Способ очистки вирусов с помощью хроматографии

1 Изобретение касается области очистки вирусов, и более конкретно, очистки вирусов, полученных путем культивирования в линиях клеток. Вирусный материал, полученный при культивировании в линиях клеток, таких как клетки Vero, содержит не только желаемые вирусы, но также и белки, и ДНК, относящиеся к клеточной культуре. Однако когда вирусы предназначены для некоторых целей, таких как производство вакцин, существенно, чтобы они были как можно более чистыми. Это связано с тем, что существуют стандарты, которые ограничивают до 100 - 1012 г/дозу вакцины разрешенное количество клеточной ДНК в вакцинах,содержащих продукты, полученные в результате длительного культивирования гетероплоидных клеточных линий. Способы очистки вирусов известны в этой области технологии. Так, в патенте США 4664912 раскрывается, в частности, способ очистки вируса бешенства путем зонного центрифугирования в градиенте сахарозы. Однако такой способ обладает тем недостатком, что его трудно автоматизировать; кроме того, необходима предварительная стадия инактивации, которая может приводить к взаимодействию между вирусной и клеточной ДНК, что затем делает стадию удаления этой ДНК более трудной. В этом источнике также раскрывается способ очистки, сочетающий стадию гель фильтрации и стадию ионообменной хроматографии. Однако такой метод очистки не дает возможности максимального удаления клеточной ДНК. Одной из задач этого изобретения является разработка способа очистки вирусов с высоким выходом, который позволяет легко автоматизировать процесс. Другой задачей изобретения является разработка способа очистки вирусов,который позволяет недеградирование вируса. Поставленные задачи достигаются данным способом очистки вирусов, полученных из культуры в клеточной линии, причем этот способ состоит в отделении вирусов от клеточных белков и ДНК, относящихся к культуре путем ионообменной хроматографии, причем он включает, по меньшей мере, одну стадию анионообменной хроматографии и одну стадию катионообменной хроматографии. В соответствии со специфической особенностью способа согласно изобретению стадия катионообменной хроматографии проводится после стадии анионообменной хроматографии. Таким образом, получен оптимизированный выход после очистки по сравнению с обратным порядком стадий. В соответствии с конкретным осуществлением, способ согласно изобретению также включает стадию аффинной хроматографии хелатирования металлом. Таким образом, количество остаточной ДНК действительно снижается до минимума. 2 Другое предпочтительное осуществление способа согласно изобретению состоит в проведении всех стадий хроматографии при одном и том же значении рН. Таким образом, возможно легко автоматизировать этот способ и существенно снизить его стоимость, при сохранении в тоже самое время его эффективности. Изобретение будет более понятно после детального ознакомления с описанием, которое следует ниже. Вирусы, которые будут очищаться по способам этого изобретения, являются вирусами,полученными с помощью линий клеток, в частности, непрерывных и гетероплоидных клеточных линий, которые, таким образом, могут подвергнуться связывают с клеточной ДНК. Этими вирусами, в частности, могут быть вирус бешенства, вирус японского энцефалита или вирус гриппа. Эти вирусы, которые нужно очистить,могут быть получены путем культивирования в клетках Vero на микроносителях. Это относится, например, к вирусу бешенства, полученного путем культивирования, как описано в патенте США 4664912. Вирусный материал фильтруют и затем обрабатывают в соответствии с этим изобретением путем анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Анионообменной хроматографией может быть обменная хроматография слабых анионов,проводимая, например, с использованием геля,содержащего диэтиламиноэтиловый радикал: гель ДЭАЭ Spherodex, продаваемым Sepracor,ДЭАЭ-сефарозный гель, продаваемый Pharmacia, гель ЭМД ДЭАЭ (EMD DEAE), продаваемый Е. Merck. Хотя это не является общепринятым для удаления нуклеиновых кислот,предпочтительно использовать ионообменную смолу с сильным анионом, такую как один из следующих гелей: гель высокого Q, продаваемый Bio-Rad, Q сефарозный гель, продаваемыйMerck. Все эти гели могут использоваться в трисбуфере или в фосфатном буфере. Выгодно использовать гель, который обеспечивает увеличение количества катионной группы, как в случае EMD ТМАЕ от Е. Merck, в котором есть цепи из 15 - 25 элементарных звеньев следующего мономераCH2-CHCONH (CH2)2N+ (СН 3)3. Подобным же образом по способу этого изобретения стадия катионообменной хроматографии предпочтительно проводится с использованием геля, который обеспечивает большую доступность анионной группы, как в случаеEMD SО 3, продаваемой Е. Merck, который имеет цепи из 15 - 25 элементных единиц следующего мономера СН 2-СНСОNН-С(СН 3)2 СН 2SO3. Этот гель также может быть уравновешен трис-буфером или фосфатным буфером. 3 В соответствии с предпочтительным осуществлением этого изобретения анионообменная хроматография осуществляется перед катионообменной хроматографией, причем элюат после первой хроматографии после необязательного разведения вводится непосредственно на вторую хроматографическую колонку. Этот порядок операции позволяет оптимизировать процесс удаления клеточной ДНК. Вирусная суспензия, полученная путем элюирования с колонки катионообменной хроматографии, имеет степень чистоты, которая уже достаточна в отношении стандартов, установленных для использования вирусов в производстве вакцин. Однако в соответствии с предпочтительным осуществлением этого изобретения к способу очистки, приведенному выше, добавляется дополнительная стадия аффинной хроматографии с использованием хелатирования металлом,например, с ионом Са 2+ в качестве иона металла. Эта хроматография может проводиться с использованием агарозного геля в качестве носителя хелатирования, такого как хелатирующий гель сефарозы FF, продаваемый Pharmacia, которая имеет следующую структуру сефаpоза 6FF) Фоpм) По методу этого изобретения эта стадия хелатирования выполняется с предыдущими двумя стадиями ионообменной хроматографии,причем элюат с катионообменной смолы вводится непосредственно на колонку хелатной хроматографии. Во время этой стадии клеточная ДНК остается связанной, тогда как вирус проходит через гель без удерживания. Эта дополнительная стадия делает возможным связывание, по меньшей мере, половины оставшейся ДНК, которая, по общему признанию, уже присутствует в очень малом количестве, но которую, с другой стороны, на этой стадии очень трудно удалить. Вирусную суспензию, очищенную таким образом, разводят стабилизатором и затем инактивируют любым известным из уровня техники методом, например, с помощью -пропиолактона, перед концентрированием и лиофильной сушкой, так чтобы затем смешать с другим материалом, полученным из той же самой культуры клеток Vero, и который будет образовывать ту же самую производственную серию. Вакцины, производимые из таких вирусов,инъекционно вводят людям, и они хорошо переносятся. Кроме того, их защитное действие на животных было подтверждено эффективностью при испытании, проведенном на мышах, результаты которого были положительными. В соответствии с этим изобретением возможно, что неожиданно и очень выгодно, проводить всю очистку при комнатной температуре, последо 001414 4 вательно и всегда при одном и том же рН, что делает метод простым, легко автоматизируемым и надежным, в частности, возможно проводить весь способ в соответствующих условиях стерильности. На основании этого способа очистки в целом получают недеградированные вирусы, чьи спикулы видны с помощью электронного микроскопа с очень высокой степенью чистоты. Пример 1. Колонку для анионообменной хроматографии готовят путем введения геля EMD ТМАЕ, продаваемого Е. Merck, в колонку, через которую сначала пропускают 1 М раствор гидроксида натрия (NaOH) в целях дезинфекции. Колонку затем уравновешивают 20 мМ трисбуфера при рН 7,5. Колонку для катионообменной хроматографии готовят путем введения геля EMS SО 3,продаваемого Е. Merck, в колонку, через которую пропускают 1 М раствор гидроксида натрия, с последующим пропусканием 20 мМ трис-буфера с рН 7,5. Колонку для аффинной хроматографии с хелатированием металлом готовят путем введения хелатирующего геля сефарозы FF, продаваемого Pharmacia, в колонку, через которую пропускают 1 М гидроксид натрия, а затем воду, с последующей ее загрузкой CaCl2 при 3 г/л; колонку затем промывают водой, после чего через нее пропускают 0,5 М NaCl, 20 мМ трисбуфера при рН 7,5. Пример 2. Материал вируса бешенства, культивированного на клетках Vero фильтруют с использованием мембраны, порог разделения которой равен 0,65 мкм, и затем мембраны, чей порог разделения равен 0,45 мкм. Этот материал состоит из суспензии вируса в культуральной среде, содержащей также клеточную ДНК, а также белки, происходящие как из клеток Vero, так и из культуральной среды. Отфильтрованный неочищенный материал пропускают через колонку для анионообменной хроматографии, приготовленной как описано в примере 1. Несвязавшуюся часть, содержащую белки и ДНК, собирают на выходе с колонки для исследования. Колонку промывают 0,1 М раствором NaCl, 20 мМ трис-буфера с рН 7,5, и связавшиеся вирусы затем элюируют путемпропускания 0,4 М NaCl, 20 мМ трис-буфера с рН 7,5 через колонку до тех пор, пока не пройдет характерный для вирусов пик. Элюат с первой колонки разводят до 1/4 последовательно 20 мМ трис-буфером с рН 7,5 и затем вводят в колонку для катионообменной хроматографии,подготовленной в соответствии с примером 1. Несвязавшуюся часть с этой второй колонки собирают для исследования. Когда весь элюат с первой колонки, содержащий вирус, пройдет через вторую колонку, ее промывают 0,1 М шиеся вирусы затем элюируют путем пропускания 0,5 М NaCl, 20 мМ трис-буфера до тех пор,пока не пройдет характерный для вирусов пик. Элюат с этой второй колонки вводят непосредственно, без разведения, на колонку для аффинной хроматографии с хелатированием металлом, подготовленную в соответствии с примером 1. На этот раз комплексы ДНК с ионами Са остаются на колонке, тогда как вирус проходит через колонку и его собирают на выходе, чтобы соединить со стабилизатором и инактивировать. ДНК, образовавшую комплексы с ионами Са, элюируют путем пропускания через колонку 50 мМ раствора ЭДТУ. Колонки для ионообменной хроматографии регенерируют путем пропускания 1 МNaCl, 20 мМ трис-буфера с рН 7,5, и дезинфицируют 1 М гидроксидом натрия перед использованием для очистки другого материала из той же самой культуры, который весь будет объединен, чтобы составить одну производственную(партию) серию. Пример 3. Количество очищенных клеточных белков и ДНК определяют в каждой партии полученного материала, после каждой стадии хроматографии. Общее количество белков определяют с помощью метода Лоури, а общее количество ДНК определяют с использованием прибора для сравнения с предельными размерами (Thresholdmachine) из устройства для исследования молекул (Molecular Device). Полученные результаты, с учетом среднего выхода на стадию для каждого материала культуры, выражали как остаточный процент для каждой из стадий этого способа очистки,являются следующими Выход, % Анионообменная колонка Катионообменная колонка Колонка для аффинной хроматографии с хелатированием металлом Общее Общее количе- количество ство белков ДНК 0,02 В целом, с помощью очистки согласно изобретению остается только 0,004% клеточной ДНК и 1,4% белков, присутствующих в неочищенном материале. Таким образом, проводимая очистка полностью удовлетворительна. Инфекционность полученных вирусов также подтверждается на каждой стадии путем измерения их инфицирующего титра по ССID50 6 и просмотру с помощью электронного микроскопа. Наблюдается, что интеграционная способность вирусов хорошо сохраняется во время всего осуществления этого способа. Когда вирусы, полученные таким способом, используются при производстве вакцин против бешенства, возможно получить дозы,содержащие не более чем 30-4010-12 г клеточной ДНК на дозу, что значительно меньше количества, регламентируемого стандартом 10010-12 г. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ очистки вирусов, полученных в культуре клеток, предусматривающий отделение вирусов путем ионообменной хроматографии от клеточных белков и ДНК, отличающийся тем, что он включает проведение, по меньшей мере, одной стадии анионообменной хроматографии и одной стадии катионообменной хроматографии. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения анионообменной хроматографии используют сильные анионы. 3. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что для проведения катионообменной хроматографии используют сильные катионы. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что стадию катионобменной хроматографии проводят после стадии анионобменной хроматографии. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что он включает проведение дополнительной стадии аффинной хроматографии,основанной на хелатировании металлом. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что хелатирование металлом основано на использовании ионов кальция. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что вирусы, подлежащие очистке,получены путем культивирования в непрерывных гетероплоидных клеточных линиях. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что вирусы, подлежащие очистке,получены в культуре клеток Vero. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что вирусы, подлежащие очистке,представляют собой вирусы бешенства. 10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что вирусы, подлежащие очистке,представляют собой вирусы японского энцефалита. 11. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что вирусы, подлежащие очистке,представляют собой вирусы гриппа. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что все стадии хроматографии проводят при одном и том же значении рН. 13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что он является совмещенным способом. 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что его осуществляют при комнатной температуре. 8 15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что его осуществляют в стерильных условиях.