Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами

1 Объектом настоящего изобретения является химерный ген нескольких генов, кодирующих устойчивость к гербицидам, растительная клетка и растение, устойчивые к нескольким гербицидам. Далее в описании гербициды будут иметь общее название, а именно, указанное в 10-м издании "The Pesticide Manual", British Crop Protection Council. Известны растения, которые были трансформированы с целью придания им устойчивости к некоторым гербицидам, например к дигалогеногидроксибензонитрилам, в частности к бромоксинилу и иоксинилу, благодаря гену,кодирующему нитрилазу, разрушающую эти гербициды, или растения, устойчивые к гербицидам -ингибиторам EPSPS, в частности, глифозату, сульфозату или фосаметину, или к ингибиторам ацетолактатсинтетазы (ALS), типа сульфонилмочевин, или к ингибиторам дигидроптероатсинтетазы, таким как азулам, или к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как глуфозинат. Известны некоторые гербициды, такие как изоксазолы, описанные, в частности, во французских заявках 95 06800 и 95 13570, и, в частности, изоксафлутол, селективный гербицид кукурузы, дицетонитрилы, описанные в европейских заявках 0 496 630, 0 496 631, в частности, 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2 СН 3-4-СF3 фенил)пропан-1,3-дион и 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2 СН 3-4-2,3 Сl2 фенил)пропан-1,3 дион, трикетоны, описанные в европейских заявках 0 625 505 и 0 625 508, в частности, сулкотрион, или же трикетоны, описанные в USP 5 506 195, или пиразолинаты. Кроме того, был выделен ген, кодирующий HPPD, с целью придания устойчивости к этим вышеназванным гербицидам, а полученные содержащие его трансгенные растения демонстрируют значительную устойчивость и являются объектом неопубликованных французских заявок 95/06800, 95/13570 и 96/05944. Однако сельскохозяйственная практика показывает, что для обработки растений фермеры предпочитают иметь у себя ассоциации гербицидов, в частности, чтобы решать различные проблемы по уничтожению сорняков, возникающие из-за ограниченного спектра отдельно взятых гербицидов. Для фермеров также представляет интерес наличие маркерного гена селекции, ассоциированного с геном, кодирующим устойчивость к гербицидам. Таким образом, сельское хозяйство нуждается в растениях,обладающих устойчивостью к нескольким гербицидам, предпочтительно, по меньшей мере, к двум или трм. Было обнаружено, что одной растительной клетке и одному растению можно придать множественную гербицидную устойчивость. Объектом настоящего изобретения, прежде всего, является химерный ген, содержащий, по 2 меньшей мере, два элементарных химерных гена, каждый из которых содержит, в направлении транскрипции, элементы регуляции, необходимые для его транскрипции в растениях, то есть, по меньшей мере, одну последовательность промоторной регуляции, по меньшей мере, одну кодирующую гетерологическую часть,содержащую одну кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, придающий растениям устойчивость к одному гербициду и,по меньшей мере, одну последовательность терминальной регуляции или полиаденилирования. В качестве кодирующей последовательности можно использовать, в частности, все известные последовательности, придающие растениям устойчивость к некоторым ингибиторам. Это:- последовательность EPSPS, кодирующая устойчивость к глифозату, сульфозату или фосаметину, в частности, последовательности мутированного или немутированного протеина,описанные в патентах:- USP 4 535 060, ЕР 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945; USP 4 971 908, USP 5 145 783, ЕР 293 358; ЕР 378 985, WO 91/04323, WO 92 044 449, WO 92 06201. В дальнейшем этот тип гена будет называться последовательностью или геном"EPSPS". Также можно назвать глифозатоксидоредуктазу (см. WO 92/000377) - фермент детоксификации глифозата;- последовательность гена нитрилазы Klebsiella sp., кодирующего устойчивость к дигалогенобензонитрилам, описанная в USP 4 810 648,и, в частности, гена, полученного от Klebsiellaozaenae, который в дальнейшем будет называться геном или последовательностью "OXY";- последовательность HPPD, описанная в вышеназванных неопубликованных французских заявках 95/06800, 95/13570 и 96/05944. Эта последовательность HPPD может быть любой природы. В частности, эта последовательность может иметь бактериальное происхождение, как,например, род Pseudomonas, или растительное происхождение, например, от однодольного или двудольного растения, в частности, от Arabidopsis или от зонтичных, например, моркови (Daucus carota). Она может быть самородной или дикой или, при необходимости, мутированной,сохраняющей при этом свойство гербицидной устойчивости к ингибиторам HPPD, таким как гербициды семейства изоксазолов или семейства трикетонов или пиразолинатов. Можно также использовать другие последовательности:- последовательность фосфинотрицинацетилтрансферазы или последовательность глутаминсинтетазы, кодирующая устойчивость к глуфозинату (см. ЕР 0 242 236);- последовательность Протопорфирогеноксидазы ("protox"), кодирующая устойчивость к гербицидам семейства дифенилэфиров, таких как ацифторфен или оксифторфен, или последовательность оксадиазолов, таких как оксадиазон или оксадиаргил, или последовательность циклических имидов, таких как хлорфталим, или последовательность фенилпирразолов, таких как TNP, или последовательности пиридинов и фенопилаты и сходные карбаматы (см. WO 95/34659). Предпочтительно, один из химерных генов содержит кодирующую последовательностьHPPD. В этом случае другая или другие последовательности могут быть любыми и, в частности, выбираемыми из группы, указанной выше. Предпочтительно, другие последовательности выбирают из группы, включающей ген нитрилазы, кодирующий устойчивость к дигалогеногидроксибензонитрилам или ген EPSPS. Химерные гены согласно изобретению могут содержать гены, кодирующие не только гербицидную устойчивость, но и другие свойства,например гены, кодирующие резистентность к насекомым, например, типа Bacillus thurigensis,сообщающие резистентность к различным представителям семейства жесткокрылых, чешуекрылых, или гены, кодирующие устойчивость к нематодам, гены, кодирующие сопротивляемость к грибковым и микробным заболеваниям,или гены, сообщающие агрономические свойства, такие как гены различных десатураз, участвующих в продукции жирных кислот. Можно, в частности, назвать ген дельта-6 десатуразы,описанный в международной заявке WO 93/06712. В качестве последовательности промоторного регулирования можно использовать любую промоторную последовательность гена, экспрессия которого осуществляется, в естественных условиях в растениях, в частности, промотор бактериального, вирусного или растительного происхождения, например, промотор гена малой субъединицы рибулоз-бискарбоксилазы(RuBisCO) или промотор гена -тубулина (европейская заявка ЕР 0 652 286), или гена вируса растений, такого как ген мозаики цветной капусты (CaMV 19S или 35S), но может быть использован любой известный подходящий промотор. Предпочтительно, прибегают к использованию последовательности промоторного регулирования, которая способствует сверхэкспресии кодирующей последовательности, например, используют последовательность, содержащую, по меньшей мере, один промотор гистона, описанный в европейской заявке ЕР 0 507 698. 4 Согласно изобретению в ассоциации с последовательностью промоторной регуляции,можно также использовать другие регулирующие последовательности, которые располагаются между промотором и кодирующей последовательностью, например активаторы транскрипции "enhancer", как, например, активатор трансляции вируса etch табака (TEV), описанный в заявке WO 87/07644, или транзитные пептиды,либо простые, либо двойные, и в этом случае,при необходимости, разделенные промежуточной последовательностью, то есть включающие,в направлении транскрипции, последовательность, кодирующую транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент с пластидной локализацией, часть последовательности зрелой N-концевой части растительного гена, кодирующего фермент с пластидной локализацией, затем последовательность, кодирующую второй транзитный пептид растительного гена,кодирующего фермент с пластидной локализацией, состоящий из части последовательности зрелой N-концевой части растительного гена,кодирующего фермент с пластидной локализацией, как описано в европейской заявке 0 508 909. В качестве последовательности терминальной регуляции или полиаденилирования можно использовать любую соответствующую последовательность бактериального происхождения, например терминальную последовательность nos Agrobacterium tumefaciens, или растительного происхождения, например терминальную последовательность гистона, описанную в европейской заявке ЕР 0 633 317. Объектом изобретения является также линия растительных клеток однодольных или двудольных растений, а именно, культурных растений, устойчивых, по меньшей мере, к двум гербицидам, из которых, по меньшей мере, один является ингибитором HPPD. Эта клетка может содержать, по меньшей мере, одну химерную конструкцию, описанную выше, включающую,по меньшей мере, два химерных гена, каждый из которых содержит последовательность, кодирующую устойчивость к одному гербициду, и один из которых содержит последовательность,кодирующую HPPD. Указанная химерная конструкция может либо переноситься вектором,либо вноситься путем введения в клетку физическими или физико-химическими средствами,например, микроинъекцией, электропорацией или бомбардировкой, в соответствии с известными методами. Объектом изобретения является также трансформированное растение, устойчивое, по меньшей мере, к двум гербицидам, одним из которых является ингибитор HPPD. Это растение может быть получено регенерацией клетки согласно изобретению, описанной выше. Растения могут быть однодольными или двудольными, в частности, культурными растениями в 5 крупном земледелии, неограничительными примерами двудольных растений являются табак, хлопок, рапс, соя, свекла, а однодольных растений - кукуруза и злаки; также это могут быть овощные культуры или цветы. Объектом изобретения является также способ получения растений с множественной гербицидной устойчивостью путем растительного трансгеназа, при этом первая стадия включает встраивание в растительные клетки, по меньшей мере, двух генов устойчивости к гербициду, из которых, по меньшей мере, один является ингибитором HPPD, вторая стадия включает регенерацию растения из трансформированных клеток согласно изобретению. Трансформация может быть получена любым известным соответствующим способом,широко описанным в специальной литературе и,в частности, в заявках и патентах, приведенных в данной заявке. Одна серия методов состоит в бомбардировке клеток или протопластов частицами, к которым прикреплены последовательности ДНК. Согласно изобретению, эти ДНК могут переноситься одними и теми же частицами или разными. Другая серия методов состоит в том,что в качестве средства переноса в растение используют химерный ген, введнный в плазмиду Ti Agrobacterium tumefaciens или Ri Agrobacterium rhizogenes. Могут быть использованы и другие методы, например, микроинъекция или электропорация. Специалист может выбрать подходящий метод в зависимости от растения, в частности,от того, является оно однодольным или двудольным. Было обнаружено, что растения, трансформированные согласно изобретению, обладают значительной устойчивостью к ингибиторам гидроксифенилпируватдиоксигеназы, например, к некоторым из последних гербицидов,таким как, изоксазолы, описанные, в частности,во французских заявках 9506800 и 95 13570, а именно 4-[4-СF3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5 циклопропилизоксазол, или "изоксафлутол",селективный гербицид кукурузы, дицетонитрилы, описанные в европейских заявках 0 496 630,0 496 631, в частности 2-циано-3-циклопропил 1-(2-SO2 СН 3-4-СF3 фенил)пропан-1,3-дион и 2 циано-3-циклопропил-1-(2-SO2 СН 3-4-2,3 Сl2 фенил)пропан-1,3-дион, трикетоны, описанные в европейских заявках 0 625 505 и 0 625 508, в частности, сулкотрион и пиразинолаты. Эти же растения, согласно изобретению, обладают значительной устойчивостью к другим гербицидам,например, таким как дигалогено бензонитрилы,а именно бромоксинил и иоксинил, глуфозат и его аналоги, глуфозинат. Объектом данного изобретения являются также растения, регенерированные из трансформированных клеток. Регенерацию получают 6 любым соответствующим способом, который зависит от природы вида, например, как описано в вышеназванных заявках. Растения согласно изобретению могут также быть получены путм скрещивания родителей, каждый из которых является носителем одного из описанных генов,кодирующих устойчивость к гербициду. Наконец, объектом данного изобретения является способ обработки растений, в частности, культур, с помощью гербицида данного типа, отличающийся тем, что гербицид наносят на растения, трансформированные согласно изобретению, как перед посевом, перед всходом, так и после всхода культуры. Под гербицидом в настоящем изобретении подразумевают активное гербицидное вещество, взятое одно или в ассоциации с добавкой, которая изменяет его эффективность, такой как вещество, повышающее активность (синергический агент), или вещество, ограничивающее активность (поанглийски "safener"). Разумеется, что вышеназванные гербициды при их практическом применении сочетают с добавками такого состава, как обычно используют в агрохимии. Согласно изобретению один из генов гербицидной устойчивости, присутствующих в растениях, может быть использован в качестве маркера селекции, либо in vitro, либо in vivo. Различные аспекты изобретения станут более понятны с помощью экспериментальных примеров, приведенных ниже. Пример 1: Выделение гена HPPD P. fluorescens A 32. Из последовательности аминокислот HPPDschi U. и др. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466),выводят последовательность различных олигонуклеотидов, чтобы амплифицировать с помощью ПЦР часть кодирующей последовательности HPPD P. fluorescens A 32 (выделена McKellar, R.C. 1982, J. Appl. Bacteriol., 53: 305-316). Фрагмент амплификации гена HPPD был использован для просеивания частичного геномного банка Р. fluorescens A 32, чтобы выделить таким образом ген, кодирующий этот фермент. А) Получение геномной ДНК Р. fluorescensA 32. Бактерию культивировали в 40 мл минимальной среды М 63 (КН 2 РO4 13,6 г/л, (NH4)2SO4 2 г/л, MgSO4 0,2 г/л, FeSO4 0,005 г/л рН 7 плюсL - тирозин 10 мМ в качестве единственного источника углерода) при 28 С в течение 48 ч. После промывания клетки помещают в 1 мл лизирующего буферного раствора (tris HCl 100 мМ рН 8,3, NaCl 1,4 М и EDTA 10 мМ) и инкубируют 10 мин при 65 С. После обработки смесью фенол/хлороформ (24/1) и обработки хлороформом, нуклеиновые кислоты осаждают добавлением одного объма изопропанола, затем помещают в 300 мкл стерильной воды и обрабатывают в растворе рибонуклеазы 10 7 мкг/мл конечн. ДНК снова обрабатывают смесью фенол/хлороформ, хлороформом и осаждают добавлением 1/10 объма ацетата натрия 3 М рН 5 и 2-х объмов этанола. Затем ДНК помещают в стерильную воду и дозируют. Б) Выбор олигонуклеотидов и синтезов. Из последовательности аминокислот HPPDPseudomonas sp. P.J.874 выбирают пять олигонуклеотидов, из которых два - в направлении от концевой группы NH2 к концевой группе СООН протеина, а три - в противоположном направлении (см. фиг. 1). Этот выбор был продиктован двумя следующими правилами:- стабильный 3' - конец олигонуклеотида,то есть, по меньшей мере, два основания без амбивалентности,- как можно более слабая дегенерация. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности: Р 1: 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3' Р 2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3' Р 3: 5'AA(C/T)TGGATIA(G/A)(G/A)АА(С/Т)ТС(С/Т) ТС 3' Р 4 : 5'AAIGCIAC(G/A)TG(С/Т)TG(Т/G/A)АTIСС 3' Р 5:5'GC(С/Т)ТТ(A/G)АА(A/G)TTICC(С/Т)TCICC3' Они были синтезированы на синтезаторе"Cyclone plus DNA Synthesizer" марки MILLPORE. С этими 5 олигонуклеотидами, амплифицированными с помощью ПЦР, фрагменты амплификации, которые теоретически должны быть получены из последовательности SEQ ID 1, имеют следующие размеры: с Р 1 и Р 3 приблизительно 690 нп с Р 1 и Р 4 приблизительно 720 нп с Р 1 и Р 5 приблизительно 1000 нп с Р 2 и Р 3 приблизительно 390 нп с Р 2 и Р 4 приблизительно 420 нп с Р 2 и Р 5 приблизительно 700 нп В) Амплификация кодирующей частиHPPD P. fluorescens A 32. Амплификация была проведена на прибореPERKIN ELMER с е буферным раствором в стандартных условиях, то есть на 50 мкл реакции имеется dNTP в 200 мкМ, праймеры в 20 мкМ, Taq полимераза 2,5 единицы и ДНК Р.fluorescens A 32 2,5 мкг. Используемая программа амплификации: 5 мин при 95 С, затем 35 циклов (45 с 95 С, 45 с 49 С, 1 мин 72 С), затем 5 мин при 72 С. В этих условиях все полученные фрагменты амплификации имеют размер, соответствующий вышеприведенным теоретическим размерам, что является хорошим показателем специфичности амплификации. Фрагменты амплификации, полученные с Р 1/Р 4, Р 1/Р 5 и Р 2/Р 4, объединяют в pBSII SK (-) после расщепления этой плазмиды с помощьюEco RV и обработки конечной трансферазой в присутствии ddTTP, как описано HOLTON Т.А. и GRAHAM M.W., 1991, N.A.R., том 19, n5,стр. 1156. Один клон каждого из трх типов частично секвенируют, это позволяет подтвердить, что в этих трх случаях амплифицировали часть кодирующего участка HPPD P. fluorescens A 32. Фрагмент Р 1/Р 4 сохраняют как зонд для просеивания частичного геномного банка Р. fluorescens A 32 и выделения полного гена HPPD. Г) Выделение гена. С помощью Southern можно показать, что фрагмент в 7 Кнп после расщепления ДНК Р.fluorescens A 32 с помощью рестрикционного фермента BamHI гибридизуется с зондом HPPD Р 1/Р 4. Таким образом, 400 мкг ДНК Р. fluorescens A 32 расщепили с помощью рестрикционного фермента BamHI и очистили на геле агарозы фрагменты ДНК, составляющие примерно 7 Кнп. Эти фрагменты объединяют в pBSII SK (-),в свою очередь расщеплнном с помощьюBamHI и дефосфорилированном обработкой щелочной фосфатазой. После трансформации в Е. coli DH10b, частичный геномный банк просеивают с помощью зонда HPPD P1/P4. Был выделен положительный клон, названный pRP А. Его упрощенная карта представлена на фиг. 2. На этой карте указано положение кодирующей части гена HPPD. Она состоит из 1077 нуклеотидов, которые кодируют 358 аминокислот (см. SEQ ID 1). Аминокислотная последовательность HPPD P. fluorescensA 32 в значительной степени гомологична последовательности HPPD Pseudomonas sp. strainP.J.874; действительно, имеется 92% совпадений между этими двумя протеинами (см. фиг. 3). Пример 2. Конструкция двух химерных генов с одной последовательностью HPPD. Чтобы придать растениям устойчивость к гербицидам, ингибирующим HPPD, конструируют два химерных гена. Первый состоит в том, чтобы поставить кодирующую часть гена HPPD P. fluorescens A 32 под контроль двойного гистонного промотора (Европейская заявка на патент 0 507 698),за которым следует Tobacco etch virus translational enhancer (TEV)(pRTL-GUS (Carrington иFreed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597 с терминальной последовательностью гена нопалинсинтетазы. Тогда HPPD будет локализована в цитоплазме. Второй будет идентичен первому, за исключением того, что между активатором трансляции TEV и кодирующей частью HPPD встраивают оптимизированный транзитный пептид (ОТП) (Европейская заявка ЕР n 0 508 909). Тогда HPPD будет локализована в хлоропласте. А) Конструкция вектора pRPA-RD-153.(Stratagene catalog212206), содержащее сайт полиаденилирования нопалинсинтетазы (NOSpolyA)(Европейская заявка n 0 652 286), клонируют между сайтами KpnI и SalI. Сайт KpnI трансформируют в сайт NotI обработкой с помощью Т 4 ДНК полимеразы I в присутствии 150 мкМ с деоксинуклеотидтрифосфатов, затем связывают с линкером NotI (Stratagene catalog1029). Таким образом получают кассету клонирования NOS polyA.- pRPA-RD-127: Производное pRPA-BL466x (Европейская заявка ЕР n 0 337 899), клонированное в pRPA-RD-11, создающее кассету экспрессии гена оху и содержащее промотор малой субъединицы рибулозы-бискарбоксилазы:"промотор (SSU) - оху ген - NOS polyA" Чтобы создать эту плазмиду pRPA-BL-488 расщепили с помощью XbaI и HindIII, чтобы выделить фрагмент в 1,9 кнп, содержащий промотор SSU и ген оху, который был объединн с плазмидой pRPA-RD-11, расщеплнной соответствующими ферментами.- pRPA-RD-132: Это производное pRPABL-488 (Европейская заявка ЕР n 0 507 698),клонированное в pRPA-RD-127 с созданием кассеты экспрессии гена оху с двойным гистонным промотором:"двойной гистонный промотор - оху ген NOS polyA" Чтобы получить эту плазмиду,pRPA-BL-466 расщепляют с помощью HindIII,обрабатывают с помощью Klenow, затем снова расщепляют с помощью NcoI. Фрагмент в 1,35 кнп, очищенный, содержащий двойной гистонный промотор Н 3 А 748, соединяют с плазмидойpRPA-RD-153: Это производное pRPA-RD132, содержащее активатор трансляции вирусаFeed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597) расщепляют с помощью NcoI и EcoRI и фрагмент в 150 нп встраивают в pRPA-RD-132, расщеплнную теми же ферментами. Создают кассету экспрессии, содержащую промотор:catalog15364-011), содержащее множество сайтов клонирования. pUC-19 расщепляют с помощью EcoRI и объединяют с линкерным олигонуклеотидом 1. Линкер 1: Селекционированный клон содержит сайтEcoRI, за которым следует полилинкер, который содержит следующие сайты: EcoRI, ApaI, AvrII, 002980 Селекционированный клон содержит сайтHindIII в середине полилинкера, который теперь содержит следующие сайты: EcoRI, ApaI, AvrII,PmeI, SfiI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI,PstI, SphI, HindIII, PacI, AsсI, XhoI и EcoNI. В) Конструкция вектора pRP Т.- pRP О: производное pRPA-RD-153, содержащее кассету экспрессии HPPD, двойной гистонный промотор - TEV - ген HPPD терминальная последовательность Nos. Чтобы получить pRP О, pRPA-RD-153 расщепляют с помощью HindIII, обрабатывают с помощью Klenow,затем опять расщепляют с помощью NcoI, чтобы удалить ген оху и заменить его геном HPPD,взятым из плазмиды pRP А путм расщепления с BstEII, обработки с помощью Klenow и повторного расщепления с помощью NcoI.pRP О расщепили с помощью PvuII и SacI, химерный ген был очищен, а затем объединн с- pRP Т: был получен встраиванием химерного гена, взятого из pRP R после расщепления с помощью SacI и HindIII, в плазмидуpRPA-BL 150 альфа 2, расщеплнную теми же ферментами (Европейская заявка Ер n 0 508 909). Таким образом, химерный ген вектора pRP Т имеет следующую структуру: Двойной гистонный Кодирующий- pRP P: это производное pRPA-RD-7 (Европейская заявка ЕР n 0 652 286), содержащая оптимизированный транзитный пептид, за которым следует ген HPPD. Оно было получено объединением кодирующей части HPPD, взятой из pRP А расщеплением BstEII и NcoI, обработкой с помощью Klenow, и плазмиды pRPA-RD7, расщеплнной с помощью SphI и АсеI и обработанной ДНК-полимеразой Т 4.- pRP Q: производное pRPA-RD-153, содержащее кассету экспрессии HPPD, двойной гистонный промотор - TEV - ОТР - ген HPPD терминальная последовательность Nos. Для его конструирования плазмиду pRPA-RD-153 расщепляют с помощью Sal I, обрабатывают с помощью Klenow, затем повторно расщепляют с помощью NcoI, чтобы удалить ген оху и заменить его геном HPPD, взятым из плазмиды pRP путм расщепления с помощью BstEII, обработкой с помощью Klenow и повторным расщеплением с помощью NcoI.Q расщепили с помощью PvuII и SacI, и выделили химерный ген, который был объединн с- pRP V: был получен путм встраивания химерного гена, взятого из pRP S после расщепления с помощью SacI и HindII, в плазмидуpRPA-BL 150 альфа 2 (Европейская заявка ЕР n 0 508 909). Химерный ген вектора pRP Q имеет следующую структуру: Двойной гистонный промотор Пример 3. Трансформация промышленного табака PBD6. Чтобы определить эффективность этих двух химерных генов их перенесли в промышленный табак PBD6, в соответствии с процедурами трансформации и регенерации, уже описанными в европейской заявке ЕР n 0 508 909. 1) Трансформация. Вектор вводят в неонкогенный штамм Agrobacterium EHA 101 (Hood и др., 1987) - носитель космиды pTVK 291 (Komari и др., 1986). Техника трансформации основана на процедуреSEITA France) из листовых эксплантатов осуществляют на базовой среде Murashige и Skoog(MS), содержащей 30 г/л сахарозы, а также 100 мкг/мл канамицина. Листовые эксплантаты отбирают у растений в теплице или in vitro и трансформируют согласно технике листовых пластинок (Science 1985, Vol. 227, р. 1229-1231) в три последовательных стадии: первая стадия включает индукцию побегов на среде MS, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, содержащей 0,05 мг/л нафтилуксусной кислоты (ANA) и 2 мг/л бензиламинопурина (ВАР), в течение 15 дней. Затем, образовавшиеся на этой стадии ростки в течение 10 дней выращивают на средеMS, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, но в которой не содержится гормон. Затем отбирают развившиеся побеги и культивируют их на укореняющей среде MS с половинным содержанием солей, витаминов и cахаров и не содержащей гормон. Примерно через 15 дней укоренившиеся побеги переносят в землю. Полученные растения называются Со 17. Трансформированные всходы табака после перенесения из условий in vitro в теплицу (60% относительной влажности, температура: 20 С ночью и 23 С днм) акклиматизировали в тече 12 ние пяти недель, затем они были обработаны 4[4-СF3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5-циклопропил изоксазолом. У контрольной пробы табака, не трансформированного и обработанного 4-[4-СF3-2(метилсульфонил)бензоил]-5-циклопропил изоксазолом дозами от 50 до 400 г/га, примерно за 72 ч развиваются хлорозы, которые в течение одной недели усиливаются и переходят в очень ярко выраженные некрозы (покрывающие около 80% концевых листьев). После трансформации этот же табак, в котором происходит сверхэкспрессия HPPD P.fluorescens, очень хорошо защищен от обработки 4-[4-СF3-2-(метилсульфонил)бензоил]-5-циклопропил изоксазолом дозой 400 г/га. В случае сверхэкспрессии гена фермента,локализующегося в хлоропласте, т.е. если трансформация была произведена с помощью гена, находящегося на векторе pRP V, то растение полностью защищено и не проявляет никаких симптомов (заболевания). Пример 4. Трансформация промышленного табака PBD6 с помощью гена EPSPS дляконструкция 173. Выделение кДНК, кодирующей EPSPS кукурузы. Ниже описаны различные стадии, которые привели к получению кДНК EPSPS кукурузы, в которой были осуществлены два изменения. Все описанные ниже операции даны в качестве примеров и соответствуют одному методу, выбранному из многих, при которых достигается один и тот же результат. Этот выбор никак не влияет на качество результата и, таким образом, для достижения того же результата, специалист может использовать любую подходящую методику. Большая часть методов инженерии фрагментов ДНК описана в "Current Protocols in Molecular Biology", том 1 и 2, Ausubel F.M. и др.,изданном Greene Publishing Associates и Wiley Interscience (1989). (Далее ссылки на протоколы,описанные в этом сборнике, будут обозначаться"ref. СРМВ"). Были проведены следующие операции, касающиеся ДНК, в соответствии с протоколами, описанными в этом сборнике, в частности: сшивание фрагментов ДНК, обработки с помощью ДНК полимеразы Klenow и Т 4 ДНК полимеразы, получение ДНК плазмид и бактериофаговв виде мини- или максипрепаратов,анализы ДНК и РНК, соответственно, согласно методикам Southern и Northern. Были также использованы другие методы, описанные в этом сборнике, и ниже приводится описание только изменений или значительных добавлений к этим протоколам. А 1. Получение фрагмента EPSPS Arabidopsis thaliana. а) два олигонуклеотида 20-mers с соответствующими последовательностями: 13 5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' 5'-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' были синтезированы из последовательности гена EPSPS Arabidopsis thaliana (Klee H.J. и др.,(1987), Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Эти два олигонуклеотида находятся соответственно в положении от 1523 до 1543 и от 1737 до 1717 опубликованной последовательности и имеют конвергентную ориентацию. б) полная ДНК Arabidopsis thaliana (var.Columbia) была получена у Clontech (каталожная ссылка: 6970-1) в) Смешивают 50 нанограмм (нг) ДНК с 300 нг каждого из олигонуклеотидов и подвергают 35 циклам амплификации с помощью прибора Perkin-Elmer 9600, в условиях стандартной среды для амплификации, рекомендованных поставщиком. В результате получают фрагмент в 204 нм, который составляет фрагмент EPSPSArabidopsis thaliana. 2. Конструирование библиотеки кДНК из клеточного ряда кукурузы BMS. а) Измельчают 5 г фильтрованных клеток в жидком азоте и экстрагируют полные нуклеиновые кислоты, согласно методу, описанному- рН лизирующего буферного раствора доводят до 9,0;- после осаждения с помощью изопропанола осадок собирают в воде и, после растворения,доводят до 2,5 М LiCl. После инкубации в течение 12 ч при С, осадок, образовавшийся при центрифугировании 15 мин при 30000 g при 4 С растворяют. Затем повторяют осаждение с помощью LiCl. Вновь растворнный осадок составляет фракцию РНК полных нуклеиновых кислот. б) Фракцию PHK-polyA + фракция РНК получают хроматографией на колонке олиго-dT целлюлозы, описанной в "Current Protocols inMolecular Biology". в) Синтез двухцепочечной кДНК на синтезированном конце EcoRI: он выполняется в соответствии с протоколом поставщика различных реактивов, необходимых для этого синтеза, в комплекте: "copy kit" компании In Vitrogen. Два одноцепочечных олигонуклеотида,частично дополненных соответствующими последовательностями: 5'-AATTCCCGGG-3' 5'-CCCGGG-3' (причм эта последовательность является фосфорилованной) сшивают с двухцепочечной кДНК с открытыми концами. Результатом этого сшивания является создание сайтов SmaI, прикрепленных к двухцепочечной кДНК, и EcoRI в виде сцепления на каждом конце двухцепочечной кДНК. г) Создание библиотеки: кДНК, имеющие на концах искусственные связующие сайты EcoRI, сшивают с кДНК бактериофага gt 10, разрезанной с помощью EcoRI 14 и дефосфорилованной согласно протоколу поставщика New England Biolabs. Аликвотная часть реакции сшивания была капсидирована in vitro с экстрактами капсидирования: Gigapack Gold согласно инструкциям поставщика, эта библиотека была титрована с использованием бактерии Е. coil C600hfl., полученную таким образом библиотеку амплифицируют и сохраняют согласно инструкции того же поставщика, и она составляет библиотеку кДНК клеточной суспензии кукурузы BMS. 3. Просеивание библиотеки кДНК клеточной суспензии кукурузы BMS с помощью зондаin Molecular Biology", том 1 и 2, Ausubel F.M. и др., опубликованный Greene Publishing Associates и S (1989) (CPMB). Коротко говоря, примерно 106 рекомбинантных фагов распределены на коробке LB со средней плотностью 100 фаг/см 2. Области лизиса реплицируют в двойном экземпляре на мембране Hybond N Amersham. д) ДНК зафиксировали на фильтрах УФобработкой 1600 кДж (Stratalinker (Stratagene. Фильтры были предварительно гидратированы в 6xSSC/0, 1% SDS/0,25 обезжиренного молока в течение 2 ч при 65 С. Зонд EPSPS Arabidopsis"random-priming" согласно инструкциям поставщика (Kit Ready to Go, Pharmacia). Полученная удельная активность составляет порядка 108 имп/мин на мкг фрагмента. После денатурирования в течение 5 мин при 100 С, зонд добавляют в среду предварительной гибридизации, и гибридизация продолжается в течение 14 ч при 55 С. Фильтры флуорографируют в течение 48 ч при 80 С на плнку Kodak XAR5, используя усиливающие экраны Hyperscreen RPN d'Amersham, Проецирование положительных пятен(бликов) на фильтре на кассеты, из которых они получены, позволяет отобрать на кассете зоны,соответствующие фагам, имеющим положительный ответ гибридизации с зондом EPSPSArabidopsis thaliana. Этот этап распределения,переноса, гибридизации, рекуперирования повторяется до тех пор, пока все пятна кассеты последовательно очищенных фагов не станут положительными на 100% при гибридизации. Область лизиса независимым фагом отбирают в разбавляющей среде (Tris-Cl рН=7,5; MgSO4 10 мМ; NaCl 0,1 М; желатина 0,1%), причм эти фаги в растворе составляют положительные клоны EPSPS клеточной суспензии кукурузыBMS. 4. Получение и анализ ДНК клонов EPSPS клеточной суспензии кукурузы BMS. Добавляют примерно 5.108 фагов к 20 мл бактерий C600hfl (2 OD 600 нм/мл) и инкубируют 15 мин при 37 С. Затем эту суспензию вводят в 200 мл среды роста бактерий в Erlen 11 и перемешивают в ротационном смесителе при 15 250 об/мин. Лизис констатируют по осветлению среды, соответствующему лизису взвешенных бактерий, и это происходит примерно после 4 ч перемешивания. Всплывшие на поверхность продукты лизиса затем обрабатывают, как описано в "Current Protocols in Molecular Biology". Полученная ДНК соответствует клонам EPSP клеточной суспензии кукурузы BMS. Один из двух мкг этой ДНК разрезают с помощью EcoRI и разделяют на геле агарозыLGTA/TBE (ref. CPMB) 0,8%. Последняя проверка состоит в том, чтобы убедиться, что очищенная ДНК нест сигнал гибридизации с зондом EPSPS Arabidopsis thaliana. После электрофореза фрагменты ДНК переносят на мембрануMolecular Biology". Фильтр гибридизуют с зондом EPSPS Arabidopsis thaliana, согласно условиям, описанным в параграфе 3. Клон, несущий сигнал гибридизации с зондом EPSPS Arabidopsis thaliana и содержащий самый длинный фрагмент EcoRI, имеет размер, определенный на геле, равный приблизительно 1,7 кнп. 5. Получение клона pRPA-ML-711. Десять мкг ДНК клона фагов, содержащего включение из 1,7 кнп расщепляют с помощьюEcoRI и разделяют на геле агарозы LGTA/TBE(ref. CPMB) 0,8%. Фрагмент геля, содержащий включение из 1,7 кнп, удаляют из геля окрашиванием BET и этот фрагмент обрабатывают агаразой согласно протоколу поставщика New aBiolabs. Очищенную ДНК фрагмента в 1,7 кнп,сшивают при 12 С в течение 14 ч с ДНК плазмиды pUC 19 (New England Biolabs), разрезанной с помощью EcoRI согласно протоколу сшивания, описанному в "Current Protocols in Molecular Biology". Два мкл указанной смеси сшивания используют для трансформации аликвотной части электро компетентных Е. coli DH10B; трансформация производится путем электропорации с использованием следующих условий: смесь компетентных бактерий и среды сшивания вводят в кювету для электропорации толщиной 0,2 см (Biorad), предварительно охлажденную до 0 С. Физические условия электропорации при использовании электропоратора марки Biorad являются следующими: 2500 В, 25 мкФ и 200 . В этих условиях среднее время разряда конденсатора составляет порядка 4,2 мс. Затем бактерии помещают в 1 мл среды SOC(ref. CPMB) и перемешивают в течение 1 ч в ротационном смесителе при 200 об/мин в трубках Corning (15 мл). После распределения на среде LB/агар, к которой добавлено 100 мкг/мл карбеницилина, мини-препараты бактериальных клонов вырастают за одну ночь при 37 С, согласно протоколу, описанному в "Current Protocols in Molecular Biology". После расщепления ДНК с помощью EcoRI и разделения в электрофорезе на геле агарозы LGTA/TBE (ref. CPMB) 16 0,8%, сохраняют клоны, имеющие включение в 1,7 кнп. Последняя проверка состоит в том, чтобы убедиться, что очищенная ДНК имеет знак гибридизации с зондом EPSPS Arabidopsis thaliana. После электрофореза фрагменты ДНК переносят на мембрану Hybond N, Amersham в соответствии с протоколом Southern, описанным в "Current Protocols in Molecular Biology". Фильтр гибридизируют с зондом EPSPS Arabidopsis thaliana, согласно условиям, описанным выше в пункте 3. Плазмидный клон, имеющий включение из 1,7 кнп и гибридизирующийся с зондом EPSPS Arabidopsis thaliana, получают в больших количествах, а ДНК, полученную в результате лизиса бактерий, очищают на градиенте CsCl так, как описано в "Current Protocols inMolecular Biology". Очищенная ДНК была частично секвенирована набором Pharmacia в соответствии с инструкциями поставщика и с использованием универсальных праймеров М 13,прямых и обратных, заказанных у того же поставщика. Полученная частичная последовательность включает примерно 0,5 кнп. Производная последовательность аминокислот на участке зрелого протеина (около 50 аминокислотных остатков) имеет 100%-ную идентичность с соответствующей аминированной последовательностью зрелого EPSPS кукурузы, описанной в американском патенте USP 4 971 908. Этот клон, соответствующий фрагменту EcoRI в 1,7 кнп ДНК EPSP клеточной суспензии кукурузыBMS был назван pRPA-ML-711. Полная последовательность этого клона была получена на двух нитях с использованием протокола набораPharmacia и при синтезе комплементарных олигонуклеотидов с обращением направления через каждые 250 нп. Полная последовательность этого клона из полученных 1713 нп представленаSEQ ID2. 6. Получение клона pRPA-ML-715. Анализ последовательности клона pRPAML-711 и, в частности, сравнение последовательности производных аминокислот с аминокислотной последовательностью кукурузы показывает расширение последовательности на 92 нп выше кодона GCG, кодирующего NН 2 концевой Аланин зрелой части EPSPS кукурузы(американский патент USP 4 971 908). Также наблюдается расширение на 288 нп ниже кодона ААТ, кодирующего СООН-концевой аспарагин зрелой части EPSPS кукурузы (американский патент USP 4 971 908). Эти две части соответствуют, очевидно, для NН 2-концевого расширения части последовательности транзитного пептида для пластидной локализации, и для СООНконцевого расширения нетранслируемого 3'участка кДНК. Чтобы получить кДНК, кодирующую зрелую часть кДНК EPSPS кукурузы, как описано вUSP 4 971 908, были выполнены следующие операции: 17 а) Удаление нетранслируемого участка 3': конструкция pRPA-ML-712. Клон pRPA-ML-711 был разрезан рестрикционным ферментом AseI, и концы, образовавшиеся в результате этого разрезания, были активированы обработкой фрагментом Klenow ДНК-полимеразы I, согласно протоколу, описанному в СРМВ. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом SacII. ДНК,полученная в результате этих операций, была разделена электрофорезом на геле агарозы"AseI-открытые концы/SacII" в 0,4 кнп был удален из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. ДНК клона pRPAML-711 была разрезана рестрикционным ферментом HindII, расположенным в полилинкере вектора клонирования pUC19, и концы, образованные в результате этого разрезания, были активированы обработкой фрагментом Klenow ДНК-полимеразы I. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом SacII. ДНК, полученная в результате этих действий,была разделена электрофорезом на геле агарозы"HindIII-открытые концы/SacII" приблизительно в 3,7 кнп, был удален из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. Оба включения были сшиты, и 2 мкл смеси сшивания были использованы для трансформации Е. coli DHIOB, как описано выше в пункте 5. Проводят анализ плазмидной ДНК различных клонов согласно процедуре, описанной дляpRPA-ML-711. Один из сохраненных плазмидных клонов содержит включение EcoRI-HindIII приблизительно в 1,45 кнп. Концевая последовательность этого клона показывает, что 5'конец включения в точности соответствует соответствующему концу pRPA-ML-711 и что 3'конец содержит последовательность:CATGCAAGCTT-3' ". Подчеркнутая последовательность соответствует кодону аминокислоты СООНконцевой аспарагин, причм следующий кодон соответствует кодону остановки трансляции. Нуклеотиды, следующие за ним, соответствуют элементам последовательности полилинкераpUC19. Этот клон, включающий последовательность pRPA-ML-711 до сайта остановки трансляции зрелого EPSPS кукурузы и за которым следуют последовательности полилинкера pUC 19 до сайта HindIII, был назван pRPA-ML-712. б) Модификация 5'-конца pRPA-ML-712: конструкция pRPA-ML-715. Клон pRPA-ML-712 был разрезан рестрикционными ферментами PstI и HindIII. ДНК, полученная в результате этих операций, была разделена электрофорезом на геле агарозыLGTA/TBE (ref. СРМВ) 0,8%. Фрагмент геля,содержащий включение PstI/EcoRI в 1,3 кнп,бьш удалн из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. Это включение было сшито в присутствии эквимолекулярного количества каждого из двух олигонуклеотидов, частично комплементарных, и имеющих следующие последовательности: Олиго 1: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCATGGAGCTCGGCTC-3' а также в присутствии ДНК плазмиды pUC19,расщеплнной рестрикционными ферментамиBamHI и HindIII. Два мкл смеси сшивания послужили для трансформации Е. coli DHIOB, как описано выше в пункте 5. После анализа содержания плазмидной ДНК в различных клонах согласно процедуре, описанной выше в пункте 5, один из клонов, имеющий включение приблизительно из 1,3 кнп, был сохранн для дальнейших анализов. 5' -концевая последовательность сохраненного клона показывает, что последовательность ДНК на этом участке является следующей: последовательность полилинкера pUC19, включающая сайты от EcoRI до BamHI, затем последовательность олигонуклеотидов, использованных во время клонирования, затем остаток последовательности, присутствующей в pRPAML-712. Этот клон был назван pRPA-ML-713. Этот клон содержит кодон метионина ATG,включенный в сайт NcoI раньше кодона Nконцевой Аланин зрелой EPSPS синтетазы. Кроме того, N-концевые кодоны аланина и глицина были сохранены, но модифицированы по третьему изменяемому основанию: начальныйGCCGGC. Клон pRPA-ML-713 был разрезан рестрикционным ферментом HindIII, и концы этого разрезания были активированы с помощью обработки фрагментом Klenow ДНК-полимеразы I. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом SacI. ДНК, полученная в результате этих операций, была разделена электрофорезом на геле агарозы LGTA/TBE (ref.CPMB) 0,8%. Фрагмент геля, содержащий включение "HindIII-открытые концы/SacII" в 1,3 кнп, был удален из геля и очищен согласно протоколу, описанному выше в пункте 5. Это включение было сшито в присутствии ДНК плазмиды pUC19, расщеплнной рестрикционным ферментом XbaI и концы этого разрезания были активированы с помощью обработки фрагментом Klenow ДНК-полимеразы I. Затем было выполнено разрезание рестрикционным ферментом SacI. Два мкл смеси сшивания послужили для трансформации E.coli DHIOB, как описано выше в п. 5. После анализа содержания плазмидной ДНК в различных клонах согласно процедуре, описанной выше в параграфе 5, один 19 из клонов, имеющий включение приблизительно в 1,3 кнп, был сохранн для дальнейших анализов. Концевая последовательность сохраненного клона показывает, что последовательность ДНК является следующей: последовательность полилинкера pUC19, включающая сайты отEcoRI до SacI, затем последовательность олигонуклеотидов, использованных во время клонирования, из которой удалены 4 нп GATCC из описанного выше олигонуклеотида I, затем остаток последовательности, присутствующей вpRPA-ML-712, до сайта HindIII, и последовательность полилинкера pUC19 от XbaI до HindIII. Этот клон был назван pRPA-ML-715. 7) Получение кДНК, кодирующей мутированную EPSPS кукурузы. Все этапы мутагенеза были выполнены с помощью набора для мутагенеза U.S.E. Pharmacia в соответствии с инструкциями поставщика. Принцип этой системы мутагенеза является следующим: плазмидную ДНК денатурируют температурной обработкой и снова ассоциируют в присутствии молярного избытка, с одной стороны, олигонуклеотида мутагенеза, и, с другой стороны, олигонуклеотида, позволяющего удалить единственный сайт рестрикционного фермента, присутствующий в полилинкере. После этапа реассоциации, синтез комплементарной цепочки выполняют с помощью действия Т 4 ДНК-полимеразы в присутствии Т 4 ДНКлигазы и протеина гена 32 в соответствующем поставляемом буферном растворе. Продукт синтеза инкубируют в присутствии рестрикционного фермента, сайт которого, предположительно,исчез в результате мутагенеза. Штамм E.coli,представляющий, в частности, мутацию mutS,используется в качестве хозяина для трансформации этой ДНК. После роста в жидкой среде получают полную плазмидную ДНК и инкубируют в присутствии рестрикционного фермента,использованного ранее. После этих обработок штамм E.coli DHIOB используют как хозяина для трансформации. Получают плазмидную ДНК выделенных клонов и проверяют секвенированием наличие введнной мутации. А) Модификация сайтов или последовательности без влияния априори на характер устойчивости EPSPS кукурузы к конкурентным ингибиторам активности EPSP синтетазы: удаление внутреннего сайта NcoI из pRPA-ML-715. Последовательность pRPA-ML-715 нумеруют произвольно, помещая первое основание кодона N-концевого Аланина GCC в положение 1. Эта последовательность содержит сайт NcoI в положении 1217. Олигонуклеотид модификации сайта содержит последовательность: 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3' После секвенирования согласно приведенной выше ссылке, последовательность, определяемая после мутагенеза, соответствует последовательности использованного нуклеотида. Сайт NcoI был удалн, и трансляция на этом 20 участке сохраняет начальную последовательность, имеющуюся на pRPA-ML-715. Этот клон был назван pRPA-ML-716. Последовательность в 1340 нп этого клона представлена SEQ ID3 и SEQ ID4. Б) Модификации последовательности, позволяющие увеличить характер устойчивостиEPSP кукурузы к конкурентным ингибиторам активности EPSP синтетазы. Были использованы следующие олигонуклеотиды: а) мутация Thr 102Ile. 5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3' После секвенирования последовательность, определяемая после мутагенеза на трех мутированных фрагментах, является идентичной последовательности родительской ДНКpRPA-ML-716 за исключением участка, подвергнутого мутагенезу, который соответствует участку использованных олигонуклеотидов мутагенеза. Эти клоны были названы: pRPA-ML717 для мутации Thr 102Ile, pRPA-ML-718 для мутации Pro 106Ser, pRPA-ML-719 для мутаций Gly 101 Аlа и Thr 102Ile и pRPAML-720 для мутаций Thr 102Ilе и Pro 106Ser. Последовательность pRPA-ML-720 в 1340 нп представлена SEQ ID5 и SEQ ID6. Включение NсоI-HindIII в 1395 нп лежит в основе всех конструкций, используемых для трансформации растений, для введения устойчивости к гербицидам - конкурентным ингибиторам EPSPS, и в частности, устойчивости к глифозату. Это включение будет далее в описании называться "двойной мутант EPSPS кукурузы". Б. Устойчивость к глифозату различных мутантов in vitro. 2.a: Экстрагирование EPSP синтетазы. Различные гены EPSP синтетазы вводятся в виде кассеты NcoI-HindIII в плазмидный вектор pTrc99a (Pharmacia, ref: 27-5007-01), разрезанный с помощью NcoI и HindIII. Рекомбинантные E.coli DH10B, способные к сверхэкспрессии различных EPSP синтетаз, обрабатывают ультразвуком в 40 мл буферного раствора на 10 г осажднных клеток и промывают тем же буферным раствором (tris HCl 200 мМ рН 7,8,меркаптоэтанол 50 мМ, EDTA 5 мМ и PMSF 1 мМ), куда добавляют 1 г поливинилпирролидона. Суспензию перемешивают в течение 15 мин при 4 С, затем центрифугируют 20 мин при 27000g и 4 С. К отделнной жидкости добавляют сульфат аммония, чтобы довести раствор до 40% насыщенности сульфатом аммония. Смесь центрифугируют 20 мин при 27000g и 4 С. К 21 вновь отделнной жидкости добавляют сульфат аммония, чтобы довести раствор до 70% насыщенности сульфатом аммония. Смесь центрифугируют 30 мин при 27000g и 4 С. EPSP синтетазу, присутствующую в этом белковом осадке, помещают в 1 мл буферного раствора (trisHCl 20 мМ рН 7,8 и меркаптоэтанол 50 мМ). В течение одной ночи проводят диализ этого раствора, используя два литра этого же буферного раствора при 4 С. 2.б: Ферментная активность. Активность каждого фермента, так же, как и его устойчивость к глифозату измеряют inSprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A,351-352 из Aerobacter aerogenes strain ATCC 25597) и фторид калия 10 мМ. Ферментный экстракт добавляют в последний момент, после добавления глифозата, конечная концентрация которого варьируется от 0 до 20 мМ. Активность измеряют по количеству освобожднного фосфата согласно технике Tausky Н.А. и Shorr Е, 1953, J. Biol. Chem., 202, 675-685. В этих условиях "дикий" фермент (WT) ингибируется на 85% начиная с концентрации глифозата, равной 0,12 мМ. При этой концентрации известный мутантный фермент Serl06 ингибируется только на 50%, а три других мутанта Ilе 102, Ile 102/Ser 106, Ala 101/Ile 102 не ингибируются или мало ингибируются. Нужно увеличить концентрацию глифозата в десять раз, до 1,2 мМ, чтобы ингибировать мутантный фермент Ilе 102 на 50%, при этом мутанты Ilе 102/Ser 106, Ala/Ile и Ala не ингибируются. Нужно отметить, что активность мутантных ферментов Ala/Ile и Ala не ингибируется вплоть до концентрации глифозата, равной 10 мМ, а активность мутанта Ilе 102/Ser 106 не уменьшается, даже если концентрацию глифозата увеличить в два раза, и она будет равна 20 мМ. В. Устойчивость трансформированных растений табака. 0-1 Конструкция плазмид:pRPA-RD-124: Добавление знака полиаденилирования "nos" к pRPA-ML-720, полученному ранее, с созданием кассеты клонирования,содержащей двойной мутантный ген EPSPS кукурузы (Thr 102Ile и Pro 106 Ser). pRPAML-720 расщепляют с помощью HindIII, обрабатывают фрагментом Klenow ДНК-полимеразыI E. coli, чтобы получить открытый конец. Осуществляют второе расщепление с помощью(кассета клонирования, содержащая знак олиадениляции нопалинсинтетазы), чтобы получитьpRPA-RD-124. Чтобы получить очищенный полезный вектор pRPA-RD-12, нужно, чтобы он был предварительно расщеплен с помощью SalI,обработан с помощью ДНК-полимеразы Klenow, затем расщеплн второй раз с помощьюpRPA-RD-125: Добавление оптимизированного транзитного пептида (ОТП) к pRPARD-124 с созданием кассеты клонирования, содержащей ген EPSPS, взятый из плазмид pRPARD-7 (европейская заявка на патент ЕР 652 286) расщепляют с помощью SphI, обрабатывают Т 4 ДНК полимеразой, затем расщепляют с помощью SpeI, и очищают фрагмент ОТП. Этот фрагмент ОТП клонируют в pRPA-RD-124,предварительно расщеплнной с помощью NcoI,обработанной с ДНК полимеразой Klenow, чтобы удалить выступающую часть 3', затем расщеплнной с помощью SpeI. Затем этот клон секвенируют, чтобы обеспечить правильное соединение между ОТП и геном EPSPS. Таким образом получают pRPA-RD-125.pRPA-RD-159: Добавление двойного гистонного промотора arabidopsis H4A748 (заявка ЕР 507 689) к pRPA-RD-125, с созданием кассеты экспрессии в растениях для экспрессии гена"ОТП - двойной мутантный ген EPSPS" в тканях двудольных растений. pRPA-RD-132 (кассета,содержащая двойной промотор) H4A748 (заявка на патент ЕР 507698) расщепляют с помощьюNcoI и SacI. Очищенный фрагмент промотора затем клонируют в расщепленной с помощью(европейская заявка на патент 508909) с созданием вектора трансформации Agrobacteriumtumefaciens. pRPA-RD-159 расщепляют с помощью Not I и обрабатывают полимеразой Klenow. Затем этот фрагмент клонируют в pRPA-BL150A с помощью Smal. 1-1 Трансформация. Вектор pRPA-RD-173 вводят в штамм Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood и др.,1987), который является носителем космидыpTVK291 (Komari и др., 1986). Техника трансформации основана на методике Horsh и др.,(1985). 1-2 Регенерация. Регенерацию табака PBD6 (происхождениеSEITA Франция) из листовых эксплантатов осуществляют на базовой среде Murashige etSkoog (MS), содержащей 30 г/л сахарозы, а также 200 мкг/мл канамицина. Листовые эксплантаты отбирают у растений, выращенных в теплице или in vitro, и трансформируют согласно технике листовых дисков (Science, 1985, Vol. 226, р.р. 1229-1231) в три последовательных стадии: первая стадия включает индукцию побегов на питательной среде, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, содержащей 0,05 мг/л наф 23 является гемизиготным для каждого из двух генов, введенных скрещиванием. Скрещенные растения получают через шесть недель. Пример 7. Измерение устойчивости табака при обработке проросшего растения изоксафлутолом и бромоксинилом или глифозатом. В этой пробе каждый тест проводят на образце из 10 растений, причем ещ 10 растений оставляют необработанными. Все виды обработки осуществляют пульверизацией из расчета 500 л раствора на гектар. Для обработки проросших растений производят посев, затем пересаживают растения в чаши размером 9 см х 9 см. Обработка проросших растений производится на стадии хорошего развития (3-4 листочка). Партии растений, соответственно, "дикие" и генетически трансформированные, как описано выше, разделяют на несколько частей: а) необработанная партия,б) другие партии, обработанные, соответственно, только одним гербицидом,- проросшие растения, обработанные 2 дозами изоксафлутола (соответственно 200 и 400 г/га),- проросшие растения, обработанные 2 дозами бромоксинила (соответственно 400 и 800 г/га),- проросшие растения, обработанные 2 дозами глифозата (соответственно 800 и 1200 г/га),в) другие партии, обработанные соответственно двумя гербицидами, в проросшей стадии,смесью, приготовленной перед самым использованием:- двумя дозами изоксафлутола и бромоксинила (соответственно 200/400 и 400/800 г/га),- двумя дозами изоксафлутола и глифозата(товарный продукт PARDNER) в виде октаноата в эмульгирующемся концентрате 225 г/л и глифозат (Round-UP). В этих условиях через 17 дней после обработки наблюдают следующие признаки фитотоксичности, которые указаны в таблице, в процентах деструкции, а также в таблице указано число растений на партию и дозы гербицидов,выраженные в граммах активного вещества на гектар: Обработка проросших растений изоксафлутолом и бромоксинилом или глифозатом Растения с геном устойчивости Гербицид в г/л без обработки = тилуксусной кислоты (ANA) и 2 мг/л бензиламинопурина (ВАР), в течение 15 дней. Затем образовавшиеся на этом этапе ростки выращивают в течение 10 дней на среде MS, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, но в которой не содержится гормон. Затем отбирают развившиеся побеги и культивируют их на укореняющей среде MS, с половинным содержанием солей,витаминов и cахаров и не содержащей гормон. Примерно через 15 дней укоренившиеся побеги переносят в землю. 1-3 Устойчивость к глифозату. Двадцать трансформированных растений были регенерированы и переведены в теплицу для конструирования pRPA-RD-173. Эти растения были обработаны в теплице на пятилистовой стадии водной суспензией RoundUp, соответствующей 0,8 кг активного вещества глифозата на гектар. Результаты соответствуют наблюдению признаков фитотоксичности, отмеченных через 3 недели после обработки. В этих условиях констатируют, что растения, трансформированные конструкцией pRPA-RD-173, имеют очень хорошую устойчивость, тогда как нетрансформированные контрольные растения были полностью уничтожены. Эти результаты ясно показывают улучшение, вызванное использованием химерного гена согласно изобретению, для того же гена, кодирующего устойчивость к глифозату. Пример 5. Трансформация промышленного табака PBD6 геном нитрилазы (дляконструкция 238). Этот табак получен согласно европейской заявке n 0 337 899, страница 6, строка 50 и следующие, из конструкции 238, которая описана под названием pRPA-BL 238. Пример 6. Скрещивание опылением. В теплице проводят скрещивание опылением, соответственно, линий Со 17, 173 и 238:- Со 17 с 238, чтобы получить растения табака PBD6 для тестирования на двойную устойчивость к изоксафлутолу и бромоксинилу ("растения HPPD + OXY") и - Со 17 с 173, чтобы получить растения табака PBD6 для тестирования на двойную устойчивость к изоксафлутолу и глифозату ("растения HPPD + EPSPS"). Три клона являются гомозиготными по задействованному гену, следовательно, потомство как ген, используемый в векторе pRPARD-173. Химерный ген pRP 2012 вводят в табак. 1) Трансформация. Вектор вводят в неонкогенный штамм Agrobacterium EHA 101 (Hood и др., 1987), который является носителем космиды pTVK 291(Komari и др., 1986) . Техника трансформации основана на методике Ноrsh и др., (1985). 2) Регенерация. Регенерацию табака PBD6 (происхождениеSEITA Франция) из 7 листовых эксплантатов осуществляют на базовой среде Мurаshige иSkoog (MS), включающей 30 г/л сахарозы, а также 350 мг/л цефотаксима и 1 мг/л изоксафлутола. Листовые эксплантаты отбирают у растений в теплице или in vitro и трансформируют согласно технике листовых пластинок (Science 1985, Vol. 227, p.p. 1229-1231) в три последовательных этапа: первый этап включает индукцию побегов на среде MS, к которой добавлено 30 г/л сахарозы, содержащей 0,05 мг/л нафтилуксусной кислоты (ANA) и 2 мг/л бензиламинопу 5%HPPD Pseudomonas fluorescens быть использован в качестве маркерного гена во время цикла"трансформация-регенерация" какого-нибудь растительного вида, табак был трансформирован с помощью химерного гена, состоящего из гена HPPD и из дважды мутированного генаEPSPS устойчивости к глифозату, и были получены трансформированные растения, устойчивые одновременно к изоксафлутолу и к глифозату, после селекции на изоксафлутоле. Материал и методы, результаты Химерный ген pRP 2012, описанный выше,переносят в промышленный табак PBD6 согласно процедурам трансформации и регенерации,уже описанным в европейской заявке ЕР n 0 508 909. Химерный ген вектора pRP 2012 имеет следующую структуру А-В, в которой А - это: Двойной гистонный промотор рина (ВАР) и 1 мг/л изоксафлутола в течение 15 дней. Затем зеленые ростки, образовавшиеся на этом этапе, культивируют в течение 10 дней на среде MS, к которой добавлено 30 г/л сахарозы и 1 мг/л изоксафлутола, но которая не содержит гормон. Затем отбирают развившиеся побеги и выращивают их на укореняющей среде MS, с половинным содержанием солей, витаминов иcахаров и 1 мг/л изоксафлутола и не содержащей гормон. Примерно через 15 дней укоренившиеся побеги переносят в землю. Все всходы, полученные в соответствии с этим протоколом, анализируют с помощью ПЦР со специфичными праймерами HPPD Р. fluorescens. Этот анализ ПЦР позволил подтвердить,что все всходы, полученные таким образом, хорошо интегрировали ген HPPD и что они устойчивы одновременно к изоксафлутолу и глифозату, в условиях, описанных в примере 7. Это испытание подтверждает, что генHPPD может быть использован как маркерный ген и что, в ассоциации с этим геном, изоксафлутол может быть хорошим агентом селекции. Пример 9. Растение с геном HPPD и геномbar, устойчивое одновременно к изоксафлутолу и фосфинотрицину. 1. Конструкция химерного гена с последовательностью HPPD. Плазмида pRPA-RD-1004,представленная на фиг. 4, получена введением химерного гена устойчивости к изоксазолам в плазмиду pUC 19 в 2686 нп, поставляемую фирмой New England Biolabs (Yannish-Perron, С.Viera, J. и Massing, J. (1985) Gene 33, 103-119) и имеющую устойчивость к ампициллину. Различными элементами химерного гена в направлении расшифровки являются:- интрон гена спирта дегидрогеназы I кукурузы, описанный Sachs M. и др Genetics 113: 449-467 (1986) и состоящий из 536 нп;(ОТП), описанный в заявке на патент ЕР 0 508 909, этот ОТП состоит из 171 нп транзитного пептида малой субъединицы Рибулозы 1,5 бисфосфат карбоксилазы/оксигеназы Heliantis annuus (Waksman G. и др., 1987. Nucleics acids Res. 15: 7181), за которыми следуют 66 нп зрелой части малой субъединиды Рибулозы 1,5 бис 27 фосфат карбоксилазы/ оксигеназы Zea mays(Lebrun и др., 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360),за ними следуют 150 нп транзитного пептида малой субъединицы Рибулозы 1,5 бисфосфат карбоксилазы/оксигеназы Zea mays (Lebrun и др., 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360). Все вместе составляет 387 нп;- терминальная последовательность гена нопалин синтетазы (nos) (зона полиаденилирования гена nоs, выделенного из pTi 37, 250 нп)(Bevan M. и др., Nucleics acids Res., 11: 369-385); 2. Конструкция химерного гена устойчивости к фосфинотрицину (ген bar): Фосфинотрицин ацетил трансфераза(ФАТ), кодируемая геном bar, является ферментом, который дезактивирует один гербицид,фосфинотрицин (ФФТ). ФФТ ингибирует синтез глутамина и вызывает быструю аккумуляцию аммиака в клетках, ведущую к их умиранию (Tachibana и др., 1986). Плазмиду, используемую для введения устойчивости к фосфинотрицину в качестве селективного агента, получают введением химерного гена pDM 302 в вектор pSP72 из 2426 нп,поставляемый фирмой Promega Corp. (Genbank/DDBJ database accession number X65332) и содержащий ген устойчивости к ампициллину. Плазмида pDM 302, состоящая из 4700 нп,была описана Сао J. и др., Plant Cell Report II: 586-591 (1992). Различными элементами этой плазмиды являются:- промотор гена актина риса, описанный- первый экзон гена актина риса, состоящий из 80 нп;- первый интрон гена актина риса, состоящий из 450 нп;- кодирующий участок гена bar в 600 нп,удаленный из плазмиды PIJ41404, описанной- терминальная последовательность гена нопалин синтетазы (nos) (зона полиаденилирования гена nos, выделенного из pTi 37, 250 нп)(Bevan M. и др., Nucleics acids Res., 11: 369-385). 3. Трансформация. Для ввода генетической конструкции используют технику бомбардировки. Плазмиды очищают на колонке Qiagen и соосаждают на частицах вольфрама М 10 согласно способуKlein (Nature 327: 70-73, 1987). Затем смесь металлических частиц и двух плазмид, описанных выше, бомбардируют на эмбриогенных клетках кукурузы. 28 4. Регенерация и использование гена bar в качестве агента селекции: Бомбардируемые каллюсы селекционируют на глуфозинате до появления зеленых секторов. Положительные каллюсы конвертируют в соматические эмбрионы, затем помещают в условия, благоприятствующие прорастанию. Молодые растения переносят в теплицу для производства семян. Молекулярные анализы этих растений показывают, что- химерный ген HPPD и гетеролитический протеин отсутствуют в нетрансформированных каллюсах. Эти результаты показывают эффективность химерного гена bar для селекции трансформированных каллюсов, содержащих другой ген, представляющий интерес для агрономии. 5. Анализ потомства трансформированных растений. Полученные выше трансформированные растения выделили пыльцу, которая, предположительно, является частично трансгенной, которая оплодотворила зародышевые клетки дикой не трансгенной кукурузы. Полученные зерна селекционировали на песке после обработки изоксафлутолом. Ниже приводится протокол селекции: 800 мл песка Фонтенбло помещают в лоток с размером сторон 15 х 20 см. Эти лотки поливают водой и поддерживают влажными с помощью питательного раствора, состоящего из 5 мл Quinoligo (Хинолина) на литр воды. Двадцать зерен кукурузы помещают в лотки, которые затем обрабатывают изоксафлутолом путем пульверизации из расчета 100-200 г активного вещества на гектар (300 или 600 мкг активного вещества на лоток). Затем эти лотки помещают в теплицу. Полученные результаты собраны в следующей таблице: Эти результаты показывают эффективность гена HPPD для селекции устойчивых растений кукурузы. Они показывают также, что экспрессия HPPS Pseudomonas в тканях кукурузы придает им устойчивость к изоксафлутолу. Представлены следующие последовательности:SEQ ID n 5 и SEQ ID n 6 последовательности, соответственно, гена и протеина EPSPS мутированной кукурузы,часть из 1340 нп клона pRPA-ML-720. Для сведения прилагаются фигуры, в качестве иллюстрации изобретения. На фиг. 1 представлена белковая последовательность HPPD Pseudomonas sp. strain P.J. 874 и теоретическая нуклеотидная последовательность соответствующей кодирующей части; пять олигонуклеотидов, выбранных для амплификации одной части этого кодирующего участка, обозначены пятью стрелками. На фиг. 2 представлена картография плазмиды с фрагментом геномной ДНК из 7 kb, содержащей ген HPPD Р. fluorescens A 32. На фиг. 3 приводится сравнение аминокислотных последовательностей HPPD P.fluorescens A 32 и HPPD Pseudomonas sp. strain P.J. 874 (указаны только аминокислоты, различающиеся у двух последовательностей), а также консенсусная последовательность. Число проросших Число погибших Число уцелевших растений растений растений ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Химерная конструкция, включающая, по меньшей мере, два элементарных химерных гена, каждый из которых содержит элементы регулирования, необходимые для его транскрипции в растениях, и кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, сообщающий растениям устойчивость к одному гербициду, отличающаяся тем, что одна из кодирующих последовательностей кодирует гидроксифенил пируват диоксигеназу (HPPD). 2. Химерная конструкция по п.1, отличающаяся тем, что она также включает третий элементарный химерный ген, содержащий последовательность, кодирующую фермент, сообщающий растениям устойчивость к гербициду. 35 3. Химерная конструкция по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность происходит из гена нитрилазы Klebsiella sp., сообщающей растениям устойчивость к одному гербициду из группы дигалогеногидроксибензонитрилов. 4. Химерная конструкция по п.3, отличающаяся тем, что гербицидом является бромоксинил. 5. Химерная конструкция по п.3, отличающаяся тем, что гербицидом является иоксинил. 6. Химерная конструкция по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует фермент,придающий растениям устойчивость к глифозату. 7. Химерная конструкция по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу(EPSPS), сообщающий растениям устойчивость к гербициду - ингибитору EPSPS. 8. Химерная конструкция по п.7, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует фермент EPSPS, сообщающий растениям устойчивость к глифозату. 9. Химерная конструкция по п.6, отличающаяся тем, что вторая кодирующая последовательность кодирует глифозатоксиредуктазу,фермент детоксификации глифозата. 10. Химерная конструкция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая HPPD, происходит из Pseudomonas sp. 11. Химерная конструкция по п.10, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая HPPD, происходит из Pseudomonas fluorescens. 12. Химерная конструкция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая HPPD, имеет растительное происхождение. 13. Химерная конструкция по п.12, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая HPPD, происходит из Arabidopsis thaliana. 14. Химерная конструкция по п.12, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая HPPD, происходит из Daucus carota. 15. Химерная конструкция по любому из пп.1-14, отличающаяся тем, что она встроена в подходящий экспрессионный вектор. 16. Химерная конструкция по п.15, отличающаяся тем, что вектор представлен плазмидой. 36 17. Линия растительных клеток, содержащих, по меньшей мере, одну химерную конструкцию по любому из пп.1-14. 18. Растение, регенерированное из трансформированной клетки, отличающееся тем, что оно регенерировано из клетки, принадлежащей к линии клеток по п.17. 19. Способ получения трансформированных растений, устойчивых, по меньшей мере, к двум гербицидам, отличающийся тем, что в растительную клетку вводят химерную конструкцию по любому из пп.1-14 и трансформированные клетки подвергают регенерации. 20. Способ обработки растений по п.18 гербицидами. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что используют, по меньшей мере, два гербицида. 22. Способ по п.20, отличающийся тем, что используют, по меньшей мере, три гербицида. 23. Способ по любому из пп.20-22, отличающийся тем, что один из гербицидов является ингибитором HPPD. 24. Способ по любому из пп.21-23, отличающийся тем, что гербициды применяют одновременно. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что гербициды применяют в виде одной композиции, готовой к использованию. 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что гербициды применяют в виде смеси, приготовленной перед самым использованием. 27. Способ по любому из пп.20-23, отличающийся тем, что гербициды применяют последовательно. 28. Способ по любому из пп.20-27, отличающийся тем, что гербицидом - ингибиторомHPPD является изоксафлутол. 29. Способ по любому из пп.20-27, отличающийся тем, что гербицидом - ингибиторомHPPD является сулкотрион. 30. Способ по любому из пп.20-29, отличающийся тем, что второй гербицид принадлежит к группе дигидрогеногидроксибензонитрилов. 31. Способ по п.30, отличающийся тем, что гербицид выбирают из группы, включающей бромоксинил и иоксинил. 32. Способ по одному из пп.20-31, отличающийся тем, что второй гербицид является ингибитором фермента EPSPS. 33. Способ по п.32, отличающийся тем, что ингибитором фермента EPSPS является глифозат или сульфозат.