Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков

СПОСОБ БЫСТРОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ,ОСНОВАННЫЙ НА ВЫЯВЛЕНИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания тестсистем для диагностики различных заболеваний, маркерами которых являются уникальные белки или изменение их концентрации. Суть изобретения: метод быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении характерных для заболевания специфических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с другими белкамиреагентами, отличающийся тем, что берут специфический для данного заболевания белокмишень, гидролизуют протеолитическими ферментами, модифицируют химическую структуру образовавшейся композиции олигопептидов таким образом, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют далее уже в качестве белков-реагентов вместо специфических иммуноглобулинов в методах иммунофлюоресценции и иммуноферментном методе. Метод может быть применен для выявления вирусных антигенов, микробных антигенов в различных биологических жидкостях человека, а также для детекции новых и малоизученных инфекционных заболеваний в связи с простотой получения диагностикумов. Мартынов Артур Викторович (UA),Фарбер Борис Славинович, Фарбер Софья Борисовна (RU) Васильева Г.С. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ФАРБЕР БОРИС СЛАВИНОВИЧ; ФАРБЕР СОФЬЯ БОРИСОВНА (RU) Область техники Изобретение относится к медицине, а именно к методам лабораторной диагностики, и предназначено для замены существующих методов иммунодиагностики с применением иммуноглобулинов на патентуемый значительно менее затратный метод. Предшествующий уровень техники Среди существующих лабораторных методов диагностики заболеваний, где используются специфические иммуноглобулины, наиболее распространены иммуноферментный метод и метод иммунофлюоресценции. Иммуноферментный анализ (или ИФА; англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) - это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов. Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время составляет более 90%. Тест-системы для иммуноферментной диагностики выявляют широкий круг различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и др. Метод ИФА дает возможность определения антител (IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются организмом в ответ на инфицирование. Антитела выявляются при взаимодействии со специальными препаратами, содержащими соответствующие антигены, образующие с антителами прочный комплекс, который можно обнаружить разными способами. В основе метода лежит принцип взаимодействия иммуносорбента - антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами. В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определнного класса. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма венозной крови, взятой натощак. Для диагностики венерических заболеваний используются три класса иммуноглобулинов: М, A, G. Благодаря тому, что иммуноглобулины разных классов вырабатываются в определенной последовательности, с помощью ИФА можно диагностировать инфекцию на разных стадиях и отслеживать динамику развития процесса. Последовательность выработки иммуноглобулинов разных классов следующая. Первыми появляются IgM-антитела. Как правило, это происходит через 1-3 недели с момента заражения. Время обнаружения антител зависит как от самой инфекции, так и от особенностей иммунной системы конкретного человека. Появляются симптомы острой инфекции. Обнаружение IgM-антител в анализе указывает на наличие острой фазы заболевания или на обострение хронических инфекционных заболеваний. Через месяц начинают вырабатываться IgA-антитела, основная часть которых концентрируется на слизистых оболочках, где реализуется их защитная функция. Последними появляются IgG-антитела, как правило, на 4 неделю с момента заражения. После лечения хламидиоза, микоплазмоза, трихомониаза их уровень значительно снижается, так как иммунитет против этих заболеваний не развивается. Следует обратить внимание на то, что обнаружение иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) указывает только на наличие антител, а не на наличие возбудителя. Поэтому в некоторых случаях иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты - как ложноположительные, так и ложноотрицательные. Однако специфичность лучших тест-систем ИФА рекомбинантного типа в настоящее время приближается к 100%. Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе,быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики. Достоинства ИФА возможность ранней диагностики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса,быстрота и удобство в работе. Недостаток ИФА - относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не сам возбудитель. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа. 1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа. 2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немеченными антителами. Комплексы антиген-антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам. 3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе. Известен новый метод детекции вируса гриппа и компоненты для его использования [1], где не ис-1 024771 пользуются антитела. В этом методе патентуются компоненты, способные специфически связываться с активными участками нейраминидазы вируса гриппа и новые компоненты для использования в этом методе. В качестве веществ, специфически взаимодействующих с гриппозной нейраминидазой, патентуются синтетические производные аналоги нейраминовой кислоты. Предполагается использование синтетических производных нейраминидазы в антительных тест-системах вместо иммуноглобулинов. Недостатком метода является полностью синтетический характер производных нейраминидазы и соответственно сложность синтеза и производство тест-системы, что значительно увеличивает ее цену, необходимость синтеза производного к каждому штамму вируса гриппа со своей нейраминидазой, невозможность использования метода для детекции других инфекций и выявления других белков, кроме гриппозных. Также известен иммунодиагностический метод и набор к нему для детектирования вирусных антигенов, таких как простой герпес [2]. Вирусный антиген иммуноконъюгирован со специфическим иммуноглобулином IgG против ирвусного антигена и сорбирован на нерастворимой матрице. Матрица взаимодействует при контакте с моноклональными иммуноглобулинами IgM, меченными биотином. Наличие антигена вируса герпеса выявляется реакцией авидина с биотином. Метод является аналогом иммуноферментного анализа. Недостатком метода является необходимость получения специфических иммуноглобулинов против вирусных антигенов с применением животных либо использования гибридом для получения моноклональных антител, что значительно удорожает конечный продукт. Также в методе используют многократную ковалентную конъюгацию иммуноглобулинов с биотином и специфических иммуноглобулинов с нерастворимым матриксом, что значительно уменьшает специфичность и чувствительность иммуноглобулинов от чего значительно падает точность проведенных исследований. Кроме того, метод предназначен только для детекции вирусных антигенов и не может быть использован для выявления бактериальных, грибковых и других низкоиммуногенных белков, к которым у иммунизированных животных трудно индуцировать синтез специфических иммуноглобулинов. Раскрытие изобретения В основу изобретения поставлена задача разработать способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков, способный выявлять любой белок специфический для конкретной болезни, в том числе низкоиммуногенный белок, к которому невозможно или трудно получить специфический иммуноглобулины, где бы не использовались иммуноглобулины и животных для их получения, где бы все процедуры получения белка-реагента сводились к нескольким простым процедурам и позволяли бы разрабатывать тест-системы для выявления новых и малоизученных инфекционных заболеваний в кратчайшие сроки. Поставленная задача решается путем разработки способа быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанного на выявлении характерных для заболевания специфических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с другими белками-реагентами, отличающегося тем, что берут специфический для данного заболевания белок-мишень (выделенный из микроорганизма, вируса или микроскопического грибка), гидролизуют протеолитическими ферментами, модифицируют химическую структуру образовавшегося макромолекулярного ансамбля из олигопептидов путем ацилирования янтарным ангидридом или алкилированием монохлоруксусной кислотой. Реакцию ведут таким образом,чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют далее уже в качестве белков-реагентов в методах иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов вместо специфических и антивидовых иммуноглобулинов. В качестве протеолитических ферментов могут быть использованы пепсин,трипсин, папанин, химотрипсин. Между полученным макромолекулярным ансамблем кислых олигопептидов и флюоресцирующим веществом флюоресцеинизотиоцианатом или другим флюоресцентным зондом могут быть получены флюоресцирующие конъюгаты для дальнейшего применения в методе флюоресцирующих антител (прямой или непрямой иммунофлюоресценции). Аналогично могут быть получены конъюгаты между супрамолекулярным ансамблем кислых пептидов и ферментом пероксидазой для дальнейшего использования этого конъюгата в иммуноферментном анализе. Вместо иммуноглобулинов авторами изобретения использован ансамбль из олигопептидов - продуктов гидролиза детектируемых впоследствии специфических антигенов, но с измененными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии - супрамолекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т.е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке [3, 4]. Специфическое взаимодействие обусловлено эффектом конъюгации и гибридизации гомогенных пептидов, но имеющих противоположный заряд - самосборка на мишени супрамолекулярного ансамбля. Метод позволяет исключить этап получения специфических иммуноглобулинов и соответственно отказаться от использования животных, ускорить до нескольких дней разработку тест-систем для новых и малоизученных инфекционных заболеваний, значительно удешевить стоимость производства тестсистем при той же чувствительности метода при значительно большей его специфичности. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - фотография эпителиальных клеток мазка, не инфицированных вирусом герпеса в патентуемом методе. Фиг. 2 - инфицированные вирусом герпеса 1 типа клетки буккального эпителия, выявленные патентуемым методом. Примеры осуществления изобретения Пример 1. Получение тест-системы для диагностики гриппа, содержащего нейраминидазу N1 и геммаглютинин H1. Берут амниотическую жидкость после инфицирования куриного эмбриона вирусом гриппа H1N1 и инкубирования до накопления максимального количества вируса в известных стандартизованных условиях, очищают известными методами содержащийся там вирус гриппа, концентрируют его путем диализа. К полученному концентрату добавляют раствор трипсина с расчетом, чтобы соотношение фермент:белок составляло 1:100, оставляют в термостате при 37 С на 12 ч. Концентрацию растворимых олигопептидов - продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически при 280 и 260 нм. Спектрофотометрический метод определения белка основан на способности ароматических аминокислот (триптофан,тирозин и в меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм. Условно принято считать, что при концентрации белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали растворитель препарата. Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05 до 2 мг/л. Определению белка данным методом мешают присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов (более 20%). В этом случае оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух длинах волн - 260 и 280 нм; содержание белка X (мг/мл) рассчитывают по формуле Калькара Х=1,45D280-0,74D260 Полученную смесь олигопептидов и РНК кипятят 10 мин, затем образовавшийся осадок негидролизованных биополимеров отделяют центрифугированием при 5g в течение 20 мин. К надосадочной жидкости добавляют флюоресцеина изотиоцианата в соотношении к белку 1/10000, оставляют раствор при 5 С на 5 ч, затем добавляют твердый янтарный ангидрид в соотношении к концентрации белка 2:1. Полученную смесь реагента далее используют в методе флюоресцирующих антител. Также в наборе используют конъюгированный с родамином стандартизованный бычий сывороточный альбумин. Пример 2. Детекция инфицирования вирусом гриппа H1N1. У пациентов, у которых подозревают грипп, берут бронхиальное отделяемое, мазок слизистой носа,кровь. Каждую пробу ресуспензируют в 0,9% забуференном растворе натрия хлорида, центрифугируют. Процедуру ресуспендирования и центрифугирования повторяют трижды для очистки клеток от сопутствующихрастворимых компонентов. Осадок клеток отбирают микропипеткой и наносят на предметное стекло, другим стеклом суспензию клеток равномерно распределяют по стеклу. Дают мазку высохнуть,опускают для фиксации в раствор ацетона либо фиксируют смесью Никифорова до высыхания мазка. На высушенный мазок наносят полученную в примере 1 композицию пептидов и оставляют в термостате при 37 С на 40 мин во влажной камере для предотвращения высыхания мазка. Затем мазок промывают забуференным 0,9% раствором натрия хлорида и наносят 0,1% раствор меченного родамином бычьего сывороточного альбумина, также оставляют на 20 мин в термостате во влажной камере. Обработка альбумином необходима для блокирования лишних эпитопов клеток, не связавшихся со специфическими флюоресцирующими пептидами. Затем мазок вынимают из термостата, промывают дистиллированной водой и высушивают. Детектируют флюоресцирующие зеленым цветом клетки в флюоресцентном микроскопе. Инфицированные вирусом клетки флюоресцируют зеленым цветом, здоровые клетки флюоресцируют красным цветом. Если вместо предметного стекла использовать камеру Горяева или флюорометрическую насадку, то можно сосчитать процентное соотношение инфицированных вирусом клеток. Для проверки работоспособности метода разработанную тест-систему проверяли в сравнительном тесте со стандартизованными и зарегистрированными РНИФ-тест-системой, ПЦР-тест-системой и культуральным методом. Для детекции брали образцы тканей больных, находящихся в стационарах в период эпидемии гриппа возрастом от 12 до 75 лет обоего пола. В качестве контролей использовали стандартизованную тест-систему для реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) выявления антигенов вируса гриппа H1N1 производства НИИ Гриппа РАМН(г. Санкт-Петербург, Российская Федерация), ревертазный ПЦР-диагностикум TaqMan (США) и выделение вируса in ovo с его детекцией стандартизованным методом гемагглютинации. Таблица 1 Сравнительные результаты обследования пациентов двух групп - с клиническими признаками гриппа,находящиеся в стационаре в период эпидемии гриппа и контрольная группа, проходящая плановое обследование без клинических признаков гриппа Как видно из табл. 1, результаты анализа, полученные с помощью разработанного метода, наиболее близко коррелируют с золотым стандартом вирусологии - культуральным методом выделения вирусом и методом ПЦР как в группе пациентов с клиническими признаками гриппа, так и у практически здоровых людей. Таким образом, предлагаемый метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, по точности приближается к культуральному методу детекции вирусов, который является стандартом вирусологической диагностики. Пример 3. Получение тест-системы для диагностики герпеса 1 типа. Берут амниотическую жидкость после инфицирования куриного эмбриона вирусом герпеса (штамм Л-2) и инкубирования до накопления максимального количества вируса в известных стандартизованных условиях, очищают известными методами содержащийся там вирус герпеса, концентрируют его путем диализа. К полученному концентрату добавляют раствор трипсина с расчетом, чтобы соотношение фермент:белок составляло 1:100, оставляют в термостате при 37 С на 12 ч. Концентрацию растворимых олигопептидов - продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически при 280 и 260 нм, как описано в примере 1. Полученную смесь олигопептидов и ДНК кипятят 10 мин, затем образовавшийся осадок негидролизованных биополимеров отделяют центрифугированием при 5g в течение 20 мин. К надосадочной жидкости добавляют флюоресцеина изотиоцианата в соотношении к белку 1/10000, оставляют раствор при 5 С на 5 ч, затем добавляют твердый янтарный ангидрид в соотношении к концентрации белка 2:1. Полученную смесь реагента далее используют в методе флюоресцирующих антител. Также в наборе используют конъюгированный с родамином стандартизованный бычий сывороточный альбумин. Пример 4. Детекция инфицирования вирусом герпеса 1 типа. У пациентов с признаками лабиальной герпесвирусной инфекции берут мазки из очага поражения,мазки лейкоцитов крови. Каждую пробу ресуспензируют в 0,9% забуференном растворе натрия хлорида,центрифугируют. Процедуру ресуспендирования и центрифугирования повторяют трижды для очистки клеток от сопутствующих растворимых компонентов. Лейкоциты дополнительно выделяют стандартизованным методом на градиенте фиккол/ферографин. Осадок клеток отбирают микропипеткой и наносят на предметное стекло, другим стеклом суспензию клеток равномерно распределяют по стеклу. Дают мазку высохнуть, опускают для фиксации в раствор ацетона либо фиксируют смесью Никифорова до высыхания мазка. На высушенный мазок наносят полученную в примере 3 композицию пептидов и оставляют в термостате при 37 С на 40 мин во влажной камере для предотвращения высыхания мазка. Затем мазок промывают забуференным 0,9% раствором натрия хлорида и наносят 0,1% раствор меченного родамином бычьего сывороточного альбумина, также оставляют на 20 мин в термостате во влажной камере. Обработка меченым альбумином необходима для блокирования лишних эпитопов клеток, не связавшихся со специфическими флюоресцирующими пептидами. Затем мазок вынимают из термостата,-4 024771 промывают дистиллированной водой и высушивают. Детектируют флюоресцирующие зеленым цветом клетки в флюоресцентном микроскопе. Инфицированные вирусом клетки флюоресцируют зеленым цветом (фиг. 2), здоровые клетки флюоресцируют красным цветом (фиг. 1). Если вместо предметного стекла использовать камеру Горяева или флюорометрическую насадку, то можно сосчитать процентное соотношение инфицированных вирусом клеток. Для проверки работоспособности метода разработанную тест-систему проверяли в сравнительном тесте со стандартизованными и зарегистрированными РНИФ-тест-системой, ПЦР-тест-системой и культуральным методом. Для детекции брали образцы у больных, находящихся на амбулаторном исследовании с жалобами на лабиальный герпес возрастом от 22 до 60 лет обоего пола. В качестве контролей использовали стандартизованную тест-систему для реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) выявления антигенов вируса герпеса 1 типа производства "Лабдиагностика"(г. Москва, Российская Федерация), ПЦР-диагностикум ЗАО "НПФ ДНК-Технология" (Российская Федерация) и выделение вируса in ovo с его детекцией стандартизованным методом иммунофлюоресценции фирмы "Лабдиагностика". Таблица 2 Сравнительные результаты обследования пациентов двух групп - с клиническими признаками лабиальной герпесвирусной инфекцией и контрольная группа, проходящая обследование без клинических признаков лабиального герпеса Как видно из табл. 2, результаты анализа, полученные с помощью разработанного метода наиболее близко коррелируют с методом РНИФ и культуральным методом выделения вирусов как в группе пациентов с клиническими признаками лабиального герпеса, так и у здоровых людей. Таким образом, предлагаемый метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, по точности коррелирует с методом РНИФ. Промышленная применимость способа Метод может быть внедрен на фармацевтических и биотехнологических предприятиях без изменения технологического цикла и не требует нового уникального оборудования или реактивов. Метод позволяет исключить этап получения специфических иммуноглобулинов и соответственно отказаться от использования животных, ускорить до нескольких дней разработку тест-систем для новых и малоизученных инфекционных заболеваний, значительно удешевить стоимость производства тест-систем при той же чувствительности метода при значительно большей его специфичности, метод коррелирует по специфичности и чувствительности с культуральным методом выделения вируса и полимеразной цепной реакцией, не требует сложного и дорогостоящего оборудования. Использованные источники информации 1. Patent US 6242582, Method of detection of influenza virus and compounds for use therein//Phillip ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении характерных для заболевания специфических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с белками-реагентами, отличающийся тем, что специфические для данного заболевания белки-мишени гидролизуют протеолитическими ферментами с последующим ацилированием или алкилированием аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов гидролизата, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют далее уже в качестве белков-реагентов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед ацилированием или алкилированием аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов к ним ковалентно присоединяют флуоресцирующий агент и затем используют в методе иммунофлюоресцентного анализа подобно специфическому иммуноглобулину, конъюгированному с флюоресциирующим агентом. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед ацилированием или алкилированием аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов к ним ковалентно присоединяют маркерный фермент через бивалентный сшивающий агент, а образовавшийся конъюгат фермента и олигопептидов используют в методе иммуноферментного анализа подобно конъюгату специфических иммуноглобулинов и маркерного фермента. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента используют трипсин. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента используют папаин. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента используют химотрипсин. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента используют пепсин. 8. Способ по пп.4-7, отличающийся тем, что продукт реакции между модифицированными олигопептидами и специфическим белком-мишенью выявляют методом гель-электрофореза по увеличению массы белка-мишени. 9. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве флюоресцирующего агента используют флюоресциинизотиоцианат. 10. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве флюоресцирующего агента используют родамин. 11. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве маркерного фермента используют пероксидазу. 12. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют глутаровый диальдегид. 13. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют малеимид. 14. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют малоновый диальдегид. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что ацилирование олигопептидов с изменением заряда проводят янтарным ангидридом. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что алкилирование олигопептидов с изменением заряда проводят монохлоруксусной кислотой. 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве белков-мишеней используют белки инактивированного температурой или радиацией микроорганизма. 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка-мишени используют индивидуальный белок инактивированного температурой или радиацией микроорганизма. 19. Способ по пп.17, 18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют вирусы. 20. Способ по пп.17, 18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют бактерии. 21. Способ по пп.17, 18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют микроскопические грибы.