Способы обнаружения вирусов гриппа

СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА Способ быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих гемагглютинин и нейраминидазный компонент, включающий в себя следующие стадии: а) связывание вирусов и/или вирусных частиц с подложкой, содержащей по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранного из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов,которые соединены или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, a1 кислый гликопротеин, а 2-макроглобулин, овомукоид и их сочетаниями, углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц; b) взаимодействие нейраминидазного компонента связанных вирусов и/или вирусных частиц с меченым ферментным субстратом, что генерируют детектируемый сигнал; и с) детекция сигнала,порожденного на этапе b). Бовин Николай Владимирович, Любавина Ирина Александровна (RU), Ляйзер Роберт-Маттиас (DE)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ВЕТЕРИНЕРМЕДИЦИНИШЕ УНИВЕРЗИТЕТ ВИН (AT) 014533 Настоящее изобретение относится к способам быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих гемагглютининовый и нейраминидазный компонент, при этом указанный способ включает связывание вирусов и/или вирусных частиц с подложкой при помощи специфической связывающей молекулы, которая связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц, и обнаружение связанных вирусов и/или вирусных частиц реакцией нейраминидазного компонента с ферментным субстратом, приводящей к обнаруживаемому сигналу. Настоящее изобретение также относится к системе быстрого обнаружения вирусов гриппа и/или вирусных частиц, в которой используется способ по изобретению, и к применению системы обнаружения по изобретению. Все вирусы птичьего гриппа (AI) представляют собой вирус гриппа типа А семейства вирусовOrthomyxoviridae, и все известные штаммы вируса гриппа А инфицируют птиц. Вирус гриппа типа А подразделяют на подтипы в зависимости от белков гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (N), выступающих из центральной части вируса. Существует 16 типов Н и до 9 подтипов N, что дает возможность для 144 различных комбинаций Н и N. Птичий грипп (также известный как вирус гриппа А, грипп типа А или грипп вида А) является гриппом, вызываемым типом вируса гриппа, который переносится птицами, но также может инфицировать некоторые виды млекопитающих. Пандемия гриппа - это крупномасштабная эпидемия вируса гриппа, например эпидемия испанки в 1918 г. Всемирная Организация здравоохранения (WHO) обеспокоена большой вероятностью возникновения пандемии гриппа в течение следующих нескольких лет. Одним из наиболее вероятных кандидатов является подтип A (H5N1) птичьего гриппа.H5N1 является типом вируса птичьего гриппа, который за счет дрейфа генов мутировал в большое число высокопатогенных вариантов, но все они в настоящее время принадлежат генотипу Z вируса птичьего гриппа H5N1. Генотип Z появился в 2002 г. путем рекомбинации ранее известных высокопатогенных генотипов H5N1, которые впервые были выявлены у птиц в Китае в 1996 г. и у людей в Гонконге в 1997 г. Вирусы H5N1, выделенные из организма человека и близко родственные вирусы птичьего гриппа, выделенные в 2004 и 2005 гг., принадлежат одному и тому же генотипу, часто называемому генотипом Z. Подтипами птичьего гриппа, подтвержденными у людей, которые, как известно, привели к высокой смертности у людей, являются: H1N1, вызвавший Испанку, H2N2, вызвавший Азиатский грипп, H3N2,вызвавший Гонконгский грипп, H5N1, H7N7, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7. Для быстрой реакции в случае возникновения мутировавшего и вирулентного штамма гриппа, способного передаваться от человека к человеку, требуется быстрый и надежный метод анализа для того,чтобы определить инфицирован индивид или животное вирусом. Существующие в настоящее время лабораторные методы обнаружения вирусов в образцах окружающей среды, взятых у животных и больных,являются трудозатратными и длительными по времени. В US-B-6503745 приведено описание соединений циклопентана и циклопентена, а также их применение в способе обнаружения вируса гриппа. Вирус захватывается покрытой фетуином поверхностью и его обнаружение осуществляют с помощью меченой композиции, которая связывается с нейраминидазой.D.E. Noyola et al. описали в Journal of Clinical Microbiology, 2000, p. 1161-1165 гранулы, покрытые фетуином. Фетуин также выступает в роли субстрата нейраминидазы, и обнаружение проводят с помощью агглютинации. В US-A-2003/0129618 описаны способы и композиции для обнаружения аналитов с помощью флуоресценции, которая возникает в полимерном материале в ответ на селективное связывание аналитов с полимерными материалами. В частности, настоящее изобретение позволяет определить с помощью флуоресценции модифицирующие мембрану реакции и аналиты, ответственные за такие модификации, и провести анализ скрининга действующих ингибиторов. Все известные и доступные быстрые методики в этой области основаны либо на использовании антител против вирусных эпитопов, либо на простых тестах на нейраминидазу (NA). Главным недостатком методов, в которых используются антитела, основанных на технике растекания капли жидкости, или других типов анализа является нестабильность антител, использующихся в качестве реагентов. Кроме того, большое число иммунологических анализов, доступных в настоящее время, специфичны для гриппа А, а не для H5N1. К тому же, использование антител неизбежно ведет к повышению стоимости анализа. Главным недостатком тестов на NA, специфичных для вирусов гриппа, является необходимость использования дорогого, субстратного реагента, используемого в данной области, который должен быть частично метилирован. Настоящее изобретение решает вышеперечисленные проблемы благодаря способу быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, благодаря системе обнаружения, в которой используется указанный способ, а также благодаря применению указанного способа обнаружения, как заявлено в формуле изобретения.-1 014533 В описании изобретения используются следующие аббревиатуры: 3'SLN = Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc; НА = гемагглютинин;TCID = доза инфекции в культуре тканей; буфер TN = 0,02 М Tris-HCl (рН 7,2) с 0,1 М NaCl. Изобретение относится к способу быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа,который включает следующие стадии: а) связывание вирусов или вирусных частиц с подложкой, содержащей по меньшей мере один тип углеводных рецепторов, выбранных из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, a1-кислый гликопротеин, а 2-макроглобулин, овомукоид и их композиций, причем углеводный рецептор связывается с гемагглютининовым компонентом вируса и/или вирусной частицы;b) реакцию нейраминидазного компонента связанных вирусов и/или вирусных частиц с их меченым ферментным субстратом, что вызывает генерирование обнаруживаемого сигнала; иc) обнаружение сигнала, генерированного на этапе b). В частности, могут быть обнаружены вирусы и/или вирусные частицы гриппа, содержащие все известные подтипы птичьего гриппа (AI). В другом варианте осуществления изобретения вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат конкретный подтип или группу подтипов. Способ подходит для обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих высокопатогенный вариант. Изобретение может, в частности, осуществляться с подложкой, которая представляет собой хроматографическую бумагу или мембрану. Такие материалы хорошо известны специалистам в данной области. Согласно изобретению можно обеспечить ковалентное связывание или физическое адсорбирование углеводного рецептора, как указано выше, с подложкой. В изобретении, в частности, используют углеводный рецептор, содержащий повтор 2-3Gal. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения (дот-блот-подход) связывание вирусов и/или вирусных частиц достигается путем нанесения образца, содержащего вирус и/или вирусные частицы, на подложку в виде пятна. Согласно изобретению связывание вирусов и/или вирусных частиц достигается пропитыванием образцом, содержащим вирус и/или вирусные частицы, всей подложки так называемой техникой растекания капли жидкости. В другом варианте осуществления изобретения меченый ферментный субстрат нейраминидазного компонента осаждается на месте связывания вируса и/или вирусных частиц. Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментный субстрат метят хромогенной группой, и реакция с нейраминидазой вызывает изменение цвета указанного ферментного субстрата. В качестве ферментного субстрата могут быть использованы, кроме прочих, следующие хромогенные производные N-ацетилнейраминовой кислоты, в частности 5-бромо-4-хлор-3-индолилNацетилнейраминовая кислота. Альтернативно, реакция с нейраминидазой вызывает специфический флуоресцентный сигнал, если в качестве метки используются подходящие флуоресцентные молекулы. Способ по изобретению может осуществляться с помощью системы быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа по изобретению. Система содержит систему для быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа способом по изобретению, причем система содержит:a) подложку, содержащую по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранного из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, a1-кислый гликопротеин, а 2-макроглобулин,овомукоид и их комбинацией, причем углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц;b) меченый ферментный субстрат, который взаимодействует с нейраминидазным компонентом, генерируя, таким образом, обнаруживаемый сигнал. В частности, подложка помещается в пластиковый контейнер с окном для считывания результата вместе с образцом и положительным контролем. Подложка содержит, в частности, по меньшей мере два разных количества указанных специфических связывающих веществ для полуколичественной оценки содержания вируса в образце. В другом варианте осуществления подложка содержит по меньшей мере два специфических рецептора разных подтипов специфичности для одновременного обнаружения вирусов, принадлежащих разным подтипам. Система обнаружения по изобретению служит в качестве контейнера для образцов и переносной установки для подтверждающих тестов, таких как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, после обнаружения вирусов и/или вирусных частиц.-2 014533 Также в соответствии с изобретением система для обнаружения может использоваться для обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа в образцах, взятых у животных и/или человека, таких как мазки, фекалии и кровь, в образцах окружающей среды и/или в качестве системы раннего предупреждения появления высокопатогенных подтипов вирусов. Гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA) находятся на поверхности вирусов гриппа. НА вызывает связывание вирусов с сиалилсодержащими клеточными рецепторами, a NA стимулирует доступ вируса к клеткам-мишеням и ускоряет высвобождение вируса из инфицированных клеток и от природных ингибиторов [Matrosovich, M.N., Matrosovich, T.Y., Gray, Т., Roberts, N.A., Klenk, H.D. 2004: J. Virol 78(22) 12665-7], т.е. НА связывает рецепторы, a NA разрушает рецепторы. Важным условием эффективной репликации вирусов является согласованное действие НА и NA, и у разных видов соотношение двух этих активных веществ различается. Вирусы гриппа, выделенные у птиц, имеют некоторые характерные особенности. Все вирусы птичьего гриппа обладают НА, который имеет наибольшее сродство кNeu5Ac2-3Gal-концевым углеводным цепям. Кроме того, активность их NA выше, чем у вирусов другого вида. В способе обнаружения и системе детекции по настоящему изобретению используются свойства обоих этих компонентов, НА и NA, вируса птичьего гриппа. Вирус гриппа связывается со специфичной связывающей молекулой, предпочтительно с субстанцией, которая содержит сиалилированные углеводы и соединена с мембраной, после чего следует реакция, предпочтительно расщепления нейраминидазного субстрата, вызывая окрашивание содержащей вирус зоны на мембране. Способ обнаружения вирусов гриппа и система по настоящему изобретению имеют ряд преимуществ по сравнению с тестовыми системами, известными из уровня техники, использование двух компонентов, НА и NA, повышает специфичность анализа и позволяет конструировать системы обнаружения с выбранными специфичностями. В то же время и в противоположность системам обнаружения, основанным на иммунологических методах,нет необходимости в дополнительных маркерных ферментах для выявления положительной детекции,так как для этих целей служит сама нейраминидаза вируса. Различные варианты тщательно отобранных типов молекул углеводных рецепторов собирают вирусы гриппа независимо от типа и подтипа и одновременно способны к специфическому распознаванию высокопатогенных форм, таких как H5N1. Результат способа обнаружения по изобретению может быть получен без использования какоголибо сложного оборудования. Способ по изобретению позволяет обнаруживать вирусы гриппа в течение 0,1-2 ч. Изобретение далее подробно описано с помощью примеров, не ограничивающих объем изобретения. Примеры Пример 1. Синтез полиакриламидного конъюгата 3'SLN-трисахарида для получения специфической молекулы углеводного рецептора. Раствор 1,7 мг (10 мкмоль) полиакриловой кислоты, полностью активированнойN-гидроксисукцинимидом, молекулярная масса 1000 кДа, в 200 мкл DMSO и 4 мкл диизопропилэтиламина, добавляли в раствор 1,46 мг (2 мкмоль) 3'SLN-O(CH2)3NH2 в 200 мкл DMSO, смесь поддерживали при 37 С в течение 48 ч, 40 мкл 25% водного раствора аммиака или 40 мкл этаноламина были добавлены и раствор поддерживали 18 ч при комнатной температуре, после чего проводили гель-проникающую хроматографию на сефарозе LH, выход 90%. Пример 2. Обнаружение вирусов гриппа в жидкости аллантоиса способом и тест-системой по изобретению. Набор. 1. Тест-полоска. 2. Буфер для образца. Буфер 1. 3. Контрастный буфер. Буфер 2. 4. Буфер для промывки А. Буфер 3. 5. Буфер для промывки В. Буфер 4. 6. Окрашивающий буфер. Буфер 5. 7. Двойная полоска (2 ряда с 8 лунками) или плашка с 96 лунками. 8. Ножницы или скальпель. 9. Щипцы. 10. Чашка для промывания полоски. 11. Емкость для протекания реакции. 12. Термостат (или его заменитель). 13. Камера для процедуры хроматографирования (или крышка, которой закрывают 96-луночную плашку с полосками).-3 014533 Материалы. Полоски: нитроцеллюлоза, абсорбент, прокладка для образца, полученная от Whatman, USA. 1. Специфический реагент (фетуин, Sigma) выделяли из сырых куриных яиц. 2. Буфер 1: 0,2 М Tris-HCl (рН 7,2) с 3 М NaCl и 0,5% Tween-20. 3. Буфер 2: 0,02 М Tris-HCl (рН 7,2) с 0,3 М NaCl и 0,05% Tween-20. 4. Буфер 3: 0,02 М Tris-HCl (рН 7,2) с 0,1 М NaCl и 0,05% Tween-20. 5. Буфер 4: 0,02 М Tris-HCl (рН 7,2) с 0, 1 М NaCl (TN- буфер). 6. Буфер 5: 4 мМ раствора Neu-X в TN-буфере с 0,01 М CaCl2.TN-буфер может быть заменен другим подходящим буфером, например забуференным фосфатом,солевым раствором или солевым раствором. Полоску (фигуру) разделяли на три зоны: зону пропитывания, обнаружения и абсорбции. Линия молекулы углеводного рецептора (тестовая линия) так же, как и контрольная линия располагаются в зоне обнаружения. Полоски сделаны из мембраны, адсорбента и прокладки для образца. Молекулу углеводного рецептора (1 мкл на 1 мг/мл раствора) помещают в зону обнаружения, после чего полоску сушат и промывают. Полоску хранят в герметично закрытом сосуде при 18-25 С. Обнаружение. 1. Получение образца. 1/10 часть (об./об.) буфера 1 добавляют в образец непосредственно перед анализом и тщательно встряхивают. Это образец 1 (Р 1). 2. Процедура обнаружения включает несколько стадий (табл. 1). На первой стадии прокладки для образца на полоске помещают в 80-100 мкл Р 1. Под действием капиллярных сил жидкость из образца поднимается вверх и достигает зоны абсорбции через зону обнаружения, где частицы вируса связываются с молекулой углеводного рецептора. Длительность этого процесса зависит от вязкости пробы, но не должна превышать 15 мин. Буфер 2 добавляют в ту же лунку плашки (альтернативно можно перенести полоску в другую лунку, заполненную буфером 2). Через 10 мин полоску вынимают из лунки. На второй стадии пропитанную часть полоски отрезают (ножницами). После того как (например, с помощью пинцета) абсорбирующую зону полоски осторожно вынимают, тестовую зону промывают буфером 3, а затем буфером 4. Затем зону абсорбции тоже отрезают. На третьей стадии оставшуюся часть тестовой зоны помещают в сосуд с буфером 5. Сосуд плотно закрывают и оставляют в темноте при 37-40 С. Наличие вируса гриппа в образце обнаруживают по темно-синему окрашиванию зоны молекулы углеводного рецептора. Длительность этой стадии зависит от концентрации I вируса в образце, и она может занять от 20 до 60 мин до обнаружения вируса с помощью реакции гемагглютинации (HAR титр около 2). Как правило, эти образцы имеют значение TCID/мл около 105. Для образцов с 10- и 100-кратно меньшим содержанием вируса (104-103 TCID/мл) окрашивание может появиться через несколько часов. После этой процедуры полоску вынимают из раствора, после чего визуально оценивают результат реакции. Контрольная линия нейраминидазы в зоне обнаружения используется для оценки функциональности анализа. Контрольная зона должна окрашиваться в темно-синий цвет. Результаты интерпретируют следующим образом: 1) если наблюдается равномерно окрашенная линия, то результат считается положительным, т.е. образец содержит вирус; интенсивность цвета должна быть сравнима с интенсивностью контрольной линии; 2) если наблюдается слабо окрашенная линия, то образец содержит вирус в концентрации, недостаточной для точного обнаружения, и выдерживание полоски в буфере 5 должно быть продолжено на всю ночь или тест может быть повторен еще раз; 3) отсутствие окрашенной линии означает, что в образце нет вируса или его концентрация меньше,чем минимальный порог обнаружения; 4) отсутствие окрашенной линии в зоне положительного контроля означает либо то, что эксперимент проведен неправильно, либо то, что NA в контрольной линии была разрушена; в этом случае рекомендуется повторное тестирование образца с использованием нового тест-набора. Данные по чувствительности теста приведены в табл. 2.-4 014533 Таблица 1 Схема способа обнаружения по изобретению-5 014533 Пример 3. Обнаружение вирусов гриппа в куриных фекалиях при помощи системы обнаружения по изобретению. В этом примере используются те же материалы и способы, что и в примере 2. 1. Было выполнено многократное разведение содержащих вирус образцов в суспензии фекалий здоровых куриц (2 г сухой субстанции на 10 мл буфера). Было показано, что тест не чувствителен и не специфичен к обнаружению вируса гриппа в фекалиях. 2. К свежим куриным фекалиям добавляли 1/10 часть (об./об.) вируса А/утка/Альберта/76(HAR-титр 1:10) и смесь гомогенизировали. После добавления буфера 2 к гомогенату (1:1 об./об.) из получившейся суспензии отбирали аликвоту и использовали ее в анализе. Темно-синее окрашивание в тестовой зоне появлялось через 2 ч. Если куриные фекалии добавляли к образцам из табл. 1 перед началом процедуры, то это не оказывало никакого заметного влияния на результаты теста. Пример 4. Обнаружение вирусов гриппа в ткани легких мертвых куриц при помощи системы обнаружения по изобретению. В этом примере используют те же материалы и способы, что и в примере 2. Ткань легких курицы, умершей от вируса гриппа H5N1, была извлечена силиновым буфером для исследования (собран: Крым/январь 2006 г.). Может быть показано, что вирусы гриппа могут быть достоверно обнаружены в легких тела курицы для исследования. Таблица 2 Предел обнаружения (LOD) вирусов птичьего гриппа в образцах,содержащих вирус, как было обнаружено с помощью тестовой системы по изобретению Штамм вакцины, имеющий гены НА и NA из А/Вьетнам/1194/04 патогенного вируса и все внутренние гены белка из А/Пуэрто-Рико/2/34. Вирусы были получены из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов (Московская область) и Института гриппа (Санкт-Петербург). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих гемагглютинин и нейраминидазный компонент, включающий стадии:a) связывания вирусов и/или вирусных частиц с подложкой, содержащей по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранного из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, a1-кислый гликопротеин, а 2-макроглобулин, овомукоид, и их сочетаниями, причем углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц;b) взаимодействия нейраминидазного компонента связанных вирусов и/или вирусных частиц с меченым ферментным субстратом, генерируя таким образом обнаруживаемый сигнал; иc) детекции сигнала, генерированного на этапе b). 2. Способ по п.1, в котором указанные вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат все известные подтипы гриппа (AI). 3. Способ по п.2, в котором указанные вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат конкретный подтип или группу подтипов. 4. Способ по п.2, в котором указанные вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат высокопатогенную форму. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором подложкой является хроматографическая бумага или мембрана. 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором углеводный рецептор ковалентно связан или физически адсорбирован на подложку. 7. Способ по п.6, в котором углеводный рецептор содержит 2-3Gal повтор. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором указанное связывание указанных вирусов и/или вирусных частиц достигается за счет нанесения образца, содержащего вирусы и/или вирусные частицы, на указанную подложку в виде пятна (дот-блот подход). 9. Способ по любому из пп.1-7, в котором указанное связывание вирусов и/или вирусных частиц достигается путем пропитывания указанной подложки образцом, содержащим вирусы и/или вирусные частицы (метода растекания капли жидкости). 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором указанный меченый ферментный субстрат указанного нейраминидазного компонента осаждается на месте связывания вирусов и/или вирусных частиц. 11. Способ по любому из пп.1-10, в котором указанный ферментный субстрат помечен хромогенной группой, и реакция с нейраминидазой вызывает изменение цвета указанного ферментного субстрата. 12. Способ по любому из пп.1-11, в котором указанный ферментный субстрат является хромогенным производным N-ацетилнейраминовой кислоты, в частности 5-бромо-4-хлор-3-индолилNацетилнейраминовой кислоты. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором реакция с нейраминидазой вызывает специфический флуоресцентный сигнал. 14. Система быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, в которой используется способ по любому из пп.1-13, содержащая:a) подложку, содержащую по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранный из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, a1-кислый гликопротеин, а 2-макроглобулин,овомукоид, и их сочетаниями, причем углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц;b) меченый ферментный субстрат, который взаимодействует с нейраминидазным компонентом, генерируя таким образом детектируемый сигнал. 15. Система обнаружения по п.14, в которой указанная подложка помещена в пластиковый контейнер с окном для считывания результатов теста с образцом и положительным контролем. 16. Система обнаружения по п.14 и/или 15, в которой указанная подложка содержит по меньшей мере два различных количества указанных специфических связывающих веществ для полуколичественной оценки содержания вируса в образце. 17. Система обнаружения по п.14 и/или 16, в которой указанная подложка содержит по меньшей мере два специфических рецептора разных подтипов специфичности для одновременного обнаружения вирусов, принадлежащих к разным подтипам. 18. Система обнаружения по любому из пп.16, 17, причем система после обнаружения присутствия вирусов и/или вирусных частиц служит контейнером для проб и переносной установкой для подтверждающих тестов, таких как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. 19. Применение системы обнаружения по любому из пп.16-18 для обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа в пробах у животных и/или человека, таких как мазки, фекалии и кровь, в пробах окружающей среды и/или как системы раннего предупреждения появления высокопатогенных подтипов