Суспензия биоразлагаемых микросфер и способ лечения глиобластомы

1 Настоящее изобретение относится к применению биоразлагаемых микросфер, высвобождающих антиканцероген, для лечения глиобластомы. Глиобластома принадлежит к группе редких заболеваний, занесенных в список NationalOrganization for Rare Disorders. Злокачественные глиальные опухоли являются неразвитыми опухолями центральной нервной системы, составляющими, в зависимости от групп, от 13 до 22% от общего количества внутричерепных опухолей. С точки зрения гистологии, в действительности различают два типа злокачественных глиальных опухолей: анаплазированные астроцитомы и глиобластомы, из которых последние представляют наиболее недифференцированную форму этих опухолей. В настоящее время эффективное лечение злокачественных глиальных опухолей отсутствует. Продолжительность выживания больных с глиобластомой не превышает одного года даже в том случае, когда хирургия сопровождается химиотерапией и радиотерапией. Лечение злокачественных глиальных опухолей ограничено главным образом тремя факторами. Первый из этих факторов - существование гематоэнцефалического барьера, который изолирует центральную нервную систему от остальной части организма. Этот барьер пропускает только небольшие жирорастворимые молекулы. Другие же молекулы, чтобы достичь центральной нервной системы, должны применяться в очень значительных дозах и при этом ценой значительных системных побочных эффектов. Вторым фактором, ограничивающим эффективность лечения глиальных опухолей, является инфильтрирующий характер этих опухолей. Поскольку мозг - в высшей степени функциональный орган, на нем невозможно осуществить обширную в онкологическом смысле этого слова операцию. Наиболее полное из возможных иссечений - это всего лишь макроскопически полное иссечение, при котором в стенках операционной полости остается большое количество инфильтрованных опухолевых клеток. В то же время многими авторами было показано, что 90% прооперированных и подвергнутых радиотерапии злокачественных глиальных опухолей рецидивировали в двух сантиметрах от начального центра опухоли. Последним фактором, ограничивающим эффективность лечения глиальных опухолей,является низкий терапевтический индекс. Опухолевые клетки в определенной степени упрятаны позади чрезвычайно хрупкой ткани, которая очень чувствительна к агрессивному воздействию радиотерапии или к некоторым антиканцерогенам. Таким образом, трудно разрушить раковые клетки, не разрушив при этом нормальные нервные клетки.patients with malignant glioma, J. Neurosurg. 76: 772-781, 1992). В настоящее время традиционное лечение глиобластом после хирургической резекции основано на наружной радиотерапии. Такое лечение не дает возможности достичь продолжительности выживания более одного года. Сочетание радиотерапии с химиотерапией с использованием 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевины (BCNU) эффективно только по отношению к анаплазированным астроцитомам. Оно дает лишь небольшой выигрыш, поскольку повышает процент выживших только к восемнадцати месяцам и при этом не меняет продолжительности выживания. При этом иммунотерапия ни разу о себе не заявила, а генная терапия еще должна себя проявить. Были испытаны несколько способов повышения локальной концентрации антиканцерогенов, в частности, осмотический разрыв гематоэнцефалического барьера, инъекция в спинномозговую жидкость, внутриспинномозговая перфузия и внутриопухолевое введение с помощью подкожных резервуаров (Tamargo RJ и Brem Н, Drug delivery to the central nervoussystem, Neurosurgery Quaterly, 2: 259-279, 1992). Ни один из этих способов не смог увеличить продолжительность выживаемости больных, а некоторые из них оказались чрезвычайно токсичными. За последние годы исследования в области галеновой фармации позволили разработать имплантируемые полимерные системы, защищающие активные вещества от разложения и делающие возможным их регулируемое локальные высвобождение в течение определенного периода времени, снижая тем самым системные побочные эффекты. Преимущества этих имплантируемых полимерных систем побудили недавно несколько исследовательских групп изучить их применение при патологиях центральной нервной системы (Langer R, Polymerimplants for drug delivery in the brain, J. Controlled Release, 16: 53-60, 1991). В частности,такие системы, будучи имплантированными в стенку опухолевой резекции злокачественных глиом, замедляют рецидив опухоли и продляют выживаемость больных. Вокруг операционной полости сохраняются отдельные, ответственные за 90% рецидивов злокачественные клетки, которые возникают в двух сантиметрах от операционного поля. В этой зоне нервная ткань функциональна, а гематоэнцефалический барьер 3 еще не нарушен, что ограничивает воздействие обычной радиотерапии и химиотерапии. Были разработаны и испытаны на животных различные имплантируемые полимерные системы, высвобождающие активные молекулы. Система биоразлагаемых дисков, состоящих из PCPP-SA (сополимер 1,3-бис(карбоксифенокси)пропана с себационовой кислотой) и высвобождающих BCNU (GLIADEL), была разработана несмотря на скромные результаты клинических исследований (Brem H, Polymers toof chemotherapy for recurrent glioma. Lancet, 345: 1008-1012, 1995). Были разработаны микросферы, высвобождающие BCNU, но результаты исследований на животных оказались мало обнадеживающими (Torres AI, Boisdron-Celle M, Benoit JP, Formulation of BCNU-loaded microspheres: influenceInfluence on drug stability, Eur. J. Pharm. Biopharm, 1998, 45, 31-39). Предметом настоящего изобретения является способ лечения глиобластомы с применением имплантируемых биоразрушаемых микросфер, высвобождающих антиканцероген. Использование микросфер по изобретению сочетают с радиотерапией и хирургией. После иссечения опухоли биоразрушаемые микросферы,которые высвобождают противораковый агент,имплантируют в операционную полость способом внутритканевой инъекции. После этого, не позже чем через семь дней, проводят радиотерапию. Благодаря использованию микросфер заявителю удалось абсолютно благоприятным образом удвоить продолжительность выживания страдающих глиобластомой больных. Действительно, использование микросфер по изобретению позволяет достичь продолжительности выживания не менее 90 недель. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения глиобластомы,заключающемуся в одновременном, раздельном или разделенном временем использовании в сочетании с радиотерапией суспензии микросфер, высвобождающих радиосенсибилизи 004943 4 рующий противораковый агент, в стерильном растворе, причем микросферы имплантируют в стенки операционной полости после иссечения глиальной опухоли на глубину по меньшей мере 2 см, предпочтительно 2-3 см на каждом см 2 при объеме одной инъекции 100 мкл, причем содержащие противораковый агент микросферы имеют полимерное покрытие, которое замедляет высвобождение противоракового агента и поддерживает в течение времени его терапевтически эффективную концентрацию в паренхиматозном пространстве в течение по меньшей мере трех недель, предпочтительно по меньшей мере четырех недель. Используемые в рамках настоящего изобретения микросферы содержат антиканцероген, который преимущественно гидрофилен и/или не преодолевает гематоэнцефалический барьер. Противораковый агент обладает тем преимуществом, что не проявляет токсичности по отношению к центральной нервной системе. Этот антиканцероген действует главным образом на клетки в стадии их деления. Противораковый агент состоит из радиосенсибилизирующего противоракового соединения или смеси противораковых соединений,содержащей по меньшей мере одно радиосенсибилизирующее противораковое соединение,причем это противораковое соединение или соединения выбирают,например,из 5 фторурацила (5-FU), платин, таких как карбоплатина и цисплатина, таксанов, таких как доцетаксел и паклитаксел, гемцитабина, VP 16,митомицина, идоксуредина, ингибиторов топоизомеразы 1, таких как иринотекан, топотекан и камптотецины, нитрозомочевин, таких какIL2, IL6, IL12 и IL13 и интерферонов. Противораковым агентом преимущественно является 5-FU. 5-FU является старым и хорошо известным антибитотиком. Это гидрофильная молекула,которая очень слабо преодолевает гематоэнцефалический барьер, в связи с чем его активность возрастает при локальном введении (Bourke RS,West CR, Chheda G et al., Kinetics of entry andRep., 36: 1-4, 1964). Активность 5-FU повышают также путем продолжительного введения. 5-FU является агентом, действие которого основано на включении в синтез нуклеиновых кислот. Исследования показали, что только от 30 до 50% клеток злокачественной глиомы у мыши (L9) и от 14 до 44% клеток злокачественной глиомы у человека находятся в стадии деления в любое время. Кроме того, продолжительности клеточного цикла глиобластомы являются большими (20 ч для глиомы L9, от 3 до 7 дней для глиобластомы человека). В то же время клиренс 5-FU в плазме осуществляется быстро (полупериод 30 мин)delivery, Neurosurgery, 14: 154-160, 1984). 5-FU не может, таким образом, разрушить значительное количество злокачественных клеток при системном введении или при локальной инъекции. 5-FU существенно активен на тканях с быстрым обновлением и исключительно нейротоксичен. Он включается в синтез нуклеиновых кислот, в котором быстрорастущие ткани испытывают особенно большую необходимость, поскольку он обеспечивает их пролиферацию и их регенерацию. Естественно, это не относится к ткани мозга, где митозы в нормальном состоянии редки и возникают только у глиальной популяции. Токсические эффекты 5-FU, которые ограничивают его введение обычными способами, являются в основном гематологическими и желудочно-кишечными. Несмотря на публикацию данных о редких побочных нейрологических эффектах 5-FU, их малоизученный этиопа 004943 6 тогенез является, по-видимому, многофакторным (блокирование цикла Кребса одним из катаболитов 5-FU или предшествующее усиление дефицита тиамина) (Aoki N, Reversible leukoencephalopathy caused by 5-fluorouracil derivatives,presenting as akinetic mutism, Surg Neurol, 25; 279-282, 1986; Moore DH, Fowler WC, Grumplerand 5-FU, Int. J. Radit. Biol. Phys., 39: 1145-1152,1997). Преимущество сочетания 5-FU и радиотерапии в каждом из этих отдельных способов лечения было показано, начиная с 60-х годов, на животных моделях и на раковых клетках in vitroof transplanted leukemic cells, J. Natl. Inst., 47: 865-870, 1971). Эта синергия обусловлена, повидимому, синхронизацией опухолевой клеточной популяции и ослаблением механизмов клеточной репарации с помощью 5-FU. Уже делались попытки применить сочетание радиотерапии и антипиримидина (5-FU или BrudR) на человеке (Goffman ТЕ, Dachowski LJ, Bobo H ettreated with iododeoxyuridine and hyperfractionated irradiation, J. Clinical Oncology, 10: 264-268,1992). Отсутствие отчетливого эффекта может быть еще объяснено системным способом введения лекарств. Когда противораковым агентом является 5FU, концентрация этого противоракового агента в спинно-мозговой жидкости, которая отражает концентрацию в паренхиматозном пространстве, составляет от 3 до 20 нг/мл. С целью ограничения нейротоксичности используемого в рамках изобретения содержащегося в микросферах противоракового агента целесообразно добавление к этому противораковому агенту какого-либо нейропротекторного соединения. Это нейропротекторное соединение может быть, например, выбрано из пептидных факторов роста, таких как NGF или BDNF. Используемые в рамках настоящего изобретения биоразлагаемые микросферы покрыты полимером, который замедляет высвобождение противоракового агента и поддерживает в паренхиматозном пространстве терапевтически эффективную концентрацию в течение периода времени не менее трех недель, преимущественно не менее четырех недель. Полимер выбирают из этилцеллюлозы, полистирола, поли(-капролактона), поли(d,l-молочной кислоты) и сополимера d,1-молочной кислоты с гликолевой кислотой. 7 Полимером преимущественно является сополимер d,1-молочной кислоты с гликолевой кислотой, или PLAGA, представляющий собой биоразлагаемый полимер, разрешенный для применения в составе галеновых препаратов пролонгированного действия (в отличие отPCPP-SA, который не разрешен для клинического использования в широком масштабе). Сополимер d,l-молочная кислота/гликолевая кислота представляет собой преимущественно PLAGA 50:50 (т.е. он содержит равные количества молочной кислоты и гликолевой кислоты), например Resomer RG 506, поставляемый фирмой BI Chimie, Франция, с молекулярной массой, равной 72000, индексом полидисперсности, равным 1,8 и характеристической вязкостью 0,80 дл/г (0,1%-ный раствор полимера в хлороформе при 25 С).PLAGA является гидрофобным сополимером, разложение которого, обусловленное реакцией гидролиза, приводит к образованию двух нормальных биологических веществ - молочной кислоты и гликолевой кислоты, метаболизируемых в итоге аэробного гликолиза в СО 2 и Н 2O. Ранее проведенные исследования показали, что основным путем выведения этих двух веществ является дыхательный тракт. Скорость биоразложения PLAGA зависит от относительного соотношения молочной и гликолевой кислот.PLAGA обладает прекрасной биосовместимостью и вызывает умеренную реакцию на посторонние тела (Visscher GE, RL Robinson, HVBiomed. Mat. Res. 19: 349-365, 1985). PLAGA входит в состав хирургических нитей (Frazza EJ,Schmidt ЕЕ, A new absorbable suture, J. Biomed.Mater. Res., 5: 43-58, 1971) и имплантируемых под кожу галеновых форм (Jalil R, Nixon JR,Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactideco-glycolide) microcapsules: problems associated(Review), J. Microencapsulation, 7: 297-325,1990). Было показано, что микросферы PLAGA 50:50 могут быть стерилизованы -облучением и что, будучи имплантированными стереотаксическим способом в мозг грызуна, они полностью биологически разлагаются в течение двух месяцев, вызывая лишь умеренную неспецифическую реакцию астроцитарного или гистиоцитарного типа (Menei Р, Daniel V, MonteroMenei С, Brouillard M, Pouplard-Barthelaix A,Benoit JP, Biodegradation and brain tissue reactionimplanted into the brain, J. Biomed. Mat. Res., 28,1079-1085, 1994). С тех пор последний результат был подтвержден Коu JH, Emmett С, Shen P etRelease, 43, 123-130, 1997. Биоразлагаемые микросферы по изобретению имеют средний диаметр 4820 мкм, преимущественно, 467 мкм. Они содержат от 15 до 35 мас.% противоракового агента, преимущественно от 19 до 27% 5-FU (предпочтительно 20%) и от 65 до 85 мас.% полимера. Особенно предпочтительны в рамках настоящего изобретения микросферы PLAGA 50:50, содержащие 5-FU. В опытах in vitro содержащие 5-FU микросферы PLAGA 50:50 могут высвобождать 5-FU в течение 21 дня. В опытах in vivo эти микросферы, имплантированные под кожу кролика,позволяют получать постоянную плазматическую концентрацию 5-FU в течение 23 дней. В опытах же in vivo в мозге грызунов кристаллы 5-FU различимы в микросферах по крайней мере до 19-го дня. После внутримозговой имплантации микросфер PLAGA-5-FU (7 мг/кг 5-FU) у кролика в сыворотке не обнаружено никаких следов 5-FU, что дает основание предполагать почти полное отсутствие вхождения лекарства в системную циркуляцию. После внутримозговой имплантации микросфер PLAGA-5-FU у грызуна при общей дозе 17 мг/кг 5-FU не наблюдалось никаких признаков системной токсичности и клинической или гистологической нейротоксичности. При дозе,поделенной до 24 Гр, прекрасно переносится сочетание микросфер 5-FU с церебральной радиотерапией (Menei Р, Векторизация в SNC методом стереотаксической имплантации микросфер. Диссертация Университета фармацевтических наук, Анжерский университет, 1995). Наконец, эти микросферы, будучи стереотаксически имплантированными в область развившейся злокачественной глиомы у крысы (глиома С 6), значительно снижают смертностьnormal С 6-glioma bearing rats, Neurosurgery, 39: 117-124, 1996). Целесообразно суспендирование микросфер в стерильном растворе с последующим инъецированием суспензии в стенку операционной полости после расширенной операции на опухоли. Стерильный раствор преимущественно содержит(об./мас.) загущающего агента, например натриевой карбоксиметилцеллюлозы,от 0,5 до 1,5%, предпочтительно 1% ПАВ,например полисорбата 80 и от 3,5 до 4,5%, предпочтительно 4% изотонизирующего агента, например маннита. Микросферы преимущественно переводят в суспензию непосредственно перед инъекцией. Суспензия преимущественно содержит 3 мл 9 описанного выше стерильного раствора и 700800 мг биоразрушаемых микросфер. После подтверждения диагноза глиобластомы и проведения макроскопического иссечения на глиальной опухоли суспензию микросфер имплантируют в стенку операционной полости на глубину по меньшей мере два сантиметра, предпочтительно от 2 до 3 см, по меньшей мере, на каждом квадратном сантиметре. Когда противораковым соединением является 5-FU, общая доза инъецируемой суспензии соответствует количеству 5-FU, составляющему от 50 до 200 мг. Радиотерапию сосредоточивают на опухолевом объеме и облученный объем охватывает предоперационную опухоль вместе с опушкой не менее двух сантиметров во всех направлениях, в то время как применяемая общая доза составляет от 50 до 60 Гр. Радиотерапию начинают проводить преимущественно между вторым и седьмым днями после операции. Общую дозу, составляющую от 50 до 60 Гр, растягивают на период времени,составляющий от 4 до 8 недель, например при 5 долях облучения в неделю. Радиотерапию проводят преимущественно при общей дозе 60 Гр в течение приблизительно шести недель, преимущественно при пяти долях облучения в неделю в течение 6,5 недель. После инъекции микросфер непосредственно вслед за иссечением на опухоли в случае рецидива опухоли могут быть стереотаксически произведены одна или несколько дополнительных инъекций микросфер. Используемые в рамках изобретения микросферы могут быть приготовлены с использованием эмульсионно-экстракционного метода в соответствии с его вариантом, описанным Boisdron-Celle М, Menei Р, Benoit JP: Preparation ofbiodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres,J. Pharm. Pharmacol., 47, 108-114, 1995. Используемые в рамках изобретения, содержащие противораковый агент микросферы с полимерным покрытием получают предпочтительно способом, основные стадии которого состоят в приготовлении органической фазы, в которой противораковый агент и полимер диспергируют в органическом растворителе. Органическую фазу и водную фазу переводят в эмульсию, после чего органический растворитель экстрагируют добавлением воды. Наконец,полученную суспензию микросфер фильтруют. Способ по изобретению отличается прежде всего тем, что, прежде чем добавить полимер,противораковый агент диспергируют в органическом растворителе при интенсивном перемешивании. Согласно вносимым в известный способ уточнениям, активное начало измельчают в планетарной шаровой мельнице. Размер получаемых при этом кристаллов составляет от 15 до 50 мкм. Размер инкапсулируемых кристаллов и 10 их диспергирование являются существенными критериями для регулирования степени инкапсулирования и кинетики высвобождения in vitro. Далее активное начало диспергируют в органическом растворителе, преимущественно дихлорметане, в круглодонной пробирке при перемешивании с помощью гомогенизирующего вала, после чего добавляют полимер. Гомогенизация позволяет получать гомогенную суспензию, сглаживать различия в степени размола от одной партии к другой и уменьшать размер кристаллов активного начала. Органическую фазу приготовляют в растворителе без сорастворителя. Отсутствие сорастворителя позволяет замедлить выпадение в осадок полимера в процессе стадии эмульгирования и при этом получают менее пористые частицы. Дисперсию активного начала переливают в первый реактор. Добавляют полимер в количестве от 8 до 13 мас.%, предпочтительно 11%. Полученную органическую фазу выдерживают при постоянном перемешивании и комнатной температуре в течение 2-4 ч и затем в течение приблизительно 15 мин при температуре от 1 до 5 С, предпочтительно при 2 С. Продленный период перемешивания органической фазы при комнатной температуре обеспечивает полное растворение полимера в растворителе. Во втором реакторе приготовляют водную фазу, выдерживая ее приблизительно при той же температуре, что и органическую фазу,предпочтительно при 2 С. Понижение температуры водной фазы и органической фазы приводит к повышению их вязкости и увеличению степени инкапсулирования. Водной фазой может, например, быть 10%-ный водный раствор поливинилацетата. Оба используемых реактора имеют двойные стенки и в обоих реакторах последовательно циркулирует охлаждающая жидкость. При смешении фаз температура органической и водной фаз предпочтительно одна и та же и преимущественно равна 2 С. Строгое выдерживание температуры обусловливает одновременно нужные размер частиц, скорость растворения активного начала и скорость экстракции растворителя. Из первого реактора органическую фазу переливают во второй реактор. При этом отношение водной фазы к органической фазе составляет от 80/3 до 120/3, предпочтительно 100/3. Полученную эмульсию перемешивают в течение по меньшей мере 3 мин, предпочтительно 3-6 мин и, еще более предпочтительно, в течение 5 мин. Выбор продолжительности перемешивания непосредственно коррелирует с кинетикой высвобождения, в частности со 11 Отсутствие сорастворителя в сочетании с достаточной продолжительностью эмульгирования делает возможным растворение активного начала с поверхности или слабо защищенного покрытием активного начала, благодаря чему кинетика высвобождения в начальной фазе становится более управляемой. К эмульсии добавляют воду при объемном соотношении эмульсия/вода от 1/4 до 1/2, предпочтительно 1/3, с целью экстракции органического растворителя. Температура экстракционной воды составляет от 1 до 5 С, предпочтительно 4 С. Стадии эмульгирования и экстракции осуществляются в одном и том же реакторе, что позволяет сгладить отличия одной партии от другой и сэкономить время. Температура экстракционной воды является низкой с целью ограничения слишком быстрого растворения активного начала. Полученную суспензию микросфер перемешивают в течение нескольких минут и затем фильтруют в инертной атмосфере. Работа в инертной атмосфере позволяет снизить риск загрязнения продукта. Полученные в соответствии с описанным выше способом микросферы предпочтительно подвергают лиофилизации. К 2-5 г порошка (фильтрационной лепешки) микросфер добавляют 10 мл стерильной воды. Смесь замораживают при -40 С и затем вводят в лиофилизатор. Лиофилизация длится 18 ч. В конце процедуры температура вторичного обезвоживания должна поддерживаться ниже 10 С. Микросферы необходимо выдержать перед сушкой при +4 С. Настоящее изобретение относится также к суспензии, состоящей из стерильного раствора,содержащего 1-1,5% мас./об. загущающего агента, 0,5-1,5% ПАВ и 3,5-4,5% изотонизирующего агента и описанные выше выделяющие противораковый агент биоразрушаемые микросферы с полимерным покрытием, которые могут быть получены описанным выше способом, причем количество микросфер составляет от 200 до 300 мг на 1 мл стерильного раствора,предпочтительно от 230 до 270 мг/мл. Эти микросферы преимущественно состоят из противоракового агента (15-35 мас.%) и полимера (65-85 маc.%). Полимером предпочтительно является сополимер d,1-молочной кислоты с гликолевой кислотой, содержащий по преимуществу равные количества молочной кислоты и гликолевой кислоты. Стерильный раствор преимущественно содержит 1,25% мас./об. натриевой карбоксиметилцеллюлозы, 1% полисорбата 80 и 4% маннита. 12 Настоящее изобретение иллюстрируют следующие не ограничивающие изобретения примеры. Пример 1. Микросферы, приготовленные методом эмульгирования-экстракции растворителя в соответствии с вариантом метода, описаннымBoisdron-Celle M, Menei P и Benoit JP (Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres, J. Pharm. Pharmacol., 47, 108-114, 1995). Измельчение 5-FU. 5-FU измельчают в планетарной шаровой мельнице типа Pulverisette 7 (Fritsch). 8,6 г 5-FU вводят в каждый отсек, содержащий 7 шариков. Измельчение проводится в течение 10 мин на скорости 7. Порошок собирают под вытяжным зонтом с ламинарным потоком. Полученные кристаллы имеют размеры от 15 до 50 мкм и распределяются по двум фракциям: мелкодисперсная фракция (с гранулометрией менее 1 мкм) и грубая фракция (более 30 мкм). Диспергирование 5-FU в органическом растворителе. Измельченную 5-FU диспергируют в 45 мл дихлорметана при перемешивании с помощью гомогенизатора типа ultra-turrax в течение 3 мин при скорости 13500 об/мин в круглодонной пробирке. Приготовление органической фазы. Дисперсию 5-FU переливают в охлаждаемый 150-мл реактор с двойной стенкой. Туда же добавляют PLAGA таким образом, чтобы отношение PLAGA/дихлорметан было равным 11%. Органическую фазу 4 ч перемешивают лопастной мешалкой со скоростью 450 об/мин при 20 С и затем 15 мин при 2 С. Температуру в реакторе поддерживают постоянной с точностью 0,1 С с помощью криостата. Приготовление эмульсии. Приготовляют 1500 мл автоклавированного 10%-ного водного раствора поливинилацетата, выдерживаемого при 2 С в охлаждаемом 6-л реакторе с двойной стенкой. Органическую фазу после этого переливают в этот реактор через вентильное отверстие первого реактора. Органическую фазу вливают в течение 5-10 с на водную фазу, перемешиваемую с помощью лопастной мешалки со скоростью 375 об/мин. Объемное соотношение водная фаза/органическая фаза равно 100/3. Эмульсию перемешивают в течение 4 мин 45 с. Экстракция. В готовую эмульсию вливают 4,5 л экстракционной воды при 4 С при объемном отношении эмульсия/вода равном 1/3. Экстракция длится 2 мин. Фильтрация. Все содержимое второго реактора сливают через дно в бак из нержавеющей стали, в котором создают давление азотом. Суспензию фильтруют на фильтре с диаметром пор 3 мкм. 13 После прохода всего количества суспензии через фильтр фильтрационную лепешку дважды промывают 3 л стерильной воды. Степень инкапсулирования противоракового агента в полученных микросферах составляет 20%. После просеивания производят десорбирование дихлорметана в сушильном шкафу в течение 48 ч. Микросферы после этого затаривают и стерилизуют -облучением в дозе 19 кГр. После стерилизации вновь проверяют степень инкапсулирования. Затем производят определение следов остаточного растворителя. Детектируемое остаточное содержание дихлорметана преимущественно составляет 0,5%. Контролируют стерильность и кинетику высвобождения in vitro полученных микросфер. Содержание активного начала в полученных микросферах равно 233,5%. Приготовляют несколько партий по описанной выше прописи и рассчитывают средний размер частиц 4820 мкм по совокупности всех партий с размером частиц 467 мкм (среднее из средних приготовленных партий). Содержание активного начала в полученных микросферах составляет 233,5%, а средний размер 4820 мкм. Пример 2. Микросферы приготовляют методом эмульгирования-экстракции растворителя как в примере 1. Измельчение 5-FU. Повторяют процедуру примера 1, измельчая 4 г 5-FU. Полученные кристаллы имеют размеры в пределах от 15 до 50 мкм и распределяются по двум фракциям: мелкодисперсная фракция (с гранулометрией менее 1 мкм) и грубая фракция (более 30 мкм). Диспергирование 5-FU в органическом растворителе. Измельченную 5-FU диспергируют в 40 мл дихлорметана в круглодонной пробирке при перемешивании с помощью гомогенизатора типа ultra-turrax в течение 3,5 мин при скорости 13500 об/мин. Приготовление органической фазы и приготовление эмульсии проводят как в примере 1. Экстракцию и фильтрацию проводят как в примере 1. Характеристики полученных микросфер: Содержание 5-FU - 22% Размер - 467 мкм Взрывной эффект через 24 ч после радиостерилизации в дозе 19 кГр: 404%. Пример 3. Было проведено открытое пилотное клиническое исследование фазы 1/11 на микросферах PLAGA 50:50/5-FU примера 1. Полученные микросферы суспендируют непосредственно перед применением в растворе, содержащем- вода в количестве, достаточном для получения препарата для инъекции, с общим объемом 3 мл. Раствор предварительно стерилизуют в автоклаве при 121 С в течение 20 мин и затем с помощью радиостерилизации -облучением в дозе от 5 до 25 кГр, преимущественно 19 кГр. Получение этой суспензии является деликатной операцией, поскольку необходимо избегать образования пузырьков. Приготовленную суспензию незамедлительно инъецируют, так как микросферы имеют тенденцию к седиментации в шприце, приводящей к его закупориванию. Суспензию микросфер имплантируют в стенку операционной полости после макроскопического иссечения глиальной опухоли на глубину 2-3 см на каждом квадратном сантиметре при объеме одной инъекции 100 мкл. Инъекцию производят 1-мл шприцом и катетером (Insyte Vialon) 18 gа (1,3 х 45 мм), из которого удаляют металлический мандрен с тем, чтобы на нескошенном конце из пенопласта оставался только пластиковый катетер для инъекции суспензии в церебральную ткань. 1-мл шприцы используют в таком количестве, которое необходимо. Инъекция суспензии со скошенной иглой таит опасность гематомы и обратного тока микросфер. Диаметр катетера должен быть достаточно мал, чтобы не травмировать церебральную ткань, и достаточно велик,чтобы катетер не оказался закупоренным суспензией микросфер. Инъекция должна производиться очень мягко и для того, чтобы избежать обратного тока микросфер, катетер перед его извлечением должен оставаться на месте в течение нескольких минут. На место инъекции накладывают фрагмент рассасывающегося кровоостанавливающего компресса (Surgical или Spongel) размером 1 см 2. Включенные в исследования больные имеют возраст от 18 до 68 лет, не имеют опухолевого анамнеза, имеют показатель Карнофского выше 60, имеют клиническую историю болезни и визуальные данные, характеризующие субтенториальную глиобластому, перенесли макроскопически полное иссечение, и внутриоперационное гистологическое исследование(проведенное на основании критериев ВОЗ: некроз, сосудистая пролиферация, ядерный плеоморфизм и митотическая активность) подтверждает диагноз глиобластомы. Критерии исключения больных следующие: метаболическая недостаточность, беременность, другая предшествующая раковая патология. Для изучения эффектов возрастающих доз 5-фторурацила вначале были отобраны три группы: в хронологическом порядке 70, 132 и 15 264 мг, причем лечение следующей группы начинается после констатации толерантности к лечению у группы, на которой проводятся испытания. По причине появления неврологической токсичности второй степени у больного, получившего 132 мг 5-FU, и в соответствии с установленными правилами, усиление терапии было остановлено и следующие больные получили ту же дозу 132 мг. Традиционную наружную радиотерапию(сосредоточенную на опухолевом объеме, оцененном по предоперационным данным ЯМР с энергией 10 Мв) начинают проводить между вторым и седьмым днями после операции. Применена общая доза 60 Гр в 33 долях по 1,8 Гр в расчете по 5 долей в неделю в течение 6,5 недель. Облученный объем охватывает предоперационную опухоль с опушкой по меньшей мере два сантиметра во всех направлениях. За больными проводится клиническое и радиологическое наблюдение: проведены компьютерная томография (через 72 ч для подтверждения макроскопически полного иссечения и клиническая оценка на 10, 20 и 30 дни. ЯМРисследование проведено на 10 и 30 дни. Наконец, определение 5-FU в крови и спинномозговой жидкости проводили через 72 ч, на 10, 20 и 30 дни. Токсичность (неврологическая, гематологическая, мукозная и кардиологическая) оценивается в градациях на основании критериев,выведенных из критериев ВОЗ. Спустя месяц больные наблюдались клинически каждые два месяца и подвергались ЯМР-исследованию каждые три месяца. У всех больных наблюдались легкая послеоперационная анемия, гиперлейкоцитоз и легкая лимфопения. Фармакологическое исследование позволило подтвердить пролонгированное высвобождение 5-FU в спинно-мозговой жидкости в течение более 30 дней и неустановившийся, более слабый переход молекулы в системную циркуляцию. Значительные концентрации 5-FU еще присутствуют в спинно-мозговой жидкости через один месяц после имплантации. Профили высвобождения 5-FU в спинномозговой жидкости обнаруживают пик на десятый и на двадцатый дни соответственно для доз 70 и 132 мг. Плазматический показатель 5-FU не детектировался, начиная с десятого дня у половины больных. Системная толерантность прекрасна у всех проходящих лечение больных. Не было обнаружено никакого изменения в химии или клеточности спинно-мозговой жидкости. Появление церебрального отека во время радиотерапии у одного больного с дозой 132 мг не позволило повысить дозу. Таким образом, в исследования были включены восемь больных, среди которых было четверо мужчин и четыре женщины, со средним 16 возрастом 48,5 лет и показателем Карнофского выше 90. Первая группа из трех человек получила дозу 70 мг, а вторая группа из пяти человек получила 132 мг. Предварительные результаты по выживаемости не могли быть интерпретированы статистически из-за малого числа больных. По последней оценке, в первой подвергнутой лечению группе (70 мг) трое больных умерли через 61,114 и 125 недель. Следует отметить, что причиной смерти больного, умершего через 114 недель, были легочные метастазы глиобластомы. Во второй подвергнутой лечению группе (132 мг) трое больных умерли через 31, 59 и 82 недели, а двое все еще находились в состоянии ремиссии на 159 и 172 неделях - дате написания этих предварительных результатов. Средняя выживаемость больных составляет 98 недель (в сравнении с 50,6 неделями в литературе для больных, отвечающих тем же критериям (Devaux ВС, О'Fallen JR, Kelly PJ, Resection, biopsy, and survival in malignant glial neoplasms, J. Neurisurg., 78: 767-775, 1993). Пять больных из восьми, т.е. 62%, оставались живыми спустя 18 месяцев, в то время как в литературе для больных, отвечающих критериям включения настоящего исследования, выживаемость 18 месяцев составляет 20% (Devaux ВС,О'Fallen JR, Kelly PJ, Resection, biopsy, and survival in malignant glial neoplasms, J. Neurosurg.,78: 767-775, 1993). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Суспензия, состоящая из стерильного раствора, содержащего 1-1,5% мас./об. загущающего агента, 0,5-1,5% ПАВ и 3,5-4,5% изотонизирующего агента, и высвобождающие противораковый агент биоразрушаемые микросферы с полимерным покрытием, в которой микросферы содержатся в количестве от 200 до 300 мг на 1 мл стерильного раствора. 2. Суспензия по п.1, отличающаяся тем,что микросферы состоят из 15-35 мас.% противоракового агента и 65-85 мас.% полимера. 3. Суспензия по п.1 или 2, отличающаяся тем, что полимером является сополимер d,lмолочной кислоты с гликолевой кислотой, содержащий преимущественно равные количества молочной кислоты и гликолевой кислоты. 4. Суспензия по пп.1-3, отличающаяся тем,что стерильный раствор содержит 1,25% мас./об. натриевой карбоксиметилцеллюлозы,1% полисорбата 80 и 4% маннита. 5. Способ лечения глиобластомы, заключающийся в одновременном, раздельном или разделенном временем использовании в сочетании с радиотерапией суспензии микросфер в стерильном растворе по одному из пп.1-4, при этом микросферы имплантируют в стенки операционной полости после иссечения глиальной опухоли на глубину по меньшей мере 2 см, 17 предпочтительно 2-3 см на каждом см 2 при объеме одной инъекции 100 мкл, причем содержащие противораковый агент микросферы имеют полимерное покрытие, которое замедляет высвобождение противоракового агента и поддерживает его терапевтически эффективную концентрацию в паренхиматозном пространстве в течение по меньшей мере трех недель, предпочтительно по меньшей мере четырех недель. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что противораковый агент является гидрофильным и/или не преодолевает гематоэнцефалический барьер. 7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем,что противораковый агент не проявляет токсичности по отношению к центральной нервной системе. 8. Способ по одному из пп.5-7, отличающийся тем, что противораковый агент состоит из радиосенсибилизирующего противоракового соединения или смеси противораковых соединений, содержащей по меньшей мере одно радиосенсибилизирующее противораковое соединение, причем это противораковое соединение или соединения выбирают из 5-фторурацила (5FU), платин, таких как карбоплатина и цисплатина, таксанов, таких как доцетаксел и паклитаксел, гемцитабина, VP 16, митомицина, идоксуридина, ингибиторов топоизомеразы 1, таких как иринотекан, топотекан и камптотецины,нитрозомочевин, таких как BCNU, ACNU илиIL13, и интерферонов. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что противораковым агентом является 5 фторурацил. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что концентрация 5-FU в спинно-мозговой жидкости, которая отражает концентрацию в паренхиматозном пространстве, составляет от 3 до 20 нг/мл. 11. Способ по одному из пп.5-10, отличающийся тем, что к противораковому соединению добавляют нейропротекторное соединение,выбранное из пептидных факторов роста, таких как NGF или BDNF. 12. Способ по одному из пп.5-11, отличающийся тем, что полимер выбирают из этилцеллюлозы, полистирола, поли(-капролактона),поли(d,1-молочной кислоты) и сополимера d,1 молочной кислоты с гликолевой кислотой. 13. Способ по одному из пп.5-12, отличающийся тем, что покрывающим микросферы полимером является сополимер d,1-молочной кислоты с гликолевой кислотой. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что покрывающий микросферы полимер является сополимером d,1-молочной кислоты с гликолевой кислотой, содержащим равные количества молочной кислоты и гликолевой кислоты. 18 15. Способ по одному из пп.5-14, отличающийся тем, что средний диаметр микросфер равен 4820 мкм, преимущественно 467 мкм. 16. Способ по одному из пп.5-15, отличающийся тем, что микросферы содержат от 15 до 35 мас.% противоракового агента и от 65 до 85 мас.% полимера. 17. Способ по пп.9 и 16, отличающийся тем, что микросферы содержат от 19 до 27% 5FU, предпочтительно 20% 5-FU. 18. Способ по одному из пп.5-17, отличающийся тем, что микросферы переводят в суспензию в стерильном растворе, а полученная суспензия предназначена для инъекции в стенку операционной полости после иссечения глиальной опухоли, и тем, что названный стерильный раствор содержит от 1 до 1,5% мас./об. загущающего агента, от 0,5 до 1,5% ПАВ и от 3,5 до 4,5% изотонизирующего агента. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что раствор содержит 1,25% мас./об. натриевой карбоксиметилцеллюлозы, 1% полисорбата 80 и 4% маннита. 20. Способ по п.9, отличающийся тем, что общая доза инъецируемого 5-FU составляет от 50 до 200 мг, предпочтительно 130 мг. 21. Способ по одному из пп.5-20, отличающийся тем, что радиотерапию сосредоточивают на опухолевом объеме, что облученный объем охватывает предоперационную опухоль с опушкой не менее двух сантиметров во всех направлениях и что примененная общая доза составляет от 50 до 60 Гр. 22. Способ по одному из пп.5-21, отличающийся тем, что радиотерапию начинают проводить преимущественно между вторым и седьмым днями после операции. 23. Способ по одному из пп.5-22, отличающийся тем, что радиотерапию проводят с общей дозой 60 Гр в течение приблизительно шести недель. 24. Способ по одному из пп.18 и 19 или 2123, отличающийся тем, что в случае рецидива опухоли суспензию микросфер стереотаксически инъецируют в несколько приемов. 25. Суспензия по одному из пп.1-4, отличающаяся тем, что микросферы получены эмульсионно-экстракционным методом, который состоит в диспергировании полимера и противоракового агента в органическом растворителе, смешивании полученной органической фазы с водной фазой для получения эмульсии,экстракции органического растворителя добавлением воды с последующей фильтрацией полученной суспензии микросфер, причем перед добавлением полимера противораковый агент диспергируют в органическом растворителе при интенсивном перемешивании. 26. Суспензия по п.25, отличающаяся тем,что органическим растворителем является дихлорметан. 27. Суспензия по п.25 или 26, отличающаяся тем, что температура водной фазы и органической фазы при их смешении одинакова и преимущественно равна приблизительно 2 С. 28. Суспензия по одному из пп.25-27, отличающаяся тем, что органическая фаза содержит 11% полимера. 29. Суспензия по одному из пп.25-28, отличающаяся тем, что соотношение водная фаза/органическая фаза равно 100/3. 30. Суспензия по одному из пп.25-29, отличающаяся тем, что эмульсию, состоящую из водной фазы и органической фазы, перемешивают в течение по меньшей мере 3 мин. 31. Суспензия по одному из пп.25-30, отличающаяся тем, что воду, необходимую для экстракции органического растворителя, добавляют в таком количестве, чтобы объемное соотношение эмульсия/вода составляло 1/3. 20 32. Суспензия по одному из пп.25-31, отличающаяся тем, что вода, необходимая для экстракции органического растворителя, имеет температуру 4 С. 33. Суспензия по одному из пп.25-32, отличающаяся тем, что противораковый агент перед диспергированием в органическом растворителе измельчают, получая кристаллы противоракового агента размером от 15 до 50 мкм. 34. Суспензия по одному из пп.25-33, отличающаяся тем, что полученную после добавления экстракционной воды суспензию фильтруют в инертной атмосфере. 35. Суспензия по одному из пп.25-34, отличающаяся тем, что микросферы подвергают лиофилизации.