Штамм blakeslea trispora и способ его применения

007616 Область техники Данное изобретение относится к штаммам Blakeslea trispora (В. trispora), продуцирующим ликопин в приемлемой среде при отсутствии экзогенного ингибитора каротиногенеза, к естественному и эффективному способу продуцирования ликопина указанными штаммами, к среде, особенно пригодной для осуществления указанного способа, и к способу выделения любого каротиноидного соединения, предпочтительно ликопина. Предпосылки изобретения Ликопин является красным каротиноидом. Он присутствует в малых количествах во многих организмах, являясь биосинтетическим предшественником большинства каротиноидов, встречающихся в природе. Однако источники, содержащие указанный натуральный краситель в больших количествах,являются редкими. При этом промышленный интерес к данному соединению постоянно возрастает благодаря его антиоксидантным и другим потенциально полезным свойствам. В настоящее время известно несколько способов получения ликопина. Первым способом является химический синтез (Meyer (2002), Chemie in unserer Zeit 36(3):178-192). Недостатком химического способа является получение продукта, который не воспринимается как натуральный. Вторым способом является экстракция из томатов (WO 97/48287 или европейский патент 608027). Экстракция из растений представляет собой очень дорогостоящий процесс из-за низкой концентрации ликопина в томатах. Ликопин можно также получить в результате ферментации В. trispora. Штамм В. trispora используется для получения -каротина с конца 1950-х годов. Первая попытка ферментативного получения ликопина описана в патенте США 3097146. В указанном патенте отмечено, что в специфических благоприятных условиях ферментации штамм В. trispora продуцирует ликопин практически при отсутствии других каротиноидов. Однако не дано четкого определения специфических условий, за исключением значения рН культуры, которое должно быть выше 6,6 на протяжении всего процесса ферментации. Выход ликопина является очень низким при максимальном уровне, равном 150 мг/л. Не приведены какиелибо экспериментальные данные, подтверждающие, что продуцируемый каротиноид является, по существу, чистым ликопином. В более поздних подходах к решению данной проблемы были использованы специфические химические ингибиторы каротиногенеза для предотвращения образования -каротина и стимуляции накопления ликопина. Примеры подобных способов приведены в патенте США 3369974, патенте Японии 48016189, патенте Японии 48016190, патенте Японии 73016189, патенте Японии 73016190,патенте РФ 2102416, патенте Японии 09313167 и патенте США 3369974. При помощи указанного способа ликопин был получен в концентрациях до 1030 мг/л при загрязнении 205 мг/л -каротина. До настоящего времени были испытаны многие соединения в качестве ингибиторов метаболизма ликопина,но не было найдено эффективных соединений пищевого сорта (MehtaCerd-Olmedo (1999), Mycoscience 40:307-310). Известно, что при блокировании синтеза -каротина возникает проблема, связанная с продуцированием каротиноидов. Каротиногенез стимулируется триспоровыми кислотами, которые являются половыми гормонами, продуцируемыми при совместном культивировании штаммов (+) и (-). В то же время-каротины являются предшественниками триспоровых кислот, поэтому блокирование продуцирования-каротина уменьшает продуцирование всех каротиноидов. В заявке WO 00/77234 указано, что проблему стимуляции каротиногенеза при незначительном продуцировании -каротина можно решить, добавляя триспоровые кислоты из внешнего источника. В указанной заявке описан способ получения ликопина путем ферментации продуцентов -каротина В. trispora или их мутантов, накапливающих ликопин. Мутанты, накапливающие ликопин, описаны в статье Мета Б. и др. (Mehta В., et al., 1995, Appl. Microbiol.Biotechnol., 42:836-838). Такие ликопинпродуцирующие мутанты далее будут именоваться мутантамиMehta. Мутанты Mehta были получены мутагенезом и продуцировали ликопин с низким выходом, равным 200 мкг/г сухой массы, на агаровых пластинках без добавления каких бы то ни было ингибиторов. Мета пришел к выводу, что мутанты Mehta являются бесполезными для применения в биотехнологии изза низкого выхода ликопина. Из заявки WO 00/77234 следует, что продуцирование ликопина указанным мутантом Mehta является менее эффективным, чем при использовании продуцентов -каротина и добавлении имидазола в качестве ингибитора, так как наибольшее продуцирование ликопина мутантом Mehta составляет примерно 4% от количества, полученного при использовании продуцентов -каротина и ингибитора в тех же условиях. Хотя в данной заявке не указаны объемные показатели продуктивности, что затрудняет сравнение с ранее известной технологией, принимая производство биомассы равным 50 г/л(что является высокой оценкой для культур грибов во встряхиваемых колбах), авторы настоящего изобретения вычислили, что мутант Mehta может продуцировать ликопин в максимальной концентрации около 60 мг/л. Такая оценка продуктивности все же ниже оценки, полученной ранее в вышеуказанном патенте США 3097146. Таким образом, существует потребность в более эффективном способе, обеспечивающем высокий выход ликопина с помощью естественного процесса ферментации и выделения. Настоящее изобретение относится к такому способу продуцирования ликопина новым штаммом В. trispora в микробиологически-1 007616 приемлемой среде, которая не содержит экзогенных специфических ингибиторов каротиногенеза и включает только ингредиенты, обычно применяемые в процессе ферментации. Преимуществом штамма по данному изобретению является то, что он позволяет продуцировать ликопин в процессе ферментации без использования соединений, которые могли бы изменить естественный характер такого процесса, и добавления продуктов, которые могли бы изменить пищевые свойства продуцируемого ликопина. Подробное описание изобретения В отличие от способов получения ликопина, ранее известных в данной области, настоящее изобретение относится к продуцированию ликопина в большом количестве в приемлемой среде, обычно используемой в процессе ферментации, без введения каких-либо добавок, ингибирующих каротиногенез. Подобный результат достигается при использовании мутанта, полученного химическим мутагенезом и селекцией. С учетом отличительных свойств мутантов, полученных ранее классическим мутагенезом(1995, Appl. Microbiol. Biotechnol., 42:836-838), весьма удивительным является то, что такой мутант был найден. Изобретение, прежде всего, относится к штамму Blakeslea trispora, который способен продуцировать по крайней мере 0,3 г/л ликопина при совместном культивировании по крайней мере в течение 3 дней с приемлемым штаммом Blakeslea trispora противоположного типа спаривания в приемлемой среде при отсутствии экзогенного специфического ингибитора каротиногенеза. Предпочтительно можно продуцировать по крайней мере 0,5 г/л ликопина, предпочтительно по крайней мере 0,7, предпочтительно по крайней мере 0,8, более предпочтительно по крайней мере 1,0, наиболее предпочтительно по крайней мере 1,2 и особенно предпочтительно по крайней мере 1,5 г/л. Количество продуцированного ликопина измерено в конце процесса ферментации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения приемлемая среда означает такую среду, которая содержит только ингредиенты, обычно используемые в ферментационных средах. Таким образом, в указанной среде отсутствуют соединения, которые могли бы изменить естественный характер данного способа, и/или не добавляются продукты, которые могли бы изменить пищевые свойства продуцированного ликопина, и/или дорогостоящие добавки. Указанная среда не содержит экзогенных ингибиторов каротиногенеза. В контексте данного изобретения ингибитор каротиногенеза означает вещество, которое специфически препятствует образованию -каротина и стимулирует накопление ликопина. Ингибитор каротиногенеза можно также определить как вещество, специфически ингибирующее метаболизм ликопина. Единственными специфическими ингибиторами каротиногенеза, которые могут присутствовать в процессе ферментации, являются вещества, продуцируемые самими штаммами. Примеры ингибиторов каротиногенеза приведены в заявкеWO 200077234, патенте США 3369974, патенте Японии 48016189 и патенте Японии 48016190,статьях MehtaCerd-Olmedo (1999), Cerd-OlmedoHutterman (1986) Angewandte Botanik 60:59-70,патенте Японии 73016189 и патенте Японии 73016190, патенте РФ 2102416, патенте Японии 09313167 и патенте США 3369974. Указанные ингибиторы могут быть N-гетероциклическими соединениями, такими как имидазол, пиридин, морфолин и их замещенные производные, или соединениями третичного амина. В контексте данного изобретения тиамин не считается третичным амином. Тиамин является незаменимым витамином для В. trispora и поэтому должен присутствовать в ферментационной среде. Ингибитор каротиногенеза может, предпочтительно, препятствовать образованию по крайней мере 10% (мас./мас.) -каротина и одновременно стимулировать образование по крайней мере 10% (мас./мас.) ликопина по сравнению с ситуацией, когда ингибитор каротиногенеза отсутствует. Предпочтительно можно предотвратить образование по крайней мере 20% -каротина, более предпочтительно по крайней мере 30%, еще более предпочтительно по крайней мере 40%, наиболее предпочтительно по крайней мере 50% и особенно предпочтительно по крайней мере 60%, по крайней мере 70%,по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 99%. Триспоровые кислоты предпочтительно не добавляют в процессе ферментации. В том случае, когда триспоровые кислоты не добавляют в процессе ферментации, единственным источником имеющихся триспоровых кислот являются нативные триспоровые кислоты, продуцируемые самими штаммами. Приемлемая среда предпочтительно содержит один или более источников углерода, один или более источников азота, минеральные соли и тиамин. Добавляемыми источниками углерода являются простые или сложные питательные вещества, которые включают углеводы или жиры, такие как декстрины, крахмалы, глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу, мальтодекстрины, животные или растительные масла. Приемлемая среда предпочтительно содержит органический или неорганический источник усваиваемого азота, такой как соевая мука, кукурузная мука, растворимые дистилляты, дрожжевой экстракт, мука из семян хлопчатника, пептон, казеин, аммиак, соли аммония, нитрат, кукурузный экстракт, сухие вещества из зерен кукурузы, жидкие вещества из зерен кукурузы и т.д. Минеральные соли, которые предпочтительно присутствуют в приемлемой среде, включают фосфаты, сульфаты, хлориды, натрий, калий, аммоний, кальций и магний. Соотношение питательных веществ можно определить с учетом требований роста штамма В. trispora и уровней продуцирования ликопина. Ферментацию предпочтительно осущест-2 007616 вляют в аэробных условиях и в погруженной культуре. Приемлемая среда предпочтительно содержит большое количество сахара в качестве источника углерода, как будет далее рассмотрено в данной заявке. Наиболее предпочтительная среда представлена ниже в табл. 1. Процесс ферментации можно осуществлять при температуре от 20 до 34 С. Альтернативно, процесс ферментации можно осуществлять при двух или более разных температурах в указанном интервале для обеспечения независимой оптимизации последовательных фаз процесса. На первой стадии ферментации температура предпочтительно может быть выбрана с учетом оптимального роста хозяина, и на второй стадии температура может быть выбрана с учетом оптимального продуцирования ликопина хозяином. Более предпочтительно температура,пригодная для продуцирования ликопина, должна быть ниже температуры, пригодной для роста хозяина. Обе температуры находятся в интервале от 20 до 34 С. Температура, пригодная для роста, предпочтительно находится между 25-32 С, более предпочтительно равна 32 С, и температура, пригодная для продуцирования ликопина, находится между 20-25 С, более предпочтительно равна 22 С. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения процесс ферментации, альтернативно, является процессом ферментации с периодической загрузкой. В процессе ферментации с периодической загрузкой, помимо питательных веществ, вводимых в приемлемую среду в начале ферментации, одно или более питательных веществ добавляют для питания ферментационной системы в процессе ферментации. Альтернативно, одно или более питательных веществ подают в ферментационную систему во время ферментации, восполняя таким образом питательные вещества, потребляемые во время ферментации. Одним из преимуществ системы с периодической загрузкой является возможность избежать нежелательных высоких концентраций питательных веществ, таких как сахар. Другим примером потенциально вредного питательного вещества, которое может быть введено при загрузке, является аммоний или любое другое питательное вещество, высокая концентрация которого является нежелательной. Вторым преимуществом ферментации с периодической загрузкой является возможность продлить ферментацию после того, как одно из питательных веществ будет полностью израсходовано, благодаря добавлению такого питательного вещества. Применение процесса с периодической загрузкой часто позволяет получить более высокую концентрацию биомассы и более высокую концентрацию продукта. Концентрацию каротиноидов в конце процесса ферментации можно измерить спектрофотометрическим методом после экстракции каротиноидов с учетом максимальных значений характеристического поглощения разных каротиноидов. Альтернативно, каротиноиды можно разделить ВЭЖХ или другими хроматографическими методами, после чего можно произвести детектирование при унифицированной длине волны поглощения или при разных длинах волн, характерных для разных каротиноидов. Особое внимание следует уделить наличию стереоизомеров каротиноидов, которые могут обладать разными хроматографическими или спектральными свойствами. В данной области известно, что первичным продуктом биосинтеза является транс-изомер, при этом разные цис-изомеры образуются в процессе изомеризации при обработке образца или выделении продукта. Поэтому считается, что общая продуктивность отдельного каротиноида является суммой продуктивности всех его стереоизомеров. Достаточно трудно обнаружить все изомеры всех каротиноидов. Поэтому удобнее характеризовать каротиногенные мутанты по соотношению двух хорошо обнаруживаемых продуктов. В контексте настоящего изобретения двумя наиболее важными каротиноидами являются -каротин, являющийся основным продуктом родительского штамма, и ликопин, являющийся основным продуктом мутантов. Мутанты или условия осуществления данного способа можно охарактеризовать по соотношению ликопина и -каротина, присутствующих в соответствующих образцах. Альтернативно, мутанты можно охарактеризовать по количеству общего ликопина, продуцируемого в процентном выражении от общего количества имеющихся каротиноидов. Из вышеизложенного следует, что в контексте данного изобретения (за исключением особо оговоренных случаев) концентрация ликопина и -каротина соответствует сумме концентраций цис- и транс-ликопина, а также цис- и транскаротина. Из-за наличия множества каротиноидов сумма -каротина и ликопина составляет примерно 90% (мас./мас.) от общего количества каротиноидов, продуцированных штаммом (за исключением особо оговоренных случаев). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения используемый штамм способен продуцировать по крайней мере 70% (мас./мас.) ликопина и менее 20% (мас./мас.) -каротина при совместном культивировании в течение по крайней мере 3 дней с приемлемым штаммом Blakesleatrispora противоположного типа спаривания в приемлемой среде при отсутствии экзогенных специфических ингибиторов каротиногенеза, предпочтительно по крайней мере 75% и менее 15%, более предпочтительно по крайней мере 80% и менее 10%, наиболее предпочтительно по крайней мере 85% и менее 5%. Приведенные процентные значения представляют процентное содержание ликопина по отношению к -каротину в виде процентного выражения от общего количества каротиноидов, продуцированных штаммом. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения используемый штамм продуцирует по крайней мере 70% (мас./мас.) ликопина при совместном культивировании в течение по крайней мере 3 дней с приемлемым штаммом Blakeslea trispora противоположного типа спаривания в-3 007616 приемлемой среде при отсутствии экзогенных специфических ингибиторов каротиногенеза, предпочтительно по крайней мере 75%, более предпочтительно по крайней мере 80%, наиболее предпочтительно по крайней мере 85%. Приведенные процентные значения представляют процентное содержание ликопина от общего количества каротиноидов, продуцированных штаммом. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления изобретения используемый штамм продуцирует смесь каротиноидов, в которой соотношение ликопина и -каротина превышает 4:1,при совместном культивировании указанного штамма в течение по крайней мере 3 дней с приемлемым штаммом Blakeslea trispora противоположного типа спаривания в приемлемой среде при отсутствии экзогенных специфических ингибиторов каротиногенеза. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения штамм продуцирует смеси каротиноидов, в которых ликопин является главным компонентом. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения штамм продуцирует смеси каротиноидов, представляющие путь биосинтеза от фитоена до -каротина. Другим объектом данного изобретения являются смеси каротиноидов, в которых соотношение ликопина и -каротина превышает 4:1. Предпочтительно получают смеси каротиноидов, в которых ликопин является основным компонентом. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения получают смеси каротиноидов, которые представляют путь биосинтеза от фитоена до -каротина. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения получают биомассу, содержащую вышеуказанную смесь каротиноидов. Указанную биомассу можно затем использовать в пищевых, кормовых или косметических продуктах. Наиболее предпочтительные смеси каротиноидов включают 0-5 мас.% нейроспорина, 0-5 мас.% фитоена, 0-10 мас.% -каротина, 5-20 мас.% -каротина, 70-90 мас.% ликопина. Наиболее предпочтительные смеси включают 0-2 мас.% нейроспорина, 0-2 мас.% фитоена, 0-5 мас.%-каротина, 5-15 мас.% -каротина, 80-90 мас.% ликопина. Штамм по настоящему изобретению может быть получен химическим мутагенезом и селекцией. В данной области известны разные методы мутагенеза (см., например, Rowlands (1984), Enzyme Microb.Technol. 6:3-10). Один из таких методов включает обработку мутагенными химикатами, включая нитрозогуанидин (NTG), этилметансульфонат (EMS) или оксид нитрохинолина (NQO). Другой метод включает обработку мутагенным излучением, таким как УФ-свет, гамма-лучи или Х-лучи. Что касается метода селекции, то особенно эффективным является разделение колонии по цвету при культивировании на агаровых средах для отбора каротиногенных мутантов, но можно использовать и другие критерии, такие как морфология колонии и мицелия, характеристики споруляции, скорость роста, устойчивость к ингибирующим соединениям или стрессовым условиям, и другие методы, обычно используемые в программах по усовершенствованию штаммов. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения ликопинпродуцирующим штаммом является штамм Blakeslea trispora lус 26(-). Указанный штамм был получен в результате множества циклов мутагенеза и селекции с использованием 1-метил-3-нитронитрозогуанидина(NG) и гамма-излучения в качестве мутагенных факторов, начиная с -каротинпродуцирующего родительского штамма В. trispora 111(-). При выращивании в сокультуре с приемлемым штаммом (+) данного вида, таким как штамм, используемый для продуцирования -каротина, в вышеуказанной приемлемой питательной среде, штамм lус 26(-) продуцирует ликопин в виде наиболее обильного каротиноида, составляющего более 70% от общего количества каротиноидов. Штамм Blakeslea trispora lус 26(-) был депонирован во Всероссийскую коллекцию коммерческих микроорганизмов как Blakeslea trispora VKPM F-822 и, таким образом, является общедоступным. Ликопин является главным каротиноидом, продуцируемым штаммом lус 26(-) во всех испытанных питательных средах. Мутанты по данному изобретению предпочтительно культивируют в среде с высоким содержанием сахара в качестве источника углерода, как будет далее отмечено в данной заявке. Наиболее предпочтительно мутанты культивируют в среде, представленной в табл. 1. Используемый штамм предпочтительно имеет такие же характеристики, что и штамм,депонированный под номером VPKM F-822. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения используемый штамм получен из штамма, депонированного под номером VPKM F-822, или его потомства. Данное изобретение далее относится к применению вышеуказанного штамма для продуцирования ликопина, предпочтительно при помощи способа, описанного в примере 8. Другим объектом данного изобретения является приемлемая среда с высоким содержанием сахара в качестве источника углерода. Высокое содержание сахара в качестве источника углерода означает высокое содержание легкоусваиваемых cахаров, являющихся источником углерода. Такая среда особенно пригодна для продуцирования ликопина мутантами В. trispora. Легкоусваиваемые сахара определяются как смеси, включающие, главным образом, моносахариды и дисахариды. Примерами таких источников углерода являются декстроза, глюкоза, фруктоза или сиропы с высоким содержанием мальтозы. В отличие от этого, питательные среды, обычно применяемые для продуцирования -каротина, включают источники углерода, содержащие крахмал в качестве основного источника усваиваемого сахара, такие как соевая мука или кукурузная мука, например среда, представленная в табл. 3. Альтернативно, ранее ис-4 007616 пользовали среды, содержащие источники легкоусваиваемого сахара, но в сочетании с другими источниками углерода, такими как растительные масла, например среда, представленная в табл. 11. Логическим обоснованием для создания таких сред является то, что, как считается, легкоусваиваемый углерод подавляет образование каротиноидов, хотя он очень хорошо стимулирует рост. Весьма удивительным было открытие того, что продуцирование ликопина мутантами В. trispora было весьма эффективным в питательных средах, содержащих легкоусваиваемые сахара в качестве главного источника углерода. Указанные среды предпочтительно содержат по крайней мере 50 мас.% углерода в форме легкоусваиваемыхcахаров, более предпочтительно по крайней мере 60%, еще более предпочтительно по крайней мере 70% и наиболее предпочтительно по крайней мере 80%. В указанных процентных значениях необходимо также учитывать углерод, содержащийся в источнике азота. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения указанные среды содержат по крайней мере 5 мас.% усваиваемыхcахаров, более предпочтительно по крайней мере 6 мас.% и наиболее предпочтительно по крайней мере 10 мас.%. Наиболее предпочтительно среда имеет состав, приведенный в табл. 1. Установлено, что показатель рН не является в процессе ферментации критическим параметром,влияющим на продуцирование ликопина. Показатель рН на стадии предварительной стерилизации может находиться в пределах от 6,2 до 8,4, предпочтительно от 7,5 до 8,4. Таблица 1 Оптимизированная среда (все ингредиенты выражены в г/100 мл) Мальтозный сироп 8,0-14,0 Кукурузный экстракт 4,0-8,0 Хлебопекарные дрожжи (сухие) 0,03-0,07 КН 2 РО 4 0,04-0,06MnSО 47H2 О Тиамин 0,0002 Растительное масло 3,0-6,0 Водопроводная вода 84,8-71,4 рН предварительной стерилизации 6,0-8,4 Изобретение относится также к применению вышеуказанной предпочтительной среды или среды,приведенной в табл. 1, для продуцирования ликопина с использованием приемлемого хозяина. Другим объектом данного изобретения является способ продуцирования ликопина с использованием вышеуказанного штамма, который включает совместное культивирование указанного штамма в течение по крайней мере 3 дней с приемлемым штаммом Blakeslea trispora противоположного типа спаривания в приемлемой среде. Приемлемой средой предпочтительно является среда, рассмотренная выше в описании изобретения. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения способ осуществляют в присутствии экзогенного специфического ингибитора каротиногенеза, аналогичного описанным выше. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения способ выполняют в присутствии экзогенных триспоровых кислот. Более предпочтительно способ выполняют, используя оптимизированную среду, представленную выше в табл. 1. Культивирование можно осуществлять во множество стадий, например в виде отдельных стадий роста и продуцирования. Вегетативная стадия может быть отдельной для каждого типа спаривания с последующим получением общей продуцирующей культуры. Кроме того, продуцирующая культура сначала может содержать только один тип спаривания, при этом другой тип спаривания добавляют позже в начале фактической фазы продуцирования. Штаммы предпочтительно совместно культивируют в течение по крайней мере 2 дней, более предпочтительно в течение по крайней мере 3 дней, еще более предпочтительно в течение по крайней мере 4 дней и наиболее предпочтительно в течение по крайней мере 5 дней. После совместного культивирования бульон может быть инактивирован пастеризацией, после чего биомассу собирают фильтрацией. Затем биомасса может быть стабилизирована сушкой, вакуумной сушкой, сушкой в псевдоожиженном слое или сушкой на ленте транспортера. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ликопин не отделяют от мицелия. Получают биомассу, содержащую вышеуказанную смесь каротиноидов. Соответственно, такую биомассу можно далее использовать в пищевых, кормовых или косметических продуктах. Альтернативно и более предпочтительно ликопин отделяют от мокрого или сухого мицелия любым способом, описанным для разрушения клеток, который позволяет выделить содержимое клеток. Затем ликопин может быть растворен в любом растворителе, в котором он растворяется. Два способа отделения ликопина от мицелия являются предпочтительными: экстракция или выделение. Для экстракции предпочтительно можно использовать приемлемый растворитель, такой как спирты, кетоны или сложные эфиры, такие как ацетон или этилацетат, алканы, такие как н-гексан. Альтернативно, может быть выполнена надкритическая экстракция, например, при помощи СO2, возможно, с использованием органического растворителя в качестве сорастворителя.-5 007616 Альтернативно и более предпочтительно биомассу можно отделить способом прямого выделения,отличительной особенностью которого является использование не смешивающегося с водой растворителя и отделение каротиноидсодержащего межфазного слоя способом, описанным в заявке WO 01/55100,которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения способом прямого выделения является нижеописанный способ. Другим объектом данного изобретения является способ прямого выделения для получения кристаллического каротиноидного соединения, который включает нижеследующие стадии:(b) промывкa смеси разрушенных клеток и кристаллического каротиноида растворителем, пригодным для удаления липида, предпочтительно этилацетатом, более предпочтительно н-бутанолом, и отделение каротиноидсодержащего межфазного слоя;(c) обработкa соответствующего слоя кристаллического каротиноида, полученного на стадии (b),щелочью с рН 9-12 при температуре 10-95 С, предпочтительно 30-85 С, наиболее предпочтительно 5075 С, необязательно в присутствии низшего спирта;(d) необязательное добавление соли к обработанной щелочью суспензии кристаллического каротиноида;(e) необязательное отделение суспензии кристаллического каротиноида от жидкой фазы;(f) необязательная промывка суспензии кристаллического каротиноида солесодержащим водным раствором;(g) необязательная промывка суспензии кристаллического каротиноида водным раствором кислоты; рН промывного раствора предпочтительно имеет значение от 1 до 5, более предпочтительно от 2 до 4,необязательно в присутствии низшего спирта. Соотношение низшего спирта и воды в смеси низший спирт/вода предпочтительно составляет от 5:1 до 1:5, более предпочтительно от 1:1 до 1:2;(h) промывка суспензии кристаллического каротиноида в первой процедуре промывки низшим спиртом, при этом порядок выполнения стадий (b)-(е) и (f) является произвольным;(i) промывкa неочищенных кристаллов каротиноида, полученных на стадиях (a)-(f), во второй процедуре промывки водой или смесью низшего спирта и воды;(j) промывкa кристаллов свежим растворителем и(k) сушкa кристаллов. Каротиноидсодержащие микробные клетки можно получить в результате любого приемлемого процесса ферментации выбранного каротиноидпродуцирующего микроорганизма. Каротиноидсодержащими микроорганизмами могут быть бактерии, грибы, водоросли или дрожжи. Грибы относятся к отряду Mucorales, предпочтительно Blakeslea trispora, водоросли относятся к роду Dunaliella, дрожжи относятся к роду Phaffia, предпочтительно Phaffia rhodozyma. Более предпочтительно вышеуказанный мутантBlakeslea trispora является каротиноидсодержащим микроорганизмом. Указанным способом можно выделить любые известные каротиноидные соединения. Предпочтительными каротиноидными соединениями являются ликопин, -каротин, фитоен и астаксантин. Стадия (а). Полученный ферментационный бульон, содержащий микробные клетки и ферментационную жидкость, можно непосредственно использовать для выделения кристаллов каротиноидов. Альтернативно, до осуществления способа по данному изобретению микробные клетки можно отделить от ферментационной жидкости любым пригодным способом, таким как фильтрация или центрифугирование. Каротиноидсодержащие микробные клетки открывают, разрушая клеточную оболочку в результате механической, химической и/или ферментативной обработки. Например, клетки могут быть подвергнуты гомогенизации, ультразвуковой обработке, автолизу, осмолизу и/или плазмолизу, необязательно при добавлении приемлемых агентов, таких как детергенты, кислоты, основания, ферменты, вещества, усиливающие автолиз, осмолизирующие вещества, например соли, и/или плазмолизирующие вещества. Таким образом, из разрушенных клеток высвобождается кристаллический каротиноид. Стадия (b). Полученную смесь разрушенных клеток и кристаллического каротиноида подвергают дальнейшей очистке. Для увеличения выхода продукта смесь разрушенных клеток и кристаллического каротиноида промывают растворителем, пригодным для удаления и других липидов, предпочтительно органическим растворителем, не смешивающимся с водой, в котором кристаллический каротиноид плохо растворяется. Этот растворитель добавляют в количестве от 1 до 100% в расчете на количество суспензии кристаллического каротиноида, предпочтительно от 10 до 40%, более предпочтительно от 20 до 30%. Следует отметить, что количество растворителя, необходимое для удаления липида, значительно меньше количества растворителя, необходимого для экстракции растворителем каротиноида из микробной биомассы. Предпочтительным растворителем, не смешивающимся с водой, является гексан или этилацетат. Таким растворителем предпочтительно является этилацетат. Другим предпочтительным растворителем являет-6 007616 ся спирт, такой как изопропанол или н-бутанол. н-Бутанол также именуется 1-бутанолом. Наиболее предпочтительно растворителем является н-бутанол. Промывка в соответствии с определением, принятым в данном изобретении, включает стадию суспендирования или перемешивания промываемого вещества в приемлемом количестве выбранного растворителя и стадию декантации или центрифугирования и последующего отделения соответствующего слоя. Стадия (с). Следующая стадия очистки состоит из обработки щелочью соответствующего слоя кристаллического каротиноида, полученного на предыдущей стадии. Щелочная обработка включает добавление водного раствора щелочи с рН от 9 до 12 к слою каротиноида и последующую инкубацию, предпочтительно при перемешивании, в течение соответствующего периода времени при температуре 10-95 С, предпочтительно 30-85 С, более предпочтительно 50-75 С. Соотношение щелочного раствора и слоя каротиноида обычно может изменяться от около 5:1 до около 1:1 (мас./мас.). Продолжительность щелочной обработки обычно зависит от применяемого показателя рН и температуры, причем чем ниже показатель рН и температура во время обработки, тем продолжительнее должна быть обработка. Например, щелочную обработку можно выполнять в течение 2 ч при рН 12 и температуре 75 С или в течение 8 ч при рН 10 и температуре 50 С. Щелочную обработку необязательно можно осуществлять в присутствии низшего спирта. Стадии (d), (е), (f). После щелочной обработки к обработанному щелочью слою кристаллического каротиноида необязательно добавляют водорастворимую соль, такую как хлорид натрия, более предпочтительно ацетат натрия. Затем слой кристаллического каротиноида отделяют от жидкой фазы и необязательно промывают солесодержащим водным раствором. Слой кристаллического каротиноида можно отделить любым методом, известным в данной области, таким как фильтрация, центрифугирование или охлаждение. Прежде чем перейти к выполнению следующей стадии очистки, слой кристаллического каротиноида один или более раз промывают водой. Стадия (g). Неочищенные кристаллы каротиноида необязательно подвергают второй процедуре промывки,включающей промывку кристаллов один или более раз водой или смесью низшего спирта и воды. Показатель рН промывочного раствора предпочтительно имеет значение от 1 до 5, более предпочтительно от 2 до 4. Вода может быть подкислена любой приемлемой кислотой, такой как серная кислота или соляная кислота, или кислым буферным раствором, таким как буфер на основе бората/соляной кислоты или цитрата/соляной кислоты. Соотношение низшего спирта и воды в смеси низший спирт/вода предпочтительно находится в пределах от 5:1 до 1:5, более предпочтительно от 1:1 до 1:2. Затем кристаллы отделяют от жидкой фазы любым приемлемым методом, таким как фильтрация или центрифугирование. Стадии (h), (i). Затем слой кристаллического каротиноида подвергают первой процедуре промывки, в соответствии с которой суспензию промывают низшим спиртом, получая при этом неочищенные кристаллы каротиноида. Указанную первую процедуру промывки повторяют один или более раз. Стадия промывки, выполняемая в соответствии с данным изобретением, обычно включает перемешивание слоя кристаллического каротиноида или (неочищенных) кристаллов каротиноида с промывочной жидкостью и последующее отделение слоя кристаллического каротиноида или кристаллов от жидкой фазы. Описанные выше стадии способа (a)-(g) предпочтительно выполняют в следующем порядке: (а), (b),(с), (d), (е), (f), (g). В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения описанные выше стадии способа (a)-(g) выполняют в следующем порядке: (а), (g), (b), (с), (d), (е), (f). В настоящем изобретении низший спирт определяется как (C1-6)спирт, например метанол, этанол, 1 пропанол, 2-пропанол и 1-бутанол. Низший спирт, используемый в настоящем изобретении, может быть единственным спиртом или может включать смесь двух или более спиртов. Низшим спиртом предпочтительно является этанол, 1-бутанол или смесь 1-бутанола и этанола. Стадия (j). Затем кристаллы промывают свежим растворителем один или более раз. Свежим растворителем является низший спирт, предпочтительно этанол, или сложный эфир уксусной кислоты низшего спирта,предпочтительно этилацетат. Более предпочтительно, свежим растворителем является растворитель пищевого сорта. В предпочтительном варианте осуществления изобретения низший спирт, используемый в первых двух промывках суспензии кристаллического каротиноида, и свежий растворитель, используемый на стадии конечной промывки кристаллов, является одним и тем же растворителем. Стадия (k). На конечной стадии способа по данному изобретению кристаллы сушат. Важным преимуществом настоящего изобретения по сравнению с известными методами экстрак-7 007616 ции/кристаллизации, применяемыми для отделения кристаллического каротиноида, является то, что для экстракции каротиноида не применяется органический растворитель. Благодаря этому кристаллическая решетка полученного каротиноидного соединения, по существу, не содержит растворителя. Еще одним объектом данного изобретения является применение способа по настоящему изобретению для увеличения содержания каротиноида в любой композиции, содержащей неочищенный кристаллический каротиноид, предпочтительно в любой суспензии неочищенного кристаллического каротиноида. Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано нижеследующими примерами. Примеры Пример 1. Выделение штамма и его характеристики. Штамм Blakeslea trispora lус 26(-) был получен в результате множества циклов мутагенеза и селекции с использованием 1-метил-3-нитронитрозогуанидина (NG) или гамма-лучей в качестве мутагенных факторов, из -каротинпродуцирующего родительного штамма В. trispora 111(-). Для выполнения мутагенной обработки получали суспензии спор (106-107 спор на мл) в растворе 10% глицерина и 5% лактозы в воде. Для мутагенеза при помощи NG использовали раствор, содержащий 150 мкг/мл NG в 100 мМ буфера трис-HCl (рН=8,0). Для мутагенеза гамма-лучами использовали дозу излучения, равную примерно 1 Мрад. В обоих способах мутагенная обработка была направлена на достижение выживания 1% спор. Ликопинпродуцирующие мутанты отбирали по красной окраске при культивировании на сусло-агаровых пластинках. Штамм lус 26(-) обладает нижеследующими морфологическими признаками: На сусло-агаре: рост колонии: ограниченный воздушный мицелий: слегка пушистый, переплетенный, светло-малинового цвета образование спор: плохое На агаре SM 17-1: рост колонии: ограниченный с образованием плоских колоний воздушный мицелий: плотный, розового цвета, со слегка приподнятым центром образование спор: очень плохое Признаки штамма lус 26(-) являются устойчивыми. Штамм является непатогенным. Агар SM 17-1 имеет нижеследующий состав, приведенный в табл. 2. Таблица 2 Среда SM 17-1 (концентрации в г/л) Глюкоза 3 0,05Na-Дезоксихолат 0,1 Тиамин 0,00002 Агар (Difco) 20 Пример 2. Продуцирование ликопина на агаровых пластинках. На модифицированном агаре SM 17-1 при использовании разных моно- и дисахаридов (например,глюкоза, арабиноза, фруктоза, лактоза, мальтоза) в качестве источника углерода мицелий штамма В. trisporalус 26(-) окрашивался в малиновый цвет, когда колонии накрывали фильтрующими дисками, пропитанными экстрактом культуры, продуцирующей -каротин. Оказалось, что триспоровые кислоты, продуцируемые в спаренной культуре штаммов В. trispora (+) и (-), используемой для продуцирования -каротина, эффективно стимулировали продуцирование ликопина в мутанте lус 26(-). Штаммы, используемые для получения культуры, продуцирующей -каротин, представляли собой родительские штаммы 111 (-) и (+) VPKM F-820 или VPKM F-821. Пример 3. Продуцирование ликопина во встряхиваемых колбах. Кукурузно-соевую среду, которая, как известно в данной области, пригодна для продуцирования каротина, использовали для продуцирования ликопина штаммом В. trispora lус 26(-) в культуре, объединенной с приемлемым штаммом В. trispora (+). В данном примере в качестве штаммов (+) использовали штаммы VPKM F-820 и VPKM F-821. Штаммы (-) и (+) культивировали отдельно на скошенном сусло-агаре при температуре 28 С в течение 20 ч в темноте и затем в течение 8-12 дней при освещении лампами дневного света при температуре 22 С. Для получения посевного материала воздушный мицелий и споры вымывали с поверхности агара дистиллированной водой. Полученные таким образом суспензии использовали для засева на 750 мл колб Эрленмейера, содержащих 50 мл жидкой среды нижеследующего состава, приведенного в табл. 3.-8 007616 Таблица 3 Жидкая среда (все ингредиенты указаны в % маc./об.) Кукурузная мука 4,7 Соевая мука 2,3 КН 2 РО 4 0,05 Тиамин 0,0002 Водопроводная вода Баланс рН Доведенный до 6,2-6,7 перед выполнением стерилизации NaOH Стерилизация 45 мин при 120 С Штаммы (-) и (+) культивировали отдельно в ротационном шейкере (250 об./мин) в течение 48 ч при температуре 26-27 С. Полученные таким образом суспензии культур использовали для инокуляции 750 мл колб для продуцирования продукта, которые содержат 50 мл питательной среды (1) нижеследующего состава, приведенного в табл. 4. Таблица 4 Питательная среда (1) (в % мас./об.) Кукурузная мука 1,73 Соевая мука 4,0 КН 2 РО 4 0,05 Тиамин 0,0002 Подсолнечное масло 8,0 Водопроводная вода Баланс рH Доведенный до 6,1-6,5 перед выполнением стерилизации NaOH Стерилизация 45 мин при 120 С Для инокуляции использовали 10 мл культуры штамма (-) и 1 мл культуры штамма (+). Затем колбы для продуцирования продукта инкубировали на ротационном шейкере (250 об./мин) в течение 5 дней при 26-27 С. Через 5 дней 0,5 мл образец культурального бульона разводили 1 мл воды и центрифугировали. Осадок после центрифугирования вновь суспендировали в 1 мл 96% этанола и центрифугировали. Осадок собирали и гомогенизировали хлороформом в пробирке Поттера. Хлороформ собирали и гомогенизацию продолжали свежим хлороформом. Указанную процедуру повторяли до тех пор, пока фракция хлороформа не переставала поглощать окраску. Собранные фракции хлороформа объединяли и общий объем доводили до 10 мл, добавляя хлороформ. Уровни продуцирования -каротина и ликопина определяли при помощи ВЭЖХ (табл. 5). Образцы для анализа получали, разбавляя 0,5 мл экстракта хлороформа 95 мл ацетона. В данном примере определяли наличие -каротина и ликопина. Присутствие других второстепенных каротиноидов не определяли, как это делали в примере 6. Содержание ликопина, вычисленное в последнем столбце табл. 5, представляет соотношение между количеством продуцированного ликопина и количеством продуцированного ликопина и -каротина. Таблица 5 Влияние спаренного штамма на уровень продуцирования -каротина и ликопина в питательной среде (1) Очевидно, что мутант lус 26(-) продуцирует ликопин в виде главного продукта каротиноидов, причем продуцирование ликопина в 4-5 раз выше продуцирования -каротина независимо от используемого штамма (+) для спаренной культуры. Кроме того, очевидно, что абсолютный уровень каротиноидов, продуцируемых мутантом, гораздо больше зависит от взаимодействия мутанта с приемлемым штаммом (+) и что разные штаммы (+) могут дать более или менее приемлемые результаты. В сравнительном эксперименте исследовали продуцирование ликопина и -каротина -каротинпродуцирующим родительским штаммом 111, используя одинаковую совокупность штаммов (+) и такие же экспериментальные условия. Продуцирование ликопина штаммом 111 составило менее 0,03 г/л. Продуцирование -каротина штаммом 111 находилось в пределах от 2,8 до 3,4 г/л.-9 007616 Пример 4. Продуцирование ликопина в улучшенной среде. Отдельные посевные культуры для штаммов (+) и (-) были получены в соответствии с примером 3 при использовании таких же штаммов. Однако на этот раз предкультуры штаммов (+) инкубировали в течение только 24 ч. Указанные суспензии штаммов (-) и (+) использовали для инокуляции питательной среды (2) нижеследующего состава, приведенного в табл. 6. Таблица 6 Питательная среда (2) (в % маc./об.) Мальтозный сироп 12,0 Кукурузный экстракт 6,0 Хлебопекарные дрожжи (сухие) 0,05 КН 2 РО 4 0,05MnSО 47H2 О Тиамин 0,0002 Растительное масло 4,0 Водопроводная вода Баланс рН предварительной стерилизации 8,0 Стерилизация При 110 С в течение 30 мин Условия инкубации продуцирующих культур и аналитические методы были аналогичны описанным в примере 3. Результаты приведены в табл. 7. В данном примере определяли наличие -каротина и ликопина. Присутствие других второстепенных каротиноидов не определяли, как это делали в примере 6. Содержание ликопина, вычисленное в последнем столбце табл. 7, представляет соотношение между количеством продуцированного ликопина и количеством продуцированного ликопина и -каротина. Таблица 7 Влияние спаренного штамма на продуцирование -каротина и ликопина в питательной среде (2) Очевидно, что питательная среда (2) обеспечивает более высокие уровни продуцирования ликопина мутантом по сравнению с питательной средой (1) (сравнение в табл. 5 и 7). Кроме того, питательная среда (2) лучше питательной среды (1) с точки зрения соотношения ликопина и -каротина (сравнение в табл. 5 и 7). В данном примере штамм (+) VPKM F-820, используемый для спаривания, обеспечивает гораздо более высокое продуцирование ликопина, чем VPKM F-821. В примере 3 штамм (+) VPKM F-821 позволил получить наиболее эффективные результаты с точки зрения концентрации продуцированного ликопина. Такой результат может иметь непосредственное отношение к известной проблеме оптимизации соотношения штаммов (+) и (-): разные штаммы могут характеризоваться разными скоростями роста в разных средах, что может вызывать образование разных фактических количеств биомассы каждого штамма, присутствующего в фазе продуцирования, и, следовательно, разные выходы ликопина. Специалистам в данной области должно быть известно, как оптимизировать соотношение спаренных штаммов после выбора других экспериментальных условий, таких как состав среды. В сравнительном эксперименте продуцирование ликопина -каротинпродуцирующим родительским штаммом 111 исследовали в улучшенной среде, используя такую же совокупность штаммов (+) и такие же экспериментальные условия. Продуцирование ликопина штаммом 111 не превышало 20-30 мг/л, в то время как уровни продуцирования -каротина родительским штаммом достигали 2,5-3,2 г/л в указанной среде. Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что на продуцирование -каротина родительским штаммом 111 не влияет используемая среда (сравнение в примере 3). Такая улучшенная среда особенно пригодна для продуцирования ликопина мутантом lус 26. Пример 5. Продуцирование ликопина в 10-литровом ферментере. Отдельные посевные культуры для штаммов (+) и (-) получали аналогично примеру 3, за исключением того, что использовали 2000 мл колбы, заполненные 200 мл среды нижеследующего состава. Было использовано множество колб для получения достаточного количества инокуляционного материала для- 10007616 культур в ферментере. Питательная среда (3) была получена на основе среды, используемой в примере 4, но с некоторыми модификациями, при использовании промышленно доступного сырья для облегчения перехода к более крупным объемам, приведенным в табл. 8. Таблица 8 Питательная среда (3) (концентрации в г/кг) Сироп Sweet M (Cerestar) 80% сухого вещества (68% которого составляет мальтоза) 75 Твердые вещества из зерен кукурузы 30 Неактивные сухие дрожжи Engevita (DSM) 5 КН 2 РО 4MnSО 47H2 О Тиамин 0,002 Соевое масло 5 мл Водопроводная вода Баланс рН предварительной стерилизации Доведен до рН=6,7 при помощи NaOH Стерилизация При 120 С в течение 120 мин Продуцирующую культуру получали в 10-литровом ферментере с начальным содержанием среды,равным 4 кг, при температуре 32 С, скорости перемешивания 200 об./мин и аэрации 6 л/мин. При необходимости добавляли противовспенивающее вещество Basildon (Basildon Chemical Co., Abingdon, UK),при этом количество растворенного кислорода всегда было выше 25% насыщения. Среду инокулировали из колбы, содержащей смесь 1000 г зрелой посевной культуры штамма (-), 500 г зрелой посевной культуры штамма (+) и 120 г стерильного соевого масла. После инокуляции температуру культуры поддерживали равной 32 С в течение 48 ч. Затем температуру доводили до 22 С и продолжали инкубировать культуру еще 72-120 ч. Показатель рН культуры не регулировали. Начальное значение рН было равно 6,2,после чего показатель рН увеличивался и достигал 6,8 в конце ферментации. Образцы отбирали для анализа через одинаковые промежутки времени. Часть образца сразу же использовали для спектрофотометрического анализа ликопина и определения количества сухого вещества бульона. Другую часть образца гомогенизировали, замораживали при -20 С и использовали позже для более детального анализа видового состава каротиноидов, как описано в примере 6. Для выполнения спектрофотометрического анализа 0,5 мл бульона разводили 3 объемами воды и центрифугировали. Фракцию осадка вновь суспендировали в 1,5 мл 96% этанола и центрифугировали. Осадок после центрифугирования переносили в пробирку Поттера и обрабатывали хлороформом до экстракции всей окраски фракцией хлороформа. Фракцию хлороформа фильтровали для удаления частиц. Порцию экстракта разводили 100-кратным количеством ацетона для измерения поглощения при 507 нм по сравнению с контрольной пробой ацетона. После ферментации в течение 5 дней было обнаружено, что уровень ликопина равен 1,36 и 1,60 г/л при выполнении дублированных измерений. Содержание сухого вещества бульона составляло 42 г/кг, поэтому содержание ликопина в биомассе в среднем было равно 3,5%. Пример 6. Анализ видового состава каротиноидов. Оттаивали замороженные образцы, полученные в примере 5. Стеклянные шарики (5 г) добавляли к 250 мг образца и смесь интенсивно встряхивали в течение 30 с. Затем добавляли 2 мл смеси хлороформа и пиридина (200:1 в объемном отношении) и образцы интенсивно встряхивали в течение 90 мин. После этого добавляли 8 мл раствора антиоксиданта ВНТ (бутилированный гидрокситолуол) в ацетоне (100 мг/л) и весь образец тщательно перемешивали. 5 мл полученного раствора центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 3000 об./мин и определяли видовой состав каротиноидов в супернатанте при помощи ВЭЖХ, при этом были обнаружены разные пики, соответствующие разным длинам волн, при использовании колонки ODS Beckman Ultrasphere и смеси 800 мл ацетонитрила, 200 мл метанола, 80 мл гексана и 1 мл триэтиламина в качестве подвижной фазы. Длины волн, использованные для обнаружения специфических каротиноидов, и коэффициенты экстинкции, использованные для коррекции полученных значений, приведены в нижеследующей табл. 9. Таблица 9 Длины волн обнаружения (нм) и коэффициенты экстинкции (Е.С.)- 11007616 Относительные количества каротиноидов были вычислены на основании поглощения при определенной длине волны и скорректированы на разницу в коэффициентах экстинкции. Были обнаружены нижеследующие относительные количества каротиноидов, приведенные в табл. 10. Таблица 10 Смесь каротиноидов, продуцированная мутантом Каротиноид Относительное количество транс-Ликопин 78,3% цис-Ликопин 4,6% транс-Бета-каротин 10,4% 13-цис-Бета-каротин 0,3% Гамма-каротин 3,5% Нейроспорин 1,1% Фитоен 1,9% Очевидно, что ликопин является основным каротиноидом, продуцируемым штаммом lус 26(-) В. trispora. В результате биосинтеза, осуществляемого В. trispora, продуцируемой формой ликопина является трансстереоизомер. Изомеризация с образованием цис-формы происходит в разной степени при обработке образца или выделении ликопина в зависимости от условий обработки. Относительное количество всего продуцированного ликопина (трис и цис) составляет 82,9%. Относительное количество всего продуцированного -каротина (транс и цис) составляет 10,7%. Авторы настоящего изобретения установили, что соотношение ликопина и -каротина равно 7,7. Пример 7. Сравнение видового состава каротиноидов при использовании питательных сред для продуцирования ликопина и -каротина во встряхиваемых колбах. Эксперимент с использованием встряхиваемых колб выполняли в соответствии со способом, описанным в примере 3, используя одинаковые штаммы. Параллельные эксперименты осуществляли при помощи одного и того же способа инокуляции и посева культуры, но с применением питательной среды,пригодной для -каротина. Указанная среда для продуцирования -каротина имеет состав, приведенный в табл. 11. Таблица 11 Питательная среда для продуцирования -каротина (в % маc./об.) Декстроза (Boom) 3 Твердые вещества из зерен кукурузы (Roquette) 3,15 КН 2 РО 4 0,05 Тиамин 0,0002 Кукурузное масло (Cerestar) 3,8 рН Доведен до 6,0-6,5 при помощи КОН Стерилизация При 120 С в течение 40 мин Главным различием между средой для продуцирования ликопина по примеру 3 и средой для продуцирования -каротина по данному примеру является гораздо более высокий уровень сахаров в среде для продуцирования ликопина. Соотношение ликопина и -каротина, продуцированных в обеих средах, показано в табл. 12. Таблица 12 Влияние среды на соотношение ликопина и -каротина Среда Соотношение ликопина и -каротина Среда для продуцирования ликопина, представленная в примере 3 5,2 0,53 Среда для продуцирования -каротина, представленная в примере 7 Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что тип используемой среды влияет на видовой состав каротиноидов, продуцируемых мутантом lус 26; среда для продуцирования ликопина по примеру 3 с высоким содержанием сахара особенно пригодна для получения ликопина с высоким выходом. Пример 8. Выделение ликопина экстракцией. 3 л ферментационного бульона, полученного в 10-литровом ферментере способом по примеру 5,фильтровали с использованием 2-литрового фильтра Seitz. Фильтровальный осадок промывали 1800 мл технологической воды. Затем промытый осадок экструдировали и сушили в вакууме в течение ночи при 40 С. Было получено примерно 100 г биомассы с содержанием сухого вещества, равным 78%. Биомассу экстрагировали последовательными 500 мл порциями свежего этилацетата при 40 С в течение 10 мин. В общей сложности было выполнено 8 циклов экстракции, в результате чего было получено 3800 г экстракта. Экстракт фильтровали и концентрировали при 40 С до достижения конечного объема около 500 мл.- 12007616 Нагревание прекращали и продолжали выпаривание при непрерывном снижении давления. При температуре 9 С данную операцию прекращали. Полученную суспензию фильтровали при помощи стеклянного фильтра G2. Были получены кристаллы в форме игл. Кристаллы промывали при комнатной температуре 100 мл свежего этилацетата и затем 100 мл свежего этанола. После сушки в течение ночи при 40 С было получено 0,23 г кристаллов. Содержание ликопина в кристаллах составляло 50-80%, при этом 4-8% ликопина имели форму цис-изомера. Пример 9. Прямое выделение ликопина. 2 л ферментационного бульона, полученного в 10-литровом ферментере способом по примеру 5,гомогенизировали в результате трех прохождений под давлением 500 бар через гомогенизатор Lab60 APV. К полученному гомогенизированному бульону добавляли 0,3 объема 1-бутанола и смесь центрифугировали со скоростью 5000 об./мин в течение 5 мин. На всех последующих стадиях центрифугирования были созданы такие же условия центрифугирования. Межфазную фракцию собирали и промывали 100 объемами 1-бутанола. Смесь центрифугировали и осадок собирали. Получали смесь, содержащую осадок после центрифугирования, 1-бутанол и воду в объемном отношении 1:2:10. Показатель рН доводили до 11,5-12,6 при помощи NaOH и смесь инкубировали в течение 2 ч при 80 С. Ацетат натрия добавляли до конечной концентрации, равной 50 г/л, после чего смесь центрифугировали. К верхнему слою добавляли 10 объемов воды, показатель рН верхнего слоя доводили до 3,5 при помощи НСl и смесь инкубировали в течение 45 мин при температуре окружающей среды. Затем добавляли 0,1 объема 1-бутанола и всю смесь центрифугировали. Межфазный слой собирали и добавляли 10 объемов этанола. Смесь центрифугировали и собирали фракцию осадка. Указанную фракцию промывали 10 объемами этанола, центрифугировали и сушили в вакууме в течение 145 мин при 40 С. Было установлено, что полученные таким образом кристаллы содержат 80% транс-ликопина, 1% цис-ликопина и 3,5% -каротина. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Штамм Blakeslea trispora, депонированный под номером VKPM F-822, или штамм, полученный из штамма, депонированного под номером VKPM F-822, имеющий, по существу, такие же свойства. 2. Потомство штамма по п.1. 3. Применение штамма по п.1 или его потомства по п.2 для получения ликопина. 4. Способ получения ликопина с использованием штамма по п.1 или его потомства по п.2 путем совместного культивирования по меньшей мере в течение 3 суток со штаммом Blakeslea trispora противоположного типа спаривания в среде, обычно используемой для ферментации и в отсутствие экзогенного специфического ингибитора каротиногенеза, с выходом по меньшей мере 0,3 г/л ликопина. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что штамм или его потомство способны продуцировать предпочтительно по меньшей мере 0,7, более предпочтительно по меньшей мере 0,8 и еще более предпочтительно по меньшей мере 1,5 г/л ликопина. 6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что штамм или его потомство способны продуцировать по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 85 маc.% ликопина в процентном выражении от общего количества продуцированных каротиноидов. 7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что штамм или его потомство способны продуцировать ликопин и -каротин в соотношении, превышающем 4:1. 8. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что подходящая среда содержит (все ингредиенты указаны в г/100 мл): Мальтозный сироп 8,0-14,0 Кукурузный экстракт 4,0-8,0 Хлебопекарные дрожжи (сухие) 0,03-0,07 КН 2 РO4 0,04-0,06