Интерферон-бета при тяжелом остром респираторном синдроме (sars)

008766 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к применению интерферона (IFN) для производства лекарственного средства с целью лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (SARS). Предшествующий уровень техники Пневмония (пневмонит) при острой инфекции паренхимы легкого охватывает альвеолярное пространство и интерстициальную ткань. Она может поражать целую долю легкого (лобарная пневмония),сегмент доли (сегментарная или лобулярная пневмония), альвеолы, прилегающие к бронхам (бронхопневмония), или интерстициальную ткань (интерстициальная пневмония). Эти различия, в общем, основаны на данных рентгенографии. Пневмонию у взрослых субъектов старше 30 лет обычно вызывают бактерии. Из них наиболее распространенной является Streptococcus pneumoniae. К другим патогенам относятся анаэробные бактерии(Branhamella) catarrhalis, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae и другие грамотрицательные бациллы. Бактериеподобный организм Mycoplasma pneumoniae наиболее часто поражает детей старшего возраста и молодежь, особенно весной. Главными легочными патогенами у младенцев и детей являются вирусы: респираторный синцитиальный вирус, вирус парагриппа, вирусы гриппа А и В. Эти агенты могут также вызывать пневмонию у взрослых, однако наиболее типичным вирусом, поражающим практически здоровых субъектов, является вирус гриппа А, реже - вирус гриппа В и редко - вирус ветряной оспы. К другим агентам относятся высшие бактерии, в том числе Nocardia и Actinomyces sp; микобактерииMycobacterMEm tuberculosis и их атипичные штаммы (в основном М. kansasii и М. avMEm-intracellulare); грибы, в том числе Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcusneoformans, Aspergillus fumigatus и Pneumocystis carinii; риккетсии в основном Coxiella burnetii (лихорадка Q). К типичным симптомам относятся кашель, лихорадочное состояние и отделение мокроты, обычно развивающиеся через несколько дней после заражения и иногда сопровождающиеся плевритом. Физикальное обследование может выявить тахипноэ и симптомы консолидации, такие, как крепитация в сочетании с шумом бронхиального дыхания. Этот синдром обычно вызывается бактериями, напримерS. pneumoniae и Н. influenzae. Диагноз ставят на основе характеристических симптомов и при наличии инфильтрата, выявленного при рентгенографии грудной клетки. У 30-50% больных не идентифицируется патоген, несмотря на клиническое проявление признаков бактериальной пневмонии. Хотя для выявления бактериальных патогенов при культивировании выделенной мокроты используют способ временных отличий, анализ этих образцов часто дает ошибочные результаты, так как нормальная флора ротовой части глотки может загрязняться патогенами в процессе их прохождения через верхние дыхательные пути. Наиболее надежны в этом отношении образцы, полученные из стерильных в норме областей, например крови больных с бактериемической пневмонией или плевральной жидкости больных эмпиемой. Для идентификации таких патогенов, как микобактерии, микоплазмы, анаэробые бактерии, хламидии, вирусы, грибы, легионеллы, риккетсии и паразиты, используют специальные методы культивирования, специальные штаммы, серологический анализ, биопсию легкого. Лечение основано на вспомогательной искусственной вентиляции легких, в том числе О 2 по показаниям, и назначении антибиотиков, подобранных на основе данных анализа окрашивания по Граму. Если анализ окрашивания по Граму не осуществлен или не установлен диагноз, антибиотики подбирают с учетом возраста больного, эпидемиологии, факторов риска хозяина и тяжести заболевания. Тяжелая атипичная пневмония, или тяжелый острый респираторный синдром (SARS), является состоянием неизвестной этиологии, недавно описанным у больных в Азии, Северной Америке и Европе. Большинство больных в возрасте 25-70 лет, у которых диагностирован SARS, ранее были практически здоровы. Имеются сообщения о нескольких случаях SARS у детей в возрасте менее 15 лет. Инкубационный период SARS составляет обычно 2-7 дней, однако в отдельных сообщениях указывают инкубационный период до 10 дней. Заболевание обычно начинается с предвестника болезни в виде лихорадки (100,4F [38,0C]). Лихорадка часто сопровождается высокой температурой, ознобом, дрожью, а также другими симптомами, например головной болью, недомоганием и миалгией. В начале болезни у некоторых больных наблюдают легкие респираторные симптомы. Обычно данные по спинальным, неврологическим или желудочно-кишечным изменениям отсутствуют, но у некоторых больных развивается диарея в процессе лихорадочной продромы. Через 3-7 дней наступает фаза ухудшения дыхания с началом сухого, непродуктивного кашля или одышки, которые могут сопровождаться гипоксемией или после проявления которых развивается гипоксемия. В 10-20% случаев респираторное заболевание является настолько тяжелым, что вызывает необходимость проведения интубации и искусственной вентиляции легких. Уровень летальности у больных с заболеванием, соответствующим определению, даваемому в настоящее время Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для SARS, составляет примерно 3%.-1 008766 Рентгенограмма грудной клетки может быть нормальной в период фебрильной продромы и в течение всего периода болезни. Однако у достаточно большой части больных респираторная фаза характеризуется появлением ранних фокальных интерстициальных инфильтратов. На более поздних стадиях SARS рентгенография грудной клетки выявляет области консолидации. В начале заболевания абсолютное число лимфоцитов часто снижено. Общее число лейкоцитов обычно находится в норме или понижено. На пике респираторного заболевания у примерно 50% больных регистрируют лейкопению и тромбоцитопению или низкое-нормальное число тромбоцитов (50000150000/мкл). Установлено, что начало респираторной фазы сопровождается повышением уровня креатинфосфокиназы (до 3000 МЕ/л) и трансаминаз печени (в 2-6 раз выше нормального значения). У большинства больных функция почек остается в норме. Тяжесть заболевания может варьировать в большом диапазоне - от легкой формы до летального исхода. Лишь у немногих субъектов, тесно контактировавших с больными SARS, обнаруживают сходное заболевание, большинство остается здоровыми. Согласно сообщениям некоторые тесные контакты приводят к развитию слабого фебрильного заболевания без респираторных признаков или симптомов. Это свидетельствует о том, что заболевание не всегда прогрессирует в респираторную фазу. Первичным путем распространения SARS является путь от субъекта к субъекту через тесный контакт. В большинстве случаев SARS развивается у персонала, обслуживающего больных SARS, или у субъектов, совместно проживающих с больным SARS, или у тех, кто прямо контактирует с инфекционным материалом (например, респираторными выделениями), полученным от больных SARS. Потенциальными путями распространения SARS могут быть прикосновение к коже другого человека или объектов, загрязненных воздушно-капельной инфекцией, с последующим касанием своих глаза (глаз), носа или рта. Заражение может произойти при кашле или чихании больного SARS, когда капельки из носа и рта попадают на других субъектов или на соседние поверхности. Возможны также пути распространенияSARS по воздуху или другие пути, которые в настоящее время не известны. Согласно полученной на настоящий момент информации такие симптомы, как лихорадка и кашель,наиболее вероятно свидетельствуют об инфицировании людей. Однако данные о том, как долго до или после появления таких симптомов больной SARS может передавать заболевание другим субъектам, отсутствуют. Ученые Центров профилактики и контроля заболеваний (CDC) и других лабораторий обнаружили неизвестный ранее коронавирус у больных SARS. В настоящее время получены только предварительные данные по причинному агенту этого состояния. Выдвинута гипотеза, согласно которой SARS вызывает новый коронавирус (Ksiazek с сотр., Новый коронавирус, ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом. The New England Journalof Medicine. WWW.nejm.org 16 April, 2003). Однако в качестве потенциальных причинных агентов SARS также исследуют другие вирусы. Коронавирусы представляют собой группу вирусов, которые при наблюдении в микроскоп имеют гало- или коронаподобный внешний вид. Эти вирусы вызывают у человека заболевание верхних дыхательных путей слабой или средней тяжести. Они ассоциированы с респираторными, желудочнокишечными, печеночными и неврологическими заболеваниями животных. Коронавирусы сохраняют жизнеспособность в окружающей среде не более 3 ч. Ученые CDC выделили вирус из тканей двух больных SARS и охарактеризовали его с помощью различных лабораторных методов. Исследование посредством электронного микроскопа показало, что вирус имеет форму и внешний вид, характерные для коронавирусов. С помощью генетического анализа установили, что этот новый вирус принадлежит к семейству коронавирусов, но отличается от ранее идентифицированных членов семейства. Тестирование образцов сыворотки больных SARS показало, что они недавно инфицированы этим вирусом. В других тестах установлено, что этот, ранее не изученный,коронавирус присутствует в различных клинических образцах (в том числе в образцах, полученных из носа и с помощью мазка со слизистой оболочки горла) других больных SARS, прямо или косвенно связанных со вспышкой заболевания. Эти результаты и другие данные, полученные из лабораторий, входящих в сеть Всемирной организации здравоохранения, свидетельствуют в пользу гипотезы, согласно которой этот новый коронавирус является причинным агентом SARS. В настоящее время проводится дополнительное изучение связи этого коронавируса с SARS. Коронавирусы периодически вызывают пневмонию у человека, особенно у субъектов с ослабленной иммунной системой. Эти вирусы также служат причиной развития тяжелых заболеваний у животных, в том числе кошек, собак, свиней, мышей и птиц. Исследователи из нескольких лабораторий сети ВОЗ сообщили об идентификации парамиксовируса в клинических образцах больных SARS. В этих лабораториях проводят изучение возможности развитияSARS в результате воздействия парамиксовируса. В настоящее время наиболее эффективная схема лечения, если она вообще имеется, не известна. В некоторых случаях терапия основана на применении антивирусных средств, таких, как оселтамивир или рибавирин. Больным назначают стероиды перорально или внутривенно в комбинации с рибавирином и другими антимикробными средствами. Однако в отсутствие клинического исследования в контролируе-2 008766 мых условиях эффективность этих схем лечения остается неизвестной. Ранние данные по лабораторному изучению одного изолята нового коронавируса показали, что рибавирин не ингибирует рост вируса или его распространение от клетки к клетке. Необходимо дополнительное лабораторное тестирование рибавирина и других противовирусных средств, чтобы убедиться в эффективности лечения с их помощью. Интерфероны представляют собой цитокины, т.е. растворимые белки, которые передают сигналы между клетками и играют важную роль в иммунной системе, способствуя разрушению микроорганизмов, вызывающих инфекцию, и репарации полученных повреждений. Интерфероны естественным образом секретируются инфицированными клетками. Впервые они были идентифицированы в 1957 г. Их название обусловлено тем, что они препятствуют репликации и размножению вирусов. Интерфероны проявляют как антивирусную, так и антипролиферативную активность. На основе биохимических и иммунологических свойств природные интерфероны человека сгруппированы в 3 больших класса: интерферон-альфа (лейкоцитарный), интерферон-бета (фибробластный) и интерферонгамма (иммунный). В настоящее время альфа-интерферон утвержден в США и других странах в качестве средства лечения волосатоклеточного лейкоза, остроконечных кондилом, саркомы Капоши (рак, обычно поражающий больных синдромом приобретенного иммунодефицита, СПИДа) и хронического гепатита типа ни-А, ни-В. Интерфероны (IFN) являются гликопротеинами, вырабатываемыми организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защитных клетках. В соответствии с низкой молекулярной массой белка IFN обладают удивительной неспецифичностью своего действия, напримерIFN, индуцированный одним вирусом, эффективно противодействует широкому кругу других вирусов. Однако они являются видоспецифичными, т.е. IFN, продуцируемый одним видом клеток, стимулирует антивирусную активность в клетках того же типа или близкородственных типов. IFNs представляют собой первую группу цитокинов, которые нашли применение благодаря их потенциальной противоопухолевой и антивирусной активности. Три главных IFN обозначены как IFN-, IFN- и IFN-. Эти основные типы IFN первоначально классифицировали в соответствии с природой клеток (лейкоцитарный, фибробластный или Т-клеточный). Однако стало ясно, что несколько типов IFN могут продуцироваться одной клеткой. Поэтому лейкоцитарный IFN сейчас называется IFN-, фибробластный IFN - IFN-, Т-клеточный IFN IFN-. Существует также четвертый тип IFN - лимфобластоидный IFN, вырабатываемый клеточной линией "Namalwa" (производной от лимфомы Беркитта), которая продуцирует смесь лейкоцитарного и фибробластного IFN. Ранее сообщено о введении единицы интерферона или международной единицы интерферона (Ед или ME для международной единицы) в качестве меры активности IFN, определенной как количество,необходимое для защиты 50% клеток от вирусного повреждения. Анализ, который можно использовать для измерения биоактивности, представляет собой анализ ингибирования цитопатического эффекта, как описано Rubinstein et al., 1981; Familletti, P.С. et al., 1981. Согласно этому способу оценки антивирусной активности интерферона около 1 ед/мл интерферона необходимо для продуцирования цитопатического эффекта в 50% клеток. Единицы определяют по отношению к международному эталонному стандартуHu-IFN-бета, представленному Национальным институтом здоровья (Pestka, S. 1986). Каждый класс IFN содержит несколько различных типов. Каждый из IFN- и IFN- является продуктом отдельного гена. Белки, классифицированные как IFN-, представляют собой наиболее разнородную группу, содержащую около 15 типов. Существует кластер генов IFN-, локализованных на хромосоме 9, содержащий не менее 23 последовательностей, из которых 15 проявляют активность и транскрибируются. ЗрелыеIFN- и IFN- имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) и сходную биологическую активность. IFN- содержат 146 аминокислот и проявляют меньшее сходство с классамии . ТолькоIFN- могут активировать макрофаги или индуцировать созревание киллерных Т-клеток. Эти новые типы терапевтических агентов иногда называют модификаторами биологического ответа (BRM), так как они влияют на ответ организма на опухоль путем воздействия на распознавание через иммуномодуляцию. Фибробластный интерферон человека (IFN-) проявляет антивирусную активность и может также стимулировать природные киллерные клетки против неопластических клеток. Он представляет собой полипептид около 20000 Да, индуцируемый вирусами и двунитевыми РНК. Исходя из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного с помощью технологии рекомбинантной ДНК (Derynk et al., 1980), выведена полная аминокислотная последовательность белка длиной 166 аминокислот.Shepard et al., (1981) описал мутацию основания 842 (CysTyr в положении 141), которая отменяет антивирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.Mark et al., (1984) ввел искусственную мутацию путем замещения основания 469 (Т) на (А), что привело к аминокислотному переключению CysSer в положении 17. В результате IFN- приобрел активность нативного IFN- и стабильность в процессе длительного хранения (-70 С).Rebif (рекомбинантный интерферон- человека) - самая последняя разработка в интерфероновой терапии рассеянного склероза (MS), представляет собой интерферон (IFN)-бeтa 1a, вырабатываемый клеточными линиями млекопитающих. В литературе пока не сообщалось о лечении SARS интерферонами отдельно или в комбинации с другими антивирусными агентами. Описание изобретения Основным предметом настоящего изобретения является использование интерферона (IFN), в отдельности или в комбинации с антивирусным агентом, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (SARS). Антивирусное действие интерферонов против двух клинических изолятов SARS-CoV (коронавирус,ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом) выявлено рядом ученых франкфуртского университета (см. J. Cintal et al., The Lancet, 362, 293-294, 2003). В этой работе ученые показали,что интерфероны ингибируют in vitro репликацию SARS-CoV. В частности, они оценили антивирусный потенциал рекомбинантных интерферонов (IFN-альфа, IFN-бета и IFN-гамма) против двух клинических изолятов: SARS-CoV-FFM-1, выделенного от больных из Франкфурта, и Hong Kong, который реплицируется в клетках Vero и Сасо 2. После введения в оба изолята наибольший защитный и антивирусный потенциал показал интерферон-бета. Кроме того, ученые провели анализ значимости ингибирования вирусной репликации для подавления вирусиндуцированного цитопатогенного эффекта в культурах, обработанных интерферономбета за 24 ч до заражения вирусом и сразу после инфицирования. Показано, что интерферон-бета дозозависимым образом ингибирует продуцирование инфекционного вируса в культуре. Термин лечение в контексте этого изобретения относится к любому благоприятному действию на развитие болезни, в том числе, аттенуацию, ослабление или уменьшение проявления патологических симптомов после начала заболевания. Термин интерферон или "IFN", используемый здесь, представляет собой любую молекулу, определенную, как таковую, в литературе и содержащую любые типы IFN, упомянутые в разделе Уровень техники. В частности, в упомянутое определение входят IFN-, IFN- и IFN-. В соответствии с настоящим изобретением IFN- представляет собой IFN. В соответствии с настоящим изобретением IFNпредставляет собой коммерчески пригодный препарат, такой, как Rebif (Serono), Avonex (Biogen) илиBetaferon (Schering). Использование интерферонов человека также предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением. Термин интерферон или "IFN", используемый здесь, обозначает соли, функциональные производные, варианты, мутеины, слитые белки, аналоги и активные фрагменты. Термин интерферон-бета (IFN-), используемый здесь, обозначает, в частности, фибробластный интерферон человека, полученный путем выделения из биологических жидкостей или с помощью технологии рекомбинантной ДНК из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, а также его соли,функциональные производные, варианты, аналоги и активные фрагменты. Термин мутеины, использованный здесь, относится к аналогам IFN, в которых один или большее число аминокислотных остатков природного IFN заменены на другие аминокислотные остатки или делетированы, или добавлены к нативной последовательности IFN без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с IFN дикого типа. Эти мутеины приготовлены с помощью известных методов синтеза и/или сайт-направленного мутагенеза, или других соответствующих методов. К представленным мутеинам относятся мутеины, описанные Shepard et al., (1981) или Mark at al., (1984). Предпочтительно любой из мутеинов имеет аминокислотную последовательность, в достаточной степени дублирующую последовательность IFN и проявляющую существенную гомологию или даже усиленную IFN-активность. Биологическая функция интерферона хорошо изучена квалифицированными специалистами, биологические стандарты определены и представлены Национальным институтом биологических стандартов и контроля (http://immunology.Org/links/NIBSC). Описан биологический анализ определения активности IFN. Анализ IFN можно выполнять по методу Rubinstein et al., 1981, который позволяет определить с помощью средств рутинного эксперимента,действительно ли данный мутеин имеет существенную гомологию и проявляет активность, характерную для IFN. В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы мутеины IFN и кодирующие их нуклеиновые кислоты, в том числе, ограниченный набор соответствующих последовательностей замещенных пептидов или полинуклеотидов, полученных с помощью обычных методов и обычными специалистами на основе представленных здесь протоколов и руководства. В соответствии с настоящим изобретением представленные изменения мутеинов известны как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов или белков изобретения представляют собой группу синонимических аминокислот, которые проявляют значимую гомологию физико-химических свойств, так что замещение между членами группы сохраняет биологическую функцию молекулы. Ясно, что в вышеупомянутые последовательности можно вводить инсерции и делеции аминокислот без изменения функции последовательностей, особенно, если в инсерции или делеции-4 008766 участвует несколько аминокислот, например, менее 30, предпочтительно менее 10, и не происходит удаления или замещения аминокислот, имеющих критическое значение для функциональной конформации,например, остатков цистеина. К области настоящего изобретения относятся белки и мутеины, полученные путем введения этих делеции и/или инсерций. В табл. 1 представлены предпочтительные синонимические аминокислотные группы. Более предпочтительные синонимические аминокислотные группы представлены в табл. 2, а наиболее предпочтительные синонимические аминокислотные группы - в табл. 3. Таблица 1 Предпочтительные группы синонимических аминокислот Таблица 2 Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Таблица 3 Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для продуцирования мутеинов IFN, применяемых в настоящем изобретении, основаны на использовании любых общепринятых методических этапов, представленных в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462,Mark et al.; 5116943, Koths et al.; 4965195, Namen et al.; 4879111, Chong et al.; 5017691, Lee et al.; белки с заменой лизина представлены в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Специфические мутеины IFN-бета описаны Mark et al., 1984. Термин слитый белок относится к полипептиду, содержащему IFN или мутеин, слитый с другим белком, который, например, имеет увеличенное резидентное время в жидкостях организма. IFN может быть слит с другим белком или полипептидом, например, с иммуноглобулином или его фрагментом. Применяемый здесь термин функциональные производные относится к производным IFN, их мутеинам и слитым белкам, которые получают с использованием функциональных групп боковых цепей остатков, а также N- или С-концевых групп посредством известных методов с учетом их фармацевтической пригодности. Так, функциональные производные не должны нарушать активность белка, проявляющего высокую гомологию с активностью IFN, и проявлять токсическое действие на составы, содержащие такой белок. Эти производные могут содержать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут-6 008766 маскировать антигенные сайты и повышать резидентность IFN в жидкостях организма. К другим производным относятся алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные путем реакции с аммонием или с первичными или вторичными аминами, N-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованных с частями ацила (например, группой алканоила или карбоциклической ароильной группой), или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, таковых серильного или треонильного остатков), образованных с частями ацила. К активным фракциям IFN, мутеинов или слитых белков настоящего изобретения относятся любые фрагменты или предшественники полипептидной цепи молекулы белка, одной или совместно с ассоциированными молекулами или остатками, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами белковой молекулы, или самими сахарными остатками, которые обеспечивают получение фракции, активность которой не является существенно сниженной по сравнению с соответствующим IFN. Применяемый здесь термин соли относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислым,содержащим добавки, солям аминогрупп описанных выше белков или их аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть получены с помощью известных методов. К ним относятся неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, трехвалентного железа, цинка и т.п., а также соли с органическими основаниями, образованные, например, с аминами, такими, как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. К кислым, содержащим добавки, солям относятся, например, соли минеральных кислот, таких, как соляной и серной кислот, а также соли органических кислот, например уксусной и щавелевой кислот. Любая из этих солей не должна изменять биологическую активность белков(IFN), относящихся к настоящему изобретению, например способность связываться с соответствующим рецептором и инициировать передачу сигнала рецептором. В соответствии с настоящим изобретением антивирусное средство может использоваться в комбинации с интерфероном для усиления его положительного действия. В соответствии с настоящим изобретением наиболее предпочтительным в качестве антивирусного средства является применение рибавирина (1D-рибофуранозил-1 Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид). В соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительным является применение рекомбинантного IFN-бета человека и соединений по изобретению. Недавно рассмотрен особый тип варианта интерферона - так называемые консенсусные интерфероны, представляющие собой не встречающиеся в природе варианты IFN (US 6013253). В соответствии с примером осуществления изобретения соединения по изобретению используют в комбинации с консенсусным интерфероном. Как используется здесь, термин консенсусный интерферон человека (IFN-con) означает неприродный полипептид, содержащий преимущественно те аминокислотные остатки, которые являются общими для подвида IFN-альфа, характерного для большинства последовательностей подтипа природного лейкоцитарного интерферона человека, и которые содержат в одном или большем числе этих положений,где отсутствуют аминокислоты, общие для всех подтипов, аминокислоту, которая преимущественно встречается в этом положении, и не случайно содержит любой аминокислотной остаток, который отсутствует в этом положении у не менее чем одного природного подтипа. IFN-con включает в себя аминокислотные последовательности, обозначенные IFN-con1, IFN-соn2 и IFN-соn3, и не только, которые представлены в патентах США 4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующиеIFN-con, могут быть получены, как описано в вышеуказанных патентах или с помощью других стандартных методов. В другом примере осуществления изобретения слитый белок содержит слияние с Ig. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, длиной 1-3 аминокислотных остатка или больше,например, длиной 13 аминокислотных остатков. Этот линкер может быть трипептидом последовательности E-F-M (Glu-Phe-Met), или последовательностью из 13 аминокислот, содержащей Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, встроенные между последовательностью IFN и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими, как повышенное резидентное время в жидкостях организма (период полувыведения), увеличенная специфическая активность, повышенный уровень экспрессии и более легкая очистка слитого белка. В другом примере осуществления изобретения IFN слит с константной областью молекулы Ig,предпочтительно, с областями тяжелой цепи, например с областями, гомологичными, например, доменам СН 2 и СН 3 IgG1 человека. В соответствии с настоящим изобретением для генерации слитых белков также пригодны другие изоформы молекул Ig, такие, как изоформы IgG2, IgG3 или IgG4, или другие классы Ig, подобные, например, IgM или IgA. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными,гетеро- или гомомультимерными. В другом примере осуществления изобретения функциональные производные содержат не менее одной части, прикрепленной к одной или большему числу функциональных групп в виде одной или большего числа боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно часть представляет собой часть полиэтилена (ПЭГ). ПЭГилирование проводят с помощью общепринятых методов, таких, как метод, описанный, например, в публикации WO 99/55377.-7 008766 Назначение доз в виде одной или нескольких доз, вводимых больному, варьирует в зависимости от различных факторов, в том числе, фармакокинетических свойств и способа применения лекарственного средства, состояния больного и его характерных признаков (пола, возраста, массы тела, состояния здоровья), уровня проявления симптомов, совместно проводимых курсов лечения, частоты приема лекарственных средств и проявления желательного эффекта. Стандартные дозы IFN-бета человека варьируют в пределах 80000-200000 МЕ/кг в день или 6-12 ММЕ (млн международных единиц) на человека в день, или 22-44 мкг на человека. В соответствии с настоящим изобретением IFN предпочтительно назначать в дозе примерно 1-50, более предпочтительно 10-30 или 10-20 мкг на человека в день. В соответствии с настоящим изобретением путь введения активных ингредиентов может быть внутривенным, внутримышечным или подкожным. Предпочтителен подкожный путь введения IFN.IFN также могут назначать ежедневно, через день или реже. Предпочтительно IFN применяют 1, 2 или 3 раза в неделю. Предпочтительным способом применения является подкожное введение, например, 3 раза в неделю. В дальнейшем предпочтительно внутримышечное введение 1 раз в неделю. Предпочтительно применение 22-44 мкг или 6-12 ММЕ IFN-бета 3 раза в неделю путем подкожной инъекции.IFN-бета могут назначать подкожно в дозе 25-30 мкг или 8-9,6 ММЕ через день. В дальнейшем могут применять 30 мкг или 9,6 ММЕ IFN-бета внутримышечно 1 раз в неделю. В примере осуществления изобретения рибавирин назначают в комбинации с IFN-бета в дозе 100-2000, предпочтительно 400-1200, более предпочтительно 800-1000 или около 1000-1200 мг на человека в день. Для больных с массой тела меньше 65 кг общепринятой дозой является 800 мг/кг в день,больным с массой тела 65-85 кг обычно назначают 1000 мг/кг в день, больным с массой тела больше 85 кг - 1200 мг/кг в день. Действующая доза может варьировать в зависимости от потребностей больного и тяжести состояния до лечения. Определение необходимой схемы приема лекарственного средства в конкретной ситуации зависит от уровня квалификации врача. Для удобства общую ежедневную дозу можно разделить на части и вводить, при необходимости, больному в течение дня. В примере осуществления изобретения рибавирин применяют перорально. Рибавирин назначают в виде инъекции или, предпочтительно, перорально. В зависимости от способа применения соединение может быть растворено в соответствующих растворителях и носителях с образованием мазей, кремов, пены и растворов, содержащих 0,01-15, предпочтительно 1-10 мас.% соединения. Для инъекции рибавирин назначают в форме раствора или суспензии, которые готовят путем растворения или суспендирования в физиологически совместимом растворе в концентрации примерно от 10 до 1500 мг/мл. Инъекция может быть внутривенной, внутримышечной, интрацеребральной, подкожной или внутрибрюшинной. Для перорального применения рибавирин может быть в форме капсулы, таблетки, пероральной суспензии или сиропа. Таблетка или капсула может содержать 10-500 мг рибавирина, предпочтительно,около 300 мг рибавирина. Капсулы обычно представляют собой желатиновые капсулы, которые могут содержать дополнительно к необходимому количеству рибавирина, указанному выше, небольшое количество, например, менее 5 мас.% стеарата магния или другого наполнителя. Таблетки могут содержать вышеприведенное количество соединения и связывающее вещество, например, раствор желатина, растворенную в воде крахмальную пасту, поливинилпирролидон и поливиниловый спирт в воде и обычное покрытие в виде сахара. Соединения изобретения и IFN могут быть приготовлены в виде фармацевтического состава. Термин фармацевтически пригодный включает в себя любой носитель, который не влияет на эффективность проявления биологической активности активного ингредиента и не обладает токсическим действием в отношении хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального применения активный белок (белки) может быть приготовлен в форме единичной дозы для инъекции в носителе, таком,как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера. В соответствии с изобретением активные ингредиенты фармацевтической композиции могут вводиться субъекту различными путями. К способам введения относятся внутрикожный, чрескожный (например, при медленном выделении лекарств), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный,подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и внутриназальный. Может быть использован любой другой терапевтически эффективный путь поступления лекарств, например, с помощью абсорбции через эпителиальные или эндотелиальные ткани или посредством генотерапии, когда молекула ДНК, кодирующая активный агент, вводится больному (например, с помощью вектора), который стимулирует экспрессию и секрецию in vivo активного агента. Кроме того, в соответствии с изобретением белок (белки) применяют совместно с другими компонентами биологически активных агентов, такими, как фармацевтически приемлемые сурфактанты, наполнители, переносчики, растворители и носители. В соответствии с настоящим изобретением предпочтителен подкожный способ введения. Другой возможностью выполнения настоящего изобретения является активация эндогенных геновIFN. В этом случае для терапии SARS используют вектор с целью индукции и/или усиления эндогенной-8 008766 выработки IFN в клетке, у которой в норме наблюдают подавление экспрессии IFN, или которая экспрессирует недостаточное количество IFN. Вектор может содержать регуляторные последовательности,функциональные в желательных для экспрессии IFN клетках, например, промоторы или энхансеры. Такие регуляторные последовательности затем вводят в локус генома с 5'-стороны с помощью гомологичной рекомбинации, связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого необходимо индуцировать или усилить. Метод, обычно называемый активация эндогенного гена (EGA), описан в публикации WO 91/09955. Изобретение также относится к применению клетки, генетически модифицированной для продуцирования IFN для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики SARS. Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) IFN может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка, связанного с фармацевтически пригодным для парентерального введения носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, поддерживающими изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Лекарственное средство стерилизуют с помощью общепринятых методов. В соответствии с изобретением соединения интерферона и IFN могут применяться индивидуально профилактически или терапевтически до, одновременно или после применения других схем лечения или агентов (например, при сложной схеме лекарственного лечения), в терапевтически эффективном количестве. Активные агенты, которые применяют одновременно с другими терапевтическими средствами,можно вводить в том же или в других композициях. Все процитированные здесь ссылки на журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США и иностранные патентные заявки, патенты, выданные в США, а также иностранные патенты, или любые другие ссылки, полностью представлены здесь посредством ссылки и включают в себя все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитированных ссылках. Кроме того, содержание документов, упомянутых в разделе ссылки, включено в данное описание посредством ссылки. Для представления, разработки или предложения на соответствующем уровне квалификации любого аспекта, описания или примера осуществления настоящего изобретения ссылка на общепринятые методические этапы, стандартные методические этапы, общепринятые методы или стандартные методы не является необходимой. Предшествующее описание специфических примеров осуществления изобретения полностью раскрывает основную сущность изобретения и позволяет при наличии необходимых знаний и квалификации(с учетом содержания цитированных здесь ссылок) легко его модифицировать и/или адаптировать для различного применения, а также исключить ошибочные эксперименты и отклонения от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому такие варианты и модификации, которые эквивалентны по смыслу рассмотренным примерам осуществления изобретения, основаны на предложенных здесь методах и протоколе. Следует понимать, что предложенная здесь терминология и фразеология используется не только для настоящего описания и должна быть доступна квалифицированному специалисту, овладевшему представленными здесь методами и протоколом и обладающему стандартными профессиональными навыками. Примеры Клинические испытания. Клинические испытания проводили с использованием 2 различных доз IFN-бета. Целью испытания являлось определение клинического исхода больных, инфицированных SARS CoV. Клинический исход определяли путем количественного измерения вирусных титров SARS-CoV в носоглоточном материале, полученном путем аспирации, и РВМС больных, а также с помощью изучения иммунологических параметров, указывающих на исход заболевания. Моделирование клинического исследования. Первое клиническое исследование разработано для детей. Причиной проведения исследования детей является менее тяжелое течение заболевания у больных детей, среди которых до сих пор не зарегистрировано летального исхода, что минимизирует риск лечения больных, которые из-за тяжести заболевания не способны переносить первоначальные дозы лекарства. Кроме того, опыт, приобретенный при проведении педиатрического исследования, может быть успешно применен для взрослых больных. Рандомизированное клиническое исследование в контролируемых условиях проведено в группе больных моложе 18 лет. Больные отобраны на основе их клинического состояния и данных рентгенографии легких по критериям, установленным ВОЗ. Больных разделили на 3 группы по 10 человек в каждой группе. Первой, контрольной группе не вводили IFN-бета. Второй группе вводили IFN-бета в низкой дозе (1 млн ед/м 2/д). Третьей группе вводили IFN-бета в средней дозе (3 млн ед/м 2/д). Больным проводили лечение в течение 1-4 недель в зависимости от течения болезни, вирусной нагрузки и иммунного ответа.-9 008766 Определение клинического исхода инфицированных CoV-SARS больных. Для анализа течения болезни собирали следующие данные, характеризующие состояние больного: лихорадка, озноб или дрожь, кашель, одышка или дыхательная недостаточность, миалгия, недомогание, вялость или раздражительность, подавленное настроение, ринорея, фарингит, анорексия, диарея или рвота, головокружение или неврологические жалобы и высыпания, где- симптомы, характерные для больных SARS. Определение клинического исхода основано на данных курса лечения в стационаре, респираторном статусе больных (одышка или цианоз), анализе газов артериальной крови, необходимости вспомогательной искусственной вентиляции легких и изменения в рентгенограммах легких. Определение вирусных титров SARS-CoV в носоглоточных аспиратах и стуле больных. Серию носоглоточных аспиратов и образцов стула больных собирали у инфицированных больных в 3-недельный период: до лечения и на 3, 6, 9, 12, 15 и 21 день лечения. Для выявления SARS-CoV образцы культивировали в клетках линии FRhK-4. Изучение инфицированных клеток проводили с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа. Для выявления цитопатического эффекта и определения вирусного титра/мл среды клетки исследовали с помощью светового микроскопа. Кроме того, из образцов выделяли общую РНК и проводили обратную транскрипцию с последующим выполнением количественной полимеразной цепной реакции для идентификации SARS-CoV с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров. Для анализа SARS-CoV антител выделяли образцы сыворотки. Иммунологические показатели, предсказывающие исход лечения. Измеряли уровень экспрессии стимулируемых IFN генов, который указывает на влияние in vivo экзогенного IFN. К IFN-стимулируемым генам относятся гены 2-5 синтетазы, PKR и Мх. Они являются надежными маркерами активности IFN в клетках. Кроме того, проводили отбор типичных больных, реагирующих на лечение (на примере улучшения результатов лечения и снижения вирусной нагрузки после лечения) и не реагирующих на лечение больных (плохой клинический исход и отсутствие изменений в уровне вирусной нагрузки или незначительные изменения после лечения IFN-бета). Профиль экспрессии генов в моноядерных клетках периферической крови больных исследовали с помощью систем микрочипов (например, Affimetrix) и анализа протеомикса. Полученные данные использовали для идентификации маркеров терапевтического ответа. Ссылки 1. Study Group. The Lancet 1998; 352, 1498-1504. 2. J. Cintal et al., The Lancet, 2003, 362, 293-294. 3. Clegg and Bryant, Exp. Opin. Parmacother, 2001; 2(4): 623-639. 4. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547. 5. Familletti, P.C., Rubinstein, S., and Pestka, S. "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibitioninduced infection with type В influenza virus. J. Infect. Dis. 1976, Jun; 133 Suppl: A109-13. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение интерферона-бета (IFN-) или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного, активной фракции или соли для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (SARS). 2. Применение IFN- или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного,активной фракции или соли в комбинации с антивирусным агентом для производства лекарственного средства, предназначенного для одновременного, последовательного или раздельного использования при лечении и/или профилактике SARS. 3. Применение по п.2, где указанный антивирусный агент является рибавирином.- 10008766 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный IFN- является рекомбинантным IFN- человека. 5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный IFN- является консенсусным интерфероном. 6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный слитый белок включает слияние с иммуноглобулином. 7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный IFN- назначается в дозе приблизительно 1-50, или приблизительно 10-30, или приблизительно 10-20 мкг на человека в день. 8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный IFN- назначается ежедневно или через день. 9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный IFN- назначается два или три раза в неделю. 10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный IFN- назначается подкожно. 11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный IFN- назначается внутримышечно. 12. Применение по любому из пп.2-11, где антивирусный агент назначается в дозе приблизительно 100-2000, или приблизительно 400-1200, или приблизительно 800-1000, или приблизительно 1000-1200 мг на человека в день. 13. Применение по любому из пп.2-11, где рибавирин назначается перорально.