кровью и воздушными пространствами лгких. У здоровых субъектов этот обмен опосредован наличием комплекса протеинсодержащего сурфактанта,который предохраняет лгкие от коллапса в конце выдоха. Комплекс лгочного сурфактанта состоит, прежде всего, из липида и содержит незначительные количества различных белков. Отсутствие достаточных уровней этого комплекса приводит к нарушению функции лгкого. Этот синдром называют респираторным дистресс-синдромом (RDS), и он обычно поражает недоношенных детей. Указанный синдром эффективно лечат модифицированными природными сурфактантными препаратами, извлекаемыми из лгких животных. Имеющиеся в продаже модифицированные сурфактантные препараты представляют собой, например, Curosurf, получаемый из лгкого свиньи, Infasurf, извлекаемый после лаважа лгкого телнка, и Survanta, химически модифицированный природный экстракт бычьего лгкого. Основными составляющими этих сурфактантных препаратов являются фосфолипиды, такие как 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, обычно известный как дипальмитоилфосфатидилхолин(DPPC), фосфатидилглицерин (PG) и сурфактантные гидрофобные белки В и С (SP-B и SP-C). Вследствие недостатков сурфактантных препаратов, получаемых из тканей животных, таких как сложность процессов производства и стерилизации и возможная индукция иммунных реакций, были созданы синтетические сурфактанты, имитирующие композицию модифицированных природных сурфактантов. Указанные синтетические сурфактанты известны как реконструированные сурфактанты. Однако оказалось, что разработка клинически активных, реконструированных сурфактантов является сложной задачей, так как нативные гидрофобные белки являются слишком большими для синтеза,сложными по структуре и нестабильными в чистом виде. Известно, что для замены указанных нативных гидрофобных белков были предложены некоторые синтетические полипептиды, частично отвечающие последовательностям нативных белков, и их аналоги,и они раскрыты, например, в WO 89/06657, WO 92/22315, WO 98/49191, WO 95/32992, US 6660833, ЕР 413957 и WO 91/18015. В WO 00/47623 раскрыты синтетические полипептиды, являющиеся аналогами нативного белка SPC, в которых: 1) цистеиновые остатки в положениях 5 и 6 заменены остатками Ser; 2) остатки Val в "центральной области" SP-C замещены другими нейтральными и гидрофобными остатками, выбранными из группы, состоящей из Leu, Ile и норлейцина (nL); 3) некоторые нейтральные аминокислоты, присутствующие в "центральной области" SP-C, заменены объмными или полярными остатками, выбранными из группы, состоящей из Lys, Try, Phe, Tyr и орнитина. Указанные искусственные полипептиды характеризуются тем, что они способны сгибаться, подобно нативному белку SP-C, и поэтому должным образом взаимодействовать с липидами сурфактанта, и не инициируют автоолигомеризацию. В WO 00/76535 описаны в общем виде препараты лгочного сурфактанта, содержащие по меньшей мере одну модификацию SP-B в комбинации по меньшей мере с одной модификацией белка SP-C.Waring A.J. et al. (реферат представлен на ежегодном собрании Педиатрического академического абщества в Сан-Франциско 29 апреля - 2 мая 2006 г.) сообщают, что было предпринято исследование с целью изучения активности синтетического сурфактанта, составленного из SP-C-мимического SP-Cff,представляющего собой синтетический SP-C с 34 остатками с фенилаланином вместо цистеина в положениях 4 и 5, и SP-B-мимического Mini-В. Однако согласно доступной литературной информации в опытах на животных лечение реконструированными сурфактантами приводит к недостаточным объмам газа в лгких и недостаточному раскрытию альвеол в конце выдоха, и для достижения активности in vivo, сравнимой с активностью, достигаемой с модифицированными природными сурфактантами, требуется вентиляция с положительным давлением в конце выдоха (PEEP) (Johansson J. et al., J. Appl. Physiol. 2003, 95, 2055-2063; Davis A.J. et al., Am JRespir Crit Care Med 1998; 157, 553-559). Доступные препараты реконструированного сурфактанта действительно не способны к образованию стабильной фосфолипидной плнки в альвеолах в конце выдоха. Во всех документах, упомянутых выше, отсутствует информация о проблеме раскрытого состояния альвеол в конце выдоха и об эффекте препаратов, раскрытых в них. Поэтому до сих пор существует неудовлетворнная потребность в реконструированном сурфактанте с улучшенными свойствами, исходя из растяжимости лгких. В частности, существует потребность в препарате реконструированного сурфактанта, способном гарантировать альвеолярную стабильность и, следовательно, поддерживать раскрытое состояние альвеол-1 015802 в конце выдоха без необходимости применения вентиляции с PEEP. К настоящему времени установлено, и это является целью настоящего изобретения, что конкретные аналоги нативного белка SP-C и предпочтительно полипептиды из WO 00/47623 могут быть успешно объединены с конкретными аналогами нативного белка SP-B для обеспечения препарата реконструированного сурфактанта с улучшенными свойствами, исходя из растяжимости лгких и, в частности, способности эффективного поддержания раскрытого состояния альвеол в конце выдоха без необходимости применения вентиляции с PEEP. В частности, на модели RDS, когда недоношенных новорожденных лечили препаратами экзогенного сурфактанта без приложения PEEP, было обнаружено, что комбинация конкретных аналогов белковSP-C и SP-B влияет на объмы газа в лгких, являющиеся показателем раскрытого состояния альвеол в конце выдоха. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему липидный носитель и комбинацию конкретного полипептидного аналога нативного сурфактантного белка SP-C с конкретным полипептидным аналогом нативного сурфактантного белка SP-B. В частности, изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему: а) липидный носитель; б) полипептид, содержащий по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и не более чем 40 аминокислотных остатков, имеющий последовательность, представленную общей формулой (I) где X представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из I, L и nL; В представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из K,R, H, W, F, Y и Orn;S возможно замещен ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, предпочтительно 16 атомов углерода, связанных с боковой цепью посредством сложноэфирной связи;представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М или М, окисленного по атому серы, I, L и nL; а является целым числом, имеющим значение от 1 до 8;b является целым числом, имеющим значение от 1 до 19; с является целым числом, имеющим значение, независимо выбранное из 3-8; е, f, g и р являются целыми числами, имеющими значение 0 или 1;n является целым числом, имеющим значение от 0 до 3; и при условии, что XaBXb(ВХс)n представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты; в) полипептид, представленный общей формулой (II) гдепредставляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W и L;представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из М, I, L и nL;представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и Т; предпочтительно R; иf является целым числом, имеющим значение 0 или 1. Изобретение также включает фармацевтически приемлемые соли указанных полипептидов и их блокированные по N- и/или С-концу производные, например, путм ацетилирования и амидирования. Изобретение также относится к его фармацевтическим композициям и их применению для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) и других респираторных расстройств. Кроме того, изобретение относится к применению полипептидов общей формулы (II) для приготовления реконструированного сурфактанта для улучшения раскрытого состояния альвеол в конце выдоха. Наконец, согласно изобретению предложен способ профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) и других респираторных расстройств, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества реконструированного сурфактанта, содержащего липидный носитель, полипептид общей формулы (I) и полипептид общей формулы (II). Перечень чертежей На фиг. 1 показана последовательность белка человека SP-C. В нативном SP-C Cys-остатки пальмитоилированы; на фиг. 2 - последовательность белка человека SP-B; на фиг. 3 - результаты, выраженные в виде объмов газа в лгких (мл/кг); на фиг. 4 - результаты, выраженные в виде дыхательных объмов (мл/кг) как функции от времени/давления.-2 015802 Определения Наблюдение за респираторной функцией после лечения in vivo экзогенными препаратами сурфактанта осуществляют путм измерения двух параметров: 1) дыхательного объма, являющегося показателем растяжимости лгких, и 2) объма газа в лгких, являющегося показателем увеличения альвеолярного воздуха или раскрытого состояния в конце выдоха и, следовательно, возможности образования стабильной фосфолипидной плнки в альвеолах в конце выдоха. В настоящей заявке термин "реконструированный сурфактант" означает липидный носитель, к которому добавлены полипептидные аналоги белков сурфактанта, приготовленные по рекомбинантной технологии или синтетическими способами. Термин "липидный носитель" означает смесь фосфолипидов и, возможно, дополнительные липидные компоненты, например нейтральные липиды, такие как триацилглицерины, свободные жирные кислоты и/или холестерин. Термин "полипептидные аналоги нативного сурфактантного белка SP-C" включает полипептиды,имеющие аминокислотную последовательность, в которой по сравнению с нативными белками одна или более аминокислот отсутствуют или заменены другими аминокислотами, при условии, что полипептиды в смеси с липидным носителем проявляют активность лгочного сурфактанта. Термин "полипептидные аналоги нативного сурфактантного белка SP-B" включает полипептиды,имеющие аминокислотную последовательность, в которой по сравнению с нативными белками одна или более аминокислот отсутствуют, при условии, что полипептиды в смеси с липидным носителем проявляют активность лгочного сурфактанта. Термин "mini-B" означает полипептид с 34 остатками на основе 8-25 N-концевых остатков и 63-78 С-концевых остатков нативного белка SP-B, чья структура впервые в общих чертах была раскрыта в презентации на веб-сайте California NanoSystems Institute. Впоследствии его полная последовательность была раскрыта в RCSB Protein Data Bank. Дополнительная информация о его структуре и активности представлена в Waring A.J. et al. J. Peptide Res 2005, 66, 364-374. Термин "варианты" означает полипептидные аналоги пептида Mini-B, имеющие аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот заменены другими аминокислотами, при условии, что пептиды в смеси с липидным носителем сохраняют активность Mini-B. Аминокислотные последовательности изображены с использованием трхбуквенного кода, причм аминокислота со свободной аминогруппой расположена в левом конце (аминный конец), а аминокислота со свободной карбоксильной группой расположена в правом конце (карбоксильный конец). Термин "синергический" означает, что эффективность двух полипептидов превышает ту, которую можно было бы ожидать в данном исследовании путем суммирования их соответствующих индивидуальных эффективностей. Все аминокислотные остатки, идентифицированные в данном описании изобретения, находятся в природной L-конфигурации, а последовательности, идентифицированные в данном описании изобретения, представлены в соответствии со стандартными сокращениями аминокислотных остатков, как показано в следующей ниже таблице соответствия. Таблица соответствия Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему липидный носитель и комбинацию конкретных полипептидных аналогов нативного сурфактантного белка SP-C с конкретными полипептидными аналогами нативного сурфактантного белка SP-B, включая пептид mini-B и его варианты. На модели RDS, когда недоношенных новорожденных лечили препаратами экзогенного сурфактанта без приложения PEEP, авторами изобретения действительно было обнаружено, что комбинация полипептида общей формулы (I) с полипептидом общей формулы (II) положительно влияет на растяжимость лгких. В частности, было обнаружено, что комбинация двух полипептидов синергически влияет на объмы газа в лгких, являющиеся показателем раскрытого состояния альвеол в конце выдоха. Указанный результат свидетельствует о том, что реконструированный сурфактант по изобретению способен стабилизировать в альвеолах фосфолипидную плнку в конце выдоха лучше, чем реконструированный сурфактант, содержащий только аналог белка SP-C или аналог белка SP-B. Более того, оказалось, что препарат заявленного реконструированного сурфактанта улучшает респираторную функцию, выраженную посредством дыхательных объмов, в степени, сопоставимой или даже немного лучшей, чем улучшение, достигаемое после введения модифицированного природного сурфактанта. Преимущественно аналог нативного белка SP-C представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и не более чем 40 аминокислотных остатков, имеющий последовательность, представленную общей формулой (I) где X представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из I, L и nL; В представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из K,R, H, W, F, Y и Orn;S возможно замещен ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, предпочтительно 16 атомов углерода, связанных с боковой цепью посредством сложноэфирной связи;представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М или М, окисленного по атому серы, I, L и nL; а является целым числом, имеющим значение от 1 до 8;b является целым числом, имеющим значение от 1 до 19; с является целым числом, имеющим значение, независимо выбранное из 3-8; е, f, g и p являются целыми числами, имеющими значение 0 или 1;n является целым числом, имеющим значение от 0 до 3; и при условии, что XaBXb(ВХс)n представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты, предпочтительно содержащую от 10 до 22 аминокислот. Предпочтительно полипептид общей формулы (I) состоит по меньшей мере из 30 и не более чем 35 аминокислот, более предпочтительно из не более чем 33 аминокислот. В конкретных воплощениях полипептиды общей формулы (I) состоят из 30, или 33, или 35 аминокислот. Предпочтительно полипептидный аналог белка SP-C представлен общей формулой (Ia), в которой е и n равны 0, а g равен 1-4 015802 где X, В иявляются такими, как определено выше; а находится в диапазоне от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно равен 1;b находится в диапазоне от 1 до 19, предпочтительно от 5 до 15; более предпочтительно равен 14;f и p равны 0 или 1. Более предпочтительно полипептидный аналог белка SP-C представлен общей формулой (Ib), в которой f равен 1 где X, В, , а и b являются такими, как определено выше; р равен 0 или 1. Еще более предпочтительно полипептидный аналог белка SP-C представлен общей формулой (Ic) гдеявляется таким, как определено выше; р равен 0 или 1. Ниже приведены примеры полипептидов формулы (Ic) В документах предшествующего уровня техники полипептид (Id) также назван как SP-C33. Более предпочтительно аналог SP-C представляет собой полипептид, выбранный из группы полипептидов, имеющих формулы (Ie), (If), (Ig) и (Ih). В предпочтительном воплощении изобретения полипептид общей формулы (I) представляет собой полипептид (If), ниже называемый как SP-C33(Leu)31. Аналог нативного белка SP-B преимущественно состоит из двух частей, соответствующих 8-25 Nконцевым остаткам и 63-78 С-концевым остаткам нативного белка SP-B (называемый как пептид mini-B) или его варианта. Более предпочтительно аналог нативного белка SP-B является полипептидом, представленным следующей ниже общей формулой (II): гдепредставляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W и L;представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из М, I, L и nL;представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и Т, предпочтительно R; иf является целым числом, имеющим значение 0 или 1. В конкретном воплощении изобретения аналог SP-B является полипептидом, представленным формулой (IIa) В других воплощениях изобретения аналог SP-B выбран из аналогов, имеющих следующие формулы: В предпочтительном воплощении полипептиды (IIa), (IIb), (IIc) и (IId) могут находиться в форме дисульфидсвязанной молекулы, в которой внутримолекулярная дисульфидная связь образована между двумя остатками Cys в положениях 1 и 33 и/или между двумя остатками Cys в положениях 4 и 27. В документах уровня техники дисульфидсвязанный полипептид (IIa) назван как окисленный Mini-B(ox Mini-B). Полипептид (IIc) ниже назван как Mini-B(Leu), а его дисульфидсвязанная форма как ox Mini-B(Leu). Полипептиды общей формулы (I) и (II) могут быть приготовлены синтетическими способами или по рекомбинантным технологиям, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Превосходное краткое изложение многих доступных технологий можно найти в J.M. Steward andJ.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, и J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983 (для твердофазного пептидного синтеза) и в Е. Schroder and K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 (для классического синтеза в растворе). Полипептиды по изобретению также могут быть приготовлены с использованием технологии твердофазного синтеза, первоначально описанной Merrifield в J. Am. Chem.Soc. 85: 2149-2154 (1963). Другие технологии полипептидного синтеза можно найти, например, в М. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John WileySons, 2d Ed., (1976), а также в других справочниках, извест-5 015802 ных специалистам в данной области техники. В указанных выше текстах, а также в J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, PlenumPress, New York, NY (1973) будут найдены подходящие защитные группы для применения в таких синтезах. Например, полипептиды общей формулы (I) могут быть приготовлены способом, раскрытым в WO 00/47623, тогда как полипептиды общей формулы (II) могут быть приготовлены способом, который указан Waring A.J. et al. в J. Peptide Res 2005, 66, 364-374. Изобретение также включает фармацевтически приемлемые соли полипептидов общих формул (I) и(II) и их блокированные по N- и/или С-концу производные, например, путм ацетилирования и амидирования. Фармацевтически приемлемые соли включают, например, соли хлористо-водородной кислоты, уксусной кислоты и трифторуксусной кислоты. Реконструированный сурфактант по изобретению может быть получен путм смешивания раствора или суспензии полипептидов общей формулы (I) и (II) и липидов с последующей сушкой смеси; иначе они могут быть получены путм лиофилизации или распылительной сушки. Предпочтительно полипептиды общей формулы (I) и полипептиды общей формулы (II) присутствуют в реконструированных сурфактантах по изобретению в фиксированном количестве и количественном отношении в виде фиксированной комбинации. Доля полипептидов общих формул (I) и (II) по отношению к реконструированному сурфактанту может варьироваться. Преимущественно каждый полипептид может присутствовать в количестве, находящемся между 0,5 и 10%, исходя из массы сурфактанта (мас./мас.), предпочтительно между 1 и 5%,наиболее предпочтительно между 1 и 3%. В предпочтительном воплощении реконструированный сурфактант содержит от 1 до 3 мас.% полипептида (If), от 1 до 3 мас.% полипептида (IIa) предпочтительно в окисленной форме. В другом предпочтительном воплощении реконструированный сурфактант содержит от 1 до 3 мас.% полипептида (If), от 1 до 3 мас.% полипептида (IIc) предпочтительно в окисленной форме. Липидный носитель преимущественно содержит фосфолипиды, которые имеются в природных лгочных сурфактантных препаратах, например фосфатидилхолины (PC), такие как дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) и пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), и фосфатидилглицерины (PG), такие как пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG) и дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG). Другие фосфолипиды, которые можно преимущественно применять, представляют собой фосфатидилинозиты (PI), фосфатидилэтаноламины (РЕ), фосфатидилсерины и сфингомиелины (SM). В конкретном воплощении липидный носитель может содержать дополнительные компоненты, например нейтральные липиды, такие как триацилглицерины, свободные жирные кислоты и/или холестерин. Реконструированный сурфактант по изобретению преимущественно содержит 90-99 мас.% липидного носителя, предпочтительно 92-98%, более предпочтительно 94-96%, и оба пептида в суммарном количестве 1-10 мас.%, предпочтительно 2-8%, более предпочтительно 4-6%. В одном из воплощений изобретения реконструированный сурфактант содержит 96 мас.% липидного носителя, 2 мас.% полипептида общей формулы (I) и 2 мас.% полипептида общей формулы (II). В конкретном воплощении липидный носитель состоит только из фосфолипидов, более предпочтительно из смеси DPPC и пальмитоилолеилфосфолипида, выбранного из POPG или его смеси с РОРС при массовых соотношениях в диапазоне от 95:5 до 50:50, предпочтительно от 80:20 до 60:40. Массовое соотношение между DPPC и POPG предпочтительно колеблется в диапазоне от 75:25 до 65:35 и более предпочтительно составляет 68:31. В случае смесей DPPC:POPG:POPC фосфолипиды предпочтительно применяют при массовых соотношениях 60:20:20 или 68:15:16. В другом воплощении липидный носитель может состоять из DPPC, DPPG и холестерина. В предпочтительном воплощении изобретения реконструированный сурфактант содержит от 1 до 5 мас.% одного из полипептидов общей формулы (Ia), от 1 до 5 мас.% одного из полипептидов общей формулы (II) и смесь DPPC и POPG при массовом соотношении 68:31. Введение реконструированного сурфактанта по изобретению осуществляют способом, известным специалисту в данной области техники, предпочтительно путем интратрахеального вливания (инфузия или болюс) или путем распыления. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим реконструированный сурфактант по изобретению. Указанные композиции преимущественно вводят в виде раствора, дисперсии, суспензии или сухого порошка. Указанные композиции предпочтительно содержат реконструированный сурфактант, растворнный или суспендированный в подходящем растворителе или в среде для ресуспендирования. Указанные фармацевтические композиции предпочтительно поставляют в виде суспензии в водном забуференном физиологическом растворе в одноразовых стеклянных пузырьках. Концентрация реконструированного сурфактанта (выраженная в виде содержания фосфолипида) преимущественно находится в диапазоне от примерно 2 до примерно 160 мг сурфактанта на 1 мл, предпочтительно между 10 и 100-6 015802 мг/мл, более предпочтительно между 20 и 80 мг/мл. Кроме того, указанные композиции могут содержать электролиты, такие как кальциевые, магниевые и/или натриевые соли, предпочтительно хлорид кальция. Фармацевтические композиции по изобретению являются пригодными для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) у недоношенных детей или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, включая RDS у взрослых (ARDS), синдром аспирации мекония (MAS) и бронхолгочную дисплазию (BPD). Также они могут быть полезны для профилактики и/или лечения других респираторных расстройств, таких как пневмония, бронхит, COPD (хроническая обструктивная болезнь лгких), астма и муковисцидоз, а также для лечения среднего серозного отита (экссудативного отита). Следующие ниже примеры иллюстрируют изобретение более подробно. Примеры Пример 1. Синтез и очистка полипептидов SP-C33(Leu)31 и SP-C33. Полипептид SP-C33(Leu)31 получали по стандартным методикам SPPS (твердофазный пептидный синтез), основанным на Fmoc-химии и последующих расщеплениях с использованием TFA. Всего было получено 186,0 г сырого SP-C33(Leu)31. Полипептид очищали, подвергая материал противоточному распределению (CCD) с использованием H2O/н-BuOH/AcOEt/AcOH (4:1:4:1) в качестве двухфазной системы растворителей. В результате этой очистки получали 78,9 г SP-C33(Leu)31 с чистотой более 60%. Окончательную очистку осуществляли препаративной HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с использованием PLRP-S в качестве неподвижной фазы в стальной колонке 50300 мм и линейного градиента от 25 до 100% В за 75 мин. Подвижная фаза состояла из буфера А: 0,1% TFA вACN/H2O 1:4 и буфера В: 0,1% TFA в IPA. Очищенный полипептид растворяли в 90% АсОН и пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой Dowex (ацетатная форма), что после лиофилизации привело к получению 5,8 г (5,4%) конечного продукта в виде ацетата. Полипептид SP-C33 получали аналогичным образом. Условные обозначенияACN - ацетонитрил,AcOEt - этилацетат,АсОН - уксусная кислота,Boc - трет-бутилоксикарбонил,n-BuOH - н-бутанол,Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил,IPA - изопропиловый спирт,TFA - трифторуксусная кислота. Пример 2. Синтез и очистка полипептидов ox Mini-B(Leu) и ox-Mini-В. Полипептид ox-Mini-B(Leu) получали по стандартным методикам SPPS (твердофазный пептидный синтез), основанным на Fmoc-химии и последующих расщеплениях с использованием TFA. Сырой полипептид очищали препаративной HPLC с использованием TFA-системы и выделяли путм лиофилизации. Окисление очищенного пептида воздухом привело к моноциклической последовательности с дисульфидной связью между Cys1 и Cys33. Моноциклический пептид очищали препаративной HPLC с использованием TFA-системы и выделяли путм лиофилизации. Второй дисульфидный мостик между Cys4 и Cys27 формировали с использованием йода. После окисления продукт очищали препаративной HPLC с использованием TFA-системы и выделяли путм лиофилизации. Было выделено 1,12 г (1,7%) конечного соединения с чистотой более 89%. Полипептид ox Mini-B получали аналогичным образом. Пример 3. Эксперименты in vivo с реконструированным сурфактантом на основе ox Mini-B и SPC33. Сурфактантные препараты испытывали на недоношенных новорожденных кроликах, полученных путм гистерэктомии при сроке беременности 27 суток. Эксперименты проводили без использования положительного давления в конце выдоха (PEEP). В качестве аналога SP-C применяли полипептид, именуемый SP-C33, который был получен в соответствии с примером 1. В качестве аналога белка SP-B применяли окисленный Mini-B (ox Mini-B), который был получен в соответствии с примером 2. Животных в момент рождения подвергали воздействию препаратов реконструированного сурфактанта, содержащих в качестве липидного носителя фосфолипидную смесь DPPC:OPG при соотношении 68:31 мас./мас. Фосфолипиды смешивали с 2 или 4% мас./мас. SPC-33, 2% мас./мас. ox Mini-B или 2% мас./мас. SPC-33 + 2% мас./мас. ox Mini-B.-7 015802 Животных, получающих такую же дозу Curosurf, использовали в качестве положительных контролей, а необработанных однопомтных животных использовали в качестве отрицательных контролей. Все препараты сурфактанта вводили в концентрации 80 мг/мл и при стандартной дозе 2,5 мл/кг. Недоношенных новорожденных кроликов подвергали вентилированию параллельно со стандартизованной последовательностью пиковых инсуффляционных давлений. Сначала для раскрытия лгких устанавливали давление 35 см водяного столба (около 3,43 кПа) на 1 мин. После этого рекрутментманевра давление понижали до 25 см водяного столба (около 2,45 кПа) в течение 15 мин и далее до 20 и 15 см водяного столба (около 1,96 и 1,47 кПа). В конце давление опять повышали до 25 см водяного столба в течение 5 мин, после чего лгкие вентилировали азотом в течение дополнительных 5 мин и затем иссекали для измерений объма газа. Измеряли объмы газа в лгких и дыхательные объмы, выраженные в мл/кг; результаты, представленные в виде средних значений, показаны на фиг. 3 и 4 соответственно. Из фиг. 3 можно понять, что животные, обработанные препаратом реконструированного сурфактанта, содержащим 2% мас./мас. ox Mini-B, имели более низкие объмы газа в лгких по сравнению с животными, получавшими 2% мас./мас. SP-C33 (примерно 2 мл/кг против примерно 4 мл/кг). Добавление 2% мас./мас. ox Mini-B к сурфактанту SP-C33 вызвало значительно большее увеличение объмов газа в лгких по сравнению с любым одиночным пептидом (8 мл/кг против примерно 6 мл/кг). Как показано на фиг. 4, аналогичную тенденцию наблюдали для дыхательных объмов, и после введения пептидов в комбинации наблюдали улучшение, сопоставимое или даже немного лучшее, чем улучшение, достигаемое после введения Curosurf. Также было обнаружено, что увеличение содержания SP-C33 от 2 до 4% мас./мас. не привело к увеличению объмов газа в лгких, показывая тем самым, что стабилизирующий эффект фосфолипидной плнки в альвеолах в конце выдоха обусловлен добавлением ox Mini-B. Указанный результат свидетельствует о том, что реконструированный сурфактант по изобретению способен стабилизировать в альвеолах фосфолипидную плнку в конце выдоха лучше, чем реконструированный сурфактант, содержащий только аналог белка SP-C или аналог белка SP-B. Более того, оказалось, что препарат заявленного реконструированного сурфактанта улучшает респираторную функцию, выраженную посредством дыхательных объмов, в степени, сопоставимой или даже немного лучшей, чем улучшение, достигаемое после введения модифицированного природного сурфактанта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Реконструированный сурфактант, содержащий смесь фосфолипидов и комбинацию полипептидного аналога нативного сурфактантного белка SP-C с полипептидным аналогом нативного сурфактантного белка SP-B, где указанный полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-C представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и не более чем 40 аминокислотных остатков, имеющий последовательность, представленную общей формулой (I) где X представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из I, L и nL; В представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из K,W, F, Y и Orn;S возможно замещен ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, предпочтительно 16 атомов углерода, связанных с боковой цепью посредством сложноэфирной связи;представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из М или М,окисленного по атому серы, I, L и nL; а является целым числом, имеющим значение от 1 до 8;b является целым числом, имеющим значение от 1 до 19; с является целым числом, имеющим значение, независимо выбранное из 3-8; е, f, g и p являются целыми числами, имеющими значение 0 или 1;n является целым числом, имеющим значение от 0 до 3; при условии, что XaBXb(BXc)n представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты; и где указанный полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-B представляет собой полипептид общей формулы (II) гдепредставляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W и L;представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из М, I, L и nL;-8 015802 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и Т; иf является целым числом, имеющим значение 0 или 1. 2. Реконструированный сурфактант по п.1, гдепредставляет собой R. 3. Реконструированный сурфактант по п.1 или 2, где аналог нативного сурфактантного белка SP-C и аналог нативного сурфактантного белка SP-B присутствуют в фиксированной комбинации. 4. Реконструированный сурфактант по любому из пп.1-3, где полипептид(II) находится в форме дисульфидсвязанной молекулы с внутримолекулярной дисульфидной связью между двумя остатками Cys в положениях 1 и 33 и/или между двумя остатками Cys в положениях 4 и 27. 5. Реконструированный сурфактант по любому из пп.1-3, где аналог нативного сурфактантного белка SP-B представлен общей формулой (IIa) 6. Реконструированный сурфактант по п.5, где аналог нативного сурфактантного белка SP-C представлен общей формулой (Ia) где X, В иявляются такими, как определено выше; а находится в диапазоне от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно равен 1;b находится в диапазоне от 1 до 19, предпочтительно от 5 до 15; более предпочтительно равен 14 иf и p равны 0 или 1. 7. Реконструированный сурфактант по п.6, где аналог нативного сурфактантного белка SP-C представлен общей формулой (Ib) где X, В, , а и b являются такими, как определено выше; и р равен 0 или 1. 8. Реконструированный сурфактант по п.7, где аналог нативного сурфактантного белка SP-C представлен общей формулой (Ic) гдеявляется таким, как определено выше; и р равен 0 или 1. 9. Реконструированный сурфактант по п.8, где аналог нативного сурфактантного белка SP-C выбран из группы, состоящей из 10. Реконструированный сурфактант по п.1, где полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-C представляет собой и полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-B представляет собой 11. Реконструированный сурфактант по п.1, где полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-C представляет собой и полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-B представляет собой 12. Реконструированный сурфактант по любому из пп.1-11, где фосфолипидная смесь содержит дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) и пальмитоилолеоилфосфолипид, выбранный из пальмитоилолеоилфосфатидилглицерина (POPG) или его смеси с пальмитоилолеоилфосфатидилхолином (РОРС) при массовых соотношениях в диапазоне от 95:5 до 50:50. 13. Реконструированный сурфактант по п.12, где фосфолипидная смесь содержит DPPC и POPG при массовом соотношении 68:31. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая реконструированный сурфактант по любому из пп.1-13 и подходящий носитель или растворитель. 15. Фармацевтическая композиция по п.14 в виде или раствора, или дисперсии, или суспензии, или сухого порошка. 16. Фармацевтическая композиция по п.15 в виде водной суспензии. 17. Фармацевтическая композиция по п.16, содержащая реконструированный сурфактант в концентрации от 2 до 160 мг/мл. 18. Фармацевтическая композиция по п.17, где концентрация реконструированного сурфактанта составляет от 20 до 80 мг/мл.-9 015802 19. Применение реконструированного сурфактанта по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики респираторного дистресс-синдрома (RDS) у недоношенных детей или в лечении или профилактике других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта. 20. Применение по п.19, где заболевания, связанные с дефицитом или дисфункцией сурфактанта,включают RDS у взрослых (ARDS), синдром аспирации мекония (MAS) и бронхолгочную дисплазию