Композиции для управления образованием бактериальных колоний

1 Область техники Настоящее изобретение относится к композициям для управления образованием бактериальных колоний в полости рта, применяемых,в частности, но не только, для уменьшения зубной бляшки. Изобретение относится также к способу уменьшения или ограничения уровня образования бактериальных колоний в полости рта путем перорального лечения, для уменьшения,таким образом, зубной бляшки. Уменьшая число или размер структур бляшки путем воздействия ферментами, можно ограничить развитие бактериальных колоний и их проникновение в гингивальную ткань. Изобретение также относится к способам получения указанных композиций. Уровень техники Периодонтальная болезнь является одной из наиболее древних и самих распространенных болезней человека. Она обнаруживается в ископаемых останках человека и наблюдается у лиц,в остальном вполне здоровых. В настоящее время периодонтальная болезнь представляет собой существенную проблему здоровья мирового масштаба. Эта болезнь является результатом накопления зубной бляшки у десневого края. Периодонтальная болезнь подразделяется на две основные разновидности, которые приблизительно соответствуют степени развития или тяжести заболевания: гингивит и периодонтит. Гингивит представляет собой воспаление десневого края, вызванное накоплением зубной бляшки. В основном гингивит характеризуется покраснением и отеком десен и кровотечением из десен. Степень развития и тяжесть этих явлений указывает на уровень развития болезни. Периодонтит характеризуется не только воспалением десневого края, но и потерей связок периодонта, потерей альвеолярной кости и потерей эпителиальных связок вследствие апикального перемещения. Патологическим последствием этих физиологических потерь является образование зубодесневого кармана, который может подвергаться инфекции и, таким образом,стать источником бактериальной инфильтрации хозяина. Переход гингивита в стадию развития язв весьма вероятно служит основой для периодонтита. В литературе указывается, что наблюдается значительное перемещение скоплений микробов из района десневого воспаления в зубодесневые карманы. Известны определенные специфические бактерии, которые ответственны за развитие периодонтальной болезни у людей,однако на тяжесть заболевания могут оказывать влияние также и другие микроорганизмы. Кроме того, результаты клинических исследований выявили корреляцию между присутствием определенных видов микробов и разновидностями и тяжестью периодонтальной болезни. Между наличием и количеством бляшек, содержащих 2 разнообразный набор бактериальных колоний, и периодонтальной болезнью имеется причинноследственная связь. Из этого следует, что ограничивая бляшку, можно снизить распространение и тяжесть периодонтальной болезни. Хронический гингивит и хронический периодонтит объединяют две важные особенности, которые могут лежать в основе последовательности развития этих заболеваний. Оба заболевания обычно не вызывают болевых ощущений до достижения развитой фазы и обе болезни обязательно требуют наличия бактериальной бляшки перед последовательным переходом этих заболеваний в зрелую периодонтальную болезнь. Хотя имеются второстепенные системные и внешние факторы, влияющие на тяжесть заболевания, важнейшим фактором, который вместе с тем дает наибольшую надежду на его контролируемость, является зависимость между бактериальной бляшкой и периодонтальной болезнью. Развитие заболевания начинается с накопления бактериальной бляшки на десневом крае. По мере развития заболевания возникает хроническое воспаление десен и периодонтального лигамента с последующей дегенерацией различных частей системы десна-зуб. Хроническое воспаление усложняется образованием зубного камня из минерализованной бляшки в различных местах соприкосновения тканей, а также в зубодесневом кармане. Перемещение эпителиальной ткани в области воспаления и некроза может захватывать структуры бляшки, приводя к абсцессам, сопровождающимся гноетечением. Конечной и наиболее тяжелой стадией периодонтальной болезни является резорбция альвеолярной кости и потеря зуба. Бляшка представляет собой гетерогенную смесь бактериальных скоплений, включенных в липкую матрицу. Бактерии составляют 50-70% массы бляшки, матрица образована отмершими клетками, глюкопротеинами слюны и протеинами серума, расположенными на полисахаридной основе. Бактерии синтезируют полисахариды как основу бляшки в процессе образования колоний. Кроме живых бактерий и матрицы в состав бляшки входят также остатки пищи, небольшое количество клеток эпителия, лейкоциты и разные другие компоненты, привнесенные хозяином или его действиями. Образование и развитие или распространение бляшки происходит в две стадии. Для первой стадии может быть необходим в качестве основы слой гликопротеинов слюны как на поверхности зуба, так и на поверхности мягких тканей полости рта. Этот основной слой органического материала, происходящий из слюны,адсорбируется на поверхности и образует приобретенную пелликулу. Эта нерастворимая приобретенная пелликула служит основой для супрагингивальной бляшки. Второй стадией является образование бактериями - пионерами 3 колоний на приобретенной пелликуле. После того, как бактерии закрепились на поверхности,они образовывают агрегации, развивают колонии и начинает формироваться бляшка. В различных зубных бляшках присутствуют больше 100 разных видов бактерий. На разнообразие бактерий влияет диета, компоненты слюны, взаимодействия между бактериями и многое другое. Расположение бляшки в полости рта, время суток, возраст пациента и состояние общей оральной гигиены пациента - все это вносит вклад в развитие и последствия зубной бляшки и периодонтальной болезни. Поэтому неудивительно, что бляшки представляют собой гетерогенный набор бактериальных сообществ,прикрепленных к зубу, которые способны вызвать обширный комплекс биохимических и физиологических последствий. Последствиями двух главных патологических состояний являются периодонтальная болезнь и кариес. Ферменты заключают в себе уникальные возможности как лечебные средства. Ранние исследования применения ферментов в лечении оральной патологии основывались на предположении, что они будут действовать бактерицидно на колонии микроорганизмов, находящихся в полости рта и поэтому проявят себя как дезинфицирующие средства. Этот подход,однако, не был успешным. Недавно было показано, что обработка клеток щечного эпителия протеазой изменяет адгезию бактерий. Эта обработка, однако, также исказила соотношение различных бактериальных популяций. Более обнадеживающие результаты были получены при переносе акцента с бактерицидного действия на изменение образования бляшки. Эти последние результаты были получены как in vitro,так и in vivo не только в модельных опытах на животных, но и в клинических опытах на людях. Эти подходы, однако, не смогли обеспечить желаемый терапевтический эффект, скорее всего из-за того, что время, необходимое для эффективного воздействия, превышало продолжительность сохранения фермента в полости рта. По существу, поток слюны, прием других жидкостей и пищи, а также нормальные механические движения в полости рта сокращают время сохранности фермента(ов). Эти факторы сократили время присутствия ферментов, в результате чего клиническая эффективность была ниже желаемой. Когда ферменты испытывались in vitro,время сохранения в полости рта не считалось важным фактором. Нет указаний, что при планировке указанных опытов in vitro этот фактор вообще учитывался в качестве существенного аргумента. Однако в этих опытных in vitro системах, показавших активность ферментов в уменьшении бляшки, были выявлены другие важные факторы. Эти другие факторы указывали на то, что (1) может быть необходим более чем один фермент; (2) может потребоваться 4 фермент с большей специфической активностью; (3) может потребоваться более подходящий фермент; (4) комбинация ферментов может оказаться более эффективной. Бляшки являются чрезвычайно сложной смесью различных компонентов, а именно, макромолекул, живых и мертвых клеток (цельных бактерий и отмерших эпителиальных клеток хозяина), а также фрагментов клеток и другого материала, происходящего как от хозяина, так и от бактериальной флоры. Первоначальные работы по химическому составу бляшки были направлены на изучение углеводной или полисахаридной основы бляшки. Для начала это было идеальным выбором, поскольку полисахаридная основа не только является структурным материалом для матрицы бляшки, но служит также углеводным запасом питания для растущих колоний бактерий. Основные исследования полисахаридов были направлены на определение свойств и строения глюканов, однако существует еще множество других компонентов, входящих в состав бляшки. При просмотре научной литературы, в которой описаны исследования по лечению заболеваний зубов ферментами,выявляются некоторые закономерности. Большинство исследований по борьбе с бляшкой при помощи ферментов было проведено под мотивом профилактики кариеса, хотя хорошо известно, что борьба с бляшкой является фундаментальным вопросом как в профилактике кариеса, так и при предотвращении периодонтальной болезни. Исследования этого типа включали изучение in vitro бактерицидного воздействия, опыты на животных и клинические исследования экспериментального характера на людях. Кроме того, в большинстве клинических исследований в качестве средства для доставки ферментов использовалась жидкость для полоскания рта, жевательная резинка была использована в меньшем количестве исследований. В патенте США 4,138,476 (Симонсон) описано применение молекулярно модифицированных ферментов, разрушающих бляшки в качестве лекарственных средств для полости рта. Глюкангидролаза была соединена с фосфатной группой-носителем для придания ферменту повышенного сродства к поверхности зубов. Модифицированная глюкангидролаза ковалентно связывалась с носителем в присутствии такого реагента как этиловый эфир хлормуравьиной кислоты, и имела повышенную способность связываться с гидроксиапатитными составляющими зубов. Патент США 5,490,988 (Беггс) относится к способу доставки лечебных средств к цели. В патенте описан высокоспецифичный способ, в котором фрагмент антитела способен присоединяться к мышени связью антиген-антитело и обеспечивает связывание лекарственного средства с фрагментом антитела через дополнительный пептид, прикрепленный к фрагменту анти 5 тела. Таким образом, продукт состоит из фрагмента антитела, пептида и лекарственного средства. Изучение опубликованных клинических отчетов по оценке ферментов показывает, что имеются две причины, по которым выбранные ферменты, хотя и обнаруживали ограниченную клиническую эффективность, не смогли полностью проявить ожидавшийся эффект: а) ферменты не были модифицированы таким образом, чтобы они задерживались в полости рта продолжительное время; б) ополаскивания рта имели разную продолжительность и проводились в разное время суток, не обращая особого внимания на то, чтобы обработка проводилась непосредственно перед периодом ограниченной оральной активности (глотания, жевания и выделения слюны и т.д.), т.е. перед сном. Краткое описание изобретения Изобретение основано на двух идеях, которые обе являются существенными для успешного лечебного предотвращения периодонтальной болезни. Первая из них - это воздействие на количество и строение бляшки в полости рта при помощи ферментов; вторая - это средства для задержки ферментов в полости рта. Для эффективной борьбы с периодонтальной болезнью обе эти идеи должны быть реализованы в первую очередь. Одной из задач, решаемых настоящим изобретением, является модификация избранных ферментов таким образом, чтобы они были способны ограничить развитие бляшки или ее компонентов. Избранные ферменты преимущественно такие, которые специфически разрушают полисахариды. Таким образом, можно ограничить рост основы матрицы бляшки без избирательного или сплошного уничтожения бактерий,избежав при этом создания дисбаланса бактериальной среды. Изобретение обеспечивает селективное воздействие на развитие бактериальных колоний и, таким образом, нацелено на профилактику, а не на лечение. Эффективность изобретения не зависит от прямого воздействия на бактерии в полости рта и, таким образом, исключает: (а) потенциальный дисбаланс бактериальной среды, например, усиленный рост бактерий в полости рта или в другом, отдаленном месте внутри или снаружи хозяина; (б) необходимость учитывать системные реакции со стороны хозяина, как иммунологические, так и токсические; и (в) необходимость введения лекарственных веществ под десенный край. Упор, таким образом, делается на адгезию бактерий, специфически в полости рта. Предпочтительно присоединять модифицированный фермент к избранным якорным молекулам для задержки его в полости рта. Предпочтительно усилить задержание ферментов в полости рта путем привязывания ферментов к специфическим молекулам, которые будут 6 прикрепляться к существующим в полости рта структурным элементам и биологическим пленкам. После привязывания ферментов их активность должна сохраняться. Существенно, чтобы в процессе присоединения избранных ферментов к специфическим "якорным" молекулам активность фермента не терялась полностью, хотя существует возможность, что активность может снижаться вследствие присоединения. Однако после присоединения должен сохраниться хотя бы минимум ферментативной активности. Другой задачей настоящего изобретения является создание способа определения уровня подавления избранными и модифицированными ферментами роста бактериальной бляшки в полости рта при помощи системы тестирования как in vitro, так и in vivo. Отобранные таким образом ферменты, сохраняющие ферментативную активность после сочетания с якорными молекулами или дериватизации, пригодны для подавления роста бляшки. Средство, предлагаемое настоящим изобретением, может, хотя это необязательно,иметь вид жидкости для прополаскивания рта,применяемого перед сном. Модифицированные ферменты в жидкости для полоскания преимущественно задерживаются в полости рта, когда слюновыделение и механическая активность на низком уровне. Кроме того, продолжительность срока сохранения (от 6 до 8 ч во время сна) может обеспечить более продолжительный период времени, в который лечебные ферменты смогут осуществлять желаемые биохимические реакции. Настоящее изобретение направлено на решение парадокса, связанного с зубной бляшкой: с одной стороны, патогенные факторы, например бактерии и бляшки задерживаются в полости рта, с другой стороны, в полости рта трудно сохранить потенциальные лекарственные средства, например, ферменты. Этот парадокс можно успешно использовать для ограничения роста зубной бляшки путем придания избранным ферментам той специфической черты, которую бактерии используют при развитии периодонтальной болезни, т.е. способности приставать к поверхностям полости рта. В настоящем изобретении значительное внимание было уделено важной и необходимой задаче увеличения времени сохранения композиции, ингибирующей рост бляшки в полости рта, поскольку только при увеличении времени сохранения композиции в полости рта она способна эффективно препятствовать росту бляшки. Если композиции, ингибирующие рост бляшки, задерживаются в полости рта короткое время, их эффективность, как правило, ограничена. Чтобы добиться уничтожения бактерий, короткое время сохранения может быть адекватным; однако, при новом подходе, основанном на изменении строения и ограничении роста основы, поддержи 7 вающей рост бактериальных колоний, необходимо более продолжительное время сохранения. Предыдущие исследования по ограничению или прекращению периодонтальной болезни в большинстве случаев были направлены напрямую на уничтожение бактерий и только незначительная часть работ была направлена на управление средой обитания бактерий. Настоящее изобретение направлено на управление ростом колоний бактерий, при одновременном сохранении равновесия между разными видами бактерий в полости рта. Регулирование количества бляшек и ограничение количества основы из внеклеточных полисахаридов позволяет управлять размером бактериальных колоний. Такое управление возможно, используя ферментные композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - схематический вид комплекса фермент-якорь, согласно настоящему изобретению, присоединившегося к зубу; фиг. 2 - схематический вид комплекса фермент-якорь, согласно настоящему изобретению, присоединившегося к пелликуле или другой поверхности полости рта; фиг. 3 - схематический вид другого варианта комплекса фермент-якорь, согласно настоящему изобретению, присоединившегося к полости рта; фиг. 4 - схематический вид комплекса фермент-якорь, согласно настоящему изобретению, присоединившегося к матрице бактериальной колонии в полости рта; фиг. 5 - схематический вид комплекса фермент-якорь, согласно настоящему изобретению, присоединившегося к бактерии в матрице бактериальной колонии в полости рта. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение предлагает задерживать в полости рта избранные ферменты. В отличие от включения свободных и доступных ферментов в зубную пасту или жидкость для полоскания рта (воздействие которых лишь преходящее), можно, модифицируя ферменты так, чтобы они задерживались в полости рта,обеспечить им более продолжительную возможность осуществлять желаемые биохимические воздействия и оказывать благотворное влияние. Кроме того, специфические ферменты отбираются преимущественно таким образом,чтобы, уменьшая токсическое воздействие на бактерии, сохранить нормальное равновесие среди бактерий и не проявить вредное влияние на другие нужные и защитные биологические пленки, например, "приобретенную пелликулу". Некоторые ферменты, расщепляющие полисахариды, модифицируются таким образом,что они способны адсорбироваться на поверхностях и структурных элементах в полости рта и ингибировать рост бактериальных колоний, связанных с матрицей бляшки. Ферменты дерива 002244 8 тизируются или связываются с "якорными" молекулами. "Якорная" часть такого комплекса фермент-якорь может прикрепляться к структурным элементам в полости рта, ингибируя рост бляшки. Известно, что Streptococcus mutans и бляшки непосредственно участвуют в развитии кариеса. Бактерия, приводящая к кариесу, использует сахарозу в производстве субстратов для метаболизма всей микробной популяции в полости рта. Конечными продуктами поддерживаемого сахарозой метаболизма являются органические кислоты, которые инициируют последовательность шагов, приводящих к образованию зубного кариеса. Кроме того, Streptococcusmutans использует сахарозу также и для содействия образованию колоний в полости рта,пользуясь набором субстратов метаболизма сахарозы для синтеза сложных водонерастворимых полисахаридов. Весьма вероятно, что такой сценарий имеет место также и в отношении многих других бактерий, которые образуют колонии в бляшке. Нерастворимые полисахаридные структуры представляют основу для расширенного роста бактериальных колоний, которые, после агрегации, наблюдаются в виде пленки, называемой бляшкой. Хотя полисахариды не обязательны для первичного закрепления пионерных бактерий на поверхности зуба, для образования и развития колоний требуются указанные нерастворимые полисахариды. Похоже, что сложные полисахариды, благодаря их нерастворимости,не только вызывают колонизацию и распространение начавших процесс бактерий, но могут также прикрывать бактерии от лекарственных средств. Таким образом, настоящее изобретение может использоваться совместно с агентами,вызывающими гибель бактерий, как специфическими, так и неспецифическими. Ограничение и регуляция количества нерастворимых полисахаридов, и, в конечном счете, развития бактериальных колоний в бляшке, проявляет благотворный эффект в предотвращении и развитии периодонтальной болезни. Одним из этих сложных, нерастворимых полисахаридов является глюкан. Ферментативное расщепление глюкана,таким образом, является одной из целей настоящего изобретения. Настоящее изобретение предлагает композицию и способ иммобилизации определенных ферментов, расщепляющих глюкан, на поверхностях и структурах в полости рта. Этим достигается ингибирование роста бляшки, прекурсора, необходимого в развитии периодонтальной болезни. При ингибировании роста бактериальных колоний желательно избежать искажения экологии микроорганизмов, т.е., равновесия между разными видами бактерий. Изменения в равновесии популяции бактерий обычно нежелательны, так как могут потенциально вызвать усиленный рост случайных бактерий, некоторые 9 из которых могут оказаться патогенными. Композиция, предлагаемая согласно изобретению,стремится сохранить обычные соотношения разных видов бактерий в полости рта. Однако абсолютное количество, по крайней мере, некоторых видов бактерий будет снижено, так как их колонии будут уменьшены. Разработка механизма увеличения срока сохранности фермента в полости рта дает возможность повысить его клиническую эффективность. Для достижения указанной цели эффективные ферменты должны оставаться в полости рта более продолжительное время, выполняя поставленную задачу. Увеличенный срок сохранения ферментов в полости рта позволит бороться с бляшками путем ограничения роста полисахаридной основы для матрицы бляшки. Композиция, предложенная согласно настоящему изобретению, таким образом, разработана для облегчения более продолжительного сохранения ферментов в полости рта. Этот подход основывается на дериватизации или сочетании подходящего(их) фермента(ов) с "якорной" молекулой для привязывания фермента к структурам полости рта при помощи "якорной" части комплекса фермент-якорь. Якорная молекула будет выбрана специфическая, способная связываться, например, с существующей бляшкой или приобретенной пелликулой, которая покрывает зуб. Благодаря сравнительно быстрому обновлению эпителиальной ткани слизистые оболочки в полости рта являются менее предпочтительным местом связывания, чем существующая бляшка или пелликула. В одном варианте настоящего изобретения два фермента с таким типом энзиматической активности, который эффективен в управлении ростом углеводной строительной основы бляшки, привязаны к трем "якорным" молекулам. Полученные шесть комплексов фермент-якорь испытывались в опытной системе in vitro, содержащей слюну (с нормальными бактериями и глюкопротеинами хозяина), для определения их способности управлять ростом бляшки и ограничить ее распространение путем присоединения к бляшке и гидролитического расщепления полисахаридной основы бляшки. Эти комплексы фермент-якорь оценивались на предмет их клинической эффективности и, при необходимости, оптимизировались. Рассмотрим фиг. 1 и 2, которые схематически иллюстрируют комплекс фермент-якорь настоящего изобретения. Чертежи являются своего рода диаграммами, которые даны не в масштабе и служат лишь для иллюстрации. На фиг. 1 показан зуб 10 с поверхностью 12. На поверхности 12 находится колония бактерий 14 в матрице, связанной с зубом 10. С поверхностью 12 связана также якорная молекула 16,которая может быть адгезивным пептидом. К якорной молекуле 16 прикреплен иммобилизи 002244 10 рованный фермент 18, образуя вместе комплекс фермент-якорь 20. Комплекс фермент-якорь 20 конкурирует с колонией 14 за место связывания с поверхностью 12 зуба 10 и, таким образом,уменьшает площадь потенциальных мест связывания с субстратом для колонии 14. Кроме того,и это особенно важно, фермент 18 проявляет каталитическое действие на колонию 14, разрушая матрицу бляшки и/или ее полисахаридную основу. На фиг. 1 показано приостановление роста матрицы 22 под действием фермента 18. В результате возможность колонии 14 расширяться будет существенно нарушена. Кроме того,комплекс фермент-якорь 20 может существенное время сохраняться на поверхности 12 зуба,представляя, таким образом, более чем временное препятствие для расширения матрицы бляшки и колонии 14. Другой вариант настоящего изобретения показан на фиг. 2. На этой фигуре элементы,соответствующие фиг. 1, имеют те же цифровые обозначения. В варианте, показанном на фиг. 2,на поверхности 12 зуба имеется пелликула 24, к которой прикрепляется фермент. Пелликула,содержащая пептиды, белки и подобные вещества, может обеспечить или представлять собой якорь, или же может использоваться отдельная якорная молекула, предварительно присоединенная к ферменту. На фиг. 4 показана деталь матрицы колонии 14 бактерий, включая индивидуальные бактерии 44. В этом варианте воплощения изобретения якорная молекула 16 комплекса 20 привязывается к бактериальной матрице, и можно ясно видеть прекращение роста матрицы 22. На фиг. 5 якорь 16 комплекса 20 присоединен напрямую к бактерии 44 в матрице 14. В объеме настоящего изобретения можно расширить комплекс фермент-"якорь", включив в него ферменты, разрушающие полисахариды,иные чем глюкан, например, ферменты, расщепляющие полисахариды на основе фруктозы,ферменты, гидролизующие глюкопротеины и пр. Комплекс можно расширить также, включив"якорные" молекулы на основе лигандов, имитирующих наружные поверхности бактерий,чтобы вызвать прямое конкурирующее связывание между бактериями и комплексами фермент"якорь". Далее, комплекс может включать"якорные" молекулы на основе рецепторов,имитирующие сайты связывания бактерий так,чтобы привязанные к "якорю" ферменты могли адсорбироваться на поверхности бактерий, уже связанных с бляшкой. И, наконец, могут использоваться "якорные" молекулы, состоящие из полипептидов с известными адгезивными свойствами. Потенциально пригодные гидролитические ферменты (гидролиз полисахаридов, ферментов,расщепляющих глюкопротеины и пр.) могут быть подвергнуты очистке для обеспечения бо 11 лее высокой специфической активности и более сфокусированной специфической реактивности. Далее, можно разработать также процедуры для определения степени связывания между ферментом и якорными молекулами, таким образом, определяя число "якорных" молекул,присоединенных к ферменту, обеспечивающее лучшее сочетание ферментативной активности и степени связывания. Понятно, что любой эффективный фермент, который предотвращает или снижает образование бактериальных колоний, может быть использован в настоящем изобретении. Преимущественно используются гидролизы, группа ферментов с гидролитической активностью,поскольку они особо эффективны. Эта группа облегчает гидролиз химических связей, связывающих остатки, которые после осуществления реакции гидролиза могут существовать как отдельные химические единицы. Предпочтительные ферменты, которые могут использоваться в настоящем изобретении, могут выбираться из одной или нескольких следующих групп: эстеразы - ферменты, расщепляющие сложноэфирные связи; гликолитические ферменты - ферменты, расщепляющие связи, присутствующие в олиго- и полисахаридах; ферменты, расщепляющие эфирные связи; ферменты, расщепляющие пептидную связь, для которых субстратом (реагентом) являются протеины; ферменты,расщепляющие связь углерод-азот, для которых субстратом (реагентом) не являются протеины; ферменты, расщепляющие кислотные ангидриды; ферменты, расщепляющие связь углеродуглерод; ферменты, расщепляющие связь с галогеном; ферменты, расщепляющие связь фосфор-азот; ферменты, расщепляющие связь сераазот и ферменты, расщепляющие связь углеродфосфор. Якорные молекулы и структуры для закрепления ферментов в полости рта могут выбираться из ряда различных соединений, таких как: А. Протеины, фрагменты протеинов и полипептиды а) природного происхожденияi. на основе природных аминокислотiii. нейтральные (алифатические аминокислоты) е) любое сочетание вышеуказанных В. Сахариды и олигосахаридыN-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, нейраминовая кислота, сиаловая кислота и др. синтетические или неприродные сахариды и аминосахара сложные эфиры cахаров, например сложные эфиры cахаров с органическими кислотами сахара, химически связанные с протеинами или полипептидами, например синтетические глюкопротеины С. Глюкопротеины и протеоглюканы а) природного происхождения, например эластин, лектин и др.b) синтетические, например модифицированные природные глюкопротеины и протеоглюканыb) синтетические, например модифицированный природный гликоль; липиды, подвергнутые какой-либо химической обработке, например эстерификации, амидированию или подобному химическому процессу Е. Липопротеины, например хиломикрон,липопротеины весьма низкой плотности(LDL), липопротеины высокой плотности (HDL) и др.F. Липиды а) неполярные, природные или синтетические, например триглицериды, холестерин и другие стеролы растений или животных и др.G. Фрагменты клеток и тени клеток - сегменты или части наружных оболочек или мембран бактериальных или животных клеток, которые могут имитировать живые и жизнеспособные бактериальные или животные клетки для закрепления фермента на поверхности в полости рта Н. Небиологические, полимерные материалы а) гомополимеры, например полиэтиленгликоль (PEG) и др.b) сополимеры, например сополимер бутадиена и стирола и др. Связь между якорными молекулами и ферментами также может иметь многие формы. Так, эти связи могут быть химическими, хемисорбционными или ковалентными, включая: амидную (пептидную), сложноэфирную, гликозидную (сахарную) и/или другие. Связи могут быть также физическими, физико-сорбционными, такими как ван-дер-ваальсовыми, вклю 13 чая липофильные; притяжение/взаимодействие между зарядами, включая электростатические взаимодействия; и/или водородные связи, включая гидрофильность. Связи между якорем в комплексе якорьфермент и поверхностным субстратом в полости рта типично будут типично такими же, какие описаны в предыдущем параграфе. На фиг. 3 схематически показан субстрат 30, являющийся поверхностью в полости рта, например, зуба,существующая бляшка, место крепления или слизистая оболочка и прикрепленный к ней комплекс якорь-фермент 32. Комплекс якорьфермент 32 включает якорную часть 34 и ферментную часть 36. Между комплексом 32 и субстратом 30 связь существует взаимодействие якорь-поверхность 38 и связь якорь-фермент 40. Предполагается, что связь между ферментной частью 36 и якорной частью 34 будет преимущественно химической, а взаимодействие между якорной частью 34 комплекса якорь-фермент 32 и субстратом 30 будет преимущественно физической. По преимуществу связь между ферментом и якорем будет химической. Взаимодействие с якорной частью комплекса якорь-фермент будет преимущественно физической. Пример. Один из вариантов воплощения изобретения предполагает отбор двух ферментов с известной активностью расщепления полисахаридной основы матрицы зубной бляшки. Такими ферментами являются: 1) -Глюкозидаза [ЕС 3.2.1.20, (13) 3glucanohydrolase].-Глюкозидаза коммерчески доступна. Хотя фермент наиболее активен по отношению к связи -1,4 глюкозы, он гидролизует также связи -1,2 и -1,3. Фермент гидролизует также связи -1,6, однако, с весьма малой скоростью. 2) Декстраназа [ЕС 3.2.1.11, (16) 6glucanohydrolase]. Декстраназа также доступна коммерчески. Этот фермент отщепляет молекулы глюкозы от полисахаридов, присоединенные связью -1,6. Многие исследователи характеризуют строение глюкана наличием связей -1,3 и 1,6. Глюкан характеризовали также наличием связей -1,4 и -1,2. С точки зрения структуры,связи -1,6 обеспечивают продольную цепь глюкана, а связи -1,3, -1,4 и -1,2 обеспечивают разветвления глюкана. Не известно, что существенно для образования колоний бактерий- продольные или разветвленные элементы. Поэтому были выбраны два коммерчески доступных фермента: -глюкозидаза, обеспечивающая расщепление связей -1,4, -1,3 и -1,3, т.е. расщепление по местам разветвления в молекуле глюкана, и декстраназа, которая обеспечивает расщепление связи -1,6, т.е. расщепление молекулы в продольном направлении. 14 Эти ферменты каждый в отдельности соединялись с каждой из якорных молекул: 1) основным полипептидом, например, Lys-Lys-GluLys-Lys или сходным основным полипептидом; 2) кислым полипептидом, например, Glu-GluLys-Glu-Glu или сходным кислым полипептидом. Тейхоевая и липотейхоевая кислота являются важными компонентами бактериальной оболочки для связывания. Эти компоненты ассоциированы также с фосфатными эфирами,придающими анионный характер наружной поверхности бактериальной оболочки. ПоэтомуLys-Lys-Glu-Lys-Lys,имеющая катионный характер, будет притягиваться к оболочке бактериальной клетки. Поскольку доступные данные указывают на то, что поверхность бактериальной клетки имеет анионный характер, резонно предполагать образование бактериальных колоний на той части бляшки, которая по своему характеру в принципе катионная. Действительно, если на бляшке имеются регионы или области с катионным характером, "якорная" молекула Glu-GluLys-Glu-Glu, которая имеет анионный характер и будет притягиваться к катионному региону бляшки, является хорошим выбором. Дополнительно или альтернативно, любой другой элемент липидного характера, например мицеллы, может служить как субстратом в полости рта, так и якорной молекулой для создания комплекса фермент-якорь. Следуя логике, притягивание зарядов как основа для закрепления избранных ферментов на различных органических структурах в полости рта, может быть также одним из факторов в прикреплении бактерий. Однако в связывании бактерий при образовании колоний на бляшке могут участвовать также и другие факторы кроме притягивания зарядов. Так, за связывание бактерий полости рта с полисахаридом (глюканом) могут нести ответственность и специфические протеины. Однако действительный механизм связывания бактерий с бляшкой не препятствует использованию других механизмов связывания для ферментов, привязанных к специфическим "якорным" молекулам, и будет охвачен настоящим изобретением. Ферменты и якоря, использованные в настоящем примере, приводят к шести дериватизированным ферментам с широкими возможностями связывания при взаимодействии зарядов. Синтез Синтетическая часть получения дериватизированных комплексов фермент-якорь включает сочетание каждой "якорной" молекулы с двумя индивидуальными ферментами. Основной полипептид Lys-Lys-Glu-Lys-Lys присоединяется к двум ферментам посредством свободной карбоксильной группы остатка Glu, кроме того, некоторое сочетание происходит также посредством С-конца полипептида. Кислый по 15 липептид Glu-Glu-Lys-Glu-Glu присоединяется посредством свободной аминогруппы остаткаLys, кроме того, некоторое сочетание с двумя ферментами происходит также посредством Nконца полипептида. Очистка шести дериватизированных ферментных продуктов реакции может проводиться колоночной хроматографией на молекулярных ситах. Можно определить активность очищенных привязанных ферментов и сравнить с недериватизированными ферментами для определения наличия изменений в энзиматической активности вследствие процедуры сочетания. Далее, шесть комплексов якорь-фермент,полученных в настоящем примере, можно перед клиническим изучением испытать в системе invitro. Можно использовать любую подходящую процедуру испытаний, например, предложенную Дрейком [Drake, D.R., Vargas, K., Cardenzana, A. and Srikantha, R. "Enhanced bactericidalDent. 8.308-312(1995)] или ее модификацию. Основные и кислые полипептиды доступны коммерчески, например, в Peptides International, Louisville, Kentucky, и могут быть синтезированы, например, по какому-либо из вариантов твердофазного метода. Эти исходные материалы можно использовать без очистки, однако,образец каждого из исходных материалов необходимо сохранить и при необходимости определить его чистоту, например, при идентификации неожиданных продуктов реакции и пр. Ферменты также доступны коммерчески,могут быть приобретены у United States Biochemical, Cleveland, ОН и Worthington Biochemical, Freehold, NJ, и также могут использоваться без очистки. Другие ферменты, которые можно использовать, но которые не доступны коммерчески, можно изолировать и очистить, используя стандартные процедуры, из тканей и организмов. Отобранный образец каждого фермента необходимо сохранить и анализировать только при необходимости определить его чистоту. Такие анализы при очистке могут иметь важное значение в зависимости от результатов экспериментов in vitro. Эти анализы можно проводить, используя сохраненные образцы ферментов. Энзиматическую активность желательно определять как перед, так и после реакции дериватизации (сочетания), и это удобно проводить используя,например,4-нитрофенилDглюкозу в стандартном методе определения активности фермента. Основной полипептид Lys-Lys-Glu-LysLys можно присоединить к каждому из ферментов, используя модифицикацию процедуры,описанной Уильямсом [Williams, A. and Ibrahim,I.A. "A mechanism involving cyclic tautomers forSoc. 103, 7090-7095 (1981)]. В этом методе в качестве реагента для сочетания используется 1 этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид(EDC). Карбоксильная группа Glu в полипептиде (а также карбоксильная группа С-конца полипептида) сочетается со свободными аминогруппами фермента, образуя ковалентные амидные связи. Кислый полипептид Glu-Glu-Lys-Glu-Glu можно присоединить к каждому из ферментов,используя модификацию процедуры, описанной О'Шенесси [O'Shannessy, D.J. and Hofmann, W.L."Coupling antibodies for site directed immobilization." Biotech. Appl. Biochem. 9, 488-496(1987)]. В этом методе свободная аминогруппа Lys (а также свободная аминогруппа N-конца полипептида) превращается в альдегидную группу и далее сочетается со свободными аминогруппами ферментов. В обеих реакциях сочетания или дериватизации, в которые вовлечены полипептидные якорные молекулы, будут образовываться разнообразные побочные продукты, однако будет наблюдаться также большое разнообразие в размере молекул (массы молекулы), что позволит провести очистку, пользуясь, например ЖХВД (HPLC) на колонке 3000 PW для разделения по размеру молекулы. Целью этого разделения является уборка после реакции. Очистка отделяет не прореагировавшие полипептидные якорные молекулы и смеси полипептидов, образованные реакцией якорных молекул между собой, от желаемого продукта - комплекса фермент-"якорь". Может быть также множество желаемых комплексов фермент-"якорь", в зависимости от числа "якорных" молекул, присоединенных к ферменту. Не представляется необходимым разделить комплексы фермент-"якорь" на отдельные фракции в зависимости от количества "якорных" молекул; лучше все типы комплексов фермент"якорь" испытать и клинически использовать совместно. Однако можно провести разделение разных типов комплекса фермент-"якорь" по отдельным молекулярным единицам, там, где это представляется уместным. Если желательно или необходимо, процедуру очистки можно стандартизовать, определив и установив рабочие параметры колонки ЖХВД (HPLC). Можно провести калибровочные опыты с 1) ферментом в отдельности; 2) якорной молекулой в отдельности; 3) реакционной смесью без добавления фермента. После установления рабочих параметров можно определить время выхода для каждой фракции общего протеина, что позволит разделить свободные "якорные" молекулы, продукты реакции между "якорными" молекулами, свободный фермент и дериватизированный или сочетанный фермент. 17 Изучение активности in vitro Перед клиническим применением можно определить эффективность любого синтезированного комплекса фермент-якорь в опытах invitro. Ниже описывается один такой опыт. Отбирают лиц с хорошим выделением слюны и высоким содержанием Streptococcusmutans и Actinomyces viscosus (по числу колоний на чашку), которые считаются бактериями,высокоактивными в формировании бляшки. Выделение слюны у отобранных лиц можно стимулировать жеванием инертного материала,например, парафильма или карбовакса. Собранная слюна служит запасом для основного посевного раствора. Основной раствор готовят,объединив образцы слюны с наибольшим содержанием идентифицированных пятен (20-25% от всех собранных образцов). После этого готовят следующие растворы:b) Раствор положительного контроля, содержащий 20 мг/мл хлоргексидина, известного ингибитора образования бляшки.c) Два контрольных тест-раствора, которые могут содержать недериватизированный фермент, т.е. фермент без якорных молекул.d) 8 Тест-растворов (6 опытных и 2 контрольных) готовят с обогащенной сахарной средой в качестве растворителя, получая основные растворы с концентрацией 10, 1,0 и 0,1 мг/мл. Процедура Стерильные стеклянные пластинки помещают в пробирки объемом 50 мл, содержащих 39 мл обогащенной сахарозной среды. Пробирки инокулируют 1 мл основного посевного раствора (слюны). Пробирки инкубируют при 37 С под 5% CO2 от 24 до 48 ч, пока не появляются визуально наблюдаемые бляшки. Пластинки вынимают, переносят в дозированные растворы свежей обогащенной сахарозной среды (39 мл в 50 мл пробирках), к которым добавлен соответствующий тест-раствор. Дозированные растворы могут иметь следующий состав: 1) Пустой опыт - обогащенная сахарозная среда. 2) Положительный контроль - 20 мг/мл хлоргексидина. 3) Контроль для опытов 1 А, 1 В и 1 С - 1,0 мг/мл -глюкозидазы без "якоря". 4) Котроль для опытов 2 А, 2 В и 2 С - 1,0 мг/мл декстраназы без "якоря". 5) Опытные обработки 1 А, 1 В и 1 С (глюкозидаза-"якорь") - 10, 1,0 и 0,1 мг/мл. 6) Опытные обработки 2 А, 2 В и 2 С (декстраназа-"якорь") - 10, 1,0 и 0,1 мг/мл. Стеклянные пластинки остаются в соответствующем дозированном растворе примерно один час. После этого их вынимают и споласкивают, окуная в чистую обогащенную сахарозную среду. 18 После этого пластинки помещают в свежую обогащенную сахарозную среду, и пробирки инкубируют таким же образом от 24 до 48 ч. Количество бляшек в каждом опыте регистрируют (фотографируют), затем бляшки с каждой пластинки удаляют, высушивают и взвешивают. Определяют энзиматическую активность обоих ферментов до и после дериватизации, а также эффективность очистки после реакции. За каждым опытом наблюдают визуально; результаты каждого опыта фотографируют (три повтора каждого опыта вместе на одном снимке) и устанавливают размер (массу) бляшки в каждом опыте. При отборе ферментов, якорей, методов и процедур следует учитывать ряд факторов, чтобы получить наиболее эффективные комплексы фермент-якорь. Некоторые из них следующие: выбранные ферменты и якорные молекулы всегда должны быть наиболее пригодными для ингибирования матрицы бактериальных колоний. Для достижения критического ингибирования роста полисахаридной основы при образовании бляшки может понадобиться более одного фермента. Данное изобретение имеет три потенциальных преимущества: 1) оно не требует бактерицидной активности; 2) сохраняется нормальный баланс микроорганизмов в полости рта, 3) для хозяина вероятность побочных эффектов в местах, отдаленных от полости рта, минимальна или полностью отсутствует. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция для управления ростом/образованием колоний бактерий, содержащая фермент, якорную молекулу, связанную с ферментом с образованием комплекса ферментякорь, причем якорь обладает способностью присоединяться к субстрату близ бактериальной колонии, в которой присоединение к субстрату обеспечивает увеличенную продолжительность сохранения комплекса фермент-якорь близ бактериальной колонии. 2. Композиция по п.1, в которой фермент выбран по его способности разрушать матрицу колонии. 3. Композиция по п.2, в которой матрица колонии включает полисахариды и фермент выбран по его способности разрушать полисахариды. 4. Композиция по п.1, в которой якорная молекула способна присоединятся к любому подходящему субстрату в полости рта. 5. Композиция по п.4, в которой якорная молекула присоединяется к поверхности зуба. 6. Композиция по п.4, в которой якорь присоединяется к пелликуле на поверхности зуба. 19 7. Композиция по п.4, в которой якорная молекула присоединяется к бактериальной оболочке. 8. Композиция по п.4, в которой якорная молекула имеет вид лиганда, имитирующего наружную поверхность бактериальной клетки,вызывая конкуренцию за связывание с поверхностями в полости рта между бактерией и комплексом фермент-якорь. 9. Композиция по п.1, в которой поверхностью в полости рта является матрица бляшки. 10. Композиция по п.7, в которой якорная молекула направлена на рецептор и создана для связывания с сайтами присоединения бактерии,чтобы комплекс фермент-якорь мог адсорбироваться на бактериальных поверхностях. 11. Композиция по п.3, в которой полисахаридом является глюкан. 12. Композиция по п.3, в которой полисахаридом является гетерогенный и сложный агрегат и смесь множества разных олиго- и полисахаридов. 13. Композиция по п.3, в которой выбранным ферментом является гидролаза с гидролитической активностью. 14. Композиция по п.1, в которой фермент выбран из группы, состоящей из эстераз, для расщепления сложноэфирных связей; гликолитических ферментов, для расщепления связей,присутствующих в олиго- и полисахаридах; ферментов, расщепляющих эфирные связи; ферментов, расщепляющих пептидную связь,для которых субстратом (реагентом) являются протеины; ферментов, расщепляющих связь углерод-азот, для которых субстратом (реагентом) не являются протеины; ферментов, расщепляющих кислотные ангидриды; ферментов,расщепляющих связь углерод-углерод; ферментов, расщепляющих связь с галогеном; ферментов, расщепляющих связь фосфор-азот; ферментов, расщепляющих связь сера-азот, и ферментов, расщепляющих связь углерод-фосфор. 15. Композиция по п.1, в которой якорная молекула выбрана из протеинов, фрагментов протеинов и полипептидов, входящих в одну или несколько следующих групп: а) природного происхождения;i. на основе природных аминокислот,ii. на основе синтетических, неприродных аминокислот, например D-аминокислот, замeщенных аминокислот, ,-дизамещенных;i. катионные (основные аминокислоты),ii. анионные (кислые аминокислоты); е) любое сочетание вышеуказанных. 16. Композиция по п.1, в которой якорные молекулы выбраны из группы сахаридов и олигосахаридов, включающей:b) природные аминосахара, например глюкозамин, галактозамин, N-ацетилглюкозамин,N-ацетилгалактозамин, нейраминовую кислоту,сиаловую кислоту; с) синтетические или неприродные сахариды и аминосахара, например,i. сложные эфиры cахаров, сложные эфирыcахаров с органическими кислотами,ii. сахара, химически связанные с протеинами или полипептидами, и синтетические глюкопротеины. 17. Композиция по п.1, в которой якорные молекулы выбраны из группы, включающей гликопротеины/протеоглюканы: а) природного происхождения, например эластин, лектин;b) синтетические, например модифицированные природные гликопротеины/протеоглюканы. 18. Композиция по п.1, в которой якорные молекулы выбраны из группы, включающей гликолипиды: а) природного происхождения, например сфингомиелин, цереброзид, ганглиозиды;b) синтетические или модифицированный природный гликоль; липиды, подвергнутые какой-либо химической обработке, например эстерификации, амидированию или подобному химическому процессу. 19. Композиция по п.1, в которой якорными молекулами являются липопротеины, выбранные из группы, состоящей из хиломикрона,липопротеинов весьма малой плотности(VLDL), липопротеинов малой плотности (LDL) и липопротеинов высокой плотности (HDL). 20. Композиция по п.1, в которой якорными молекулами являются липиды, выбранные из группы, включающей: а) неполярные, природные или синтетические липиды, например триглицериды, холестерин и другие стеролы растений или животных;b) полярные, природные или синтетические липиды, например, фосфолипиды (фосфатидилсерин). 21. Композиция по п.1, в которой якорными молекулами являются фрагменты клеток,тени клеток или сегменты или части наружных оболочек или мембран бактериальных или животных клеток, которые могут имитировать живые и жизнеспособные бактериальные или животные клетки для закрепления фермента на поверхности в полости рта. 22. Композиция по п.1, в которой якорными молекулами являются небиологические, полимерные материалы, выбранные из группы,состоящей из сополимеров типа сополимеров бутадиена и стирола. 23. Композиция по п.1, в которой ферментом является -гликозидаза. 24. Композиция по п.1, в которой ферментом является декстраназа. 25. Композиция по п.1, в которой якорной молекулой является основной полипептид. 26. Композиция по п.25, в которой основным полипептидом является Lys-Lys-Glu-LysLys. 27. Композиция по п.1, в которой якорной молекулой является кислый полипептид. 28. Композиция по п.27, в которой кислым полипептидом является Glu-Glu-Lys-Glu-Glu. 29. Композиция по п.1, в которой субстратом являются мицеллы. 30. Способ управления образованием бактериальных колоний, при котором создают комплекс якорь-фермент, состоящий из фермента,выбранного по его способности хотя бы частично разрушать матрицу колонии, и якоря, часть которого связана с ферментом для образования комплекса; выбирают якорь по его способности присоединяться к субстрату для увеличения времени сохранения комплекса фермент-якорь близ матрицы. 31. Способ по п.30, при котором образование бактериальных колоний регулируют в полости рта. 32. Способ по п.31, при котором матрицей колонии является матрица бляшки, а матрица бляшки включает полисахариды. 22 33. Способ получения композиции для управления пролиферацией бактериальных колоний, при котором отбирают фермент по его способности разлагать структурный компонент,на котором происходит образование бактериальных колоний; отбирают якорную молекулу по ее способности сочетаться с выбранным ферментом таким образом, что фермент сохраняет эффективную энзиматическую активность для разложения структурного компонента, причем якорную молекулу далее отбирают по ее способности присоединяться к субстрату близ бактериальной колонии; сочетают якорь с ферментом с образованием комплекса ферментякорь. 34. Способ по п.33 для управления пролиферацией бактериальных колоний в полости рта. 35. Способ управления образованием колоний бактериальной бляшки в полости рта, при котором фермент, специфически разлагающий бляшки, сочетают с якорем, отобранным из группы, состоящей из оболочки клетки, фрагментов оболочки клетки, фрагментов клетки и теней клетки.