Композиции и способы для осуществления реакций галогенирования

1 Настоящее изобретение в целом относится к способам, трансгенным растениям и трансгенным микроорганизмам, которые можно применять для биосинтеза галогенированных природных продуктов, где галогенирование является специфичным для субстрата или определенной области. Одним из объектов изобретения является применение галогенированных метаболитов, полученных с помощью способа по изобретению, для защиты организмов-хозяев от патогенов, более конкретно, для защиты растений от фитопатогенов. Согласно этому объекту изобретение относится к трансгенным растениям, обладающим повышенной устойчивостью к фитопатогенам, и к организмам, применяемым для биологической борьбы, обладающим повышенной эффективностью в этом отношении. Хорошо известно, что биосинтез свыше 2000 встречающихся в естественных условиях галогенированных метаболитов зависит от двух классов ферментов: галопероксидаз и несодержащих гем галопероксидаз (Gribble G.W., Thenatural production of chlorinated compounds. Environ. Sci. technol. 28:310-319, 1994; van Pee K-H,Biosynthesis of halogenated metabolites by bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 50:375-99, 1996). В первой группе ферментов как бромпероксидазы,так и хлорпероксидазы несут протопорфирин IX в качестве гемсодержащей простетической группы. Эта группа катализирует реакцию с перекисью водорода с образованием гидроперекиси (соединение I), которое затем взаимодействует с галогенидом (X; Х=Вr-, Cl- или I-) с образованием связанного с ферментом (Е) промежуточного продукта ЕОХ. К настоящему времени неизвестно, является ли ЕОХ галогенирующим агентом или разложение ЕОХ приводит к образованию активированного галогенирующего агента Х+ с коротким временем полужизни или его производного (например, НОХ,Х 2 или Х 3-). Однако отсутствие субстратной специфичности и отсутствие специфичности для определенной области у этого класса галогеназ позволяет с большой долей уверенности предположить, что галогенирование происходит вне активного сайта и катализируется одним из продуктов разложения ЕОХ (Franssen MCR,Halogenation and oxidation reactions with haloperoxidases. Biocatalysis 10:87-111, 1994). Известно, что имеется два типа несодержащих гем галопероксидаз, а именно, ферменты, несущие ванадий, и ферменты, несущие каталитическую триаду Ser/Asp/His, характерную для сериновых протеиназ. Первая группа катализирует зависящее от ванадия и гидроперекиси образование НОХ, которое и в этом случае приводит к галогенированию вне активного сайта и которое характеризуется отсутствием субстратной специфичности (Franssen MCR, Halogenation and oxidation reactions with haloperoxidases.Biocatalysis 10:87-111, 1994). Не содержащие ванадий и не содержащие гем галопероксидазы, 004942 2 вероятно, образуют сложный ацетатный эфир в сайте активного остатка Ser, который далее превращается в перуксусную кислоту в присутствии гидроперекиси; перуксусная кислота окисляет ион галогенида с образованием активированных галогенирующих агентов (Pelletier I,Altenbucher J, Mattes R. A catalytic triad is required by the non-heme haloperoxidase to performhalogenation. Biochim. Biophys. Acta 1250:149157, 1995). И в данном случае это приводит к реакции, которая не обладает либо субстратной специфичностью, либо специфичностью для определенной области (van Pee K-H, Biosynthesis of halogenated metabolites by bacteria. Annu.Rev. Microbiol. 50:375-99, 1996). В настоящее время выявлен дополнительный класс генов галогеназ, продукты которых обладают способностью осуществлять специфичное для определенной области галогенирование широкого спектра природных продуктовAppl. Environ. Microbiol. 63:2147-2154, 1997). В настоящем изобретении описаны способы переноса галогена на субстрат специфичным для определенной области образом, предусматривающие контакт субстрата со специфичной для определенной области галогеназой в присутствии окислителя, донора галогена, трансферазы электронов и восстановителя, причем, если перенос происходит in vivo, то трансфераза электронов кодируется гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты. В частности описаны варианты способа:- где способ по изобретению дополнительно включает компонент ФАД (флавинадениндинуклеотид) или ФМН (флавинмононуклеотид), предпочтительно ФАД,- где трансфераза электронов представляет собой фермент, обладающий способностью катализировать перенос электрона с НАДН или НАДФН или ферредоксина на ФАД,- где трансфераза электронов представляет собой фермент, обладающий способностью катализировать перенос электрона с НАДН или НАДФН или ферредоксина на специфичную для определенной области галогеназу,- где трансфераза электронов представляет собой флавинредуктазу, ферродоксин-НАДФредуктазу, ферредоксин, диафоразосульфгидрилредуктазу или НАДН-цитохром В 5 редуктазу, НАДФН-ФМН-редуктазу, НАДФНцитохром Р 450-редуктазу или нитратредуктазу,- где трансфераза электронов содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 30% любой из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 29 или 31, 3- где трансфераза электронов содержит аминокислотную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 29 или 31,- где специфичная для определенной области галогеназа представляет собой рrnА, рrnС,пиолутеорингалогеназы plta, pltD и pltM, тетрациклингалогеназу cts4, гидролазу а или балгимицингалогеназу bha A,- где специфичная для определенной области галогеназа содержит последовательностьSEQ ID NO: 1,- где специфичная для определенной области галогеназа представляет собой полипептид, включающий аминокислотный домен,имеющий последовательность, которая соответствует любой из последовательностей SEQ IDNO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17. Кроме того, объектом изобретения являются клетки-хозяева, экспрессирующие гетерологичную нуклеиновую кислоту, практически аналогичную любой из последовательностейSEQ ID NO: 18, 10, 22, 24, 26, 28 или 30, и по меньшей мере одну гетерологичную нуклеиновую кислоту, практически аналогичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14 или 16, в частности,- клетка-хозяин представляет собой бактериальную, грибную или растительную клетку,- клетка-хозяин представляет собой микробную клетку,- клетка-хозяин дополнительно экспрессирует нуклеотидные последовательности, кодирующие рrnВ и prnD. Изобретение относится также к- способам получения пирролнитрина,предусматривающим выращивание указанной выше клетки-хозяина,- способам защиты растения от патогена,предусматривающим обработку растения указанной клеткой-хозяином, причем пирролнитрин продуцируется хозяином в количествах,которые ингибируют патоген,указанные выше способы также предусматривают выделение пирролнитрина из хозяина. Изобретение относится также к- растениям, включающим клетку-хозяина по изобретению,- способам защиты растения от патогена,предусматривающим выращивание указанного выше растения, причем пирролнитрин продуцируется в растении в количествах, которые ингибируют патоген,- семенам указанного выше растения,- способам предупреждения роста грибов на культурном растении, предусматривающим выращивание растения по изобретению, где растение представляет собой культурное растение,- способам повышения производства галогенированных субстратов в хозяине, предусмат 004942 4 ривающим экспрессию гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует в хозяине трансферазу электронов, где хозяин экспрессирует по меньшей мере один эндогенный полипептид, обладающий специфичной для определенной области галогеназной активностью. При создании изобретения неожиданно было обнаружено, что специфичные для определенной области галогеназы обладают способностью переносить галоген на субстрат in vitro,но для осуществления этого им требуется дополнительный протеиновый фактор, трансфераза электронов. Открытие того факта, что для осуществления галогенирования in vitro этим ферментам необходим дополнительный протеиновый фактор, было сделано путем очистки РrnА, галогеназы D-триптофана, которая участвует в пути биосинтеза пирролнитрина, дихлорированного нитрофенолпиррольного антибиотика, вырабатываемого Pseudomonas fluorescens. При очистке этой зависящей от НАДН и флавинадениннуклеотида (далее обозначенного как"ФАД") галогеназы происходило постепенное снижение галогенирующей активности. В процессе осуществления ионообменной хроматографии экстрактов P. fluorescens, для которых характерна сверхэкспрессия РrnА, частично очищенную и неактивную РrnА можно было повторно активировать (реактивировать), добавляя аликвоты хроматографических фракций,в которых отсутствовала РrnА. Далее на основе чувствительности к нагреванию и действию протеаз было установлено, что фактор, ответственный за реактивацию, который в контексте настоящего описания обозначен как Р 2 P. fluorescens, представляет собой протеин. Очистка РrnА до гомогенного состояния приводит к полной потере активности, которую можно восстановить путем добавления трансферазы электронов по изобретению. Последовательность второй галогеназы,участвующей в пути биосинтеза пирролнитрина,РrnС, аналогична последовательности РrnА,хотя она аналогична в меньшей степени последовательности РrnА, чем последовательностям следующих специфичных для определенной области галогеназ, которые, как известно, участвуют в биосинтезе перечисленных ниже галогенированных природных продуктов: пиолутеорин (см. Nowak-Thompson В., Chaney N Wingof the gene responsible for chlorination of tetracycline. Biosci Biotechnol Biochem 59:1099-106,1995). Аналогично РrnА очистка PrnC сопровождалась потерей галогенирующей активности,которую можно было восстановить путем добавления трансферазы электронов по изобретению. Ранее было установлено, что путь биосинтеза пирролнитрина функционирует в Е. coli,когда экспрессируется оперон пирролнитрина,кодирующий РrnА, PrnB, PrnC и PrnD (данные о нуклетидной последовательности оперона пирролнитрин см. в 5.8 X/N, процитировано в патенте США 5723759, который полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки). РrnА и PrnC функционируют в качестве галогеназ; РrnВ катализирует перегруппировку индолильного фрагмента триптофана в аминофенилпиррол, a PrnD окисляет аминофенильный фрагмент с образованием нитрофенильного заместителя. При создании изобретения неожиданно было установлено, что когда происходит сверхэкспрессия трансферазы электронов по изобретению, в данном случае флавинредуктазы Е. coli (обозначена далее как "Fre"), то производство in vivo пирролнитрина значительно увеличивается. Наличие "Р 2-подобной активности" выявляли в Е. coli, добавляя экстракт Е. coli в очищенную неактивную РrnА. Затем фракции, обладающие Р 2-подобной активностью Е. coli,частично очищали с помощью ионообменной хроматографии, гидроксиапатита и гельхроматографии на колонках. Колоночные фракции, обладающие активностью, и фланкирующие неактивные фракции обрабатывали трипсином и секвенировали с помощью массспектрометрии; пептиды, идентифицированные в неактивных фракциях, вычитали из присутствующих в активных фракциях, обладающих Р 2 подобной активностью Е. coli, и остальные пептиды соотносили с базой данных генома Е. coli. В результате этого была идентифицирована одна уникальная нуклеотидная последовательность, НАДН-зависимая флавинредуктаза (да 004942Genbank 23486). Как будет более подробно описано ниже,fre E. coli затем клонировали и сверхэкспрессировали, и было установлено, что клетки, для которых характерна сверхэкспрессия, обладали повышенной Р 2-подобной активностью Е. coli,прямо пропорциональной увеличению активности флавинредуктазы. Кроме того, fre совместно с опероном пирролнитрина трансформировали Е. coli с использованием отдельных плазмид. Клетки, несущие обе плазмиды, продуцировали значительно больше пирролнитрина или метаболитов пирролнитрина, чем клетки, несущие только оперон пирролнитрина, что подтверждает установленный факт о том, что Fre является вспомогательным фактором для РrnА и РrnС, а также о том, что в Е. coli флавинредуктазная активность является основным фактором, лимитирующим производство пирролнитрина. Одним из вариантов осуществления является способ переноса галогена на субстрат специфичным для определенной области образом,предусматривающий контакт субстрата со специфичной для определенной области галогеназой в присутствии окислителя, донора галогена,трансферазы электронов и восстановителя, причем, если перенос происходит in vivo, то трансфераза электронов является гетерологичной для хозяина. Другим вариантом осуществления является способ переноса галогена на субстрат специфичным для определенной области образом,предусматривающий контакт субстрата со специфичной для определенной области галогеназой в присутствии окислителя, донора галогена,трансферазы электронов, восстановителя и ФАД или ФМН, причем, если перенос происходит invivo, то трансфераза электронов является гетерологичной для хозяина. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления реакция приводит к производству пирролнитрина. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления трансфераза электронов представляет собой фермент, который обладает способностью катализировать перенос электронов с НАДН или НАДФН или ферредоксина на ФАД, или трансфераза электронов представляет собой фермент, который обладает способностью катализировать перенос электронов с НАДН или НАДФН или ферредоксина на специфичную для определенной области галогеназу. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления аминокислотная последовательность трансферазы электронов по меньшей мере на 30% идентична, предпочтительно на 40% идентична, более предпочтительно на 50% идентична, еще более предпочтительно на 60% идентична, еще более предпочтительно на 70% идентична, еще более предпочти 7 тельно на 80% идентична или еще более предпочтительно на 90% идентична аминокислотной последовательности НАДФН-ФМН-редуктазы,НАДФН-цитохром Р 450-редуктазы печени крысы, ферредоксин-НАДН-редуктазы шпината, цитохром b5-редуктазы или нитритредуктазы. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления аминокислотная последовательность специфичной для определенной области галогеназы по меньшей мере на 30% идентична, предпочтительно на 40% идентична,более предпочтительно на 50% идентична, еще более предпочтительно на 60% идентична, еще более предпочтительно на 70% идентична, еще более предпочтительно на 80% идентична или еще более предпочтительно на 90% идентична аминокислотной последовательности РrnА,РrnС, пиолутеорингалогеназ PltA, pltD и pltMAmycolatopsis orientalis или балгимицинредуктазы bha A Amycolatopsis mediterranei. Одним из предпочтительных вариантов осуществления является клетка-хозяин, экспрессирующая гетерологичную нуклеиновую кислоту, практически аналогичную нуклеиновой кислоте трансферазы электронов по изобретению, и экспрессирующая гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая кодирует специфичную для определенной области галогеназу по изобретению. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления клетка-хозяин представляет собой бактериальную, грибную или растительную клетку. Одним из предпочтительных вариантов осуществления является клетка-хозяин, экспрессирующая молекулу гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую prnA, prnB,prnC, prnD и fre. Еще одним предпочтительным вариантом осуществления является способ получения пирролнитрина путем выращивания клеткихозяина, которая может представлять собой растительную клетку, экспрессирующей гетерологичные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют prnA, prnB, prnC, prnD и fre. Одним из предпочтительных вариантов осуществления является растение, содержащее клетку-хозяина, которая экспрессирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, практически аналогичную нуклеиновой кислоте трансферазы электронов по изобретению, и которая экспрессирует гетерологичную нуклеиновую кислоту,кодирующие специфичную для определенной области галогеназу по изобретению. И еще одним предпочтительным вариантом осуществления является растение, экспрессирующее гетерологичные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют prnA, prnB, 004942prnC, prnD и трансферазу электронов по изобретению. Краткое описание перечня последовательностейSEQ ID NO: 1 обозначает консервативный аминокислотный мотив, присутствующий в специфичных для определенной области галогеназах по изобретению.SEQ ID NO: 3 обозначает аминокислотную последовательность PrnA Р. fluorescens.SEQ ID NO: 5 обозначает аминокислотную последовательность PrnC P. fluorescens.SEQ ID NO: 7 обозначает аминокислотную последовательность PltA P. fluorescens.SEQ ID NO: 9 обозначает аминокислотную последовательность ltdD P. fluorescens.SEQ ID NO: 11 обозначает аминокислотную последовательность PltM P. fluorescens.SEQ ID NO: 13 обозначает аминокислотную последовательность гидролазы А из A. orientalis.SEQ ID NO: 15 обозначает аминокислотную последовательность cts4 S. aureofaciens.SEQ ID NO: 17 обозначает аминокислотную последовательность bhаА A. mediterranei.SEQ ID NO: 19 обозначает аминокислотную последовательность Fre E. coli.SEQ ID NO:21 обозначаете аминокислотную последовательность НАДН-цитохром b5 редуктазу крысы.SEQ ID NO: 23 обозначает аминокислотную последовательность НАДФН-цитохром р 450-редуктазу кролика.SEQ ID NO: 25 обозначает аминокислотную последовательность ферродоксина S. oleracea.SEQ ID NO: 27 обозначает аминокислотную последовательность НАДФН-ФМН V. fischeri.SEQ ID NO: 29 обозначает аминокислотную последовательность ферредоксин-НАДФредуктазы S. oleracea.SEQ ID NO: 31 обозначает аминокислотную последовательность нитратредуктазы A.SEQ ID NO: 32 обозначает праймер для флавинредуктазы E.coli.SEQ ID NO: 33 обозначает праймер для флавинредуктазы E.coli.pNOV524. Получение галогенированных природных продуктов in vitro Согласно настоящему изобретению галогенированные природные продукты можно получать in vitro путем взаимодействия специфичной для определенной области галогеназы с субстратом в присутствии донора галогена,окислителя, восстановителя и трансферазы электронов по изобретению. Специфичная для определенной области галогеназа по изобретению представляет собой галогеназу, которая обладает способностью взаимодействовать с галогенидом, окислителем и восстановительной системой, катализируя замену одной или нескольких связей углеродводород на одну или несколько связей углеродгалоген в процессе реакции биологического галогенирования, и является специфичной для субстрата и/или определенной области. Понятие 10 Предпочтительными специфичными для определенной области галогеназами по изобретению являются галогеназы, которые включают приведенный ниже консервативный мотив и катализируют замену по меньшей мере одной связи углерод-водород на по меньшей мере одну связь углерод-галоген в определенной области.xl-W-x2-W-x3-I-P-x4 (SEQ ID NO: 1),где X1 обозначает G или Т; Х 2 обозначает V, L, T, F или М; Х 3 любой аминокислотный остаток; Х 4 обозначает I, F, M или L. Согласно предпочтительному варианту осуществления галогеназы по изобретению представляют собой триптофангалогеназы. Триптофангалогеназы по изобретению включают PrnA (SEQ ID NO:3 (см. протеин, имеющий регистрационный номер ААВ 97504; HammerFEMS Microbiol Lett, N l;180(l):39-44, 1999) и специфичные для определенной области галогеназы, идентичные на 90, 80, 70, 60, 50 или 40% последовательности, представленной в SEQ IDNO:3). Процент идентичности аминокислотных последовательностей в контексте настоящего описания определяют с помощью пpoгpaммBASTP, версия 2.09, которую можно получить на сайтеgorf/bl2.html, где задаваемыми параметрами являются: матрица баллов blosum62, в которой штраф за появление бреши равен 7, а штраф за расширение бреши равен 2 и наклон х- равен 50 и математическое ожидание равно 10,00, при этом размер слова равен 3. Согласно другому предпочительному варианту осуществления специфичные для определенной области галогеназы по изобретению включают монохлораминопирролнитрингалогеназы. Монохлораминопирролнитрингалогеназы включают PrnC (SEQ ID NO: 5), соответствующие протеину с регистрационным номером ААВ 97506, и специфичную для определенной области галогеназу, предпочтительно идентичную ему на 90, 80, 70, 60, 50 или 40%. Особенно предпочтительным вариантом осуществления являются специфичные для определенной области галогеназы по изобретению, любая из которых по меньшей мере на 30% идентична, предпочтительно на 40% идентична, более предпочтительно на 50% идентична, еще более предпочтительно на 60% идентична, еще более предпочтительно на 70% идентична, еще более предпочтительно на 80% идентична, еще более предпочтительно на 90% идентична, еще более предпочтительно на 95% идентична или еще более предпочтительно на 99% идентична аминокислотной последовательности любой из из таких галогеназ, как PrnA (SEQ ID Трансфераза электронов по изобретению может представлять собой трансферазу электронов, которая обладает способностью переносить электроны с НАДН или НАДФН или ферредоксина или другого восстановителя на ФАД или ФМН, или трансферазу электронов, которая обладает способностью переносить электроны с НАДН или НАДФН или ферредоксина или другого восстановителя на галогеназу с помощью НАД(Ф)Н-зависимой оксидоредуктазы или оксидоредуктазы с другими донорами электронов, такими как система фотосинтеза хлоропласта, лактат, ксантин и др. Трансферазы электронов можно охарактеризовать как избирательные трансферазы электронов, при использовании которых перенос электронов можно определять, оценивая окисление НАДН или НАДФН или ферредоксина по характерному изменению абсорбции, связанной с окислением восстановителя. Это изменение (или увеличение скорости изменения) зависит от присутствия ФАД или ФМН. Окисление НАДН и НАДФН можно определять, осуществляя мониторинг при 340 нм; окисление приводит к уменьшению абсорбции. Окисление ферредоксина можно определять, осуществляя мониторинг при 420 нм; окисление приводит к увеличению абсорбции. Перенос электронов можно также определять, оценивая окисление НАДН или НАДФН по характерному снижению флуоресценции при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания 380 нм. Это снижение флуоресценции зависит от присутствия ФАД или ФМН. Трансферазы электронов можно также охарактеризовать как избирательные трансферазы электронов, при использовании которых пе 004942 12 ренос электронов на специфичную для определенной области галогеназу по изобретению от НАДН или НАДФН можно определять путем смешения трансферазы электронов с 50 микромолярным раствором НАДН или 50 микромолярным раствором НАДФН с использованием 50 микромолярного раствора галогеназы или без него (галогеназа должна находиться в голоферментном состоянии, т.е. она должна быть уже связана со всеми необходимыми кофакторами,такими как ФАД) и оценки увеличения скорости окисления НАДН или НАДФН, зависящей от галогеназы; окисление оценивают по уменьшению абсорбции при 340 нм или уменьшению флуоресценции, как описано выше. Трансферазы электронов по изобретению можно охарактеризовать как избирательные трансферазы электронов, при использовании которых перенос электронов на галогеназу по изобретению от ферредоксина можно определять путем смешения трансферазы электронов с 50 микромолярным раствором восстановленного ферредоксина с использованием 50 микромолярного раствора галогеназы или без него (галогеназа должна находиться голоферментном состоянии, т.е. она должна быть уже связана со всеми необходимыми кофакторами, такими как ФАД) и оценки увеличения скорости окисления,зависящей от галогеназы; окисление ферредоксина оценивают по увеличению абсорбции при 340 нм. Согласно предпочтительному варианту осуществления трансфераза электронов по меньшей мере на 30% идентична, предпочтительно на 40% идентична, более предпочтительно на 50% идентична, еще более предпочтительно на 60% идентична, еще более предпочтительно на 70% идентична, еще более предпочтительно на 80% идентична, еще более предпочтительно на 90% идентична аминокислотной последовательности любой из приведенных ниже трансфераз, таких как: флафинредуктаза Е. coli,включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 (описана Fieschi F., Nivierebacteria: Photorhabdus luminescens. Vibrio fischeri. Vibrio harveyi. and Vibrio orientalis."J Bacteriol (1994, июнь);176(12):3544-3551). Трансферазы электронов по изобретению можно применять в виде экстракта или в очищенной форме. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления трансфераза электронов по изобретению по меньшей мере на 30% идентична, предпочтительно на 40% идентична,более предпочтительно на 50% идентична, еще более предпочтительно на 60% идентична или еще более предпочтительно на 70% идентична,еще более предпочтительно на 80% идентична или еще более предпочтительно на 90% идентична любой из последовательностей SEQ IDNO: 21, 23, 25, 27, 29 или 31 и дает позитивную реакцию на трансферазу электронов с использованием любого из описанных выше тестов. Выбор восстановителя, такого как пиридиновый нуклеотид, например, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид или восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат или восстановленный ферредоксин, зависит от выбора трансферазы электронов по изобретению, в целом, все трансферазы электронов по изобретению обладают более высокой каталитической активностью в присутствии либо одного, либо другого пиридинового нуклеотида; но, как правило, также обладают некоторой активностью в присутствии другого пиридинового нуклеотида. Так, при необходимости в других вариантах для реакций галогенирования с определенными трансферазами электронов можно применять пиридиновый нуклеотид, который не является предпочтительным. Предпочтительными пиридиновыми нуклеотидами для различных трансфераз электронов являются следующие: НАДФН является предпочтительным пиридиновым нуклеотидом для НАДФН-цитохром Р 450-редуктазы и ферредоксин-НАДФ-редуктазы. НАДН является предпочтительным пиридиновым нуклеотидом для флафинредуктазы Е. coli, НАДН-цитохром-b5 редуктазы, нитратредуктазы и диафоразосульфгидрилредуктазы. Ферредоксин-НАДФ-редуктазу можно также применять с восстановленным ферредоксином, который можно получать путем освещения растений, из выделенных хлоропластов или фотосистемы I, содержащей фрагмены хлоропластов. Ферредоксин может так быть восстановлен зависящими от ферредоксина дегидрогеназами, такими как пируват:ферредоксиноксиредуктаза (Horner D.S., Hirt R.P., EmbleyMol Biol Evol (1999, сентябрь); 16(9): 12801291). Согласно предпочтительному варианту осуществления для повышения эффективности реакции в реакцию in vitro можно включать ФАД. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления в реакцию включают ФАД, а специфичная для определенной области галогеназа представляет собой РrnА. Согласно другому варианту осуществления для проведения реакции галогеназу, представляющую собой очищенную специфичную для определенной области галогеназу по настоящему изобретению, объединяют с субстратом, представляющим собой ион галогена, такой как Сl-, и с донором активного кислорода, таким как Н 2 О 2, KIO4, йодсобензол, йодсобензоат,трет-бутилгидроперекись,бензоилпероксид,кумолгидроперекись, дикумилпероксид, пероксиуксусная кислота или родственные соединения. Доноры активного кислорода не нуждаются в поставке О 2 и восстановителя. Выбор субстрата по изобретению должен зависеть от выбранной специфичной для определенной области галогеназы по изобретению. Субстраты по изобретению могут включать триптофан, индол, аминофенилпиррол и их производные и тетрациклин, субстраты дляbhaA включают все балгимициновые субстраты из классов B1-1, B1-2, B2-1, В 2-2 и В 3 (описанные у Pelzer S., Sussmuth R., Heckmann D ,Recktenwald J., Huber P., Jung G., Wohlleben W.,Identification and analysis of the balhimycin biosynthetic gene cluster and its use for manipulatingmediterranei DSM5908. Antimicrob Agents Chemother 43:1565-1573, 1999). Донор галогена, который можно применять согласно изобретению, может применяться в реакции в виде соли неорганического или органического катиона или их соответствующих кислот. Донор галогена по изобретению может представлять собой ион F-, Cl-, Вr- или I-. Реакции по изобретению можно осуществлять в буфере, значение рН которого составляет 4-10, при температуре от 0 до 65 С. Донор галогена можно добавлять в виде соли, например хлоридов, таких как LiCl, NaCl, KCl, CsCl,MgCl, СаСl2 и NH4Cl. Время реакции находится в диапазоне от 1 мин до 48 ч. Оптимальными условиями являются: рН 7,5, температура 30 С, время реакции 12 ч. Эффективность катализа реакций галогенирования in vitro можно повышать путем ковалентного сочетания трансферазы электронов с галогеназой, что позволяет осуществлять транспорт электронов с восстановителя на галогеназу согласно процессу первого порядка, а не процессу второго порядка (в зависимости от концентрации галогеназы). Аналогичный результат 15 можно получать путем создания с помощью генной инженерии слитого протеина, который содержит и трансферазу электронов и специфичную для определенной области галогеназу по изобретению, путем слияния их кодирующих областей в рамке считывания. Слияния можно осуществлять с добавлением встраиваемой последовательности кодирующей короткую пептидную последовательность, которая разделяет домены протеинов трансферазы электронов и галогеназы, или без этой последовательности. Слитые протеины можно получать в любой из двух ориентации: (1) N-конец-трансфераза электронов-(необязательно линкер)-галогеназа-Сконец; (2) N-конец-галогеназа-(необязательно линкер)-трансфераза электронов-С-конец. Согласно другому варианту осуществления протеиновые компоненты системы, включающей специфичную для определенной области галогеназу и трансферазу электронов, можно иммобилизировать согласно описанной ниже методике, и давать им возможность взаимодействовать с субстратом с получением продуктов. Галогеназу и трансферазу электронов можно использовать в виде индивидуальных ферментов, которые подвергают совместной иммобилизации, или в виде слитого протеина, в котором кодирующие последовательности двух компонентов слиты с образованием одного протеина, обладающего активностями трансферазы электронов и галогеназы. Дополнительный фермент и соответствующий вторичный восстановитель можно включать в систему для регенерации НАДН или НАДФН; примеры таких пар фермент - вторичный восстановитель включают: алкогольдегидрогеназу и этанол; глюкозо 6-фосфатдегидрогеназу и глюкозо-6-фосфат,альдегиддегидрогеназу и ацетальдегид, липоамиддегидрогеназу и восстановленный тиол, такой как липоамид, дитиотреитол или меркаптосульфоновая кислота. Согласно этому варианту осуществления ферменты (которые могут включать ферменты системы регенерации НАДН или НАДФН, если такая система используется) можно иммобилизировать с помощью любого из нескольких известных методов. Их примеры включают: (1) внесение фермента внутрь контейнера с полупроницаемой мембраной (мембрана для диализа), которая позволяет проникать субстратам и нуклеотидам, но не ферментам; (2) ковалентное связывание ферментов с нерастворимым матриксом; (3) связывание ферментов с матриксом через антитела к ферментам или антитела к антигенам, слитым с ферментами; (4) связывание ферментов с матриксом через биотин и биотинсвязывающий домен, такой как авидин; (5) полимеризацию матрикса (такого как метилакрилатный полимер) вокруг ферментов. Иммобилизованные ферменты затем можно обрабатывать буфером, содержащим восста 004942 16 новитель, вторичный восстановитель (если используется система регенерации НАД(Ф)Н),субстрат и соль галогенида. Для облегчения солюбилизации субстратов можно включать органические растворители. Типичные условия реакции включают: значение рН от 4 до 10, температура от 0 до 65 С. После получения достаточного количества галогенированного продукта галогенированные природные продукты удаляют из реакционной смеси. Получение галогенированных природных продуктов в гетерологичных хозяевах Гетерологичные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие трансферазы электронов по изобретению можно экспрессировать в бактериях- или грибах-хозяевах, которые могут осуществлять галогенирование природных продуктов с более высокой эффективностью по сравнению с нативными хозяевами. Например,для повышения производства природного продукта гетерологичные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие трансферазу электронов по изобретению, можно экспрессировать в продуцентах пирролнитрина, таких как PseudomonasPseudomonas fluorescens, в организмах, продуцирующих антибиотики из класса ванкомицина,таких как различные виды Amycolatopsis, например, A. orietalis и A. mediterranei, в продуценте хлортетрациклина, таком как Streptomycesaureofaciens, и других продуцирующих антибиотики видах Streptomyces. Кроме того, гетерологичные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие специфичные для определенной области галогеназы и трансферазы электронов можно совместно экспрессировать в бактериях- или грибах-хозяевах,которые могут осуществлять галогенирование природных продуктов с более высокой эффективностью по сравнению с нативными хозяевами. В некоторых случаях для синтеза галогенированных природных продуктов по изобретению требуется только одна стадия биосинтеза,т.е. стадия галогенирования, и следовательно,должны экспрессироваться только гетерологичные молекулы нуклеиновых кислот, которые включают кодирующие последовательности галогеназы и трансферазы электронов по изобретению. В других случаях путь биосинтеза галогенированного природного продукта включает одну или несколько стадий галогенирования. В этом случае необходимо экспрессировать несколько гетерологичных молекул нуклеиновых кислот. Понятие "гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты" в контексте настоящего описания обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, не связанную в естественных условиях с клеткой-хозяином, в которую ее интродуцируют, включая генетические конструкции, не 17 встречающиеся в естественных условиях множественные копии встречающейся в естественных условиях молекулы нуклеиновой кислоты; а также гомологичную молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с не встречающейся в естественных условиях молекулой нуклеиновой кислоты. В наиболее широком смысле понятие"практические аналогичная", если в контексте настоящего описания оно используется в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, обозначает, что молекула нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидной последовательности, с которой проводится сравнение, причем соответствующая молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий практически такие же строение и функцию, что и полипептид,кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение, например, если в нем имеют место только замены аминокислот, которые не влияют на функцию полипептида. Предпочтительно практически аналогичная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение. Специально следует отметить, что понятие "практически аналогичная" включает молекулы нуклеиновой кислоты, последовательность которых модифицирована с целью оптимизации экспрессии в конкретных клетках. Желательно, чтобы практически аналогичная молекула нуклеиновой кислоты была по меньшей мере на 30% идентична нуклеотидной последовательности, с которой проводится сравнение, предпочтительно по меньшей мере на 45%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 99%. Сравнения последовательностей проводят,используя алгоритм Смита-Ватермана сравнительного анализа структуры последовательности (см., например, Waterman M.S. Introductionlocals, версия 1.16, со следующими параметрами: совпадение: 1, штраф за несовпадение: 0,33,штраф за открытие бреши: 2, штраф за расширение бреши: 2. Молекула нуклеиновой кислоты, котораяNaPO4, 1 мМ ЭДТК при 50 С с отмывкой двукратным SSC (2xSSC), 0,1%-ным ДСН при 50 С, 004942 18 предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТК при 50 С с отмывкой 1xSSC, 0,1%-ным ДСН при 50 С, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТК при 50 С с отмывкой 0,5xSSC, 0,1%-ным ДСН при 50 С, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5 МNaPO4, 1 мМ ЭДТК при 50 С с отмывкой 0,1xSSC, 0,1%-ным ДСН при 50 С, и еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТК при 50 С с отмывкой 0,1xSSC, 0,1%-ным ДСН при 65 С. Полинуклеотиды по изобретению, которые гибридизуются в указанных выше условиях,предпочтительно включают по меньшей мере 80 пар оснований, более предпочтительно по меньшей мере 50 пар оснований и особенно предпочтительно по меньшей мере 21 пару оснований и наиболее предпочтительно 18 пар оснований. Методы осуществления таких генетических манипуляций известны в данной области, и они являются специфическими в отношении различных пригодных хозяев. Например, для экспрессии гетерологичных генов в Е. coli могут использоваться экспрессионные векторы рKK223, встроенные в виде транскрипционного или трансляционного слияния под контролем промотора tac. Для экспрессии оперонов, кодирующих множественные открытые рамки считывания ("ОРС"), наиболее простой метод представляет собой встраивание оперона в виде транскрипционного слияния в такой вектор, как рKK223, что позволяет использовать родственный сайт связывания рибосомы гетерологичных генов. В данной области также известны методы осуществления сверхэкспрессии в грамположительных видах, таких как Bacillus, и их можно использовать в контексте настоящего изобретения (Quax и др. в: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz и др.(ред-ры), American Society for Microbiology,Washington (1993. Альтернативные системы для обеспечения сверхэкспрессии основаны на применении дрожжевых векторов, и они включают использование Pichia, Saccharomyces и(1990. Некоторые из этих галогенированных природных продуктов могут обладать эффективностью в отношении ингибирования роста микроорганизмов, прежде всего фитопатогенных микроорганизмов. Галогенированные природные продукты можно получать с использованием организмов, в которых происходит сверхэкспрессия галогеназы и/или трансферазы электро 19 нов, и организмы, которые можно применять для этой цели, включают грамотрицательные и грамположительные бактерии и дрожжи, а также растения, что более подробно описано ниже. Для целей получения галогенированных природных продуктов основными критериями выбора организма-хозяина является легкость манипуляций с ним, быстрый рост (т.е. ферментация в случае микроорганизмов) и отсутствие чувствительности к галогенированному природному продукту, который требуется сверхпродуцировать. Эти методы получения галогенированных природных продуктов имеют значительные преимущества по сравнению с методами химического синтеза, обычно применяемыми для получения галогенированных природных продуктов. Применение представленных в настоящем описании способов должно повысить эффективность получения и выход галогенированных природных продуктов при использовании ферментации и их можно применять для введения новых атомов галогенов в положения,в которых они не присутствовали в природном продукте, что трудно достичь методами синтеза. Одним из преимуществ по сравнению с химическим синтезом является удешевление стоимости производства и возможность синтезировать соединения, отличающиеся предпочтительным специфичным для определенной области галогенированием. Включение трансферазы электронов может повышать эффективность реакции и выход галогенированных продуктов. Кроме того, новые галогенированные продукты можно получать путем введения галогена в известные природные продукты либо с помощью встречающихся в естественных условиях галогеназ с использованием требуемого субстрата и специфичности в отношении определенной области, либо с помощью сконструированных галогеназ с использованием нового субстрата и специфичности в отношении определенной области. Может оказаться очень трудным использовать химические методы для галогенирования многих природных продуктов, например, макролидов, поликетидов и нерибосомных пептидов, отличающихся специфичностью в отношении определенной области и энантиомерной специфичностью. Условия, необходимые для галогенирования арильных и алкильных фрагментов, как правило, приводят к другим изменениям в структуре природного продукта. Галогеназы могут также приводить к получению энантиомерно чистых продуктов (в случае галогенирования прохирального атома углерода) в противоположность рацемическим смесям, которые обычно получают с помощью органического синтеза. Способность продуцировать соединения, отличающиеся соответствующим стереохимическим строением, особенно важно для молекул, несущих несколько хирально активных атомов углерода. Галогенированные природные продукты, продуцируемые 20 гетерологичными хозяевами, могут найти широкое применение, включая медицину (т.е. для борьбы с патогенами и/или инфекционным заболеванием), а также сельское хозяйство. Если для получения галогенированного продукта требуется более одного фермента, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза представляющего интерес галогенированного продукта, можно экспрессировать в одном организме. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления все необходимые нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты, требуемые для природного продукта, должны быть интегрированы в хромосому организма в виде одного оперона и находиться под контролем приемлемого регуляторного элемента. Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления нуклеотидные последовательности могут быть включены в плазмиду с селектируемым маркером. Другой альтернативный предпочтительный вариант осуществления включает экспрессию требуемых нуклеотидных последовательностей в двух или большем количестве совместимых плазмид, или требуемые нуклеотидные последовательности могут быть распределены между хромосомой и одной или несколькими совместимыми плазмидами. Экспрессию молекул нуклеиновой кислоты можно контролировать с помощью нативных регуляторных элементов нуклеотидных последовательностей пути биосинтеза, кодирующих природный продукт, или с помощью промоторов, выбранных для более точного контроля экспрессии нуклеотидных последовательностей пути биосинтеза. Оптимально включать нуклеотидные последовательности трансферазы электронов в оперон вместе с нуклеотидными последовательностями специфичной для определенной области галогеназы (или галогеназ) по изобретению. В альтернативном варианте последовательности трансферазы электронов можно экспрессировать отдельно. Другой способ по изобретению создания галогенированных продуктов предусматривает распределение участвующих в биосинтезе молекул нуклеиновой кислоты между двумя или большим количеством отдельных организмов. Организмы можно выращивать по отдельности и промежуточные продукты биосинтеза, продуцируемые одной культурой, переносить в другую культуру, в которой происходит экспрессия продуктов следующих стадий пути биосинтеза. В альтернативном варианте организмы можно совместно культивировать с промежуточными продуктами, которые при необходимости можно переносить из одного в другой. При любом из указанных подходов каждая галогеназа нуждается в совместной экспрессии с приемлемой трансферазой электронов в одном и том же организме и в одной и той же субклеточной области. 21 Новые галогенированные продукты можно получать интродукцией галогеназы в организм,который уже экспрессирует гены, необходимые для производства представляющей интерес негалогенированной структуры. Галогеназу можно конструировать так, чтобы она обладала специфичностью в отношении определенного сайта в полной структуре, или чтобы она обладала специфичностью в отношении компонента структуры, который далее должен быть включен в конечную структуру в нативном организме. Например, галогеназу можно конструировать с целью специфического галогенирования аминокислоты, которую затем включают в содержащий пептид антибиотик. Образовавшийся продукт после этого может нести новые связанные с галогеном модификации в положениях, которые отсутствовали в природном продукте. В любой из описанных выше систем значительные преимущества с точки зрения эффективности галогенирования можно получить путем слияния нуклеотидных последовательностей, кодирующих трансферазу электронов и специфичную для определенной области галогеназу, с получением слитого протеина, обладающего обеими функциональными активностями; такой слитый протеин может обладать более высокой эффективностью в отношении переноса электронов от восстановителя к галогеназе. Нуклеотидные последовательности трансферазы электронов можно сливать либо с 5'-, либо с 3'-концом галогеназы. Кодирующую последовательность короткого линкерного пептида (линкер) можно встраивать в слияние, отделяя кодирующие последовательности доменов протеина трансферазы электронов и галогеназы; длина линкера может варьироваться от 1 до 30 аминокислотных остатков. Галогеназу и/или трансферазу электронов по изобретению можно также экспрессировать в гетерологичных бактериальных и грибных хозяевах с получением галогенированных природных продуктов с целью повышения эффективности предназначенных для биологической борьбы штаммов таких бактериальных и грибных хозяев. Все микроорганизмы, которые можно применять для гетерологичной сверхэкспрессии антипатогенных галогенированных природных продуктов, представляют собой микроорганизмы, которые обладают способностью колонизировать растения или ризосферу. Они могут приходить в контакт с фитопатогенными грибами, бактериями и нематодами, ингибируя рост патогена. Они включают грамотрицательные микроорганизмы, такие как Pseudomonas, Enterobacter и Serratia, грамположительный микроорганизм Bacillus и грибыTrichoderma и Gliocladium. Наиболее предпочтительными гетерологичными хозяевами являются Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aurantiaca, Enterobacter cloa 004942cereus, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum и Gliocladium virens. Для экспрессии в гетерологичных предназначенных для биологической борьбы штаммов необходимо выбрать векторы, пригодные для репликации в выбранном хозяине, и соответствующий промотор. Методы экспрессии в грамотрицательных и грамположительных бактериях и грибах хорошо известны в данной области и приведены ниже в описании. Получение галогенированных продуктов в трансгенных растениях Галогеназы и/или трансферазы электронов по изобретению экспрессируют в трансгенных растениях, осуществляя тем самым биосинтез выбранных галогенированных природных продуктов в трансгенных растениях. В некоторых случаях для синтеза галогенированных природных продуктов по изобретению требуется только одна стадия биосинтеза, т.е. стадия галогенирования, и следовательно, должны экспрессироваться только гетерологичные молекулы нуклеиновых кислот, которые включают кодирующие последовательности специфичной для определенной области галогеназы и трансферазы электронов по изобретению. В других случаях путь биосинтеза галогенированного природного продукта включает одну или несколько стадий галогенирования. В этом случае необходимо экспрессировать несколько гетерологичных молекул нуклеиновых кислот. В контексте настоящего описания понятие"растение" относится к любому растению или части растения на любой стадии развития. Оно также включает отводки, культуры клеток или тканей и семена. В контексте настоящего описания понятие "ткань растения" включает (но не ограничиваясь ими) целые растения, клетки растения, органы растений, семена растений, протопласты, каллюс, клетки в культурах и любые группы растительных клеток, организованные в структурные и/или функциональные единицы. Если галогенированный природный продукт обладает антипатогенным свойствами, то получают трансгенные растения с повышенной устойчивостью к фитопатогенным грибам и бактериям. Для экспрессии в трансгенных растениях может потребоваться модификация и оптимизация молекул нуклеиновых кислот, кодирующих галогеназы и/или трансферазы электронов по изобретению и соседние последовательности. Хотя во многих случаях молекулы нуклеиновой кислоты из других организмов могут экспрессироваться с высоким уровнем в растениях без модификации, низкая экспрессия в трансгенных растениях может быть обусловлена тем,что молекулы нуклеиновой кислоты имеют кодоны, которые не являются предпочтительными для растений. В данной области известно, что все организмы обладают конкретными предпоч 23 тениями в отношении наиболее часто встречающегося кодона, и кодоны других организмов можно заменять для того, чтобы соответствовать специфическим предпочтениям растения, с сохранением аминокислотных последовательностей, которые кодируются ими. Кроме того,высокий уровень экспрессии в растениях наиболее легко достигается при использовании кодирующих последовательностей, в которых содержание GC составляет по меньшей мере приблизительно 35% и предпочтительно более 45%. Нуклеотидные последовательности микроорганизмов, имеющие низкое содержание GC, могут плохо экспрессироваться из-за присутствия мотивов АТТТА, которые могут дестабилизировать транскрипты, и мотивов ААТААА, которые могут вызывать неадекватное полиаденилирование. Помимо этого, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие галогеназы или трансферазы электронов по изобретению, можно отбирать по признаку наличия незаконных сайтов сплайсинга, которые могут приводить к укорачиванию мРНК. Все необходимые изменения в кодирующей последовательности, такие как описанные выше изменения, осуществляют с помощью хорошо известных методов сайтнаправленного мутагенеза, ПЦР и конструирования синтетических генов с помощью методов,описанных в опубликованных заявках на патент ЕР 0385962, ЕР 0359472 и WO 93/07278. Предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты могут представлять собой немодифицированные молекулы, которые экспрессируются с высокими уровнями в трансгенных растенияхмишениях, или в другом варианте молекулы нуклеиновых кислот модифицируют путем удаления дестабилизирующих элементов и несоответствующих мотивов полиаденилирования и незаконных сайтов сплайсинга, а также модифицируют путем включения предпочтительных для растений кодонов и изменения содержанияGC, предпочтительного для экспрессии в растениях. Хотя предпочтительные нуклеотидные последовательности генов могут соответствующим образом экспрессироваться как в однодольных, так и в двудольных видах растений,последовательности можно модифицировать для того, чтобы удовлетворять специфическим предпочтениям однодольных или двудольных растений в отношении кодона и в отношении содержания GC, поскольку, как было установлено, эти предпочтения является различными(1989. Для эффективной инициации трансляции может оказаться необходимым модифицировать последовательности, соседние с сайтом инициации метионина. Последовательности, соседние с выбранными молекулами нуклеиновой кислоты,могут инициировать эффективную трансляцию в растениях или в альтернативном варианте мо 004942 24 гут осуществлять это неэффективно. В случае,когда они не обладают эффективностью в растениях, их можно модифицировать путем включения последовательностей, для которых известно, что они являются эффективными в растениях. Joshi предложил пригодную для растений консенсусную последовательность (NAR 15: 6643-6653 (1987); SEQ ID NO: 15), а фирмойClontech предложен дополнительный консенсусный инициатор трансляции(каталог 1993/1994 г., стр. 210; SEQ ID NO: 16). Эти консенсусные последовательности можно применять с молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению. Эти последовательности включают в конструкции, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, до ATG включительно(оставляя при этом немодифицированной вторую аминокислоту выбранной молекулы нуклеиновой кислоты), или в альтернативном варианте до следующего за ATG кодона GTC включительно (в этом случае допускается возможность модификации второй аминокислоты трансгена). В трансгенных растениях экспрессия молекул нуклеиновых кислот, кодирующих гелогеназы или трансферазы электронов по изобретению, находится под контролем промотора,для которого установлена способность функционировать в растениях. Выбор промотора может варьироваться в зависимости от временной и пространственной схемы экспрессии, а также в зависимости от видов-мишеней. Когда галогенированные природные продукты по изобретению обладают антипатогенной активностью и защищают растения от листовых патогенов, предпочтительной является экспрессия в листьях; для защиты растений от потогенов колосьев, предпочтительной является экспрессия в соцветиях (например, в колосьях, метелках,стержнях кукурузных початков и т.д.); для защиты растений от корневых патогенов предпочтительной является экспрессия в корнях; для защиты проростков от корневых патогенов предпочтительной является экспрессия в корнях и/или проростках. Однако во многих случаях требуется иметь защиту от более чем одного типа фитопатогенов, поэтому желательно, чтобы экспрессия происходила в нескольких типах ткани. Хотя установлено, что многие промоторы из двудольных растений могут функционировать в однодольных и наоборот, в идеальном варианте для экспрессии в двудольных выбирают промоторы двудольных, и для экспрессии в однодольных выбирают промоторы однодольных. Однако не существует ограничения в отношении источника выбранных промоторов; достаточно, чтобы они были функционально активными в отношении контроля экспрессии молекул нуклеиновой кислоты по изобретению. Предпочтительные промоторы, которые экспрессируются конститутивно, включают промоторы 35S и 19S CaMV и промоторы генов, ко 25 дирующих актин или убикитин. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению также можно экспрессировать под контролем химически регулируемых промоторов. Это позволяет синтезировать галогенированный природный продукт только тогда, когда культурные растения обрабатывают химическими индукторами. Предпочтительный метод химической индукции экспрессии генов подробно описан в опубликованной заявке ЕР 0332104 и в патенте US 5614395(которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Предпочтительным химически индуцируемым промотором является промоторPR-la табака. Предпочтительной категорией промоторов являются индуцируемые ранением промоторы. Описаны многочисленные промоторы, которые обеспечивают экспрессию в местах ранения, а также в местах заражения фитопатогеном. В идеальном варианте такой промотор должен проявлять активность только локально в местах заражения, и в этом случае антипатогенный галогенированный природный продукт накапливается только в тех клетках, в которых его необходимо синтезировать для того, чтобы ограничить рост внедряющегося патогена. Предпочтительные промоторы этого типа включают промоторы, описанные у Stanford и др., Mol. Gen.Plant Cell 1: 151-151 (1989), у Rohrmeier и Lehle,Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), у Firek и др. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993) и у Warner и др. Plant J. 3: 191-201 (1993). Предпочтительные тканеспецифичные схемы экспрессии включают экспрессию, специфичную для зеленой ткани, специфичную для корня, специфичную для стебля и специфичную для цветка. Промоторы, пригодные для экспрессии в зеленой ткани, включают многие промоторы, которые регулируют экспрессию генов,участвующих в фотосинтезе, и многие из них,происходящие как из однодольных, так и из двудольных растений, были клонированы. Предпочтительным промотором является промотор РЕРС гена фосфоенолкарбоксилазы кукурузы (Hudspeth и Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989. Предпочтительным промотором для специфичной для корня экспрессии является промотор, описанный de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991); ЕР 0452269 [1479]), а еще одним предпочтительным специфичным для корня промотором является промотор гена Т-1 по настоящему изобретению. Предпочтительным специфичным для стебля промотором является промотор, описанный в WO 93/07278,который контролирует экспрессию гена trpA кукурузы. В предпочтительных вариантах осуществления трансгенные растения продуцируют галогенированный природный продукт, т.е. пирролнитрин, специфичным для корня образом. Со 004942 26 гласно особенно предпочтительному варианту осуществления гены биосинтеза пирролнитрина экспрессируют под контролем специфичного для корня промотора с целью защиты трансгенных растений от фитопатогена Rhizoctonia. Также предпочтительными являются трансгенные растения, продуцирующие антипатогенные галогенированные природные продукты под контролем промотора, индуцируемого ранением или индуцируемого заражением патогеном. Помимо выбора приемлемого промотора, в конструкциях, предназначенных для экспрессии галогенированного природного продукта в растениях, требуется наличие соответствующего терминатора транскрипции, который должен быть присоединен по ходу транскрипции относительно гетерологичных молекул нуклеиновых кислот галогеназы и/или трансферазы электронов. В данной области известны и могут применяться несколько таких терминаторов (например, tml CaMV, E9 rbcS). Согласно настоящему изобретению можно применять любой терминатор, для которого известно, что он функционирует в растениях. В кассеты экспрессии для молекул нуклеиновых кислот галогеназы и/или трансферазы электронов можно включать многочисленные другие последовательности. Они включают последовательности, для которых установлена способность усиливать экспрессию, такие как интронные последовательности (например, генов Adhl и bronzel) и вирусные лидерные последовательности (например, вируса табачной мозаики (TMV), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) и вируса мозаики люцерны(AMV. Для производства галогенированных природных продуктов в растениях необходимо,чтобы молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая первую стадию в пути биосинтеза галогенированного природного продукта, имела доступ к субстрату этого пути биосинтеза. Для каждого конкретного галогенированного природного продукта и пути биосинтеза этот субстрат, вероятно, должен отличаться, и это связано с его клеточной локализацией в растении. Во многих случаях субстрат может быть локализован в цитозоле, в то время как в других случаях он может быть локализован в какойлибо субклеточной органелле. Поскольку биосинтетическая активность в растении свойственна хлоропласту, часто субстрат может быть локализован в хлоропласте и вследствие этого галогеназы и трансферазы электронов по изобретению наиболее предпочтительно направлять к соответствующей органелле (например,хлоропласту). Субклеточную локализацию кодируемых трансгеном ферментов можно осуществлять с помощью хорошо известных в данной области методов. Как правило, ДНК, кодирующую направляющий пептид известного генного продукта, который осуществляет направленный 27 перенос в определенную органеллу, обрабатывают и сливают против хода транскрипции относительно требуемых молекул нуклеиновой кислоты галогеназы или трансферазы электронов. Для хлоропласта известен целый ряд таких направляющих перенос последовательностей и установлено, что они функционируют в гетерологичных конструкциях. Согласно предпочтительному варианту осуществляют направленный перенос молекул нуклеиновых кислот, необходимых для биосинтеза пиролнитрина, в хлоропласт, поскольку субстрат этого пути биосинтеза триптофан синтезируется хлоропластом. В некоторых случаях сверхэкспрессия нуклеиновых кислот, необходимых для получения галогенированного природного продукта,может снижать доступность клеточного субстрата для конкретного пути биосинтеза, и это может оказывать вредные воздействия на клетку. В подобных ситуациях требуется увеличение количества субстрата, необходимого для сверхэкспрессии молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе субстрата. В случае триптофана (субстрат для биосинтеза пирролнитрина) это можно достигать путем сверхэкспрессии молекул нуклеиновых кислот, кодирующих trpA и trpB. Еще один путь повышения доступности субстрата предусматривает выключение известных путей биосинтеза, для которых используются конкретные субстраты (при условии, что это можно осуществлять без нежелательных побочных воздействий). В этом случае синтезируемый субстрат целенаправленно направляется к пути биосинтеза галогенированного природного продукта, а не других соединений. Векторы, пригодные для трансформации растений, приведены ниже в настоящем описании. Для опосредованной Adrobacterium трансформации можно применять бинарные векторы или векторы, несущие по меньшей мере одну пограничную последовательность Т-ДНК, однако, для прямого переноса пригоден любой вектор и может оказаться предпочтительной линейная ДНК, содержащая только представляющую интерес конструкцию. В случае прямого переноса можно применять трансформацию отдельными видами ДНК или котрансформацию(1986. Как для прямого переноса, так и для опосредуемого Adrobacterium переноса обычно(но не обязательно) применяют трансформацию с использованием селектируемого маркера, который может придавать устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или метатрексату) или гербициду (баста). Однако выбор селектируемого маркера не имеет решающего значения для изобретения. Для синтеза галогенированного природного продукта в трансгенном растении часто требуется одновременная сверхэкпрессия множест 004942 28 ва молекул нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты пути биосинтеза галогенированного природного продукта. Это можно осуществлять путем индивидуальной трансформации отдельными молекулами нуклеиновых кислот, участвующих в биосинтезе галогенированного природного продукта, различных линий растений и последующего скрещивания полученных линий. Отбор и поддержание линий, несущих множество нуклеотидных последовательностей, облегчается использованием в различных трансформирующих конструкциях различных селектируемых маркеров. Линия, в которой накоплены все молекулы нуклеиновых кислот, необходимые для биосинтеза галогенированного природного продукта, могут синтезировать галогенированный природный продукт, а другие линии не могут. Этот подход можно применять для гибридных культур, таких как кукуруза, у которых конечный гибрид обязательно скрещивается с двумя родительскими линиями. Поддержание различных инбредных линий, несущих различные гетерологичные молекулы нуклеиновой кислоты, также может оказаться целесообразным в случаях, когда путь биосинтеза конкретного галогенированного природного продукта может привести к получению целого ряда галогенированных природных продуктов, каждый из которых может найти применение. Путем использования различных линий, несущих различные альтернативные нуклеотидные последовательности, которые необходимы для более поздних стадий пути биосинтеза, для осуществления гибридного скрещивания с линиями, которые несут все остальные требуемые молекулы нуклеиновых кислот, можно создавать различные гибриды, несущие различные выбранные галогенированные природные продукты, которые могут найти различное применение. Альтернативные методы получения линий растений, несущих множество нуклеотидных последовательностей, включают повторную трансформацию существующих линий, которые уже трансформированы молекулой или молекулами нуклеиновой кислоты пути биосинтеза галогенированного природного продукта (и отобраны с использованием различных маркеров), а также применение отдельных трансформирующих векторов, которые несут целый ряд молекул нуклеиновых кислот, участвующих в биосинтезе, каждая из которых находится под контролем соответствующих регуляторных элементов (т.е. промотора, терминатора и т.д.). С учетом простоты конструирования молекул ДНК использование клонирующих векторов для загрузки множеством участвующих в биосинтезе молекул нуклеиновых кислот является предпочтительным методом. Другой предпочтительный метод предусматривает конструирование описанного выше слитого протеина, включающего галогеназу по изобретению и трансферазу электронов по изо 29 бретению, и экспрессию нуклеиновой кислоты,кодирующей такой слитый протеин, в трансгенном растении по изобретению. Молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансферазу электронов, можно сливать либо с 5'-, либо с 3'-концом молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует галогеназу. В слияние необязательно можно включать линкер, отделяющий домены протеинов трансферазы электронов и галогеназы. Согласно предпочтительному варианту осуществления слитый протеин включает линкер (GLy)6. Однако специалисту в данной области должно быть очевидно, что также можно применять линкер другой приемлемой длины и/или состава. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления получение галогенированных природных продуктов в растениях можно осуществлять путем прямой трансформации пластид. Экспрессия в пластидах, в которые гены встраивают путем гомологичной рекомбинации во все несколько тысяч копий кольцевого пластидного генома, присутствующего в каждой растительной клетке, имеет преимущество, состоящее в том, что огромное количество копий,превосходящее количество копий, экспрессируемых генами ядерной ДНК, позволяет обеспечивать уровни экспрессии, которые легко могут превысить 10% от общего растворимого протеина растения. В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидную последовательность встраивают в вектор, обеспечивающий направленный перенос в пластиду, и трансформируют им пластидный геном соответствующего растения-хозяина. Получают растения, гомопластические в отношении пластидных геномов, которые содержат нуклеотидную последовательность и которые предпочтительно обладают способностью осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности с высоким уровнем. Метод трансформации пластид описан подробно в патентах US 5451513, 4545817,5545818 и 5877462, в международных заявках на патент РСТ WO 95/16783 и WO 97/32977 и уMcBride и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7306 (1994), все документы полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Основная методика трансформации пластид включает введение в пригодную тканьмишень участков клонированной пластидной ДНК, фланкирующих селектируемый маркер вместе с нуклеотидой последовательностью,например, с использованием способа биобаллистического переноса или трансформации протопласта (например, трансформации, опосредуемой хлоридом кальция или ПЭГ). Фланкирующие области длиной 1-1,5 т.п.н., называемые последовательностями, обеспечивающими направленный перенос, облегчают гомологичную рекомбинацию с пластидным геномом и, таким образом, позволяют заменять или модифициро 004942 30 вать специфические области пластома. Первоначально в качестве селектируемых маркеров для трансформации использовали точковые мутации в хлоропластных генах 16S-рРНК и rpsl2,которые обусловливают устойчивость к спектиномицину и/или стрептомицину (Svab Z., Hajdukiewicz Р. и Maliga P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990); Staub J.M. и Maliga P.,Plant Cell 4: 39-45 (1992. Присутствие клонирующих сайтов между этими маркерами позволяет создавать вектор для интродукции чужеродных генов, обеспечивающий направленный перенос в пластиду (Staub J.M. и Maliga P.,EMBO J. 12: 601-606 (1993. Существенное увеличение частоты трансформации получают,замещая гены рецессивной рРНК или рпротеина, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, доминантным селектируемым маркером, бактериальным геном aadA, кодирующим спектиномициндетоксицирующий фермент аминогликозид-3'-аденилтрансферазу(Svab Z. и Maliga P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993. В данной области известны другие селектируемые маркеры, пригодные для трансформации пластид, и они подпадают под объем изобретения. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения индуцибельное пластидное производство пирролнитрина достигается путем прямой трансформации хлоропласта с использованием fre, prnA, prnB,prnC и prnD в качестве оперонов под контролем промотора бактериофага Т 7. Индуцибельную экспрессию осуществляют путем скрещивания с растениями, несущими ядерную конструкцию,кодирующую РНК-полимеразу Т 7, сконструированную так, что она несет транзитный пептид хлоропласта и находится под контролем промотора PR1, позволяющего осуществлять индуцируемую ВТН экспрессию. Получение галогенированных природных продуктов с помощью способов по изобретению можно осуществлять в широком разнообразии растительных клеток, включая клетки голосеменных, однодольных и двудольных растений. Хотя ген можно встраивать в любую растительную клетку в этих широких классах, особенно приемлемыми являются клетки культурных растений, которые включают (но не ограничиваясь ими) рис, пшеницу, ячмень, рожь,кукурузу, картофель, морковь, батат, сахарную свеклу, бобы, горох, цикорий, салат, капусту,цветную капусту, брокколи, турнепс, редис,шпинат, спаржу, лук, чеснок, баклажан, перец,сельдерей, морковь, тыкву крупноплодную, тыкву пепо, цуккини, яблоню, грушу, айву, дыню,сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, табак, томаты,сорго и сахарный тростник. Когда аллель(и) для специфичной для определенной области галогеназы и/или траснфе 31 разы электронов по настоящему изобретению получают путем прямого отбора в культурном растении или в культуре клеток растения, из которой культурное растение можно регенерировать, то его(их) интродуцируют в коммерческие сорта с помощью традиционных методов селекции, не используя методы генной инженерии аллеля и трансформации им растения. Примеры Приведенные ниже примеры служат для более детального описания изобретения и способа его воплощения на практике. Они не ограничивают объем изобретения, а только служат в качестве практического руководства. Пример 1. Реакции галогенирования in vitro с использованием РrnА А. Активация РrnА флавинредуктазой Е. coli. Р 2, нитратредуктазойAspergillus и цитохром b5-редуктазой. РrnА очищают с помощью ионообменной хроматографии из штамма Pseudomonas fluorescens BL915ORFl-4 с использованием плазмиды рРЕН 14 (рrnА), описанной у Kirner и др. (Kirner,S. и др., J. Bacteriol, (1998, апрель), 180 (7): 1939-1943). Очищенный фермент обладает очень низкой активностью без добавления Р 2,полученного согласно методу, описанному выше в разделе Предпосылки создания изобретения. Концентрация протеина или препарата составляет 0,36 мг/мл. Готовят смесь для анализа, содержащую буфер HEPES, рН 7,5 (50 мМ), глюкозо-6-фосфатAspergillus niger получают от фирмы Sigma"SOD") получают от фирмы Sigma Chemical Co.Sigma (5 ед./мл), ФАД (7 мкМ). Применяют либо НАДН-зависимую смесь, либо НАДФНзависимую смесь, как указано ниже. НАДНзависимую смесь для анализа приготавливают,добавляя 12 мг НАДН к 4,5 мл описанной выше смеси для анализа. НАДФН-зависимую смесь для анализа готовят, добавляя 3 мг НАДФН к 1 мл описанной выше смеси для анализа. Описанные ниже реакции 1-7, осуществляют в полипропиленовых пробирках в трех повторностях. После смешения РrnА и указанной смеси для анализа и трансферазы электронов образцы встряхивают и затем смешивают путем переворачивания при комнатной температуре. Реакции прекращают через 20,5 ч после их инициации путем кипячения в течение 2 мин,затем образцы подготавливают для ЖХВРанализа путем ультрафильтрации через мембраны типа Microcon (14000 х g, 30 мин). ЖХВРанализ осуществляют согласно методу, обозначенному как PrnAl (описан ниже), инъецируемый объем составляет 50 мкл, данные получают в течение первых 6 мин. 32 Стандарты готовят путем смешения 5 или 10 мкл 7-Сl-Тrр (1 мМ) с достаточным количеством 50 мМ буфера HEPES, рН 7,5, доводя конечный объем до 200 мкл. D-Trp элюируется через 2 min, a 7-Cl-trp элюируется через 4,3 мин, что установлено по элюированию аутентичных D-Trp и 7-Сl-Тrр. Количество 7-Сl-Тrр определяют, сравнивая со стандартной кривой. Изучаемые активности заметно возрастают в присутствии 7-Сl-Тrр после добавления трансферазы электронов. Аналитический ЖХВР-метод PrnAl Определение 7-Сl-Тrр Применяют ЖХВР-систему типа WatersAlliance, снабженную фотодиодной детекторной матрицей. ЖХВР-система типа Waters Alliance включает колонку 4,6 х 50 мм, упакованную С 18-силикагелем, размер частиц 3 мкм. Применяемый метод градиентного элюирования обозначен в настоящем описании как PrnAl. Скорости потока составляют 1 мл/мин и данные об абсорбции получают при длинах волн 210 - 400 нм с разрешением 1,2 нм и частотой дискретизации 1/с. Систему предварительно уравновешивают с использованием смеси вода:метанол(85:15). После инжекции образца колонку в течение 6 мин обрабатывают градиентом от исходных условий до использования смеси вода:метанол 40:60. Затем в промежутке времени от 6,0 до 7,0 мин концентрацию метанола повышают до 100% согласно линейному градиенту. Колонку промывают в течение 1 мин 100%ным метанолом, затем повторно уравновешивают. D-Trp элюируется через 2 мин, а 7-Сl-Тrр элюируется через 4,3 мин, что установлено по элюированию аутентичных D-Trp и 7-Сl-Тrр. 1. Активация РrnА флавинредуктазой Е.Fre), очищают с помощью преципиации сульфатом аммония и последующей гидрофобной хроматографии согласно методу, основанному на использовании протокола Fieschi и др., J. Biol.Chem 270. 30392-30400, 1995, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Очистка флавинредуктазы согласно методу Fieschi предусматривает гомогенизацию бактерий и фракционирование сульфатом аммония. При этом осаждается фермент, обладающий активностью флавинредуктазы. Преципитат собирают центрифугированием, ресуспендируют в 25 мМ Трис/Сl, рН 7,5, 0,5 М КСl,10% глицерин. Затем для завершения процесса используют метод Fontcave и др., J Biol Chem(1987, сентябрь) 5;262(25):12325-12331, который полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки. Концентрация протеина в собранном очищенном образце Fre составляет 21 мкг/мл. Каждая реакционная смесь содержит 20 мкл РrnА, 160 мкл описанной выше смеси НАДН и 20 мкл Fre. Образовавшийся чистый продукт включает 21,461,02 нМ 7-Сl-Тrр. 33 2. Активация РrnА с помощью Р 2. Р 2 представляет собой препарат протеин трансферазы электронов, полученный из Psendomonas fluorescens очисткой ионообменной хроматографией, описанной выше в разделе Предпосылки создания изобретения. Он не обладает PrnA-активностью. Концентрация протеина в образце Р 2 составляет 4,8 мг/мл. Каждая реакционная смесь содержит 20 мкл РrnА, 160 мкл смеси НАДН и 20 мкл Р 2. Образовавшийся чистый продукт включает 12,502,02 нМ 7-СlТrр. 3. Активация РrnА нитратредуктазой шпината. Используют рекомбинантный ФАД-домен нитратредуктазы шпината (далее обозначена какSNIR) (18,6 мкМ). Каждая реакционная смесь содержит 20 мкл РrnА, 160 мкл смеси НАДН и 20 мкл SNIR. Образовавшийся чистый продукт включает 0,0480,73 нМ 7-Сl-Тrр. 4. Активация РrnА нитратредуктазой Aspergillus. Нитратредуктазу Aspergillus sp. (10 ед./мл) получают от фирмы ICN. Каждая реакционная смесь содержит 20 мкл РrnА, 160 мкл смеси НАДН и 20 мкл нитратредуктазы. Образовавшийся чистый продукт включает 1,49 +/-0,18 нМ 7-Сl-Тrр. 5. Активация РrnА крысиной НАДНцитохром-b5-редуктазой. Получают рекомбинантный растворимый домен НАДН-цитохром-b5-редуктазы из печени крыс (11,7 мкМ). Каждая реакционная смесь содержит 20 мкл РrnА, 160 мкл смеси НАДН и 20 мкл цитохром-b5-редуктазы. Образовавшийся чистый продукт содержит 0,310,11 нМ 7 Сl-Тrр. 6. Активация РrnА диафоразсульфгидрилредуктазой. Диафоразсульфгидрилредуктазу(200 ед./мл) получают от фирмы United States Biochemicals. Каждая реакционная смесь содержит 20 мкл РrnА, 160 мкл смеси НАДН и 20 мкл диафоразы. Образовавшийся чистый продукт содержит 2,240,04 нМ 7-Сl-Тrр. 7. Активация РrnА кроличьей НАДФНцитохром Р 450-редуктазой. НАДФН-цитохром Р 450-редуктазу печени кролика (0,069 мг/мл) получают от фирмыSigma Chemical Co. Каждая реакционная смесь содержите 20 мкл РrnА, 160 мкл смеси НАДФН и 20 мкл НАДФН-цитохром Р 450-редуктазы. Образовавшийся чистый продукт включает 3,350,23 нМ 7-Сl-Тrр. Пример 2. Активация РrnА флавинредуктазой Е. coli; ферредоксин-НАДФ-редуктазой шпината, ферредоксин-НАДФ-редуктазой шпината + ферредоксином шпината; и НАД(Ф) Н:ФМН-редуктазой Photobacterium fischeri. В приведенных ниже вариантах 1-4 используют следующие компоненты: РrnА (опи 004942Aspergillus niger (39 ед./мл), супероксиддесмутазу бычьих эритроцитов (15 ед./мл), глюкозо-6 фосфатдегидрогеназу Leuconostoc mesenteroides(10 ед./мл); НАДН (3 мг/мл), НАДФН (3 мг/мл). Каждый анализ проводят в смеси для анализа, содержащей либо НАДН (для образцов,содержащих Fre и НАД(Ф)Н:ФМН-редуктазу),либо НАДФН (для образцов, содержащих FNR и Fd), PrnA и указанную трансферазу электронов. Параллельно инкубируют образцы, представляющие собой отрицательный контроль; они заменяют буфер для РrnА. Стандарты для количественной оценки готовят путем разбавления 0, 1, 2 или 5 мкл стандарта 7-Сl-Тrр (1 мМ в 100 мкл смеси для анализа, 50 мкл НАДН, 20 мкл РrnА и 50 мкл буфера; пробирки нагревают до 100 С перед добавлением РrnА, затем смесь нагревают в течение еще 2 мин. Дальнейшую обработку осуществляют параллельно с ферментативными реакциями. Все образцы перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакции прекращают и образцы обрабатывают согласно методу, описанному выше в примере 1, включая применение аналитического ЖХВР-метода PrnAl, описанного в примере 1. 1. Активность РrnА в присутствии Fre: 100 мкл смеси для анализа, 50 мкл НАДН, 20 мкл РrnА и 50 мкл Fre (0,84 мкг/мл) смешивают, как описано выше. Образовавшийся чистый продукт включает 8,44 нМ 7-Сl-Тrр. 2. Активность РrnА в присутствии ферродоксин НАДФ-редуктазы: 100 мкл смеси для анализа, 50 мкл НАДН, 20 мкл РrnА и 50 мклFNR (4,1 мкМ) смешивают, как описано выше. Образовавшийся чистый продукт включает 4,22 нМ 7-Сl-Тrр. 3. Активность РrnА в присутствии ферродоксин-НАДФ-редуктазы (FNR) и ферродоксина (Fd): 100 мкл смеси для анализа, 50 мкл НАДФН, 20 мкл РrnА и 50 мкл FNR (4,1 мкМ) смешивают, как описано выше. Образовавшийся чистый продукт включает 9,15 нМ 7-Сl-Тrр. 4. Активность РrnА в присутствии НАД(Ф)Н:ФМН-редуктазу Photobacterium fischeri: 100 мкл смеси для анализа, 50 мкл НАДФН, 20 мкл РrnА и 50 мкл НАД(Ф)Н: ФМН-редуктазы, полученной от фирмы Roche(4 ед./мл) смешивают, как описано выше. Образовавшийся чистый продукт включает 0,11 нМ 7-Сl-Тrр. Пример 3. Реакции галогенирования in vitro с использованием РrnС. Оценивают способность Fre, ферродоксинНАДФ-редуктазы, ферродоксина и НАД(Ф)Н: ФМН-редуктазы активировать PrnC P. fluorescens, пониженную за счет удаления эндогенной 35 трансферазы электронов (Р 2), как описано ниже. РrnС катализирует хлорирование монодехлораминопирролнитрина (MDA) с образованием аминопирролнитрина (APRN). Для проведения описанного ниже анализа применяют следующие продукты. Буфер 100 мМ Трис/С 1, 1 мМ ЭДТК, рН 7,5. Монодехлораминопирролнитрин (MDA), 74,2 мМ, получают с использованием культуры Pseudomonas fluorescens, экспрессирующей РrnА и РrnВ согласно методу, описанному у (Kirner и др., 1998), публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Смесь для анализа включает ФАД (5 мкМ) и MDA (742 мкМ) в буфере. НАДН растворяют в буфере в концентрации 6 мг/мл или НАДФН растворяют в буфере в концентрации 6 мг/мл. Экстракт N1 представляет собой неочищенный экстракт в буфере,содержащий РrnС и эндогенную трансферазу электронов Р 2, описанную выше в примере 1. РrnС экспрессируется в бактериях P. fluorescens(штамм pPEH/prnC /134prn), которые несут делецию одного хромосомального оперона рrn,но включают нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 4), кодирующую РrnС под контролем промотора tac в плазмиде pPEH-PrnC(Kirner et al, 1998). В этой системе промотор tac обеспечивает конститутивную экспрессию РrnС. Экстракт N2, РrnС в экстракте N1, очищают смешением экстракта N1 с анионобменной смолой и последующим удалением смолы центрифугированием для снижения активности РrnС P.fluorescens за счет удаления активности Р 2, используя 100 мМ Трис/Сl-буфер. Описанные ниже анализы осуществляют следующим образом: экстракт N2 смешивают с указанной трансферазой электронов, смесью для анализа и либо с НАДН, либо с НАДФН, как указано. Нативную активность РrnС предварительно до удаления с помощью Р 2-активности определяют с использованием параллельного образца, в котором экстракт N1 смешан со смесью для анализа и НАДФН. Все образцы перемешивают переворачиванием в течение ночи,затем реакции прекращают, добавляя 10 мкл(1 мл), 0,6 мл растворимого в органических растворителях слоя переносят в другую пробирку и растворитель удаляют вакуумным центрифугированием. Остаток повторно растворяют в 200 мкл смеси 60/40 H2O/CH3CN + 100 мкл CH3CN. Образцы фильтруют через найлоновые фильтры с размером пор 0,2 мкм для удаления осадившегося продукта. Образцы анализируют с помощью описанного ниже метода, обозначенного как PrnCIso. Анализируют и обобщают хроматографические данные по абсорбции при 220 нм. Активность РrnС выражают в виде отношения площади пика APRN к сумме площадейAPRN и MDA, умноженному на 100. Предполагается, что рассчитанное соотношение коэффи 004942 36 циентов экстинкции при 220 нм эквивалентно чистому превращению (в % ) MDA в APRN путем галогенирования. Аналитический ЖХВР-метод PrnCIso. Применяют ЖХВР-систему типа WatersAlliance, снабженную фотодиодной детекторной матрицей и колонкой 4,6 х 50 мм, упакованной С 18-силикагелем, размер частиц 3 мкм. Применяемый ЖХВР-метод представляет собой изократическое элюирование при скорости потока 1,5 мл/мин с использованием в качестве растворителя смеси вода:ацетонитрин (58:42). Данные об абсорбции получают при длинах волн 210 400 нм с разрешением 2,4 нм и частотой дискретизации 5/с. Систему предварительно до инжекции уравновешивают в течение минимум 6 мин. Для инжекции используют объем 50 мкл, данные получают в течение 6 мин с последующим дополнительным 6-минутным изократическим элюированием до инъекции следующего образца. При использовании этого метода MDA элюируется через 2, 16 мин, аминопирролнитрин (APRN) элюируется через 3,05 мин. Концентрации протеинов определяют согласно ВСА-методу с использованием стандартных методик, описанных поставщиком (фирмаcoli. 50 мкл экстракта N2 смешивают с 20 мкл флавинредуктазы Е. coli (21 мкг/мл), 100 мкл смеси для анализа и 50 мкл НАДН; перемешивание продолжают в течение ночи с последующим анализом продукта согласно описанному выше методу. Полученные данные об активности свидетельствуют о превращении 51,8%MDA в APRN. 2. Активность РrnС в присутствии ферродоксин-НАДФ-редуктазы шпината: 50 мкл экстракта N2 смешивают с 20 мкл ферродоксинНАДФ-редуктазы шпината (20,7 мкМ), 100 мкл смеси для анализа и 50 мкл НАДН; перемешивание продолжают в течение ночи с последующим анализом продукта согласно описанному выше методу. Полученные данные об активности свидетельствуют о превращении 1,8% MDA в APRN. 3. 3. Активность РrnС в присутствии ферродоксин-НАДФ-редуктазы шпината и ферродоксина шпината: 50 мкл экстракта N2 смешивают с 20 мкл ферродоксин-НАДФ-редуктазы шпината (20,7 мкМ) и ферредоксином шпитана (Fd)(35 мкМ), 100 мкл смеси для анализа и 50 мкл НАДН; перемешивание продолжают в течение ночи с последующим анализом продукта согласно описанному выше методу. Полученные данные об активности свидетельствуют о превращении 2,5% 4. Активность РrnС в присутствии НАД(Ф) Н:ФМН-редуктазы: 50 мкл экстракта N2 смешивают с 20 мкл НАД(Ф)Н:ФМН-редуктазы си для анализа и 50 мкл НАДН; перемешивание продолжают в течение ночи с последующим анализом продукта согласно описанному выше методу. Полученные данные об активности свидетельствуют о превращении 4,0% MDA в(50 мкл) смешивают со смесью для анализа (100 мкл), и НАДН (50 мкл); перемешивание продолжают в течение ночи с последующим анализом продукта согласно описанному выше методу. Полученные данные об активности свидетельствуют о превращении 7,8% MDA в APRN. Пример 4. Галогенирование в Е. coli. А. Клонирование нуклеиновой кислоты,кодирующей флавинредуктазу Е. coli. Нуклеотидную последовательность, кодирующую флавинредуктазу Е. coli (далее обозначена "fre") получают с помощью ПЦРрепликации в штамме E.coli XL-1 Blue (фирма(SEQ ID NO: 33). Затем молекулу нуклеиновой кислоты клонируют в Торо (фирма Invitrogen),трансформируют ей штамм Е. coli XL-1 Blue(фирма Stratagene) и трансформанты отбирают,высевая в твердую LB-среду (бульон Лурия),дополненную ампициллином. Отбирают несколько колоний и анализируют посредством секвенирования ДНК для подтверждения их идентичности. С помощью указанной методики обнаружена одна молекула нуклеиновой кислоты, имеющая последовательность, идентичную известной последовательности fre (регистрационный номер Genbank 23486). Вторая молекула имеет нуклеотидную последовательность,включающую мутацию нуклеотида 247, которая приводит к аминокислотной замене Lys83 наGlu83 (мутант далее обозначен как freE83.) Б. Индуцибельная сверхэкспрессия fre и мутанта freE83. Для осуществления индуцибельной сверхэкспрессии fre и мутанта freE83 проводят клонирование fre дикого типа и несущего замену мутанта freE83 в сайтах EcoRl/Pst вектора рKK223-3+ампициллин (amp) 30 С в течение ночи, затем разбавляют 30 мл LB+amp, 5 мМ IPTG (изопропилтиогалактозид) (фирма Fisher), выдерживают в течение 5 ч и собирают центрифугированием. Дебрисы бактерий суспендируют в 4,5 мл 50 мМHEPES, рН 7,5, 1 мМ ЭДТК плюс 0,5 мл (5 мг/мл) лизозима в течение 15 мин при 25 С,подвергая двум циклам замораживания 004942 38 оттаивания. После облучения ультразвуком в течение 1 мин на льду гомогенат центрифугируют при 16K х g в течение 20 мин. Затем супернатанты подвергают серийному разведению с помощью 50 мМ HEPES, рН 7,5, 1 мМ ЭДТК,получая 8 образцов, относительные концентрации которых составляют от 1 до 1/10000. Каждый бактериальный экстракт и разбавленный бактериальный экстракт анализируют в отношении комплементации PrnA-активности путем добавления 20 мкл экстракта к 180 мкл раствора, содержащего 7,2 мкг РrnА (0,36 мкг/мкл), 3,3 мкМ ФАД, 3,3 мМ NaCl, 1,67 мМD-Trp, 0,67 мг/мл НАДН и 50 мМ HEPES, рН 7,5. Реакционные смеси инкубируют при 30 С в течение 2 ч. Реакции прекращают, нагревая до 100 С в течение 2 мин, с последующим центрифугированием при 21000 х g в течение 5 мин. Затем растворы супернатантов фильтруют через ультрафильтрационные мембраны с порогом пропускания молекулярной массы молекул 10 кДа. Затем фильтрат анализируют с помощью ЖХВР с обращенной фазой для количественной оценки превращения D-Trp в D-7-хлортриптофан с использованием аналитического метода,описанного выше в примере 1 под названиемPrnAl. Добавление экстракта Е. coli, содержащего незагруженный вектор рKK223-3, приводит к образованию 0,34 пмоля 7-Сl-Тrр в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Добавление экстракта Е. coli, содержащего freE83- pKK223-3,приводит к образованию 1,14 пмоля 7-Сl-Тrр в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Добавления экстракта Е. coli, содержащего frepKK223-3, приводит к образованию 301 пмоля 7-Сl-Тrр в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Анализ флавинредуктазы осуществляют добавлением 10 мкл бактериального экстракта к 990 мкл 50 мМ HEPES, рН 7,5 содержащего 0,1 мг/мл НАДФН и 9,5 мкл рибофлавина. Если активность является слишком высокой для того,чтобы оценивать первые 20% реакции, то бактериальный экстракт разбавляют в соотношении 1/10 в 50 мМ буфере HEPES, а затем осуществляют анализ согласно описанной выше методике. Затем спектрофотометрически при длине волны 340 нм оценивают превращение НАДФН в НАДФ. Добавление экстракта Е. coli, содержащего незагруженный вектор рKK223-3, приводит к образованию 0,055 пмоля флавинредуктазной активности в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Добавление экстракта Е.coli, содержащего freE83 рKK223-3, приводит к образованию 0,157 нмоля флавинредуктазной активности в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Добавление экстракта Е. coli,содержащего fre- pKK223-3, приводит к образованию 25,4 нмоля флавинредуктазной активности в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Эти результаты свидетельствуют о том, 39 что в добавленном экстракте присутствует флавинредуктазная активность, составляющая 25,4 нмоля в мин на мкг протеина в добавленном экстракте. Эти результаты демонстрируют, что изменения флавинредуктазной активности пропорциональны изменениям галогенирующей активности. В. Совместная экспрессия fre и оперона рrn в Е. coli. Полным опероном пирролнитина Pseudomonas fluorescens (5,8 X/N, процитировано в патенте США 5723759, который включен в настоящее описание в качестве указанной выше ссылки) в рKK223-3 (фирма Pharmacia) трансформируют Е. coli. Последовательность fre,включающую промотор Taq, переносят из рKK223-3 в несущий маркер тетрациклина вектор pACYC184 (NEB), который содержит совместимый сайт инициации репликации р 15 А. Затем эту плазмиду совместно трансформируют с 5.8X/N, и оба вектора отбирают путем отбора по признаку устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу. В качестве отрицательного контроля также конструируют штамм, содержащий только fre. По 60 мл культутры каждой линии выращивают при 37 С, встряхивая со скоростью 200 об/мин в течение 48 ч. Из каждой культуры по 5 мл экстрагируют для плазмидного анализа с целью подтверждения присутствия одной или обеих плазмид. Для анализа протеина и его активности используют аликвоты по 15 мл. Остальные 40 мл культуры экстрагируют дважды 2 объемами этилацетата. Этилацетатные фракции концентрируют досуха в вакууме и затем переносят в 50 мкл смеси 6:4 H2O/CH3CN и 60 мкл МеОН. Затем 20 мкл полученных растворов анализируют с помощью ЖХВР, используя для аминопирролнитрина и пирролнитрина описанный ниже метод, обозначенный какAlliance, снабженную фотодиодным детектором и колонкой 4,6 х 50 мм, упакованной С 18 силикагелем, размер частиц 3 мкм. Применяемый ЖХВР-метод представляет собой метод градиентного элюирования. Скорости потока составляют 1,2 мл/мин и данные об абсорбции получают при длинах волн 210-400 нм с разрешением 2,4 нм и частотой дискретизации 5/с. Систему предварительно уравновешивают с использованием смеси вода : ацетонитрил(65:35). После инжекции образца колонку обрабатывают, используя линейный градиент от исходных условий до смеси вода : ацетонитрил 40:60. Аминопирролнитрин элюируется через 5,0 мин, а пирролнитрин элюируется через 6,6 мин. И аминопирролнитрин и пирролнитрин оценивают путем интегрирования площадей пиков на хроматограммах при длинах волн, используемых для диагностики. Для аминопир 004942 40 ролнитрина измерения абсорбции проводят при 300 нм. Для пирролнитрина измерения абсорбции проводят при 250 нм. Результаты свидетельствуют о том, что накопление аминопирролнитрина увеличивается более чем в 10 раз, а накопление пирролнитрина увеличивается более чем в 4 раза в клетках Е.coli, которые совместно экспрессируют плазмиды, несущие fre и оперон пирролнитрина, по сравнению с клетками, которые экспрессируют только оперон пирролнитрина. Пример 5. Галогенирование с использованием РrnА, экспрессированной в трансгенных растениях с последующей очисткой и анализомArabidopsis thaliana, экотип Columbia,трансформируют (с помощью метода опосредуемой Agrobacterium трансформации) 4 молекулами нуклеиновых кислот оперона пирролнитрина, кодирующими РrnА, РrnВ, РrnС иPrnD, каждая из которых находится под контролем промотора убикитина, согласно методу,описанному ниже в примере 6. Отдельные молекулы нуклеиновых кислот пирролнитрина подвергают ПЦР-репликации с использованием соответствующих сайтов рестрикции из плазмиды рСIВ 169 (патент US 5723759), которая содержит космидный клонGenbank U74493. Молекулы нуклеиновых кислот субклонируют и секвенируют. Промотор убикитиназ и первый интрон (J. Callis и др.(1990) и S. R. Norris и др., Plant Molecular Biology. 21:895-906 (1993 подвергают ПЦРрепликации из генома Arabidopsis так, чтобы они включали сайты 5'-KpnI и 3'-BamHI. Промотор убикитина, терминатор nos (Depicker и др.,Journal of Molecular and Applied Genetics 1:561573 (1982 и каждую отдельную молекулу нуклеиновой кислоты пирролнитрина (см. патентыUS 5723759 и 5955348, каждый из которых полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки) клонируют в модифицированном векторе pSportl. Консенсусную последовательность Козака, представляющую собой нкуклеотидный триплет -3 АСС, добавляют к каждой из нуклеиновых кислот РrnА, В и D непосредственно за начальным 5'- ATG. Молекулу нуклеиновой кислоты РrnС не модифицируют. Начальный кодон GTG РrnВ заменяют на кодон ATG. Эти модификации позволяют создать набор векторов рРЕН 7826, 27, 28 и 29 (Рrn А, В, С, D соответственно). Все остальные последовательности являются консенсусными для последовательности дикого типа. Конструируют дублет РrnАС путем встраивания KpnI-фрагмента рСIB7826 в сайт KpnI pCIB7828 (РrnС), получая рСIВ 7830. Конструируют дублет PrnBD путем встраивания KpnI-фрагмента рСIВ 7827 (РrnВ) в сайт KpnI pCIB7829 (PrnD), получая рСIB7831. Оперон четырех молекул нуклеиновых кислот 41 создают путем встраивания NotI-фрагмента рСIB7830 в NotI-фрагмент рСIВ 7831, получая рСIВ 7832. XbaI-фрагмент рСIB7832 встраивают в бинарный вектор рСIВ 200, получая трансформирующий вектор рСIB7819. Конечный вектор встраивают путем электропорации в Agrobacterium и применяют для трансформации Arabidopsis.Arabidopsis thaliana трансформируют методом, описанным у N. Bechtold и др. (N. Bechtold и др., С. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199 (1993. Выращивают 2 трансформированные линии (3 и 12) и нетрансформированную контрольную линию и собирают листья (1 г). Листья замораживают в жидком N2, растирают в порошок в ступке и экстрагируют 6 мл LSбуфера (50 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ NaCl). После центрифугирования при 5000 х g в течение 15 мин до получения дебриса супернатант фильтруют через стекловолоконный фильтр для удаления оставшихся частиц.PrnA очищают иммуносорбционным методом путем смешения экстракта (3 мл) с аффинным матриксом. Аффинный матрикс получают путем перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре 100 мкл комплекса кроличий антикозлиный IgG-агароза (полученного от фирмы Sigma) с 50 мкл козлиной сыворотки кPrnA. Затем агарозные гранулы трижды промывают 1 мл LS-буфера. После смешения 3 мл образца с аффинной матрицей неабсорбированный материал удаляют с гранул путем отмывки LSбуфером. Образец, который применяют в качестве положительного контроля, получают путем смешения 5 мкл PrnA (0,36 мкг/мкл), полученной из Pseudomonas fluorescens согласно методике, описанной в примере 1, с 3 мл LS, и затем обрабатывают параллельно с образцами растительных экстрактов. 200 мкл буфера для анализа (50 мМFre (21 мкг/мл), выделенной из Е. coli согласно методике, описанной в примере 1, добавляют к агарозным гранулам, содержащим очищенную иммносорбционным методом PrnA, за исключением одного образца каждой из линий 3 и 12. Затем образцы перемешивают в течение ночи переворачиванием, фильтруют через фильтры типа Microcon-10, затем продукт анализируют ЖХВР-методом PrnAl (описанным выше в примере 1). Инъецируемый объем образца 50 мкл. Обнаружены следующие уровни 7-Сl-Тrn: положительный контроль (экзогенная PrnA, добавленная к нетрансформированному растительному экстракту) - 185 пмолей, линия 3 + Fre 42 ля, линия 12 без Fre - 0 пмолей, нетрансформированный контроль - 0 пмолей. Эти данные свидетельствуют о том, что трансформированные растения экспрессируютPrnA в активной форме, активность которой зависит от добавления Fre. Пример 6. Галогенирование в трансгенных растениях. А. Получение галогенированных соединений в цитоплазме трансгенных растений путем трансформации нуклеиновой кислотой, кодирующей флавинредуктазу Е. coli в растениях,которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие PrnA, PrnB, PrnC и PrnD. Нуклеотидную последовательность SEQID NO:6, кодирующую флавинредуктазу E.coli,клонируют в векторе pNOV019, помещая молекулу нуклеиновой кислоты под контроль промотора убикитина 10 Arabidopsis (UB10) (J. Callis и др., Journal of Biological Chemistry 265:12486-12493 (1990) и S.R. Norris и др., PlantMolecular Biology. 21:895 -906 (1993, и помещая ее перед терминатором нопалинсинтазыAgrobacterium (Depicker и др., Journal of Molecular and Applied Genetics 1:561-573 (1982. Завершают создание бинарной векторной системы, содержащей pNOV507 (KаnR ), 508,(ChlorR) и 509, (AmpR). Для конструирования оперона пирролнитрина в сочетании с молекулой нуклеиновой кислоты fre и селектируемым маркером, определяющим устойчивость к гербициду, используют три описанных ниже вектора. pNov507 (KanR) представляет собой бинарный вектор с полилинкером между левой и правой пограничными последовательностями,встроенным путем отбора уникальных сайтов рестрикции, которые не встречаются ни в промоторах, ни в терминаторе, ни в молекулах нуклеиновых кислот пирролнитрина, fre или селектируемого маркера. Два других вектора pNOV508 (Chlor R) иpNOV509 (Amp R) представляют собой векторы,которые содержат часть полилинкера pNOV507 с дополнительными сайтами рестрикции, добавленными с целью клонирования кассет отдельных молекул нуклеиновых кислот оперона пирролнитрина. Эти два вектора представляют собой сконструированные или собранные векторы. Кассету, содержащую fre в сочетании с кассетой селектируемого маркера UB3 изpNOV111, встраивают путем лигирования вpNOV509. Затем эту двойную кассету переносят в бинарный вектор pNOV507, получая конечный вектор pNOV510. Этот вектор переносят путем электропорации в Agrobacterium. Линии Arabidopsis thaliana, которые трансформированы молекулами нуклеиновых кислот PrnA, PrnB, PrnC и PrnD согласно методике, описанной в примере 5, трансформируют согласно методу, описанному у N. Bechtold и др. (N. Bechtold С. R. Acad. 43 Все молекулы нуклеиновых кислот пути синтеза пирролнитрина в растениях и различные конструкции помещают под контроль промотора убикитина 3 Arabidopsis (UB3) (J. Callis и др., Journal of Biological Chemistry 265:1248612493 (1990) и S.R. Norris и др., Plant MolecularprnD, и линию дикого типа Columbia трансформируют pNOV510 путем инфильтрации Agrobacterium согласно методу, описанному у N.Bechtold и др., выше. Семена собирают, сушат и высаживают в почву. Трансформированные растения выявляют путем опрыскивания проростков селектирующим агентом в концентрации 0,025% трижды в течение 8 дней. Затем с помощью ЖХВР или метода газовой хроматографии- масс-спектрометрии подтверждают присутствие в растении пирролнитрина и определяют его уровень. Аналогично этому или в другом варианте согласно описанной выше методике можно подтверждать наличие активности рrnА и/илиprnC в растительных экстрактах. Б. Получение галогенированных соединений в цитоплазме трансгенных растений путем совместной трансформации флавинредуктазой Е. coli и опероном пирролнитрина. Нуклеотидные последовательности, кодирующие PrnA, PrnB, PrnC и PrnD пути биосинтеза пирролнитрин, представленные в патентеUS 5723759 и включенные в настоящее описание в качестве указанной выше ссылки, и SEQID NO:7, кодирующую флавинредуктазу E.coli,интродуцируют в растения в виде одной конструкции тДНК. Экспрессия каждой из молекул нуклеиновых кислот пути биосинтеза пирролнитрина находится под контролем промотораUB3, в то время как экспрессия fre (SEQ IDNО:7) находится под контролем UB10. Все пять молекул нуклеиновых кислот либо обладают сходством с последовательностью сайта инициации трансляции Козака вследствие наличия А в положении -3, либо они изменены так, чтобы обладать в максимально возможной степени указанным сходством. Все молекулы нуклеиновых кислот заканчиваются терминатором nos. Согласно предпочтительному варианту осуществления конечный вектор конструируют путем сборки кассет, несущих промотор UB3 направленные в цитозоль гены биосинтеза пирролнитрина, и UB10-fre, с получением бинарного вектора, включающего следующую конструкцию: правая пограничная последовательность-UВ 3-рrnА-nos-UB3-рrnС-nos-UB3-prnBnos-UB3-prnD-nos-UB10-fre-nos-UB3 селектируемый маркер-nos-левая пограничная последовательность. Этот вектор обозначенpNOV523 (SEQ ID NO: 34). Согласно другому варианту осуществления направленный в цитозоль оперон пирролнитрина создают встраиванием путем лигирова 004942XbaI. NotI-фрагмент А/В-дублета из рСIB10253 встраивают путем лигирования в C/Dдублетный вектор рСIB10254. Эту конструкцию также переносят в pNOV507 в виде кассетыXbaI. Конечный вектор включает следующую конструкцию: правая пограничная последовательность-UВ 3-рrnА-nos-UB3-prnB-nos-UB3 рrnС-nos-UВ 3-рrnD-nos-UB10-fre-nos-UB3 селектируемый маркер-nos-левая пограничная последовательность. Этот вектор затем переносят путем электропорации в Agrobacterium и применяют для трансформации Arabidopsis (Columbia) путем инфильтрации Agrobacterium (N. Bechtold и др.,C.R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199(1993. Семена собирают, сушат и высаживают в почву. Трансформированные растения выявляют путем опрыскивая проростков селектирующим агентом в концентрации 0,025% трижды в течение 8 дней. Затем с помощью ЖХВР или метода газовой хроматографии - массспектрометрии подтверждают присутствие в растении пирролнитрина и определяют его уровень. В. Получение галогенированных соединений в пластидах трансгенных растений. Создают нуклеотидные конструкции, кодирующие prnA and В, предназначенные для экспрессии транзитных пептидов хлоропластов(Wong E.Y. и др., Plant Molecular Biology том 20: 81-93 (1992, и помещают совместно в вектор,позволяющий осуществлять отбор по признаку устойчивости к канамицину. Протоколы трансформации описаны более подробно в предыдущих примерах (N. Bechtold и др., C.R. Acad. Sci.Paris, Life Sciences 316:1194-1199 (1993. Конструирование векторов, осуществляющих направленный перенос молекул нуклеиновых кислот пирролнитрина в пластиды Индивидуальные молекулы нуклеиновых кислот пути биосинтеза пирролнитрина подвергают ПЦР-репликации из рСIВ 10230, 31, 32, 33(Рrn А, В, С, D соответственно), так, чтобы они содержали сайты рестрикции 5'-NheI и 3'BamHI. Молекулы нуклеиновых кислот подвергают Торо-клонированию в pCR2.1 (фирма Invitrogen, офис в США, Карлсбад, штат Калифорния 92008, каталожный номер K2030-01) для подтверждения последовательности. Последовательность малой субъединицы транзитного пептида RuBPcase подвергают ПЦР-репликации из библиотеки кДНК Arabidopsis в pFL61 (Wong и др., Plant Mol Biol 20: 81-93 (1992. Эту нуклеотидную последовательность встраивают путем лигирования на 5'-конец каждой из молекул нуклеиновых кислот пирролнитрина в рРЕН 31,30, 29 и 28 (Рrn А, В, С, D соответственно). Этот набор векторов рРЕН содержит кассету UВ 3 45 интрон-nos. Дополнительный зрелый пептид синтезируют в виде комплементарных олигомеров, отжигают и встраивают путем лигирования в 5'-область конструкции транзитного пептида,содержащей молекулу нуклеиновой кислоты пирролнитрина. Это позволяет получить осуществляющие направленный перенос молекул нуклеиновой кислоты пирролнитрина в пластиды векторы рСIB10249, 50, 51 и 52 (Рrn А, В, С,D соответственно). PrnAB-дублет pCIB 10253 создают встраиванием путем лигирования кассеты, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты РrnА и KpnI, из pCIB 10249 в pCib 10250.PrnCD-дублет pCIB 10254 создают встраиванием путем лигирования кассеты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты РrnС и XhoI, изpCIB 10251 в pCIB 10252. Каждый дублет переносят в виде XbaI-кассеты в бинарный векторpCIB200(KanR). Векторы, предназначенные для направленного переноса в пластиды, в состав которых входят селектируемые маркеры, имеют следующее строение: для frе-вектора - правая пограничная последовательность-UВ 10-сlр-frеnоs-UВ 3-селектируемый маркер-nos-левая пограничная последовательность; для РrnА/Ввекторов - правая пограничная последовательность-UB3-prnA-nos-UB3-prnB-nos-UB3 селектируемый маркер-nos-левая пограничная последовательность; и для PrnC/D-векторов правая пограничная последовательность-UВ 3prnС-nos-UВ 3-рrnD-nos-UВ 3-селектируемый мaркep-nos-левая пограничная последовательность. Затем осуществляющий направленный перенос в пластиды вектор prnAB-fre переносят путем электропорации в Agrobacterium и применяют для трансформации Arabadopsis Columbia с использованием метода, описанного выше у N. Bechtold и др. Семена собирают, сушат и высаживают в почву. Трансформированные растения выявляют путем опрыскивания проростков селектирующим агентом и последующего самоопыления до гомозиготности. Аналогично этому, осуществляющий направленный перенос в пластиды вектор prnCD/ селектируемый маркер интродуцируют в Arabadopsis согласно описанной выше методики и полученным трансформантам дают самоопыляться до гомозиготности. Гомозиготные трансформированные растения, несущие осуществляющую направленный перенос в пластиды конструкцию рrnАВfrе/селектируемый маркер, затем скрещивают с гомозиготными растениями, несущими осуществляющую направленный перенос в пластиды конструкцию prnCD/селектируемый маркер. Согласно другому варианту осуществляющую направленный перенос в пластиды кассетуfre. Этот вектор обозначен как pNOV524 (SEQ 46 путем электропорации в Agrobacterium и применяют для трансформации Arabidopsis Columbia с помощью описанного выше метода N.Bechtold и др. Как линию Arabidopsis дикого типа, так и линию Arabidopsis, ранее трансформированную вектором pCIB 10253 (который содержит направленный к пластидам дублет рrnА/В),трансформируют с помощьюpNOV524. Семена собирают, сушат и высаживают в почву. Трансформированные растения выявляют путем опрыскивания проростков селектирующим агентом и последующего самоопыления до гомозиготности. Полученное потомство подвергают действию соответствующего селектирующего агента. Устойчивые к этому селектирующему агенту растения несут fre и рrnА, В, С и D в гомозиготном состоянии. Специалисту в данной области должны быть известны многочисленные возможные варианты этого метода. Во всех случаях экспрессию пирролнитрина оценивают с помощью ЖХВР или газовой хроматографии. Пример 7. Галогенирование путем экспрессии РrnС в листьях трансгенных растений,дополнительно содержащих MDA. Осуществляют анализ методом Вестернблоттинга растений линий Columbia, трансформированных конструкцией pNOV524 (содержит направленные в пластиды prnC, prnD и fre) с последующим отбором гербицидом баста. Кроме того, осуществляют анализ методом Вестернблоттинга линий Arabidopsis, трансформированных pCIB 10253 (содержит направленные в пластиды рrnА и рrnВ) и затем трансформированных pNOV 524, с последующим отбором с использованием баста. Отдельные листья каждой из линий гомогенизируют в однократном буфере для образца протеина, кипятят и разделяют с помощью 10% ДСН-ПААГа. Затем мембрану зондируют в присутствии протеинов рrnС и prnD антителами к рrnС и prnD соответственно. Выявляют линии Arabidopsis, дающие положительную реакцию в отношении экспрессии рrnС и prnD. Эти же экстракты протеинов повторно анализируют на присутствие протеина флавинредуктазы (fre), используя 10-20%-ный градиент геля, и затем зондируют мембрану антителами к fre. Выявляют линии, дающие положительную реакцию в отношении экспрессииArabidopsis, дающей положительную реакцию на наличие экспрессии направленных в пластиды рrnС, prnD и fre, и листья линии Arabidopsis,дающей отрицательную реакцию на рrnС иprnD. Листья подвергают вакуумной фильтрации MDA, погружая в 5 мМ MES (рН 5,7); 400 мМ маннитный буфер, и выдерживают в течение ночи в темноте при комнатной температуре. Затем буфер экстрагируют этилацетатом, концентрируют досуха и анализируют с помощью 47 ЖХВР (согласно методу, описанному ранее в примере 4). В листьях растений, позитивных в отношении рrnС, prnD и fre, происходит превращение MDA в APRN (примерно 5%). Превращение выявляют после инкубации в течение 3 ч. Кроме того, примерно 30% APRN превращается в пирролнитрин. Кроме того, в листьях растений,представляющих собой отрицательный контроль, в которых не происходит экспрессия рrnС или prnD, не выявлено превращения MDA ни в APRN, ни в пирролнитрин. Все процитированные выше публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Перечень последовательностей