Подавление зависимости опухолевых клеток от фактора роста

005945 Изобретение относится к применению ингибиторов рецептора прогестерона для подавления зависимости опухолевых клеток от фактора роста. Эстрадиол и прогестерон вовлечены в развитие рака грудной железы. Однако при диагностике примерно только у 1/3 опухолей обнаруживается зависимость от стероидных гормонов. Предполагается,что в большинстве опухолей, резистентных к стероидным гормонам, пролиферативный контроль местнодействующих аутокринных и паракринных пептидных факторов роста ослабляется. В этом случае возникают инвазивные опухоли с чрезвычайно плохим прогнозом, которые являются положительными по рецепторам фактора роста и резистентными к стероидным гормонам (Elledge и др., Semin. Oncol. 19(1992)244-253). Факторы роста регулируют клеточный рост путем активации внутриклеточных путей передачи сигнала после связывания на клеточной поверхности с высоко аффинными рецепторами тирозинкиназы. Более поздние данные позволяют предположить, что клетки карциномы грудной железы могут быть сенсибилизированы прогестинами к митогенному действию EGF (эпидермального фактора роста) (Groshong и др., Mol. Endocrinol. 11 (1997) 1593-1607). Так, например, прогестерон может индуцировать вхождение клеток линии T47D человеческой карциномы грудной железы в S-фазу, сопровождаемое временным повышением активности циклина 1D и циклинзависимой киназы 4. Однако стимуляция роста ограничена одним циклом и сопровождается остановкой роста при переходе G1/S второго цикла (Groshong и др., см. выше; Musgrove и др., Mol. Cell. Biol. 13 (1993) 3577-3587). В условиях остановки цикла прогестероном клетки являются чувствительными к пролиферативному действию EGF. Кроме того, показано, что прогестерон усиливает действие EGF на клетки T47D путем возбуждения EGFR, Еrb2 и Еrb3 и усиливает фосфорилирование сигнальных молекул по тирозину. (Lange и др., J. Biol. Chem. 273 (1998), 3130831316; Richer и др., J. Biol. Chem. 273 91998), 31317-31326). В противоположность этому, пока не удалось показать ингибирующего действия EGF на опухолевые клетки путем влияния на рецептор прогестерона. В рамках экспериментов, приводящих к данному изобретению, в настоящее время достаточно неожиданно было обнаружено, что ингибиторы прогестеронового рецептора, например, 17-фторалкилстероиды, могут, по меньшей мере, частично ингибировать связывание факторов роста, таких, как EGF, с опухолевыми клетками, особенно с опухолевыми клетками, которые обладают высокой и/или существенной экспрессией рецептора прогестерона. Таким образом, объектом данного изобретения является применение ингибитора рецептора прогестерона для получения агента, подавляющего связывание факторов роста с опухолевыми клетками и особенно агента, подавляющего пролиферацию опухолевых клеток или опухолей, которые образуются с помощью факторов роста. Ингибитор рецептора прогестерона в терминах данного изобретения предпочтительно означает вещество, которое конкурентно ингибирует связывание прогестерона с его рецептором. В данном случае ингибитор рецептора прогестерона предпочтительно выбирают из 17 фторалкилстероидов, как они раскрыты, например, в WO98/34947. Эти 17-фторалкилстероиды имеют общую формулу I:R1 означает метильную или этильную группу,R2 означает радикал формулы CnFmHо, где n=2, 3, 4, 5 или 6, m1 и m+о=2n+1, R3 означает свободную или этерифицированную в виде простого или сложного эфира гидроксильную группу,R4 и R5 означают каждый атом водорода, вместе дополнительную связь или метиленовую группу,St означает стероидную кольцевую систему ABC или отдельную формулу А, В или С. где R6 означает атом водорода, линейную (С 1-С 4)алкильную группу или разветвленную (С 3-С 4)алкильную группу, или атом галоида,R7 означает атом водорода, линейную (С 1-С 4)алкильную группу или разветвленную (С 3-С 4)алкильную группу, или, если St означает стероидную ABC-кольцевую систему А или В, в дополнение к этомуR6 и R7 означают вместе дополнительную связь,X означает атом кислорода, гидроксииминогруппу =N-OH или два атома водорода,R8 означает радикал Y или арильный радикал, который необязательно замещен группой Y в нескольких положениях, при этомR9a и R9b одинаковые или разные и подобно R9 означают атом водорода или (С 1-С 10)алкильную группу и в случае радикалов -NR9a R9b также их физиологически совместимые соли с кислотами, а в случае радикалов -CO2R, с R9 в значении водорода, также их физиологически совместимые соли с основаниями. Особенно предпочтительным примером таких ингибиторов рецептора прогестерона является соединение 11-(4-ацетилфенил)-17-гидрокси-17-(1,1,2,2,2-пентафторэтил)эстра-4,9-диен-3-он (соединение А ниже). Кроме того, и другие антипрогестины, например, онапристон (11-[n(диметиламино)фенил]-17-гидрокси-17-(3-гидроксипропил)-13-эстра-4,9-диен-3-он) являются тем не менее также пригодными. Действие ингибиторов рецептора прогестерона обнаружено, главным образом, в случае опухолевых клеток с высокой и/или существенной экспрессией прогестеронового рецептора, например, в положительной по рецептору прогестерона линии клеток T47D карциномы грудной железы (Sartorius и др., Cancer Res. 54 (1994), 3668-3877). Ингибиторы прогестеронового рецептора подавляют индуцированное прогестероном усиление экспрессии факторов роста, особенно тех факторов, которые связываются с факторами роста семейства рецепторов EGF, таких, как, например, рецептор EGF. Ингибиторы особенно предпочтительно подавляют связывание EGF с клетками человеческой карциномы грудной железы. Следовательно, в соответствии с данным изобретением ингибиторы рецептора прогестерона могут применяться в терапии опухолей у млекопитающих и предпочтительно у человека, чтобы особенно специфично блокировать прогрессию опухоли, особенно карциному грудной железы на стадии стероидзависимого роста до стадии зависимого от фактора роста развития. При этом может происходить эффективная обработка опухоли на стадии стероид-зависимого роста, например, антиэстрогенами, лишающая опухоль способности прогрессировать на стадии зависимого от фактора роста развития, связанного со значительным ухудшением прогноза для пациента. Введение ингибиторов рецептора прогестерона может также обеспечить замедление опухолевого роста на стадии зависимого от фактора роста развития. Для цели по настоящему изобретению могут быть использованы нестероидные антиэстрогены, такие, как, например, тамоксифен, нафоксидин, ралоксифен и ЕМ 800. Два последних упомянутых антиэстрогена являются представителями, так называемых, SERMs (селективными модуляторами рецептора эстрогена); в соответствии с изобретением могут быть использованы также и другие соединения с типом действия SERMs, например, соединения, которые упоминаются в РСТ/ЕР 99/05093, и из последних, в свою очередь, соединение 5-(4-5-[(RS)-4,4,5,5,5-пентафторпентил)сульфинил]пентилоксифенил)-6 фенил-8,9-дигидро-7H-бензоциклогептен-2-ол. Примеры стероидных антиэстрогенов включают те соединения, которые раскрыты в ЕР 0348341 А,особенно фаслодекс, и те, которые раскрыты в WO 98/07740, особенно 11-фтор-7-5-[N-метил-N-3(4,4,5,5,5-пентафторпентилтиопропиламино]пентилэстра-1,3,5(10)-триен-3,17-диол, или те, которые описаны в WO99/33855, особенно 17-фтор-7-5-[метил-(7,7,8,8,9,9,10,10,10-нонафтордецил)амино] пентилэстра-1,3,5(10)-триен-3,17-диол или их фармацевтически совместимые производные или аналоги. Подобным образом в качестве антиэстрогенов могут быть использованы ингибиторы ароматазы с антиэстрогенным действием, такие как, например, те, которые приведены в ЕР 0495825 В 1 на стр. 7-8. Введение ингибиторов рецептора прогестерона может быть осуществлено в соответствии с общепринятыми способами, например, локально, местно, подкожно, энтерально или парентерально. Для энтерального введения особенно подходят таблетки, таблетки с нанесенным покрытием, капсулы, пилюли,суспензии или растворы, которые могут быть приготовлены обычным способом с прибавлением дополнительных веществ и наполнителей, известных в области галеновых препаратов. Для локального или местного применения пригодны, например, вагинальные суппозитории или трансдермальные системы,такие, как кожные пластыри. Подкожное введение может осуществляться путем инъекции масляного раствора. Стандартная доза может содержать, например, 0,1-100 мг активного соединения или активных соединений (ингибитора или ингибиторов рецептора прогестерона). При введении человеку суточная доза активного соединения или активных соединений составляет приблизительно 0,1-400 мг, предпочтительно приблизительно 10-100 мг и, в частности, приблизительно 50 мг. Кроме того, изобретение должно быть объяснено с помощью следующих примеров и фигур. Фиг. 1 представляет антипролиферативное действие исследуемых веществ на клетки линии T47D карциномы грудной железы.-2 005945 Фиг. 2 представляет количества белка рецептора прогестерона (PR) и рецептора эстрогена (ER) в клетках линии T47D карциномы грудной железы. Фиг. 3 представляет транскрипционную активность рецептора прогестерона в клетках T47D. Фиг. 4 представляет анализ по Скэтчарду связывания EGF с клетками T47D как функции от присутствия исследуемых веществ. Фиг. 5 представляет зависимость связывания EGF с клетками T47D от присутствия исследуемых веществ. Пример. Материалы и способы. Материалы 125I-EGF (100 мКи/ммоль) получали от фирмы Amersham Buchler. Соединение А, 4 гидрокситамоксифен (4-OH-Tam), ZM182780 (Фаслодекс, Зенека Фармасьютикалз, Макклесфилд, Великобритания) и эстрадиол были синтезированы (в Институте химии фармацевтических агентов) ScheringAG в соответствии с известными способами. Линии клеток Использовали клетки линии T47D карциномы грудной железы человека, положительные по рецепторам эстрогена (ER) и прогестерона (PR) (Freake и др., BBRC, 101(1981),1131-1138). Исследования роста Опухолевые клетки культивировали при плотности 5000 клеток/лунку в 96-луночных планшетах в течение 6 дней в среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, 200 нМ инсулина и 0,1 нМ эстрадиола в присутствии соединений, указанных в каждом случае, и оценивали рост клеток путем окрашивания кристаллическим фиолетовым. Количество белка PR и ER Количества PR и ER в клеточных лизатах определяли с использованием анализов связывания стероида с радиоактивно меченым прогестероном или эстрадиолом согласно способам, описанным Fuhrmann и др. (Contraception, 54 (1996), 243-251). Связывание 125I-EGF с опухолевыми клетками Клетки T47D, предварительно обработанные R5020, инкубировали в течение 2 ч с 125I-EGF при 4 С. Неспецифическое связывание составляло во всех случаях менее 10% общего связывания. Трансактивационный анализ Клетки T47D кратковременно трансфиксировали с MTV-LUC (Cato и др., EMBO J., 9:2237-40) и культивировали в отсутствии или в присутствии 1 нМ R5020. В опыте по опосредованному PR антагонизму кратковременно трансфиксированные клетки T47D обрабатывали R5020 и, кроме того, увеличивающимися концентрациями соединения А или RU486. Через 24 ч проводили тест с люциферазой. Результаты Фиг. 1 демонстрирует антипролиферативное действие различных исследуемых веществ. Клетки(нижняя поперечно заштрихованная полоса) 0,1 нМ Е 2 и увеличивающихся концентраций соединения А, онапристона , ZK191703 или 4-ОН-Таm . В случае клеток T47D соединение А проявляет выраженное антипролиферативное действие в чрезвычайно малых концентрациях. Фиг. 2 демонстрирует количества белка PR и ER в клетках T47D. Фиг. 3 демонстрирует транскрипционную активность PR в клетках T47D, на основании чего данные клетки были кратковременно трансфиксированы с MTV-LUC и культивированы (а) в отсутствии (Со) или в присутствии 1 нМ R5020. В тесте на опосредованный PR антагонизм кратковременно трансфиксированные клетки T47D обрабатывали 0,1 нм R5020 и соединением А или RU468 в увеличивающихся концентрациях (б). На фиг. 4 представлен анализ по Скэтчарду связывания 125I-EGF с клетками T47D. Клетки культивировали в течение 48 ч в присутствии 20 нМ R5020 с 20 нМ соединения А или без него и затем промывали. После этого определяли связывание EGF в диапазоне концентраций 0,25-150 нг/мл EGF путем инкубации в течение 2 ч при 4 С. Вставки показывают количество связанных лигандов относительно логарифма концентрации свободного лиганда. Очевидно, что можно было блокировать усиление связыванияEGF, вызываемое R5020 (средняя фигура), относительно контроля (верхняя фигура) при добавлении соединения А (нижняя фигура). На фиг. 5 показано связывание 125I-EGF с интактными клетками T47D. С этой целью клетки обрабатывали в течение 48 ч 2 или 20 нМ R5020 и соединением А или онапристоном или одним соединением А. Здесь также можно видеть, что соединение А блокирует усиление связывания EGF с клетками T47D, вызванное R5020. Подобный, хотя и значительно более слабый эффект, обнаружен также и в случае онапристона. Обсуждение Приведенные выше результаты показывают, что стимулированный эстрадиолом рост клеток T47D при интенсивном и существенном контакте с PR был эффективно блокирован соединением А. С помощью трансактивационных анализов можно показать, что PR в клетках T47D проявлял транскрипционную активность и мог быть блокирован соединением 1.-3 005945 Стимуляция клеток T47D с R5020 приводила к 2-3-кратному усилению экспрессии рецептора EGF,которая блокировалась соединением А. В то же самое время, связывание EGF с клетками увеличивалось в 2-3 раза и могло быть предотвращено соединением А и менее эффективно онапристоном. Повышенное связывание EGF с клетками, обработанными R5020, могло быть вызвано усиленной экспрессией рецептора EGF или повышенным образованием гетеродимера между рецептором EGF и еrbВ 2. Данные результаты свидетельствуют о взаимодействии между сигнальными системами PR и фактора роста в клетках человеческой карциномы грудной железы. Путем применения антипрогестинов прогрессия опухолевых клеток от стадии зависимого от стероидов роста подавляется или предотвращается до стадии зависимого от фактора роста развития. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение ингибитора рецептора прогестерона с целью получения агента для подавления связывания факторов роста с опухолевыми клетками и/или с опухолью. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибируется пролиферация опухолевых клеток и/или опухоли, вызванная факторами роста. 3. Применение по п.1 или 2, где ингибитор рецептора прогестерона выбирают из 17 фторалкилстероидов общей формулы IR1 означает метильную или этильную группу,R2 означает радикал формулы CnFmHo, где n означает 2, 3, 4, 5 или 6, m1 и m+о=2n+1,R3 означает свободную или этерифицированную в виде простого или сложного эфира гидроксильную группу,R4 и R5 каждый означает атом водорода, вместе означают дополнительную связь или метиленовую группу,St означает стероидную кольцевую систему ABC или отдельную формулу А, В или С.R6 означает атом водорода, линейную (С 1-С 4)алкильную группу, или разветвленную (С 3-С 4)алкильную группу, или атом галоида,R7 означает атом водорода, линейную (С 1-С 4)алкильную группу, или разветвленную (С 3 С 4)алкильную группу, или, если St означает стероидную ABC-кольцевую систему А или В, в дополнение к этому R6 и R7 означают вместе дополнительную связь,X означает атом кислорода, гидроксииминогруппу =N-OH или два атома водорода,R8 означает радикал Y или арильный радикал, который необязательно замещен группой Y в нескольких положениях, при этомR9a и R9b являются одинаковыми или разными и, подобно R9, означают атом водорода или (С 1-С 10) алкильную группу и в случае радикалов -NR9a R9b также их физиологически совместимые соли с кислотами, а в случае радикалов -CO2R9, с R9 в значении водорода, также их физиологически совместимые соли с основаниями. 4. Применение по п.3, где ингибитором рецептора прогестерона является соединение 11-(4 ацетилфенил)-17-гидрокси-17-(1,1,2,2,2-пентафторэтил)эстра-4,9-диен-3-он.-4 005945 5. Применение по одному из пп.1-4, где опухолевые клетки обладают высокой и/или существенной экспрессией рецептора прогестерона. 6. Применение по одному из пп.1-5, где опухолевыми клетками являются клетки карциномы грудной железы. 7. Применение по одному из пп.1-6, где связывание EGF и/или других факторов, связывающихся с рецептором EGF, подавляется в опухолевых клетках. 8. Применение по одному из пп.1-7, где подавляется образование гетеродимеров между рецепторами EGF и еrbВ 2. 9. Применение по одному из пп.1-8 в терапии опухолей. 10. Применение по п.9 с целью ингибирования прогрессии опухоли от стадии зависимого от стероида роста до стадии зависимого от фактора роста развития. Фиг. 1. Антипролиферативное действие. Клетки T47D культивировали в присутствии (верхняя поперечно заштрихованная полоса) или в отсутствии (нижняя поперечно заштрихованная полоса) 0,1 нМ E2 и увеличивающихся концентраций соединения А , онапристона , ZK191703 или 4-ОН-Тат . Фиг. 2. Количества белка рецептора прогестерона (PR) и рецептора эстрогена (ER) в клетках T47D. КоличестваPR и ER определяли в клеточных лизатах, используя методики связывания стероида с радиоактивно меченым прогестероном или эстрадиолом. Фиг. 3. Транскрипционная активность PR в клетках T47D. А: клетки T47D были кратковременно трансфиксированы с MTV-LUC и культивированы в отсутствии или в присутствии 1 нМ R5020. Б: в тесте на опосредованный PR антагонизм кратковременно трансфиксированные клетки T47D обрабатывали 0,1 нм R5020 и соединением А или RU468 в увеличивающихся концентрациях.R5020 с 20 нМ соединения А или без него и затем промывали и после этого определяли связывание EGF в диапазоне концентраций 0,25-150 нг/мл EGF путем инкубации в течение 2 ч при 4 С. Вставки показывают количество связанных лигандов относительно логарифма концентрации свободного лиганда. Фиг. 5. Связывание 125I-EGF с интактными клетками T47D. Клетки обрабатывали в течение 48 ч с 2 или 20 нМ R5020 и соединением А или онапристоном или одним соединением А.