Интраназальное или ингаляционное введение виросом

ИНТРАНАЗАЛЬНОЕ ИЛИ ИНГАЛЯЦИОННОЕ ВВЕДЕНИЕ ВИРОСОМ Керстен Александр Й. (US), Герез Лисия,Схун Питер Й., Наута Йозеф Й.П., Ван Рейнек Леиссиус Дорин Х. (NL) Представитель: Настоящее изобретение предоставляет композицию гриппозных виросом, содержащую восстановленные оболочки указанного вируса, где вирусные оболочки полностью получены из гриппозных вирусных частиц, где к восстановленным виросомам не добавлены липиды из внешних источников, где виросомы содержат антигены гриппа гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные, где к композиции не добавлены отдельные адъюванты и/или иммуностимуляторы и где композиция предназначена для интраназального или ингаляционного введения, при этом композиция характеризуется тем, что однократное интраназальное или ингаляционное введение человеку является достаточным для индукции системного иммунного ответа, и/или локального иммунного ответа, и/или ответа цитотоксических лимфоцитов против указанных антигенов вируса гриппа, причем системный ответ находится в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа, и доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 30 мкг. Изобретение также предоставляет применение восстановленных гриппозных виросом для промышленного производства указанной композиции и соответственно промышленного производства вакцинных составов. 014532 Область изобретения Настоящее изобретение относится, в частности, к композициям для инактивированных вакцин против гриппа и путям введения, где однократное интраназальное или ингаляционное введение дает систематический иммунный ответ, что положительно коррелирует с клинической защитой. Предпосылки изобретения Различные концепции для иммунизации против гриппа назальным или орофарингеальным путем и использования инактивированного антигена гриппа рассматривались в качестве неинъекционных альтернатив подкожной или внутримышечной иммунизации. На животных моделях были получены данные,поддерживающие неинъекционные подходы. Концепции используют инактивированный антиген гриппа(такой как химически инактивированные целые вирусные частицы или дополнительно обработанные компоненты вируса, такие как расщепленный вирус или очищенные поверхностные антигены гемагглютинин (НА) и/или нейраминидаза (NA для иммунизации интраназальным путем, что подтверждается данными, полученными на животных, включая или использование адъюванта или иммуностимулятора в сочетании с инактивированным антигеном гриппа, или требует множественной вакцинации. Адъювант представляет собой любую субстанцию, которая усиливает иммуногенность смешанных с ней антигенов. У людей успешная вакцинация против гриппа интраназальным путем была показана только для (а) живых (Холодовых штаммов) вакцин против гриппа (FluMist, MedImmune Vaccines Inc.) (ссылки 1, 2, 3),(б) виросомальных вакцин против гриппа, адъювированных термолабильным токсином Е. coli (NasalFlu,Berna Biotech Ltd.) (ссылка 4), или (в) использования больших количеств антигена и повторной вакцинации (ссылки 5, 10, 11). Хотя живые вакцины способны индуцировать удовлетворительный иммунный ответ, их специфический характер, связанный с тем, что вакцина содержит живой вирус, служит причиной дополнительных факторов риска и может вызывать побочные эффекты вследствие обязательного цикла вирусной репликации в верхних дыхательных путях. Необходимые условия хранения также ограничивают коммерциализацию этих продуктов. Прочная связь между использованием интраназальных вакцин против гриппа, содержащих термолабильный токсин Е. coli в качестве адъюванта, и параличом лицевого нерва (паралич Белла) ведет к изъятию виросомальных вакцин, адъювированных термолабильным токсином, с рынка (ссылка 6). Эффективность вакцин против гриппа в данной популяции можно оценить путем определения параметров иммуногенности, относящихся к количеству противогриппозных антител, вырабатывающихся после вакцинации. Эти параметры иммуногенности, как правило, обозначаемые как критерии Комитета по медицинским продуктам, предназначенным для человека, используются для ежегодного релицензирования инактивированных вакцин против гриппа (ссылка 7). До настоящего времени не была описана удачная иммунизация людей против гриппа, отвечающая этим иммунологическим требованиям или критериям Комитета по медицинским продуктам, предназначенным для человека (ссылка 7), с однократным интраназальным введением инактивированной вакцины и без добавления адъюванта, являющегося дополнительным ингредиентом вакцины, не полученным из инфекционного агента, от которого вакцина предназначена защищать и который добавлен в состав вакцины с целью усиления иммунного ответа на антиген. Поэтому очевидно, что в данной области сохраняется необходимость в композиции инактивированной вакцины против гриппа, не содержащей адъювант и отвечающей критериям Комитета по медицинским продуктам, предназначенным для человека, при указанном однократном введении, которая способна индуцировать удовлетворительный системный иммунный ответ после однократного интраназального введения (ссылка 7). Указанные критерии Комитета по медицинским продуктам, предназначенным для человека(критерии СНМР) определены ниже. В письме СНМР (Комитета по медицинским продуктам, предназначенным для человека) с правилами согласования требований к вакцинам против гриппа определены следующие серологические параметры для оценки иммуногенности инактивированных вакцин против гриппа: уровень серопротекции, где серопротекция определяется как гемагглютинин-ингибирующий титр(HI) 40,уровень сероконверсии, где сероконверсия определяется как титр HI до вакцинации 10 и титр HI после вакцинации 40 или титр HI до вакцинации 10 при по меньшей мере четырехкратном увеличении титра HI,среднее увеличение (разы), которое представляет собой геометрическое среднее значение межиндивидуальных увеличений (т.е. титр HI после вакцинации/титр HI до вакцинации). Требования СНМР к иммуногенности вакцин против гриппа состоят в том, что для каждого из трех штаммов вируса в вакцине по меньшей мере один из следующих критериев должен присутствовать: Исследование также относится к детям, для которых было показано, что они иммунологически отвечают сравнимым со взрослыми образом (ссылка 8). Изобретение также применимо к пожилым индивидуумам, т.е. индивидуумам, возраст которых старше 60 лет. Описание изобретения Неожиданно и в противоречие данным, полученным на грызунах и в литературе по клиническим испытаниям, проведенным на людях, мы обнаружили, что у людей иммунный ответ после однократной интраназальной вакцинации с помощью инактивированной вакцины против гриппа, содержащей восстановленные вирусные оболочки, соответствовал всем трем критериям СНМР эффективности вакцины против гриппа для возрастной группы 18-60 лет. Одно единичное интраназальное введение представляет собой прививку с помощью вакцинного состава через одну или обе ноздри без необходимости повторять введение вакцинного состава с целью удовлетворить указанным выше критериям СНМР иммуногенности инактивированной вакцины против гриппа. Одно единичное введение вакцины (через назальный,ингаляционный, оральный, подкожный или внутримышечный путь) в основном представляет собой режим вакцинации, который не включает множественное введение вакцины, разделенное во времени днями или неделями, известное в данной области как примирование и повторная иммунизация. Разработанный состав представляет собой состав для интраназального или ингаляционного введения, содержащий смесь одного или нескольких активных компонентов и зксципиенты, приготовленные таким образом,чтобы сделать возможным интраназальное или ингаляционное введение. Настоящее изобретение относится к способу индуцирования системного иммунного ответа (циркулирующие иммуноглобулины или В-клетки, продуцирующие антитела), который находится в соответствии с критериями СНМР, преимущественно с однократным интразальным или ингаляционным введением виросомальной вакцины против гриппа. Настоящее изобретение также относится к способу индуцирования локального иммунного ответа в слизистой, включающему увеличение секреторных иммуноглобулинов, известных как IgA, на поверхности слизистых оболочек преимущественно с помощью однократного интраназального или ингаляционного введения виросомальной вакцины против гриппа. Индукция специфических IgG- и IgA-ответов после интраназального введения касается активности лимфоидной ткани в носовой полости (ссылка 12). Было показано, что такая ткань, известная как ассоциированная с носовой полостью лимфоидная ткань,также является участком слизистой, индуцирующим клеточные иммунные ответы (ссылка 13). Так как было показано, что виросомы обладают способностью вызывать клеточный иммунный ответ (ссылки 14,15), настоящее изобретение также относится к способу индуцирования специфических цитотоксических лимфоцитов (CTL). Виросомы представляют собой липидный бислой, содержащий вирусные гликопротеины. Как правило, виросомы производят путем экстракции мембранных белков и липидов из оболочечных вирусов с помощью детергента, с последующим восстановлением характерного бислоя посредством удаления указанного детергента. Настоящее изобретение также относится к композиции гриппозных виросом, содержащих восстановленные вирусные оболочки (в частности, восстановленные без последующего добавления липидов и без добавления иммуномодулятора или иммуностимулятора (как правило, обозначаемого как адъювант с целью вакцинации через аэрозоль, который наносится на слизистую носоглотки или ротоглотки через одну или обе ноздри для достижения системного и локального иммунитета против гриппа. Также возможно однократное введение через ингаляцию. Также возможно однократное введение на слизистую рта. Восстановленные виросомы гриппа могут быть получены из инактивированного вируса, который может быть растворен в недиализируемом детергенте, удаляемом адсорбцией на гидрофобные бусины. Препарат может содержать очищенную суспензию одного или нескольких антигенов гриппа, выбранных из гемагглютинина (НА), нейраминидазы (NA), производных гемагглютинина и производных нейраминидазы. Мембранные вирусные белки гемагглютинин и нейраминидаза могут быть восстановлены в мембране, состоящей из вирусных липидов, содержащих низкие концентрации эндотоксина и овальбумина(см. ссылку 9). Производные гемагглютинина и/или нейраминидазы представляют собой молекулы гемагглютинина и/или нейраминидазы с измененными аминокислотными последовательностями и/или структурами. Например, аминокислоты могут быть удалены, изменены или добавлены в последовательности. Также могут быть изменены сайты гликозилирования. Производные сохраняют способность индуцировать иммунный ответ при введении в организм хозяина. Вирус гриппа, используемый для получения восстановленных виросом, может быть выращен, например, в куриных яйцах с зародышами, или в клеточной культуре адгезированных клеток, или в клеточной суспензии. Вирус может быть, например, дикого типа, или реассортантом, или генетически мо-2 014532 дифицированным штаммом. Тип вируса, например, может быть любым гриппом подтипа А или В, включая пандемические штаммы. Настоящее изобретение также относится к вакцинам. Термин вакцина нужно понимать как фармацевтический препарат, направленный на иммуноактивацию. В определенных вариантах осуществления изобретения вакцины могут содержать безвредные варианты или производные патогенных микроорганизмов, что, например, стимулирует иммунную систему к установлению защиты против актуального патогена. В определенных вариантах осуществления вакцина, например, вызывает адаптивный иммунитет при введении в организм хозяина. Вакцина может содержать мертвую или аттенуированную форму патогена или компонент патогена, такой как антигенный компонент патогена. Препарат вакцины также может содержать фармацевтический носитель, который может быть разработан для конкретного способа,с помощью которого планируется введение вакцины, такой как фармацевтический носитель, разработанный для интраназального или ингаляционного введения. Вакцина против гриппа может содержать один или несколько неденатурированных антигенов гриппа, один или несколько из которых способны вызывать специфический иммунный ответ на грипп. Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей гриппозные виросомы, содержащие восстановленные оболочки указанного вируса, где композиция разработана для интраназального или ингаляционного введения состава. Изобретение также относится к указанной композиции, в которой виросомы содержат гриппозные антигены гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные. Изобретение также относится к указанной композиции, где вирусные оболочки полностью получены из вирусных частиц. Изобретение также относится к указанной композиции, в которой в восстановленные виросомы не добавляли липиды из внешнего источника. Изобретение также относится к указанной композиции, где в композицию не добавляли отдельные адъюванты и/или иммунные стимуляторы. Изобретение также относится к указанной композиции, где однократное интраназальное или ингаляционное введение состава субъекту способно вызвать системный иммунный ответ. Изобретение также относится к указанной композиции, где однократное интраназальное или ингаляционное введение состава субъекту также способно вызвать локальный иммунный ответ. Изобретение также относится к указанной композиции, где однократное интраназальное или ингаляционное введение состава субъекту также способно вызвать ответ цитотоксических лимфоцитов. Изобретение также относится к указанной композиции, где способность вызвать системный иммунный и/или локальный иммунный ответ и/или ответ цитотоксических лимфоцитов проявляется у человека. Изобретение также относится к указанной композиции, где иммунный ответ включает иммунный ответ, направленный против гриппозных антигенов гемагглютинина и/или нейраминидазы или их производных. Изобретение в предпочтительном варианте осуществления также относится к указанной композиции, где иммунный ответ соответствует критериям СНМР для вакцины против гриппа. Изобретение также относится к указанной композиции, где иммунный ответ обеспечивает один или несколько уровней серопротекции 70% для взрослых и/или 60% для пожилых,уровень сероконверсии 40% для взрослых и/или 30% для пожилых и среднее увеличение 2,5 для взрослых и/или 2,0 для пожилых. Изобретение в особо предпочтительном варианте осуществления также относится к указанной композиции, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении равна 30 мкг или менее. Наконец, изобретение также относится к указанной композиции, где композиция представляет собой вакцинный состав, содержащий фармацевтический носитель для интраназального или ингаляционного введения. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению гриппозных виросом, содержащих восстановленные оболочки указанного вируса, для производства композиции для интраназального или ингаляционного введения. Изобретение также относится к указанному применению, в котором гриппозные виросомы содержат гриппозные антигены гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные. Изобретение также относится к указанному применению, где вирусные оболочки полностью получены из частиц вируса гриппа. Изобретение также относится к указанному применению, в котором к композиции гриппозных виросом не добавляли липиды из внешнего источника. Изобретение также относится к указанному применению, в котором к композиции не добавляют отдельные адъювант и/или иммунный стимулятор. Изобретение также относится к указанному применению, где однократное интраназальное или ингаляционное введение композиции субъекту является достаточным для индукции системного иммунного ответа. Изобретение также относится к указанному применению, где однократное интраназальное или ингаляционное введение композиции также вызывает локальный иммунный ответ. Изобретение также относится к указанному применению, где однократное интраназальное или ингаляционное введение также вызывает ответ цитотоксических лимфоцитов. Изобретение также относится к указанному применению, где субъектом, получающим назначение, является человек. Изобретение также относится к указанному применению, где композиция вызывает иммунный ответ, включающий иммунный ответ, направленный против гриппозных антигенов гемагглютинина и/или нейраминидазы или их производных. Изобретение в предпочтительном варианте осуществления также относится к указанному применению, где композиция вызывает иммунный ответ, который находится в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа. Изобретение также относится к указанному применению, где иммунный ответ обеспечивает один или несколько уровней серопротекции 70% для взрослых и/или 60%-3 014532 для пожилых, уровень сероконверсии 40% для взрослых и/или 30% для пожилых и среднее увеличение 2,5 для взрослых и/или 2,0 для пожилых. Изобретение в особо предпочтительном варианте осуществления также относится к указанному применению, где введенная посредством интраназального или ингаляционного введения доза гемагглютинина на один вирусный штамм равна или меньше чем 30 мкг. В заключение, изобретение также относится к указанному применению, где произведенная композиция является вакцинным составом. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции гриппозных виросом, содержащих восстановленные оболочки указанного вируса, где вирусные оболочки полностью получены из гриппозных вирусных частиц, где в восстановленные виросомы не добавляли липиды из внешних источников, где виросомы содержат гриппозные антигены гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные, где к композиции не добавляли отдельный адъювант и/или иммунный стимулятор, и где композиция разработана в качестве состава для интраназального или ингаляционного введения, композиция которого характеризуется тем, что однократное интраназальное или ингаляционное введение указанного состава человеку способно вызвать системный и/или локальный иммунный ответ против указанных гриппозных антигенов, каковой системный ответ находится в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа, и где доза гемагглютинина на один вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении равна или меньше чем 30 мкг. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к применению гриппозной виросомы, содержащей восстановленные оболочки указанного вируса, для производства композиции для интраназального или ингаляционного введения, где вирусные оболочки полностью получены из гриппозных вирусных частиц, где в восстановленные виросомы не добавляли липиды из внешнего источника, где виросомы содержат гриппозные антигены гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные, и где в композицию не добавляли отдельные адъювант и/или иммунный стимулятор, при этом применение указанной гриппозной виросомы для производства композиции для интраназального или ингаляционного введения характеризуется однократным интраназальным или ингаляционным введением композиции человеку, достаточным для индукции системного и/или локального иммунного ответа против указанного гриппозного антигена, причем ответ находится в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа и где доза гемагглютинина на один вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 30 мкг. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к вакцинному составу, содержащему композицию гриппозных виросом, содержащих восстановленные оболочки указанного вируса, где вирусные оболочки полностью получены из гриппозных вирусных частиц, где в восстановленные виросомы не добавляли липиды из внешнего источника, где виросомы содержат гриппозные антигены гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные, где в композицию не добавляли отдельный адъювант и/или иммунный стимулятор, при этом вакцина характеризуется тем, что разработана для однократного интраназального или ингаляционного введения человеку, и где доза гемагглютинина на один вирусный штамм при однократном интраназальном или ингаляционном введении менее или равна 30 мкг. Преимущественно указанное однократное интраназальное или ингаляционное введение состава способно вызывать системный и/или локальный иммунный ответ у указанного выше человека. В соответствии с настоящим изобретением также предоставляется устройство, содержащее количество указанного вакцинного состава для однократного интраназального или ингаляционного введения. По настоящему изобретению введенная доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении также может быть ниже или равна 25, 20, 15, 10 или 5 мкг. Используемая литератураLPP виросомальная вакцина у 8-недельных мышей balb/c; интраназальное сравнение различных уровней HA/LPP при субоптимальных уровнях дозы НА. Группы из 10 серонегативных к гриппу самок мышей Balb/c получили LPP (липопептидную) виросомальную вакцину посредством интраназального введения, при соотношениях HA/LPP 1:1,5, 1:0,7,1:0,4, 1:0 (т.е. без LPP) и с 2 мкг НА в дозе. Кроме того, контрольная группа из 10 самок мышей получила 0 мкг НА/доза (интраназальное введение наполнителя). Изготовили 4 препарата LPP-содержащих виросом. В кратком изложении, инактивированный вирус гриппа в 30-40% растворе сахарозы был осажден посредством центрифугирования. Вирус ресуспендировали и растворили в буфере, содержащем детергент монододециловый эфир октаэтиленгликоля (OEG). Затем ультрацентрифугированием удалили вирусный нуклеокапсид. OEG-Содержащий супернатант разделили на 4 равных объема и добавили различные количества липопептида P3CSK4 в OEG-содержащем буфере (P3CSK4: N-пальмитоил-3-[2,3-бис(пальмитоилокси)-(2RS)-пропил]-[R]-цистенил-[S]-серил-[S]лизил-[S]-лизил-[S]-лизил-[S]-лизин). Объем был доведен OEG-содержащим буфером. OEG удалили абсорбцией на гидрофобной резине. Это привело к образованию LPP-содержащей виросомы, восстановленные вирусные везикулы содержат НА и NA в своих мембранах и (необязательно) LPP в своих мембранах. После удаления OEG виросомы фильтровали через поливинилдифторидовые мембраны с размером пор 0,22 мкм. Стартовый материал составлял 20 мг НА из гриппа A/Wyoming/3/2003 X-147 (A/Fujian/411/200(H3N2)-подобный штамм), содержащих 252 ME эндотоксина/100 мкг НА. После растворения приготовили 4 порции, как показано в табл. 1. Таблица 1 Получение виросом Носитель составлен из 5 мМ HEPES, 145 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 7,4). Для группы Е (см. табл. 2) носитель фильтровали через поливинилдифторидовые мембраны с размером пор 0,22 мкм. 4 порции полученных виросом разбавили до концентрации 200 мкг/мл для интраназальной и 67 мкг/мл для внутримышечной иммунизации, и их равные части поместили в 1-мл бутылочки (по 2 на группу), как показано в табл. 2. Эти группы вакцин использовали, как показано в табл. 4. Носитель: 5 мМ HEPES, 145 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 7,4), фильтрованный через поливинилдифторидовые мембраны с размером пор 0,22 мкм. Анализ состава Использованные для этого исследования составы анализировали по нескольким параметрам, как показано в табл. 3. Таблица 3 Аналитические данные о виросомах, использованных для получения вакцины Метод Лоури: белки образуют голубую окраску после добавления щелочного сульфата меди и фенолового реактива Фолина. Содержание белка определяют по поглощению при 750 нм с применением БСА в качестве эталона.Hartree, E.F. Anal Biochem 48: 422-427 (1972). б Европейская фармакопея: монография 2053 и раздел 2.7.1. в Принцип: каждый фосфолипид содержит один атом фосфора, который можно использовать для количественного определения фосфолипидов. Фосфолипиды разрушают хлорной кислотой, и полученный фосфат образует комплекс с молибдатом, который восстанавливается аскорбиновой кислотой для получения голубой окраски продукта. Окраска определяется с помощью спектрофотометра при 812 нм. Количество фосфолипида в образце количественно определяется с помощью фосфатного калибратора.Chim. Acta 1961; 24: 203-204. г Европейская фармакопея 2.6.14. д Овальбуминовый иммуноферментный твердофазный анализ представляет собой прямой сэндвичевый иммуноферментный анализ, использующий для связывания иммобилизованные поликлональные антитела к овальбумину и антиовальбуминовый HRP конъюгат в качестве системы детекции. Конъюгат и образцы инкубируют одновременно. Не связавшиеся компоненты удаляют на этапе отмывки. Субстрат(ТМВ и Н 2 О 2) добавляли в лунки. Индикатором присутствия специфически связанного конъюгата в лунках было появление голубой окраски. Серную кислоту добавляли к субстрату, чтобы остановить реакцию, что приводило к изменению окраски продукта на желтый цвет. Оптические плотности (OD) определяют при 450 нм. Для оптимальных результатов использовали референтный фильтр при 620 нм. Стандартная кривая, построенная по результатам, полученным на овальбуминовых эталонах (0,3-20,0 нг/мл),включена в анализ. Концентрации неизвестных образов могут быть интерполированы по стандартной кривой.e В соответствии с монографиями 0869 и 2053: чистоту объединенного моновалентного продукта проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле. Электрофорез: в соответствии с Европейской Фармакопеей 2.2.31. Тестовая система Тестовые животные Были использованы семь групп по десять самок мышей Balb/c (BALB/cAnNCrl) в каждой. В начале применения мыши были в возрасте 8-9 недель и весили 17-19 г. Животные были интраназально вакцинированы в нулевой и в 14 день моновалентной LPP виросомальной вакциной против гриппа (A/Wyoming) и были забиты и вскрыты на 21 день после второй вакцинации. Интраназально: тестовые субстанции были инокулированы интраназально (10 мкл были разделены на обе ноздри) под легкой изофуран/О 2/N2O анестезией в положении животного на спине. Таблица 4 Режим введения Перед первой вакцинацией и через 14 дней после первой вакцинации собрали образцы крови из глазницы под изофуран/O2/N2O анестезией. На 35 день все животные были умерщвлены и были собраны образцы крови (обескровливание под О 2/СО 2 анестезией через абдоминальную аорту или пункцию сердца). Сыворотка из всех образцов была собрана, глубоко заморожена и хранилась в полипропиленовых пробирках при -10 С до использования. Вирус гриппа агглютинирует красные клетки крови (RBC), что блокируется в присутствии достаточного количества специфических антител к вирусу. Этот феномен предоставляет основание для теста подавления гемагглютинации, который используется для качественного и количественного определения специфических противовирусных антител в сыворотке. Сыворотки были добавлены к вирусу гриппа и индюшачьим RBC. Был проведен анализ некоторых разведений (титрованием). Титр HI определяли как взаимодействующий титр при наибольшем разведении, который все еще ингибирует гемагглютинацию. Средние геометрические значения титров (СГЗТ) вычислили следующим образом: 1) вычислить индивидуальные log (титров) как среднее арифметическое двух дублетов-7 014532 2) вычислить среднее арифметическое индивидуальных log (титров); 3) СГЗТ (группы) = 10 ЕХР (среднего геометрического log (титров. Статистика Титры HI суммировали по группам вакцинации и дням, используя средние геометрические значения титров. Логарифмированные титры HI 35 дня для групп анализировали с помощью линейной регрессии для изучения взаимосвязи доза-эффект между количеством LPP в вакцине и СГЗТ. Результаты Анализ титров HI СГЗТ приведены в табл. 5. Таблица 5 Средние геометрические значения титров В нулевой день у мышей нельзя было обнаружить специфические антитела к НА (т.е. все титрыHI10). На 14 день у большинства мышей, вакцинированных интраназальным путем, нельзя было обнаружить специфические антитела к НА (И.Н.). Все титры HI были 10, за исключением одной мыши в группе А (титр HI: 80), одной мыши в группе С (титр HI: 35) и одной мыши в группе D (титр HI: 160). На 35 день была замечена зависимость доза-эффект в генерации специфических антител к НА, т.е. добавление большего количества LPP в вакцину приводит к более высоким титрам антител. Титры HI (логарифмированные) 35 дня были сравнены между группами с помощью линейной регрессии. Соответствующий наклон линии регрессии был высокозначимым (Р 0,0001). Таким образом,наблюдавшаяся взаимосвязь доза-эффект между количеством LPP в вакцине и СГЗТ статистически значима. Заключение Повторная интраназальная вакцинация мышей восстановленными виросомами гриппа без адъюванта не вызывает измеримый системный иммунный ответ. Повторная интраназальная вакцинация с использованием восстановленных виросом гриппа, адъювированных LPP при том же уровне дозы НА (2 мкг НА/доза) и с повышением дозы LPP показала системный иммунный ответ, зависящий от дозы LPP. В качестве яркого контраста с настоящим изобретением (см. далее пример 2), ранее эти данные были сочтены подтверждающими для консенсусного мнения в данной области о том, что использование иммуностимулятора (в данном случае LPP) необходимо для интраназальной вакцинации инактивированной вакциной против гриппа, даже если антиген гриппа (НА) представлен в восстановленной виросоме. Пример 2. Двойное слепое, рандомизированное, параллельное групповое исследование с целью исследования безопасности липопептидного адъюванта и его влияния на эффективность виросомальной субъединичной вакцины против гриппа после назального введения молодым взрослым людям в возрасте 18 до 40 лет. Молодые добровольцы были интраназально вакцинированы с адъювантом LPP (липопептидом) виросомами гриппа дозами объемом 0,2 мл (0,1 мл в каждую ноздрю), содержащими 150 мкг НА/мл на штамм и 315 мкг LPP/мл. Сходная группа была интраназально вакцинирована восстановленными виросомами гриппа без LPP дозами объемом 0,2 мл (0,1 мл в каждую ноздрю), содержащими 150 мкг НА/мл на штамм. Целью исследования было подтверждение на людях правильности продемонстрированной на мышах концепции о том, что для получения удовлетворительного системного иммунного ответа после интраназальной вакцинации инактивированной вакциной против гриппа требуется использование адъюванта (например LPP). План исследования Это было двойное слепое, рандомизированное, параллельное групповое исследование на молодых здоровых субъектах в возрасте 18 до 40 лет. Исследование проводили в одном исследовательском центре: Swiss Pharma Contract Ltd., Basel, Switzerland. Главным исследователем был доктор М. Сейберлинг. Исследование состояло из двух частей. В первой части безопасность LPP виросомальной субъединичной вакцины против гриппа с адъювантом оценивали на 12 субъектах. Девять субъектов были вакцинированы LPP-RVM (LPP с восстановленными вирусными мембранами; поверхностный антиген вакцины против гриппа, инактивированный, виросомы, LPP с адъювантом) и три субъекта были вакцинированы RVM(поверхностный антиген вакцины против гриппа, инактивированный, виросомы). Во второй части исследования эффективность и безопасность вакцины LPP-RVM оценивали на одной тысяче субъектов (по 50 в группе). Исследование проводилось на здоровых субъектах. Кроме того, субъекты, участвующие во второй части исследования, не вакцинировались против гриппа в течение трех лет перед началом исследования. Это повышает гомогенность исследуемой во второй части исследования популяции посредством минимизации количества субъектов с уже существующими антителами к гриппу. Первая часть. В течение 14 дней до вакцинации (посещение 1), после того как субъект дал информированное согласие, он или она были проверены на включающие и исключающие критерии и прошли медицинский осмотр. В это посещение образец клеток назального эпителия взяли для цитологического исследования и измерили базовую активность ресничек эпителия с помощью сахаринового теста. В посещение 2 (день 1) для стандартных гематологических анализов были взяты образцы крови по 4-6 мл, для стандартного биохимического анализа были взяты образцы крови по 6-10 мл и были определены витальные показатели. После рандомизации субъект был вакцинирован одним из двух вакцинных составов и оставался в центре в течение первых 24 ч после вакцинации для наблюдения за немедленными локальными и системными реакциями и побочными эффектами. Витальные показатели оценивали через 4 и через 24 ч после вакцинации. Кроме того, после 24 ч были взяты два образца крови для стандартных гематологического (4-6 мл) и биохимического (6-10 мл) анализов; образец клеток назального эпителия взяли для цитологического исследования и измерили базовую активность ресничек эпителия с помощью сахаринового теста. Субъекты получили опросный лист (опросный лист 1), чтобы они на следующий день дома оценили локальные и системные реакции (день 3). Субъект должен был вернуться к месту проведения исследования через два дня после того как их отпустили. Посещение 3 (день 4). В это посещение оценивали локальные и системные реакции и были записаны любые спонтанные побочные эффекты, которые проявились между предыдущим и настоящим посещением. Кроме того, были взяты два образца крови для стандартных гематологического (4-6 мл) и биохимического (6-10 мл) анализов и определены жизненные показатели. Субъекты вернулись к месту проведения исследования через две недели после первой вакцинации на 15 день (посещение 4). В это посещение образец клеток назального эпителия взяли для цитологического исследования и измерили базовую активность ресничек эпителия с помощью сахаринового теста и были записаны побочные эффекты, проявившиеся между посещением 3 и посещением 4. Вторая часть. В течение 14 дней перед первым забором крови и смыва из носовой полости (посещение 1), после того как субъект дал информированное согласие, он или она были проверены на включающие и исключающие критерии и его или ее здоровье было проверено на медицинском осмотре. В посещение 2 (день 1) (это посещение может быть объединено с посещением 1) были взяты образцы крови от 6 до 10 мл для определения базовых значений титров ингибирования гемагглютинации и были взяты образцы крови для стандартных гематологического (4-6 мл) и стандартного биохимического(6-10 мл) анализов. Для определения базового титра назальных антител IgA был собран образец назального смыва. На следующий день, в посещение 3 (день 1) после определения витальных показателей, субъекты были рандомизированы, чтобы быть вакцинированными однократной дозой одного из двух составов назальной вакцины против гриппа. Любые немедленные локальные реакции, системные реакции и побочные эффекты отслеживались на месте в течение первого часа после вакцинации. После этого витальные показатели были вновь определены, и субъект получил домой опросный лист для ежедневных записей о локальных и системных реакциях в течение первых семи дней после вакцинации. Двумя неделями позднее (посещение 4; день 15) был взят образец крови 6-10 мл для определения титра HI, были взяты два дополнительных образца крови для стандартных гематологического (4-6 мл) и биохимического (6-10 мл) анализов, образец назального смыва был взят для титра назальных IgA антител. Оценка эффективности Для оценки эффективности образцы крови и образцы назального смыва были собраны в день -1 (базовый) и день 15. Образцы крови Образцы крови от 6 до 10 мл для определения титров антител, ингибирующих гемагглютинацию(HI) (Palmer D.F., Dowdle W.R., Coleman M.T., Schild G.C. Hemagglutination Inhibition Test, Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis. U.S. Dept. Hlth. Ed. Welfare, P. H. S. Atlanta; 1975:25-62). После забора крови и коагуляции (не менее 30 мин при комнатной температуре) сыворотки были отделены и заморожены (-20C) до титрования. Титрование антител было выполнено в дублете. Определенные в образцах титры представляли собой средние геометрические значения двух измерений. Сыворотки, полученные до и после вакцинации, титровались одновременно.-9 014532 Образцы назального смыва Для сбора образцов назального смыва 6 мл предварительно подогретого (37 С) физиологического раствора под риноскопическим контролем были введены в одну ноздрю. Субъекта попросили наклонить голову под углом в 60, так что смывная жидкость могла вытечь. Собранный смыв был введен во вторую ноздрю, которая была промыта таким же образом. К образцам добавили консервирующий раствор(1/100-я от объема образца). Консервирующий раствор содержал 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, растворенного в 100 мМ Tris-HCl буфере, рН 8. Образцы были сразу очищены низкоскоростным центрифугированием (10 мин при 800g), разделены на равные части (во избежание в будущем повторного оттаивания образцов) и помещены в сухой лед -80 С перед перевозкой. Уровни IgA в образцах назального смыва определяли твердофазным иммуноферментным анализом и статистически анализировали с помощью критерия Уилкоксона. Вакцина против гриппа использовалась в качестве покрывающего антигена в 96-ячеечных планшетах. Неспецифические сайты связывания были блокированы при инкубации с помощью блокирующего буфера. Назальные смывы использовались в двукратном разведении (12 разведений на образец) в блокирующем буфере для абсорбции специфичных к гриппу антител на антигенах 96-ячеечного планшета. Перед инкубацией 96-ячеечные планшеты были отмыты с ферментами, конъюгированными с противочеловеческими антителами (конъюгированная пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза). Не связанные противочеловеческие антитела были удалены при отмывке и количество штаммоспецифичных антител против гриппа определили путем измерения оптической плотности после добавления субстрата для ферментативной реакции. Вакцинный состав В этом исследовании использовались два разных состава вакцины против гриппа. Оба состава содержали вирусные антигены, как рекомендовано ВОЗ для южного полушария в 2005 г. (WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2005 influenza season. Weekly Epidem Rec. 2004;79:369-376) при уровнях дозы 30 мкг на штамм в дозе 0,2 мл.A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-подобный штамм,A/Wellington/1/2004 (H3N2)-подобный штамм,B/Shanghai/361/2002-подобный штамм. В кратком изложении, инактивированный вирус гриппа был осажден в 30-40% растворе сахарозы посредством центрифугирования. Вирус был ресуспендирован и растворен в буфере, содержащем детергент монододециловый эфир октаэтиленгликоля (OEG). Впоследствии вирусный нуклеокапсид был удален ультрацентрифугированием. В OEG-содержащий супернатант добавили липопептид P3CSK4 в OEGсодержащем буфере или только OEG-содержащий буфер в случае не содержащих LPP восстановленных вирусных мембран (P3CSK4: N-пальмитоил-S-[2,3-бис(пальмитоилокси)-(2RS)-пропил]-[R]-цистеинил[S]-серил-[S]-лизил-[S]-лизил-[S]-лизил-[S]-лизин). OEG был удален абсорбцией на гидрофобную резину. Это привело к образованию LPP-содержащих или не содержащих LPP восстановленных вирусных мембран (восстановленные вирусные везикулы с НА и NA в их мембранах и, необязательно, LPP в их мембранах). После удаления OEG виросомы были отфильтрованы через поливинилдифторидовую мембрану с размером пор 0,22 мкм. Для каждого штамма вируса был сделан отдельный препарат как с LPP, так и без LPP (табл. 6). Количества добавленного LPP соответствовали соотношению HA/LPP 1:0,7 (мас./мас.). Метод Лоури: белки образуют голубую окраску после добавления щелочного сульфата меди и фенолового реактива Фолина. Содержание белка определяют по поглощению при 750 нм с применением БСА в качестве эталона.Hartree, E.F. Anal Biochem 48: 422-427 (1972). б Европейская фармакопея: монография 2053 и раздел 2.7.1. в Принцип: каждый фосфолипид содержит один атом фосфора, который можно использовать для количественного определения фосфолипидов. Фосфолипиды разрушают хлорной кислотой и полученный фосфат образует комплекс с молибдатом, который восстанавливается аскорбиновой кислотой для получения голубой окраски продукта. Окраска определяется с помощью спектрофотометра при 812 нм. Количество фосфолипида в образце количественно определяется с помощью фосфатного калибратора.Anal. Chim. Acta 1961; 24: 203-204. г Европейская фармакопея 2.6.14. д Овальбуминовый иммуноферментный твердофазный анализ представляет собой прямой сэндвичевый иммуноферментный анализ, использующий для связывания иммобилизованные поликлональные антитела к овальбумину и антиовальбуминовый HRP конъюгат в качестве системы детекции. Конъюгат и образцы инкубируют одновременно. Не связавшиеся компоненты удаляют на этапе отмывки. Субстрат(ТМВ и Н 2 О 2) добавляли в лунки. Индикатором присутствия специфически связанного конъюгата в лунках было появление голубой окраски. Серную кислоту добавляли к субстрату, чтобы остановить реакцию, что приводило к изменению окраски продукта на желтый цвет. Оптические плотности (OD) определяют при 450 нм. Для оптимальных результатов использовали референтный фильтр при 620 нм. Стандартная кривая, построенная по результатам, полученным на овальбуминовых эталонах (0,3-20,0 нг/мл),включена в анализ. Концентрации неизвестных образов могут быть интерполированы по стандартной кривой.e В соответствии с монографиями 0869 и 2053: чистоту объединенного моновалентного продукта проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле. Электрофорез: в соответствии с Европейской Фармакопеей 2.2.31. Эффективность На вирусный штамм логарифмированные титры HI антител на 15 день и титры назальных IgA антител на 15 день сравнивались между двумя группами посредством критерия суммы рангов Уилкоксона при двустороннем уровне значимости 0,05. Титры HI антител на 15 день также оценивались посредством вычисления следующих трех параметров для вирусного штамма и для группы вакцинации: уровень серопротекции, где серопротекция определяется как HI титр 40,уровень сероконверсии, где сероконверсия определяется как титр HI до вакцинации 10 и титр HI после вакцинации 40 или титр HI до вакцинации 10 при по меньшей мере четырехкратном увеличении титра HI,среднее увеличение, которое представляет собой геометрическое среднее значение увеличений титра HI. Данные об эффективности анализировались как в соответствии с протоколом, так и в соответствии с назначенным лечением. Однако исходя из того, что это было так называемое контрольно-проверочное исследование, анализ в соответствии с протоколом был выбран первостепенным. Образец в соответствии с назначенным лечением состоял из вакцинированных субъектов с некоторыми поствакцинационными данными об эффективности. Образец в соответствии с протоколом состоял из вакцинированных субъектов, которые выполнили протокол и у которых не произошло значительных нарушений протокола. Значительные нарушения включали (среди прочих) нарушение во включающих или исключающих критериях и применение запрещенных препаратов. Кроме того, субъекты с лабораторно подтвержденной интеркуррентной инфекцией гриппа и субъекты с недостающими первичными данными об эффективности также были исключены из образца по протоколу. Так или иначе, субъект исключался из образца по протоколу до того, как база данных об исследовании была выведена из слепого метода. Результаты Таблица 8 Оценка гуморального иммунного ответа по СНМР после назальной вакцинации виросомальной вакциной против гриппа (RVM) Уровни серопротекцииRVM: виросомальная вакцина против гриппа- 12014532 Таблица 8 Оценка гуморального иммунного ответа по СНМР после назальной вакцинации виросомальной вакциной против гриппа (RVM) (продолжение) Уровни сероконверсииRVM: виросомальная вакцина против гриппаLPP-RVM: виросомальная вакцина, адъювированная липопептидом Таблица 8 Оценка гуморального иммунного ответа по СНМР после назальной вакцинации виросомальной вакциной против гриппа (RVM) (продолжение) Среднее увеличение титра HI антителRVM: виросомальная вакцина против гриппаLPP-RVM: виросомальная вакцина, адъювированная липопептидом Таблица 9 Титры IgA в назальном смыве (СГЗТ) Заключение Неожиданно и в противоречие с доклиническими данными, полученными для тех же партий вакцины (пример 1) и как описано в WO 04/110486, и клиническими данными (Gluck U., Gebbers J.O., Gluck R.,Phase 1 evaluation of intranasal virosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxinin adult volunteers. J Virol. September 1999; 73 (9):7780-6), удовлетворительный системный иммунный ответ в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа был получен у группы людей, вакцинированных только один раз восстановленной виросомальной вакциной против гриппа без адьюванта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция для однократного интраназального введения человеку, способная вызвать системный и/или локальный иммунный ответ против антигенов гриппа гемагглютинина и/или нейраминидазы или их производных, указанная композиция содержит гриппозные виросомы, полученные из восстановленных оболочек указанного вируса, где вирусные оболочки полностью получены из гриппозных вирусных частиц,к восстановленным виросомам не добавлены липиды из внешних источников,виросомы содержат гриппозный гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные,доза гемагглютинина на вирусный штамм при однократном интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 30 мкг,характеризующаяся тем, что в композицию не добавлен отдельный адъювант и/или иммуностимулятор.- 13014532 2. Композиция по п.1, где однократное интраназальное или ингаляционное введение состава также способно вызвать ответ цитотоксических лимфоцитов. 3. Композиция по п.1 или 2, где иммунный ответ находится в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа. 4. Композиция по п.3, где иммунный ответ обеспечивает один или более из следующего: уровень серопротекции 70% у взрослых и/или 60% у пожилых, уровень сероконверсии 40% у взрослых и/или 30% у пожилых и среднее увеличение 2,5 для взрослых и/или 2,0 для пожилых. 5. Композиция по любому из пп.1-4, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 25 мкг. 6. Композиция по любому из пп.1-4, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 20 мкг. 7. Композиция по любому из пп.1-4, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 15 мкг. 8. Композиция по любому из пп.1-4, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 10 мкг. 9. Композиция по любому из пп.1-4, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 5 мкг. 10. Применение гриппозных виросом, полученных из восстановленных оболочек указанного вируса, в производстве композиции для однократного интраназального введения человеку, способной вызвать системный и/или локальный иммунный ответ против антигенов гриппа гемагглютинина и/или нейраминидазы или их производных, где указанная композиция содержит гриппозные виросомы, полученные из восстановленных оболочек указанного вируса, где вирусные оболочки полностью получены из гриппозных вирусных частиц,к восстановленным виросомам не добавлены липиды из внешних источников,виросомы содержат гриппозный гемагглютинин и/или нейраминидазу или их производные,доза гемагглютинина на вирусный штамм при однократном интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 30 мкг,характеризующаяся тем, что в композицию не добавлен отдельный адъювант и/или иммуностимулятор. 11. Применение по п.10, где однократное интраназальное или ингаляционное введение состава также способно вызвать ответ цитотоксических лимфоцитов. 12. Применение по п.10 или 11, где иммунный ответ находится в соответствии с критериями СНМР для вакцин против гриппа. 13. Применение по п.12, где иммунный ответ обеспечивает один или более из следующего: уровень серопротекции 70% у взрослых и/или 60% у пожилых, уровень сероконверсии 40% у взрослых и/или 30% у пожилых и среднее увеличение 2,5 для взрослых и/или 2,0 для пожилых. 14. Применение по любому из пп.10-13, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 25 мкг. 15. Применение по любому из пп.10-13, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 20 мкг. 16. Применение по любому из пп.10-13, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 15 мкг. 17. Применение по любому из пп.10-13, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 10 мкг. 18. Применение по любому из пп.10-13, где доза гемагглютинина на вирусный штамм при интраназальном или ингаляционном введении меньше или равна 5 мкг. 19. Применение по любому из пп.10-18, где промышленно произведенная композиция представляет собой вакцинный состав. 20. Вакцинный состав, содержащий композицию по любому из пп.1-9. 21. Устройство для интраназального или ингаляционного введения, содержащее вакцинный состав по п.20 и механизм для аэрозолизации вакцины. 22. Устройство по п.21, где устройство содержит количество вакцинного состава для однократного интраназального или ингаляционного введения. 23. Устройство по любому из пп.21-22, где устройство является одноразовым.