Полимерная микрочастица, содержащая адсорбированные на ней белок и антитело, для получения фармацевтической композиции для интраназального введения

1 Данное изобретение относится к полимерным микрочастицам, содержащим белок и антитела, адсорбированные на них, для получения фармацевтической композиции для введения в нос. В данном описании и последующей формуле изобретения термин "белок" подразумевает любое соединение как результат конденсации двух или более аминокислот. Поэтому термин включает в себя, не ограничиваясь ими, биологически активные пептиды, полипептиды и белки. Известно, что у различных видов животных, включая человека, всасывание белков, введенных через нос, оказывается выше 40% для пептидов, содержащих от 3 до 6 аминокислот(АК), приблизительно 10-15% для полипептидов, содержащих от 9 до 27 АК, и менее 1% для высокомолекулярных полипептидов (например,для инсулина (51 АК) всасывание почти нулевое), хотя существуют значительные межвидовые различия для одних и тех же пептидов или даже индивидуальные различия у одного и того же вида [Lee W.А., Longenecker J.Р. "Biopharm.Manufact." April pp 1-7 (1988)]. Это объясняет, почему в конце 80-х только 3 нанопептида как таковые (десмопрессин, липрессин, окситоцин) вводили, используя назальный путь, а после 80-х стали изучать ингибиторы протеиназ и усилители прохождения через мембрану слизистой носа. В основном эти усилители представляют собой поверхностноактивные вещества, которые увеличивают пассивную проницаемость мембраны слизистой носа. В результате оказалось возможным получение композиций кальцитонина (32 АК), инсулина (51 АК), гормона роста (191 АК) и других белков и высокомолекулярных полипептидов для введения в нос [Lee W.А., Longenecker J.Р.Res." 10, 682, (1993); Shao Z. et al. "Pharmaceutical Res." 11, 1174 (1994). Однако в связи с тем, что усилители представляют собой поверхностно-активные вещества, они оказывают неблагоприятное действие,повреждая мембрану слизистой оболочки носа более или менее глубоко и обратимо, таким образом увеличивая пассивную проницаемость. С целью улучшения абсорбции также используют замедлители прохождения через нос,такие как вязкие агенты, адгезивные полимеры и им подобные, но полученные результаты оказываются весьма умеренными. Кроме того, замедлители оказывают токсическое действие на мембрану слизистой и реснички. 2 Для устранения этих недостатков предлагается введение лекарственных средств, включенных в микросферы крахмала, которые не всасываются, так как они слишком большие, но которые частично гидратируют в просвете носа и медленно высвобождают предварительно включенные в них пептиды [Illum L. et al. "Int. J.Pharm." 47, 233, (1988)]. В этом случае замедляющее действие наблюдают одновременно с улучшением всасывания молекул небольшого и среднего размера. Однако, всасывание больших молекул не улучшается, так как мембрана слизистой остается неповрежденной. В ЕР-А-0 474 453 описана фармацевтическая композиция для введения через нос, содержащая i) белок и ii) термолабильную субъединицу энтеротоксина В (LTB). Комплекс белок/LTB обеспечивает увеличение интраназального всасывания белка по сравнению с всасыванием при введении одного белка (см. табл. 1). Однако LTB не является антителом, а комплекс белок/LTB не проводится с помощью микрочастиц. К тому же в ЕР-А-0 474 453 не проведено сравнение между всасыванием слизистой носа комплекса белок/LTB и всасыванием слизистой кишечника. В ЕР-А-0 681 833 описана фармацевтическая композиция для назального введения, содержащая (i) белок, адсорбированный на (ii) носителе из поливалентного металла. Эта композиция охарактеризована одинаковой или более высокой биологической усвояемостью по сравнению с биоусвояемостью, достигаемой при инъекции или при оральном введении. Однако в табл. 1 в ЕР-А-О 681 833 показано, что биоусвояемость инсулина при назальном введении только в два раза выше, чем при подкожном введении, в результате которого, как известно,имеет место более высокая биологическая усвояемость, чем при пероральном поступлении. Наконец, в международной заявке РСТWO 94/28879 описана фармацевтическая композиция для перорального введения, содержащая биологически активный материал, антитело,которое специфически связывается с вышеупомянутым биологически активным материалом и множеством микрочастиц из полимерного материала. В частности, биологически активный материал относится к семейству пептидов, полипептидов и белков. Предпочтительны микрочастицы, представляющие собой микросферы полистирола. Биологически активное вещество и антитела адсорбируются на вышеупомянутых микрочастицах, а последние подвергаются эндоцитозу со стороны эпителия, покрывающего фолликулы Пейеровых бляшек у мышей. Поэтому можно рассчитать у лабораторного животного как количество микрочастиц, поступающих в клетки-переносчики (поглощение), так и количество микрочастиц, которое эффективно про 3 ходит трансмурально и достигает лимфы мезентериального потока, который собирает весь транспортируемый материал. В вышеупомянутой заявке наиболее эффективного переноса достигают, используя гормон роста быка в качестве белка и специфическое антитело, подобное bGH-Ab, в качестве антитела. Измерение поглощения проводят in vivo посредством включения в тощую кишку и подвздошную кишку крысы 3,6 х 1011 покрытых микрочастиц; через 90 мин ткань фиксируют и осуществляют измерение (при расчетах учитывают 6 циклов эндоцитоза за 90 мин). Получены следующие результаты:a) общее поглощение за 90 мин составляет 40 см 2: 8400000 микрочастиц [продуктивность=0,023% (=8400000/3,6 х 1011)];b) полное поглощение на единицу площади за 90 мин составляет 40 см 2: 210000 микрочастиц/см 2; [продуктивность, см 2=0,00058%(=210000/3,6 х 1011)]. В свою очередь, измерения трансмурального потока выполняли, включая in vivo в тощую кишку + подвздошную кишку крысы 3,6 х 1011 покрытых микрочастиц и собирая лимфу через канюлю из мезентериального потока каждые 5 мин. Получены следующие результаты:a) трансмуральный транспорт на 40 см 2 за 90 мин: 65000 микрочастиц: [продуктивность на 40 см 2=65000/3,6 х 1011(=0,00018%)];b) материал, транспортированный трансмурально за 90 мин/см 2: 1625 микрочастиц/см 2;[продуктивность/см 2=4,4 х 10-9(=0,0000044%)]. Эти данные показывают, что эндоцитоз в кишечнике оказывается в 130 раз (2,3 х 10-5/1,8 х 10-7) выше, чем поглощение при трансмуральном переносе. Это означает, что из 130 подвергнутых эндоцитозу частиц 129 задерживаются в вышеупомянутой лимфоидной ткани Пейеровых бляшек и только 1 микрочастица попадает в лимфу. Неожиданно было установлено, что в мембране слизистой носа производительность активного транспорта белка и специфического антитела к вышеназванному веществу, адсорбированных на микрочастицах полимерного соединения, оказывается в 400 тысяч раз выше,чем в кишечнике. Более определено, поскольку результаты абсорбции в эксперименте на кишечнике получают in vivo, эти данные относятся к поступающему потоку (просвет лимфы), состоящему как из активного, так и из пассивного околоклеточного транспорта, который увеличивает продуктивность. На основании этой исходной предпосылки, соотношение продуктивности назального и кишечного транспорта оказывается, без сомнения выше, чем в 400 тысяч раз, как упоминалось ранее. Фактически изучали изолированную мембрану слизистой носа in vitro, и это давало воз 002324 4 можность измерять два противоположных однонаправленных потока покрытых микрочастиц, и собственно абсорбцию рассчитывали как разницу этих потоков. Поэтому собственно абсорбция мембраной слизистой носа не включает в себя поступающий пассивный компонент, но,в отличие от поглощения, описанного для кишечника, является исключительно результатом активной абсорбции. Далее следует отметить, что кроме крайне благоприятного соотношения продуктивности,вообще назальный путь введения является более выгодным по сравнению с оральным введением,так как абсорбированное вещество не проходит через пищеварительную систему желудочнокишечного тракта, и, попадая потом в циркуляцию, не проходит через печень. Поэтому первым объектом данного изобретения является обеспечение применения полимера микрочастиц, содержащих адсорбированные на нем белок и антитело для получения фармацевтической композиции для введения в нос. Белок предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя BSA (бычий сывороточный альбумин), инсулин, энкефалин, гормоны, факторы роста, цитокины, факторы коагуляции, нейропептиды, противомикробные агенты и их фрагменты. Антитело, в свою очередь,представляет собой иммуноглобулин, выбранный из группы, включающей в себя IgM, IgА иIgG. Предпочтительно иммуноглобулин является специфичным к белку. Микрочастицы предпочтительно представляют собой микросферы из неиммуногенного полимерного материала,такого как полистирол, латекс или другие полимеры. Необязательно, чтобы полимерный материал был биологически деградируемым. Предпочтительно фармацевтическую композицию согласно изобретению готовят в приемлемой дозированной форме, содержащей эффективную дозу белка и антитело, адсорбированное на микрочастицах полимерного материала, вместе с фармацевтически приемлемым инертным ингредиентом. Примерами приемлемых дозированных форм для введения в нос являются кремы, мази,аэрозоли, спреи и капли. Дозированные формы также содержат другие общепринятые ингредиенты, такие как консерванты, стабилизаторы, буферы, соли для регулирования осмотического давления, эмульгаторы, ароматизаторы и им подобное. Количество белка и антител в фармацевтической композиции согласно изобретению варьирует в широких пределах, в зависимости от известных факторов, таких например, как стадия и тяжесть заболевания, вес тела пациента,число суточных доз и активности выбранного белка. Оптимальное количество, тем не менее,легко определяется специалистом в данной области. 5 Обычно соотношение белок/иммуноглобулин составляет от 1 до 15000 моль белка на каждый моль иммуноглобулина. Предпочтительно от 1 до 5000, даже более предпочтительно от 1 до 100 моль белка на каждый моль иммуноглобулина. В свою очередь весовое количество белка в фармацевтической композиции согласно изобретению специалисты в данной области легко устанавливают в каждом случае на основании известной активности используемого белка. Дозированные формы фармацевтической композиции согласно изобретению готовят способами, хорошо известными химику-фармацевту, включающими в себя смешивание, гранулирование, прессование, растворение, стерилизацию и им подобное. Для оценки активность белков, адсорбированных на микрочастицах вместе с антителами,специфичными к белку, определяют посредством экспериментов, описанных ниже. Пример 1. Перенос микрочастиц при интраназальном введении. Для эксперимента используют две гетеролатеральные мембраны слизистой носа, выделенные у самцов новозеландских кроликовальбиносов (вес тела: 3-3,5 кг) после умерщвления путем дислокации шейных позвонков. Участки мембраны слизистой, соответствующие верхней носовой раковине, промывают забуференным раствором Кребса-Хенселейта ["Соmр.al., 27, 1280, (1996)], а затем вставляют в тефлон в работающей камере (Ussing) (подвергают воздействию участки 0,3 см 2) и инкубируют в растворе Кребса-Хенселейта, поддерживаемом при 271C. Состав забуференного раствора КребсаХенселейта следующий (в мМ): Na+ 142,9; K+ 5,9; Са 2+ 2,5; Mg2+ 1,2; Сl- 127,7; НСО 3-24,9; Н 2 РO4- 1,2; SO42- 1,2; глюкоза 5,5. рН поддерживают на уровне 7,4, тогда как промывку проводят газом O2 95%+СО 2 5%. Промывной газ также используют для насыщения ткани кислородом и смешивания раствора. Различия трансэпителиального электрического потенциала (Vms) определяют на приготовленных таким образом гетеролатеральных тканях, используя цифровой мультиметр(Keithley Instr., Cleveland, США, модель 136). Измерения производят каждые 10 мин в течение первых 30 мин эксперимента (чтобы оценить функциональность эпителия после выделения) и в конце эксперимента (150 мин после начала; то есть 120-минутный инкубационный период). В конце периода преинкубации раствор с участка подслизистой оболочки одной из двух тканей и с участка слизистой оболочки другой ткани заменяют 250 мкл суспензии флуоресцентных полистироловых микросфер (сопряженных с флуоресцеином изоцианатом, 002324FITC:Polyscience Inc., Warrington, PA, USA) приблизительно 0,5 мкм в диаметре. Концентрацию микросфер измеряют в 10 мкл образцах(измеряют, по меньшей мере, в начале и в конце периода инкубации), относительно прямой линии калибровки абсорбирующей способностиCorp., Norwalk, CT, USA) при длине волны 600 нм. Приводимые концентрации для микросфер предварительно определяют в камере Буркера(флуоресцентный микроскоп Orthoplan MPV2,Leitz GMBH, D-6330 Wetzlar, Germany). Bo время эксперимента выявляют незначительные изменения в начальной и конечной концентрациях микрочастиц. Эти микрочастицы, транспортируемые в течение 120 мин инкубации, измеряют в камере Буркера, вследствие их низкой концентрации, и выражают в количестве микрочастиц см 2 ч-1 однонаправленных потоков слизистаяподслизистая (Jms) или наоборот (Jsm). Как донорский раствор, так и раствор, содержащий микрочастицы, обрабатывают ультразвуком в начале и в конце эксперимента, до проведения измерений для того, чтобы предотвратить агрегацию помещенных в раствор Кребса-Хенселейта микрочастиц друг с другом и тенденцию к абсорбции в ткани. Донорский раствор полностью обновляют каждые 30 мин,этот режим оказывается оптимальным для поддержания постоянной концентрации свободных микрочастиц. Пример 2. Перенос адсорбированных на микрочастицах белков при интраназальном введении. Осуществляют такой же способ, как в предыдущем примере 1, за исключением того, что микрочастицы суспендируют в белковом растворе (6,5 х 10-6 М), и весь раствор инкубируют в течение 90 мин при 37 С. Затем проводят 4 промывания, каждое из которых состоит из осаждения центрифугированием и повторного суспендирования в забуференном растворе Кребса-Хенселейта, содержащем бычий сывороточный альбумин, BSA (7,4 х 10-4 М, 5% процент/объем). Пример 3. Перенос адсорбированных на микрочастицах антител при интраназальном введении. Осуществляют тот же самый способ, который применяют в предыдущих примерах 1 и 2,за исключением того, что микрочастицы суспендируют в белковом растворе, содержащем антитела. Пример 4. Перенос адсорбированных на микрочастицах белков, связанных с антителами,при интраназальном введении. Осуществляют такой же способ, какой описан в предыдущих примерах 1 и 2, за исключением того, что используют полипептиды, адсорбированные на микрочастицах и специфиче 7 ски связанные с антителами. Микрочастицы прежде всего суспендируют в приемлемом белковом растворе (6,5 х 10-6 М), и всю суспензию инкубируют в течение 90 мин при 37 С. Затем проводят 4 промывки, каждая из которых состоит из осаждения при центрифугировании и повторного суспендирования в забуференном растворе Кребса-Хенселейта, содержащего BSA(7,4 х 10-4 М, 5% процент/объем). Наконец, вторую инкубацию микрочастиц, покрытых раствором, содержащим специфические антиполипептидные антитела, (6,5 х 10-8 М), проводят в течение 16 ч при 4 С. Для исследования кинетики переноса покрытых микрочастиц последние не разбавляют и не концентрируют до тех пор, пока они не будут покрыты при обычной исходной концентрации так, чтобы независимо от конечной концентрации микрочастиц имело место гомогенное покрытие. Из используемых полипептидов бычий сывороточный альбумин (BSA) иммуноглобулин А (IgA молозива человека), иммуноглобулин G(мышиные антитела против инсулина человека и анти-BSA) поставляет Sigma (St. Louis, МОUSA), тогда как инсулин быка и энкефалин(Lucerne, Switzerland). Результаты примеров 1-4 иллюстрируются в табл. 1, показывающей потоки слизистаяподслизистая (Jms) и наоборот (Jsm) нативных микрочастиц (не покрытых) или покрытых различными белками. Независимо от типа покрытия, эксперимент считают достоверным только тогда, когда устанавливают, что выделенная мембрана слизистой является жизнеспособной как в начале эксперимента, так и во время преинкубации, а также в конце инкубации. При этом учитываемым параметром является различие трансэпителиального электрического потенциала (Vms),показатели как трансэпителиального транспорта активных электрогенных ионов, так и клеточного метаболизма (который поддерживает последний) и целостности эпителия как барьера. Начальный минимальный Vms составляет+1 мв( позитивная подслизистая оболочка). Vms возрастает медленно и прогрессивно во время эксперимента, таким образом, указывая не только на то, что изолированная мембрана слизистой не подвергается деградации, но также и на то, что происходит постоянное восстановление функциональности вышеупомянутой мембраны слизистой in vitro. Co временем тенденция оказывается сходной с таковой, описанной Сrеmaschi D. et al. "Соmр. Biochem. Physiol." 99A, 361, (1991). Инкубацию проводят при температуре 271 С. По сравнению с 37 С эта температура способствует снижению метаболизма и транспорта приблизительно вдвое, но делает выделенную ткань более стабильной. В различных 8 типах проведенных экспериментов средний Vms через 30 мин преинкубации при 27 С (до введения донорского раствора с микрочастицами и начала инкубации с измерением потока) составляет 400,1 мв (134 образца слизистых).Vms в конце 120 мин инкубации составляет 6,6+-0,2 мв (134 образца слизистых, р 0,01). Независимо от типа покрытия в течение 120 мин инкубации не выявляют никакого значительного снижения концентрации микрочастиц в донорских растворах со временем. Эта концентрация в действительности составляла 3,250,05 х 1011 микрочастиц/мл (134 эксперимента) в начале инкубации и 3,220,04 х 1011 микрочастиц/мл (нами проведено 134 эксперимента) в конце инкубации. Это означает, что в рассматриваемом периоде времени потока Jms и Jsm являются однонаправленными и что никаких потерь микрочастиц не происходит вследствие абсорбции и агрегации. Поэтому это создает надежность при ссылках на концентрацию раствора, создающего потоки. Представленные в табл. 1 результаты показывают, чтоa) при различных условиях покрытия, значения Jsm соответствуют приблизительно 3-6 миллионам микрочастиц см-2 ч-1 из 325 биллионов микрочастиц/мл донорского раствора;b) когда микрочастицы не покрыты полипептидами, величина Jms незначительно отличается от величины Jsm; поэтому не происходит никакой собственно абсорбции микрочастиц(Jnet незначительно отличается от нуля);c) покрытие полипептидами, независимо от используемого полипептида (BSA, инсулин,энкефалин, IgA, антиинсулиновый IgG, антиBSA-IgG), дает величину Jms, которая всегда значительно выше, чем величина Jsm; следовательно, собственно абсорбция имеет место (Jnet значительно отличается от нуля);d) когда, после покрытия микрочастиц посредством адсорбции инсулина или BSA, соответствующее антитело (антиинсулиновый IgG или анти-BSA-IgG в концентрации 1:100 относительно концентрации, используемой для адсорбции) связано с ними связью, которая является специфической в отношении этих двух белков, Jms сильно стимулируется как в отношении инсулина, так и BSA, также как и в отношении двух антител, неспецифически адсорбированных на микрочастицах; следовательно,собственно абсорбция (Jnet) значительно увеличивается. Поскольку наивысшие потоки как таковые были получены с инсулином, связанным с его специфическим IgG, исследовали кинетику транспорта для этого типа покрытия. С этой целью микрочастицы покрывали, как было описано ранее, затем разбавляли или концентриро 9 вали, а потоки измеряли при различных концентрациях микрочастиц. В табл. 2 представлены результаты, полученные при выполнении 6 экспериментов на каждую концентрацию. Эти результаты показывают, чтоa) при концентрации 2 биллиона и 200 миллионов микрочастиц/мл, Jms не отличается значительно от Jsm. Поэтому Jnet не отличается от нуля;b) при более высоких концентрациях, в то время как Jsm не претерпевает никакого статистически достоверного изменения, Jms становится значительно выше, чем Jsm. Поэтому Jnet статистически отличается от нуля; 10 также увеличивается; следовательно, Jnet также возрастает. Увеличение все еще наблюдается при концентрации 982 биллиона микрочастиц/мл, то есть в 500 раз более высокой, чем используемая минимальная концентрация;d) кинетические кривые носят сигмовидный характер, и максимальную продуктивность/см 2 трансэпителиального транспорта получают при 3,2 х 1011 микрочастиц/мл, что эквивалентно 1,7%. Эта продуктивность, полученная при 27 С, оказывается в 400000 раз выше, чем соответствующая продуктивность, наблюдаемая в кишечнике при 37 С, и рассматриваемая как течение полного активного собственно потока и пассивного потока, в просвете лимфы, как упоминалось ранее (1,7 х 10-3/4,4 х 10-9=400000). Таблица 1. Потоки нативных микрочастиц или микрочастиц, покрытых полипептидом (Аg) или антителом, или полипептидом, связанным со специфическим IgG (Ag+Аb) Покрытие Число Концентрация (1011/мл)Vms (mV) Потоки (106cм-2 ч-1) микрочастиц экспериментов исходная конечная исходная конечная ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение полимерной микрочастицы,содержащей адсорбированные на ней белок и антитело, для получения фармацевтической композиции для интраназального введения. 2. Применение полимерной микрочастицы по п.1, отличающееся тем, что белок выбирают из группы, содержащей БСА, инсулин, энкефалин, гормоны, факторы роста, цитокины, факторы коагуляции, полипептиды, противомикробные агенты и их фрагменты. 3. Применение полимерной микрочастицы по любому из пп.1-2, отличающееся тем, что антитело представляет собой иммуноглобулин,выбранный из группы, содержащей IgM, IgА и 4. Применение полимерной микрочастицы по п.3, отличающееся тем, что иммуноглобулин является специфичным в отношении белка. 5. Применение полимерной микрочастицы по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что микрочастицы представляют собой микросферы. 6. Применение полимерной микрочастицы по п.5, отличающееся тем, что полимерный материал является биологически деградируемым. 7. Применение полимерной микрочастицы по п.5, отличающееся тем, что полимерный материал представляет собой полистирол. 8. Применение полимерной микрочастицы по любому из пп.3-6, отличающееся тем, что 12 соотношение белок/иммуноглобулин составляет от 1 до 15000 моль белка на моль иммуноглобулина. 9. Применение полимерной микрочастицы по любому из пп.3-6, отличающееся тем, что соотношение белок/иммуноглобулин составляет от 1 до 5000 моль белка на моль иммуноглобулина. 10. Применение полимерной микрочастицы по любому из пп.3-6, отличающееся тем, что соотношение белок/иммуноглобулин составляет от 1 до 100 моль белка на моль иммуноглобулина.