Способ диагностики, страдает ли пациент от множества печеночных заболеваний, и способ определения риска пациента в отношении множества заболеваний печени

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ, СТРАДАЕТ ЛИ ПАЦИЕНТ ОТ МНОЖЕСТВА ПЕЧНОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ПАЦИЕНТА В ОТНОШЕНИИ МНОЖЕСТВА ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ Первым объектом данного изобретения является способ диагностики, страдает ли пациент от множества печеночных заболеваний, где у указанного пациента было предварительно диагностировано первое заболевание печени, путем определения уровня человеческого прогастрина (hPG) в образце плазмы или сыворотки указанного пациента, при котором если пороговое значение прогастина составляет по меньшей мере 400 пМ, то указанный пациент страдает по меньшей мере от одного дополнительного заболевания печени. Кроме того, описан способ определения риска пациента в отношении множества заболеваний печени, включающий определение с помощью биохимического анализа уровней hPG в сыворотке или плазме пациента и оценку относительного риска пациента на основе полученных данных для одной или более печеночных патологий, где уровень hPG ниже 100 пМ свидетельствует о том, что пациент находится на уровне "низкого риска" для одной или более печеночных патологий; уровень hPG от 100 до 400 пМ свидетельствует о том, что пациент находится на уровне "высокого риска" в отношении наличия цирроза с раком печени или без него и на уровне "повышенного риска" также на наличие гепатита С, и уровень hPG выше 400 пМ свидетельствует о том, что пациент находится на уровне "повышенного риска" на наличие рака печени, цирроза и гепатита С. При этом пациент подвергается дополнительному тестированию при использовании других диагностических средств для подтверждения того, что указанный пациент не имеет рака печени, если указанный пациент имеет уровень hPG ниже 100 пМ; а также дополнительному тестированию при использовании других диагностических средств на рак печени и/или гепатит С, если пациент имеет уровень hPG от 100 до 400 пМ.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЛЕ ЛАБОРАТУАР СЕРВЬЕ (FR) Перекрестная ссылка на родственные заявки Заявка на данное изобретение заявляет приоритет временной заявки под номером 61/293557, поданной 8 января 2010 г., полное содержание которой является введенным в данное описание в качестве ссылки в своей целостности. Ссылка на список последовательностей Список последовательностей предоставляется в данном описании. Предпосылки создания изобретения Изобретение обеспечивает способы и материалы для диагностики и скрининга печеночных патологий, включая пролиферативные и дегенеративные заболевания печени; в частности способы и материалы для количественной оценки или определения уровней прогастрина для диагностики печеночных патологий. Данные относительно гормонов гастрина и прогастрина. Гастрин представляет собой пептидный гормон желудочно-кишечного тракта, который функционирует как стимулятор секреции желудочного сока. У взрослых млекопитающих он вырабатывается преимущественно G клетками гастральной полости и в варьирующей степени в верхней части толстого кишечника и поджелудочной железе, с едва определяемыми количествами в толстой кишке. В последние годы повысился интерес к роли семейства пептидов гастрина в колоректальном канцерогенезе. В частности, существует подтверждение, что формы предшественников гастрина (прогастрин и удлиненный глицином гастрин), которые ранее предполагались как неактивные, играют роль в развитии колоректального рака. Ген гастрина транслируется в полипептид из 101 аминокислот, который называется препрогастрином и который содержит сигнальную последовательность (подчеркнута), которая отщепляется, образуя прогастрин, полипептид из 80 аминокислот. В свою очередь, прогастрин процессируется с образованием продукта расщепления G34, пептида из 34 аминокислот, соответствующих остаткам от 38 до 71 прогастрина. G34 потом удлиняется на своем карбокситерминальном конце с помощью остатков глицина, образуя удлиненный глицином G34 (G34-Gly). Побочный продукт расщепления прогастрина представляет собой пептид из 6 аминокислот, который называется С-терминальным фланкирующим пептидом, илиCTFP, который соответствует по полипептидной последовательности остаткам от 55 до 72 прогастрина и называется как G17-Gly. Удаление С-терминальных глицинов G34-Gly и G17-Gly, после чего осуществляется С-терминальное амидирование, обеспечивает образование G34 и G17 соответственно, которые оба являются С-терминально амидированными. Большинство анализов для прогастрина не различают прогастрин и другие продукты гастринового гена, что приводит к неточному измерению уровней полноразмерного прогастрина. Поскольку уровни прогастрина играют определенную роль в одном или более заболеваниях, точные значение для измерения прогастрина являются желательными. Данные относительно печеночных патологий. Многие печеночные патологии являются сложными для диагностики. Например, рак печени не может быть диагностирован с помощью обычных анализов крови. Обычно является необходимым физический скрининг при использовании опухолевого маркера альфа-фето белка (AFP). Однако повышенные уровни AFP не являются специфическими для рака печени. У взрослых высокие уровни AFP в крови(свыше 500 нг/мл) наблюдаются в трех случаях: рака печени, эмбрионально-клеточных опухолей (виды рака яичек и яичников) и метастатического рака печени (рака, имеющего происхождение от других органов). Кроме того, чувствительность AFP для печеночного рака составляет приблизительно 60%. Другими словами, повышенный уровень AFP в крови наблюдается только у приблизительно 60% пациентов с печеночным раком; 40% пациентов с печеночным раком имеют нормальные уровни AFP. Другая сложность для диагностики печеночной патологии представляет собой цирроз, следствие хронического заболевания печени, которое характеризуется рубцеванием печени и слабой функцией печени. Золотой стандарт диагностики представляет собой путь биопсии печени, что является инвазивной процедурой. Гепатит C представляет собой инфекционное заболевание, которое поражает печень и вызывается вирусом гепатита C (HCV). Инфекция часто является бессимптомной, но после установления заболевания хроническая инфекция может прогрессировать до рубцевания печени (фиброз) и прогрессирующего рубцевания (цирроз). Гепатит C типично диагностируется с помощью серологического скрининга. Другие способы определения и/или подтверждения гепатита C были бы желательными. Поскольку раннее и точное определение рака печени, цирроза и гепатита C имеет потенциал для повышения длительности выживания пациента, имеется насущная и давно существующая потребность в способах диагностики или определения этих патологий, включая случаи, когда пациент имеет более одного или все из упомянутых выше заболеваний. Краткое изложение сущности изобретения Было обнаружено, что, в то время как пациенты с одной или двумя патологиями печени могут демонстрировать повышенные уровни человеческого прогастрина (hPG), пациенты с раком печени, гепатитом С и циррозом демонстрируют чрезвычайно повышенные уровни hPG, которые являются более чем просто аддитивными по отношению к уровням hPG, которые демонстрируются пациентами только с одним или двумя такими состояниями. Основываясь на раскрытии настоящего изобретения, можно сказать,что уровни hPG в плазме или сыворотке пациента могут использоваться для оценки фактора риска для патологии печени. Более того, избыточные уровни hPG в плазме или сыворотке могут использоваться для диагностики пациента, страдающего от рака печени, гепатита C и цирроза. Виды печеночного рака, которые могут диагностироваться с помощью способов в соответствии с данной заявкой, включают первичные виды рака печени (например, гепатоклеточную карциному, рак,возникающий в печени) и вторичные виды печеночного рака. В данном документе описан способ диагностики, страдает ли пациент от множества печеночных заболеваний, где у указанного пациента было предварительно диагностировано первое заболевание печени, который предусматривает определения уровня человеческого прогастрина (hPG) в образце плазмы или сыворотки указанного пациента, при котором если пороговое значение прогастина составляет по меньшей мере 400 пМ, то указанный пациент страдает по меньшей мере от одного дополнительного заболевания печени. При этом пациент может страдать первым заболеванием печени, которое выбирается из группы, состоящей из рака печени, гепатита C и цирроза. Диагностируемые множественные печеночные заболевание печени выбираются из группы, состоящей из рака печени и цирроза, рака печени и гепатита С, рака печени, гепатита C и цирроза. В предпочтительном варианте осуществления предложенного способа этап определения уровняhPG осуществляют с помощью антитела, которое специфически связывает hPG. Причем значение порога прогастрина может составлять по меньшей мере 500 пМ. В одном из вариантов осуществления изобретения пациент принадлежит к популяции, имеющей более высокую, чем средняя, частоту встречаемости гепатита С, или указанный пациент проживает в географическом районе, который имеет более высокую, чем средняя, частоту встречаемости гепатита С,или указанный пациент имеет состояние зависимости от лекарственного средства или алкоголя. Кроме того, заявленный способ диагностики дополнительно может включать этапы идентификации пациента с концентрацией hPG в плазме или сыворотке по меньшей мере приблизительно 400 пМ; исследования указанного пациента по крайней мере на два из следующих заболеваний: рак печени, при использовании радиографии или методики создания изображения; вирус гепатита С, при использовании анализа на основе нуклеиновой кислоты; и цирроз печени, путем исследования образца крови от указанного пациента на один или более сывороточных маркеров фиброза; посредством чего диагностируют,страдает ли пациент от множества печеночных заболеваний. Еще одним объектом данного изобретения является способ определения риска пациента в отношении множества заболеваний печени, включающий определение с помощью биохимического анализа уровней hPG в сыворотке или плазме пациента; и оценку относительного риска пациента для одной или более печеночных патологий, где уровень hPG ниже 100 пМ свидетельствует о том, что пациент находится на уровне "низкого риска" для одной или более печеночных патологий; уровень hPG от 100 до 400 пМ свидетельствует о том, что пациент находится на уровне "высокого риска" в отношении наличия цирроза с раком печени или без него и на уровне "повышенного риска" также на наличие гепатита С; иhPG уровень выше 400 пМ свидетельствует о том, что пациент находится на уровне "повышенного риска" на наличие рака печени, цирроза и гепатита С. Причем пациент подвергается дополнительному тестированию при использовании других диагностических средств для подтверждения того, что указанный пациент не имеет рака печени, если указанный пациент имеет уровни hPG ниже 100 пМ; и дополнительному тестированию при использовании других диагностических средств на рак печени и/или гепатит С,если пациент имеет уровни hPG от 100 до 400 пМ. Такие способы могут также быть полезными в качестве стандартной диагностики в популяциях, которые имеют более высокое, чем среднее, значение частоты встречаемости печеночных заболеваний,например в популяции, которая потребляет лекарственные средства или алкоголь, или лиц, которые проживают в географических участках с более высоким, чем среднее, значением частоты встречаемости печеночных заболеваний. Количественная оценка уровней hPG может также использоваться с дополнительными биомаркерами, такими как альфа-фето белок ("AFP"), для идентификации, диагностики, дифференциации или оценки степени риска печеночных патологий. Способы, раскрытые в данном описании, могут использоваться для определения приемлемых терапевтических курсов воздействия. При осуществлении способов, раскрытых в данном описании, конкретный анализ для измерения уровней hPG не является критическим при условии, что измеренный уровень hPG является точным. Как уже отмечено, в некоторых воплощениях анти-hPG антитела традиционно используются для измерения уровней hPG. Как было отмечено,hPG расщепляется организмом на меньшие пептиды. Является предпочтительным, чтобы hPG определялся и измерялся в способах в соответствии с данным изобретением при использовании анализов,которые не определяют побочные продукты процессинга прогастрина, для того, чтобы избежать неточных измерений hPG. Этого можно достичь путем применения антител, которые связываются с полноразмерным hPG, но не с меньшими hPG пептидами. Этого также можно достичь путем применения двух различных антител, которые оба связываются с полноразмерным hPG, но в такой степени, как эти антитела связываются с меньшими hPG пептидами, но которые оба не связываются с одинаковыми меньшими hPG пептидами. В таких анализах только продукт, который является связанным с обоими антителами,представляет собой полноразмерный hPG. Например, антитела, которые связываются с С- иN-терминальными эпитопами hPG, позволяют осуществлять определение и измерение полноразмерногоhPG без определения и измерения меньших hPG пептидов. Таким образом, в некоторых аспектах изобретение обеспечивает способ диагностики пациента, где биологический образец приводят в контакт с первым антителом, которое связывается с первым эпитопом hPG, предпочтительно С- или N-терминальным эпитопом, и первым антителом, которое связывается с отличным эпитопом hPG, предпочтительно эпитопом на другом конце. В типичном способе, который использует анти-hPG антитело для определения и измерения hPG,пациента идентифицируют как такого, который страдает от гепатического или печеночного заболевания путем приведения в контакт образца, полученного от пациента, по крайней мере, с одним анти-hPG антителом; и определение. Способы в соответствии с данным изобретением в общем случае включают оценку биологического образца на уровни hPG. Биологический образец может представлять собой плазму или сыворотку. Могут также использоваться тканевые уровни прогастрина; однако уровни hPG, измеряемые в ткани, как ожидается, будут отличаться от уровней hPG, которые обнаруживаются в сыворотке или плазме, но будут повышенными по отношению к нормальному уровню hPG пациента тогда, когда пациент страдает от печеночных патологий. Таким образом, тканевые уровни hPG могут также использоваться для мониторинга риска или состояния печеночной патологии пациента. Тогда, когда используется образец ткани,прогастрин может определяться при использовании иммуноанализа, который осуществляется на клеточном или тканевом экстракте, или могут использоваться иммуногистохимические методики с применением поликлонального или моноклонального антитела, меченного с помощью способного к обнаружению маркера. Иммуногистохимические методики обеспечивают качественное измерение уровней прогастрина. Приемлемые способные к определению маркеры включают радиоактивную метку (такую как радиоактивный йод), флуоресцентную метку или хемилюминесцентную метку. Краткое описание фигур Фиг. 1 обеспечивает аминокислотные последовательности препрогастрина (где сигнальный пептид является подчеркнутым), прогастрина и продуктов процессинга прогастрина, включая G34, G34-Gly, G17,G17-Gly и С-терминальный фланкирующий пептид, CTFP. Фиг. 2 обеспечивает столбчатую диаграмму значений hPG, показательных для определенных печеночных патологий. Фиг. 3A-3L обеспечивают полипептид и соответствующий полинуклеотид, последовательности VH и VL цепей для типичного мышиных анти-hPG моноклональных антител. Фиг. 3 А показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:16) и полипептидные (SEQ ID NO:12) мышиные VH цепи для анти-hPG MAb3. Фиг. 3 В показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:17) и полипептидные (SEQ ID NO:13) мышиные VL цепи для анти-hPG MAb3. Фиг. 3 С показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:18) и полипептидные (SEQ ID NO:14) мышиные VH цепи для анти-hPG MAb4. Фиг. 3D показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:19) и полипептидные (SEQ ID NO:15) мышиные VL цепи для анти-hPG MAb4. Фиг. 3 Е показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:67) и полипептидные (SEQ ID NO:59) мышиные VH цепи для анти-hPG MAb8. Фиг. 3F показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:71) и полипептидные (SEQ ID NO:63) мышиные VL цепи для анти-hPG MAb8. Фиг. 3G показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:68) и полипептидные (SEQ ID NO:60) мышиные VH цепи для анти-hPG MAb13. Фиг. 3 Н показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:72) и полипептидные (SEQ ID NO:74) мышиные VL цепи для анти-hPG MAb13. Фиг. 3I показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:69) и полипептидные (SEQ ID NO:61) мышиные ные VH цепи для анти-hPG MAb19. Фиг. 3L показывает полинуклеотидные (SEQ ID NO:74) и полипептидные (SEQ ID NO:66) мышиные VL цепи для анти-hPG MAb19. Фиг. 4A-4Z обеспечивают полинуклеотидные последовательности VH и VL цепей для типичных человеческих анти-hPG моноклональных антител. Фиг. 4 А показывает полипептидные (SEQ ID NO:21) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb3. Фиг. 4 В показывает полипептидные (SEQ ID NO:22) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb3. Фиг. 4 С показывает полипептидные (SEQ ID NO:23) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb4. Фиг. 4D показывает полипептидные (SEQ ID NO:24) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb4. Фиг. 4 Е показывает полипептидные (SEQ ID NO:75) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb8(а). Фиг. 4F показывает полипептидные (SEQ ID NO:76) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb8(а). Фиг. 4G показывает полипептидные (SEQ ID NO:77) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb8(b). Фиг. 4 Н показывает полипептидные (SEQ ID NO:78) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb8(b). Фиг. 4I показывает полипептидные (SEQ ID NO:79) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb8(с). Фиг. 4J показывает полипептидные (SEQ ID NO:76) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb8(с). Фиг. 4K показывает полипептидные (SEQ ID NO:80) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb13(а). Фиг. 4L показывает полипептидные (SEQ ID NO:81) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb13(а). Фиг.4 М показывает полипептидные (SEQ ID NO:82) человеческие VH цепи для анти-hPGMAb19(b). Фиг. 4 Х показывает полипептидные (SEQ ID NO:93) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb19(b). Фиг. 4Y показывает полипептидные (SEQ ID NO:94) человеческие VH цепи для анти-hPG MAb19(с). Фиг. 4Z показывает полипептидные (SEQ ID NO:95) человеческие VL цепи для анти-hPG MAb19(c). Подробное описание Определения. Если не указано иное, то следующие термины являются предназначенными для того, чтобы иметь свои обычные значения, которые обсуждаются ниже в контексте настоящего описания."Человеческий прогастрин" или "hPG" представляет собой полипептид с аминокислотной последовательностью, идентифицированной как SEQ ID NO:20. Как используется в данном описании, hPG определяется как включающий первичный белковый продукт гена гастрина; т.е. препрогастрин без сигнального пептида или препептида. См. Rehfeld et al. (2004), Regulatory Peptides, 120 (1-3): 177-183. hPG состоит из трех хорошо определенных участков, разделенных двумя d-Arg сайтами расщепления. В соответствии с этим, если не указано иное, то hPG состоит из продуктов процессинга препрогастрина, которые сохраняют два d-Arg сайта. hPG не включает "гастринов", т.е. G34 и G17, но может включать, например,укороченные варианты (вплоть до 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) или варианты hPG, которые сохраняют два d-Arg сайта, которые расположены при или приблизительно в аминокислотах 36/37 и 73/74, см. фиг. 1."Биологический маркер" или "биомаркер" означает характеристику, которая объективно измеряется и оценивается как показатель нормальных биологических процессов, болезненных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство."Сэндвич-анализ" относится к специфическому типу иммуноанализа, который может использоваться для количественной оценки соединения, которое взаимодействует с образцом. Сэндвич-анализ называется таким образом по причине того, что антиген образца связывается между иммобилизованным антителом и идентифицирующим или эталонным антителом. В сэндвич-анализах в соответствии с данным изобретением человеческий прогастрин связывается между анти-hPG антителами. Этот анализ обеспечивает количественную оценку hPG, но не предшественников или его продуктов, обеспечивая, таким образом, более точное измерение концентрации hPG. Преимущественно антитела в соответствии с данным изобретением, направленные против N- или С-терминальных участков прогастрина, являются также специфическими для прогастрина отдельно. Меньшие фрагменты процессинга прогастрина, таким образом,с меньшей вероятностью действуют как конкурентные агенты к одному или другому антителу, искажая,таким образом, результаты анализа. Термины "субъект" или "пациент" в данном описании используются попеременно и относятся к позвоночному животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно к человеку."Антитело" или "Ab" относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с или является иммунологически реактивной с определенным антигеном и включает поликлональные, моноклональные, генетически сконструированные и иным образом модифицированные антитела, включая,но без ограничения таковыми, химерные антитела, гуманизированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, включая, например, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG и scFv фрагменты. В различных воплощениях анти-hPG моноклональные антитела включают весь или часть константного участка антитела. В некоторых воплощениях константный участок представляет собой изотип, выбранный из IgA (например, IgA1 или IgA2), IgD, IgE, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) и IgM. Антитела (включая моноклональные антитела) могут быть получены от любого из видов животных, включая, но без ограничения таковыми, мышь, кролика, крысу, свинью, морскую свинку, курей, ослов, лошадей, верблюда и ламу. Как используется в данном описании, антитело является "высокоспецифическим для hPG", если оно связывается с полноразмерным прогастрином, но не связывается вообще с CTFP, с амидированным гастрином или удлиненным глицином гастрином, а фраза "специфическое для hPG" или "антитело, которое специфически связывается с hPG", если оно демонстрирует по крайней мере приблизительно в 5 раз большее связывание с hPG, чем с CTFP и другими продуктами гена гастрина, как измеряется с помощью стандартных анализов связывания. Анализ ELISA, который может использоваться для оценки специфичности определенного анти-hPG антитела, обеспечивается в примере 4. Такие специфические анти-hPG антитела (в данном описании называются как "анти-hPG антитела") могут быть поликлональными ("анти-hPG PAbs") или моноклональными ("анти-hPG MAbs"), несмотря на то, что для терапевтических применений и в некоторых случаях для диагностических или других invitro применений моноклональные антитела являются предпочтительными. Термин "моноклональное антитело", как используется в данном описании, не является ограниченным антителами, которые получают с помощью гибридомной технологии. Моноклональное антитело имеет происхождение от одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, при использовании любых способов, доступных или известных в области техники. Моноклональные антитела, полезные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены при использовании широкого разнообразия методик, известных в области техники, включая применение гибридомной, рекомбинантной методики и способа фагового дисплея или их комбинации. Во многих применениях в соответствии с настоящим изобретением, включая in vivo применение анти-hPG моноклональных антител у людей и in vitro анализы определения, химерные, приматизированные, гуманизированные или человеческие антитела могут использоваться приемлемым образом. Термин "scFv" относится к одноцепочечному Fv антителу, в котором вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи из традиционного антитела был объединен с образованием одной цепи. Ссылка на "VH" относится к вариабельному участку иммуноглобулиновой тяжелой цепи антитела,включая тяжелые цепи Fv, scFv или Fab. Ссылка на "VL" относится к вариабельному участку иммуноглобулиновой легкой цепи, включая легкие цепи Fv, scFv, dsFv или Fab. Антитела (Abs) и иммуноглобулины(Igs) представляют собой гликопротеины, которые обладают одинаковыми структурными характеристиками. В то время как антитела демонстрируют связывающую специфичность по отношению к специфической мишени, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие подобные антителу молекулы,которые не имеют целевой специфичности. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с весом приблизительно 150000 Да, которые состоят из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на одном своем конце вариабельный домен (VH), после которого следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном своем конце (VL) и константный домен на своем другом конце. Анти-hPG моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением включают "участки,определяющие комплементарность (CDRs)." CDR также являются известными как гипервариабельные участки в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасом (FR). Как является известным в области техники, аминокислотное положение/очерчивание границ гипервариабельного участка антитела будет варьировать в зависимости от контекста и различных определений в области техники. Некоторые положения в рамках вариабельного домена могут рассматриваться как гибрид гипервариабельных положений в том, что эти положения могут подразумеваться как такие, которые находятся в рамках гипервариабельного участка в соответствии с одним набором критериев, в то время как подразумеваются как такие, которые находятся за пределами гипервариабельного участка в соответствии с другим набором критериев. Одно или более из этих положений может также обнаруживаться в удлиненных гипервариабельных участках. Изобретение обеспечивает антитела, включающие модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Вариабельный домен нативных тяжелой и легкой цепей, каждый, включает четыре FR участка, главным образом путем приобретения -складчатой конфигурации, связанной тремя CDR, которые образуют петлю, соединяющую, а, в некоторых случаях, формирующую, часть -складчатой структуры. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с CDR из других цепей с помощью FR участков,которые осуществляют свой вклад в образование сайта целевого связывания антитела (см. Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Термин "эпитоп" относится к любой части (детерминанте) белка, которая является способной вызывать иммунный ответ и, в частности, связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или GAG боковые цепи и обычно имеют специфические пространственные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Говорят, что два антитела связываются существенно с тем же эпитопом белка (или перекрывающимися эпитопами белка), если аминокислоты в белке, которые снижают или устраняют связывание одного антитела, также снижают или устраняют связывание другого антитела, и/или если антитела конкурируют за связывание с белком, т.е. связывание одного антитела с белком снижает или устраняет связывание другого антитела. Определение, будут ли два антитела связывать существенно тот же эпитоп, осуществляется с помощью способов, известных в области техники, таких как конкурентный анализ. При осуществлении изучения конкуренции между контрольным антителом (например, одним из антипрогастриновых антител, описанных в данном документе) и любым исследуемым антителом, можно сначала метить контрольное антитело с помощью определяемой метки, такой как биотин, ферментная, радиоактивная метка или флуоресцентная метка, для того, чтобы позволить осуществить последующую идентификацию. Исследуемое (немеченное) антитело, которое существенно связывается с тем же эпитопом, что и контрольное (меченое) антитело, будет способным блокировать связывание контрольного антитела и,таким образом, будет снижать связывание контрольного антитела. Выражение "анализ, специфический для hPG" или "анализ, специфический для человеческого прогастрина" относится к анализу, который отличает полноразмерный hPG от CTFP и других продуктов гастринового гена. В контексте диагностического анализа на основе антитела анализ, специфический дляhPG, может использовать антитело, которое специфически связывается с hPG. Альтернативно, анализ,специфический для hPG, может использовать два антитела, которые оба связываются с полноразмернымhPG, но иным образом оба не связываются с теми же продуктами гастринового гена, так, что hPG является единственной молекулой, которая производится геном гастрина и которая узнается обоими антителами. Например, антитела, которые связываются с С- и N-терминальными эпитопами hPG, могут использоваться в анализе, который отличает hPG от других пептидов гастринового гена. В отношении применения термина "рак" следует отметить, что у пациентов, у которых клетки из первичной (исходной) опухоли освободились и мигрировали в другие расположения в пределах организма, типично, посредством лимфы или крови, с помощью процесса, который называется "метастазы" с образованием другой, метастатической (или вторичной) опухоли, вторичная или метастатическая опухоль типично является того же типа, что и исходная опухоль, несмотря на ее новое расположение, так что заболевание называется метастатическим раком, а не раком новой резидентной ткани. Например, рак поджелудочной железы, который распространился на печень, представляет собой метастатический рак поджелудочной железы, но не рак печени. В соответствии с этим метастатическая гепатоклеточная карцинома относится к раку, который возник в печени и куда-либо метастазировал. Вторичный рак печени(т.е. метастатический рак, который имеет происхождение от источника, отличного от печени, который метастазировал до печени) может также диагностироваться на основе избыточных уровней hPG. Например, колоректальный рак, который метастазировал (т.е. метастатический колоректальный рак) до печени,представляет собой форму вторичного рака печени. Другими словами, рак печени определяется при использовании уровней hPG в сыворотке, плазме или ткани как при первичном, так и вторичном раке печени. Уровни прогастрина и печеночные патологии. Нормальные уровни прогастрина в общем случае считаются такими на уровне 20-50 пМ, типично 0-5 пМ. Настоящее изобретение демонстрирует тот факт, что пациенты с одной или двумя печеночными патологиями могут демонстрировать повышенные уровни человеческого прогастрина (hPG) и что пациенты с раком печени, гепатитом С и циррозом демонстрируют чрезвычайно повышенные уровни hPG. Фиг. 2 графически иллюстрирует уровни hPG у пациентов с одной или более печеночных патологий, как определяется с помощью ELISA-сэндвич-анализа при использовании анти-hPG антител. Внешние границы площадей диаграмм показывают от 25 до 75 процентилей. "Усы" диаграмм составляют от 5 до 95 процентилей. Одинарные линии представляют среднее значение. Точки показывают обособленные части. Приведенная табл. 1 подытоживает данные 5-95 процентилей. На основе указанного выше уровни hPG, превышающие 50 или 100 пМ, могут быть показательными для одной или более патологий печени. Уровни hPG, которые составляют по крайней мере приблизительно 400, 500 или 600 пМ, являются особенно диагностически значимыми, поскольку они являются весьма показательными для множественных патологий печени, в частности показательными для присутствия рака печени и цирроза, рака печени и гепатита С и рака печени, цирроза и гепатита С. Уровни в плазме крови у пациентов только с гепатитом С были обнаружены подобными таковым для здоровых пациентов в исследовании, которое измеряет общие уровни прогастрина (т.е. уровни полноразмерного прогастрина и продуктов расщепления). Konturek et al., 2003, Scand J Gastroenterol 6: 643647. Уровни полноразмерного прогастрина у пациентов только с гепатитом С, как ожидается, будут очень низкими. Уровни прогастрина могут использоваться для точечной оценки риска и вероятности соответствующего риска заболевания. Например, модель для соотнесения риска смертности у пациентов с конечной стадией заболевания печени, см. Kamath et al. (2001), Hepatology, 33(2): 464-70. При использовании эмпирических данных корреляции определенных уровней прогастрина с состоянием заболевания печени, точечное значение и ассоциированная вероятность риска заболевание могут быть получены из уровней биомаркеров, таких как прогастрин, и, необязательно, других биомаркеров. Вероятность риска заболевания может быть качественно описана при использовании четырех групп риска: низкого риска, повышенного риска, высокого риска и тяжелого риска. Уровни риска, на которые ссылаются в настоящем изобретении, имеют следующие значения."Низкий риск" означает, что уровни биологического(их) маркера(ов) пациента не указывают на присутствие данной печеночной патологии."Повышенный риск" означает, что уровни биологического(их) маркера(ов) пациента указывают на повышенный риск данной печеночной патологии. Этот риск имеет такую величину, что дополнительное исследование является необходимым."Высокий риск" означает, что уровни биологического(их) маркера(ов) пациента указывают на значительно повышенный риск данной печеночной патологии. Этот риск имеет такую величину, что дополнительное исследование является необходимым. Ориентировочный диагноз на основе специфичности биологических маркеров может быть перепроверен."Тяжелый риск" означает, что уровни биологического(их) маркера(ов) пациента являются очевидным образом патологическими и указывают на четкую патологию. Может быть поставлен диагноз на основе специфичности биологического(их) маркера(ов). Пациенты, уровни прогастрина которых в плазме или сыворотке являются ниже 0-100 пМ, имеют низкий риск двух видов заболеваний печени, например гепатоклеточной карциномы и цирроза, и чрезвычайно низкий риск для диагностики всех трех заболеваний печени - рака, цирроза и гепатита С. Пациенты с нормальными уровнями прогастрина в плазме или сыворотке (например, 0-5 пМ) или слегка повышенными уровнями (вплоть до 100 пМ) могут тем не менее иметь рак печени. В соответствии с этим является желательным дополнительное исследование пациента с уровнями hPG в плазме или сыворотке 100 пМ или ниже для оценки, имеет ли она или он рак печени. Пациенты, уровни прогастрина которых в плазме или сыворотке находятся в интервале от 100 до 400 пМ, с малой вероятностью имеют рак печени без других печеночных патологий. Такие пациенты имеют высокий риск наличия цирроза (с раком печени или без него) и повышенный риск дополнительного наличия гепатита С. Пациенты, которые имеют уровни прогастрина в плазме и сыворотке крови выше 400 пМ, являются таковыми с тяжелым риском наличия рака печени, гепатита C и цирроза. Отношения между уровнями hPG у пациента и состоянием патологии печени могут использоваться в разнообразных диагностических способах. Диагностические способы в общем случае предусматривают сравнение уровней hPG в образце пациента с нормальным значением hPG, например уровнями hPG от здоровых индивидуумов или пула здоровых индивидуумов. Если уровни hPG являются повышенными,то повышенный уровень коррелирует с вероятной патологией печени, например, на основе оценки риска,обеспечиваемой так, как описано выше. Такие способы необязательно включают этап, при котором обеспечивается образец жидкости организма от пациента. Жидкость организма потом может подвергаться анализу на уровни hPG, предпочтительно с помощью биохимического анализа. В некоторых применениях анализ уровня маркера рака пациента в сочетании с уровнем hPG пациента может использоваться для повышения специфичности маркера печеночного рака у пациента или для определения показателя точки риска и вероятности риска соответствующего заболевания. Предпочти-7 029653 тельный маркер представляет собой альфа-фетопротеин (AFP). Сывороточный AFP, специфический для плода гликопротеиновый антиген, представляет собой наиболее широко используемый опухолевый маркер для определения пациентов с раком печени, например гепатоклеточной карциномой. Описанная чувствительность AFP для определения гепатоклеточной карциномы широко варьирует как с популяцией,положительной по вирусу гепатита В (HBV), так и с популяцией, отрицательной по HBV, что приписывается перекрыванию моделей скрининга и диагностического изучения. Когда AFP используется для скрининга популяций высокого риска, были продемонстрированы чувствительность от 39 до 97%, специфичность от 76 до 95% и значение позитивного предсказания (PPV) от 9 до 32%. AFP не является специфическим для рака печени. Титры также повышаются при остром или хроническом гепатите, при беременности и в присутствии эмбрионально-клеточных опухолей. Приведенная табл. 2 показывает относительный риск для данной патологии печени на основе уровней hPG в сочетании с уровнями AFP. Оценка относительного риска на основе уровней как hPG, так иAFP, обеспечивает более чувствительный и точный анализ на печеночные патологии, чем только на основе AFP. Таблица 2 Другие вторичные маркеры, которые могут использоваться в сочетании с прогастрином, включают онкофетальные антигены, гликопротеиновые антигены, ферменты и изоферменты, генные маркеры и цитокины, которые коррелируют с раком печени. Дополнительные приемлемые вторичные маркеры включают глипикан-3, гамма-глутамил трансферазу II, альфа-1-фукозидазу, трансформирующий фактор роста бета 1, специфический для опухоли фактор роста, мРНК гамма-глутамил трансферазы, фактор роста сосудистого эпителия, интерлейкин-8 и его варианты. Типичные маркеры являются описанными уZhou et al. (2006), World Journal of Gastroenterology, 12(8): 1175-1181. Печеночные патологии могут быть подтверждены с помощью стандартных методик, известных в области техники. Например, рак печени, такой как гепатоклеточная карцинома, может быть подтвержден с помощью лучевой терапии или методики получения изображений, такой как ЯМР-томография, с биопсией или без биопсии и с количественной оценкой маркера крови, такого как AFP или без нее. ГепатитC может быть подтвержден с помощью количественной оценки вирусных частиц в крови, путем анализа уровней фиброза при использовании ультразвука, при использовании анализа на основе нуклеиновой кислоты и/или с помощью фиброскана. Цирроз может быть подтвержден с помощью диагностики при использовании ультразвука с биопсией или без нее и/или путем определения сывороточных маркеров фиброза. Могут также использоваться другие методики. Способы измерения уровней прогастрина. Способы в соответствии с настоящим изобретением диагностируют одну или более печеночных патологий и/или оценивают риск печеночной патологии на основе уровней hPG пациента. Уровни прогастрина в плазме и сыворотке могут измеряться при использовании любой известной аналитической методики. Такие методики включают, но без ограничения, ELISA, сэндвич ELISA, иммуноблоттинг (Вестернблоттинг), иммунопреципитацию, BIAcore методику и т.п., а также анализы, основанные на свойствах белка, включая, но без ограничения таковыми, ферментативную активность или взаимодействие с другими белковыми партнерами. Для иммуноанализов, предпочтительного класса анализов, могут использоваться один или более антипрогастриновых (анти-PG) антител в соответствии с данным изобретением(либо поликлональные, либо моноклональные, и нейтрализующие или ненейтрализующие). Предпочтительные иммуноанализы специфически определяют прогастрин в отличие от других продуктов гастринового гена, включая продукты деградации. Сэндвич-анализы обеспечивают такую специфичность для определения прогастрина в отличие от других побочных продуктов гастринового гена, обеспечивая, таким образом, более точное измерение сывороточных уровней прогастрина. В предпочтительном иммуноанализе антитела связывают антиген/эпитоп, включающий терминальный участок,уникальный для прогастрина. Например, в некоторых воплощениях прогастрин определяют при использовании сэндвич ELISA с одним анти-PG антителом, нацеленным на N-терминальный конец прогастрина, и вторым анти-PG антителом, нацеленным на С-терминальный конец прогастрина. Типичные антитела раскрываются ниже в разделе 6.4, и в общем виде методика "сэндвич" для измерения уровней прогастрина при использовании анти-PG антител раскрывается далее. Готовят поверхность, такую как ячейки в планшете на 96 ячеек, с которой связывают известное количество первого, "иммобилизованного" антитела к прогастрину. Идентифицирующее антитело может представлять собой, например, анти-PG антитело, которое связывает С- или N-терминальный конец прогастрина. После блокирования исследуемый образец применяют к поверхности, после чего осуществляют период инкубации. Поверхность потом промывают для удаления несвязанного антигена, и применяют раствор, содержащий второе "идентифицирующее" антитело к прогастрину. Идентифицирующее антитело может представлять собой любые анти-PG моноклональные антитела, описанные в данном документе, обеспечиваемое идентифицирующее антитело связывает отличный от иммобилизованного антитела эпитоп. Например, если иммобилизованное антитело связывает С-терминальный участок пептида прогастрина, то приемлемое идентифицирующее антитело будет представлять собой такое, которое связывает N-терминальный участок пептида прогастрина. Уровни прогастрина могут потом определяться либо непосредственно (если, например, идентифицирующее антитело является конъюгированным со способной к определению меткой), либо опосредованно(с помощью меченого вторичного антитела, которое связывает идентифицирующее анти-PG антитело). В специфическом воплощении уровни человеческого прогастрина (hPG) измеряют в биологическом образце для исследования, как описывается в примере 1. Кривые графика зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений(ROC) получали на основе уровней hPG в плазме крови, как определяется с помощью сэндвич-анализа, и демонстрировали, что измерение уровней hPG обеспечивает диагностически полезный анализ для различения между пациентами с одной из печеночных патологий и пациентами, имеющими другие виды рака,и/или здоровыми индивидуумами. Типичные антитела для способов на основе антител для измерения уровней hPG являются раскрытыми в следующем разделе. Анти-hPG антитела. Иммуноанализ для измерения уровней hPG может использовать одно или более поликлональных или моноклональных анти-hPG антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Различные процедуры, известные в области техники, могут использоваться для получения поликлональных антител к hPG. В частном воплощении могут быть получены кроличьи поликлональные антитела. Для получения антител различные хозяйские животные могут быть иммунизированы путем инъекции hPG, включая, но без ограничения, кроликов, мышей, крыс. Различные адъюванты могут использоваться для повышения иммунологического ответа, в зависимости от хозяйских видов, и включая, но без ограничения таковыми, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плюроника, полианионы, пептиды, минеральные масла, гемоцианины лимфы улитки и динитрофенол. Моноклональные антитела предпочтительно используются в способах в соответствии с данным изобретением. Моноклональные антитела, которые являются гомогенной популяцией антитела к определенному антигену, могут быть получены с помощью любой методики, которая обеспечивает получение молекул антитела с помощью стабильных клеточных линий в культуре. Такие включают, но без ограничения, гибридомную методику Kohler и Milstein, методику на основе человеческой В-клеточной гибридомы и методику на основе EBV-гибридомы. См., например, Kohler и Milstein (1975), Nature, 256: 495497; Kozbor et al. (1983), Immunology Today, 4: 72; Cole et al. (1985), p. 77-96 у Reisfeld и Sell (1985),Monoclonal Antibodies and Myeloma Therapy Liss; Coligan (1991), Current Protocols in ImmunologyAntibodies: Principles and Practice (2-е изд.) Academic Press. Такие антитела могут представлять собой любой класс иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс. Недавно было обнаружено, что, по крайней мере, для моноклональных анти-hPG антител выбор антигена, используемого для получения анти-hPG антитела, может быть важным (см. международную заявку РСТ/ЕР 2010/006329, поданную 15 октября 2010 г., и патентную заявку США 12/906,041, поданную 15 октября 2010 г., раскрытия и специфически раскрытые в них анти-hPG антитела, которые являются введенными в данное описание в качестве ссылки, далее называются как заявки '329 и '041 соответственно). Как раскрывается в заявках '329 и '041, не все антигены, которые имеют происхождение от hPG,стимулируют продукцию моноклональных антител, которые специфически связывают hPG при физиологических условиях. Действительно, некоторые антигены, которые использовались для успешного получения поликлональных анти-hPG антител, таких как полноразмерный рекомбинантный hPG (см., например, WO 08/076454, которая относится к Singh) и пептид, соответствующий последним десяти аминокислотам на С-терминальном конце hPG (см. WO 07/135542, которая относится к Hollande et al.), были неудачными для получения моноклональных антител. В одном предпочтительном воплощении антитела, специфические для С- и N-терминальных эпитопов hPG, могут использоваться для определения и измерения уровней hPG со специфичностью, означая,что определяется только полноразмерный hPG. Как отмечено в заявках '329 и '041, антигенныеN- и С-терминальные последовательности в пределах последовательности hPG были идентифицированы как такие, которые могут использоваться для получения моноклональных антител, которые специфиче-9 029653 ски связывают hPG. Интересно отметить, что антигенная последовательность не требует ограничения участками последовательности hPG, которые являются уникальными для нее. Пептидные антигены,имеющие участок последовательности совместно с другими продуктами гена гастрина, например G17, G34 и CTFP, обеспечивают моноклональные антитела, которые не только связывают hPG, а также связывают его специфически. Анти-hPG антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую N-терминальному участку hPG, и/или такие, которые связываютN-терминальный участок hPG, обозначаются в данном описании как "N-терминальные анти-PG антитела." Специфический типичный антигенный участок hPG, который может использоваться для конструирования иммуногена, приемлемого для получения как поликлональных, так и моноклональных антител,специфических для hPG, соответствует остаткам от 1 до 14 hPG: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:25). Типичные иммуногены, полезные для получения N-терминальных анти-hPG антител, а также последовательностей CDR VH и VL N-терминальных анти-hPG моноклональных антител, которые получают с помощью таких типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 3 А и в разделе "Примеры". Таблица 3A В табл. 3 А все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной NС ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид был синтезирован с помошью С-терминального линкера остатка аминогексаноевой кислоты (Ahx), после которого следует остаток Cys), который может потом быть конъюгирован либо с бычьим сывороточным альбумином ("BSA"),либо с носителем на основе гемоцианина лимфы улитки ("KLH") с помощью линкерного остатка Cys. Анти-hPG антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую С-терминальному участку hPG, и/или такие, которые связывают С-терминальный участок hPG, обозначаются в данном описании как "С-терминальные анти-PG антитела". Специфический типичный антигенный участок hPG, который может использоваться для конструирования иммуногена, приемлемого для получения как поликлональных, так и моноклональных антител, специфических для hPG, соответствует остаткам от 55 до 80 hPG:QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID NO:27). Типичные иммуногены, полезные для получения С-терминальных анти-hPG антител, а также последовательностей CDR и VH и VL С-терминальных анти-hPG моноклональных антител, которые получают с помощью таких типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 3 В и в разделе "Примеры". В табл. 3 В все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной NС ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид был синтезирован с помощьюN-терминального линкера Ahx-Ahx-Cys, который может потом конъюгировали либо с носителем на основе гемоцианина лимфы улитки ("KLH"), либо с дифтерийным токсином ("DT") с помощью линкерного остатка Cys. Специфические эпитопы, связываемые типичными анти-hPG моноклональными антителами MAb1MAb23, которые обеспечиваются в табл. 4 А и 4 В, были картированы при использовании методики SPOT и аланинового сканирования, как описывается у Laune et al. (2002), J. Immunol. Methods 267: 53-70 иLaune (1997) J. Biol. Chem. 272: 30937-30944, соответственно (см. также пример 6 заявки '329). В методике SPOT пептидные последовательности из 15 аминокислот, охватывающие путативные эпитоп, получали и наносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую потом подвергали зондированию при использовании исследуемого антитела для определения минимальной последовательности эпитопа, которая узнается антителом. Аланиновое сканирование используют для определения остатков в пределах эпитопов, которые являются критическими для связывания антитела. Каждый остаток в пределах путативного эпитопа подвергали мутации, один за другим, до аланина, и содержащие аланин пептиды потом подвергали зондированию при использовании исследуемого антитела. Для N-терминальных анти-hPG моноклональных антител MAbs 1-4 и 15-20 эпитопы включают, по крайней мере, следующие последовательности: DAPLG (SEQ ID NO:28), PDAPLG (SEQ ID NO:29),PRSQQPD (SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD (SEQ ID NO:31) или WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID NO:32), как показано в табл. 4 А. Таблица 4A Эксперименты по картированию эпитопов выявили, что анти-hPG MAb2 и MAb4 связывают тот же эпитоп; анти-hPG MAb1 и MAb3 связывают приблизительно тот же эпитоп; MAb17, MAb18, MAb19 иMAb20 связывают приблизительно тот же эпитоп; MAb15 и MAb16 связывают приблизительно тот же эпитоп; анти-hPG MAb5, MAb6, MAb7, MAb9 и MAb12 связывают тот же эпитоп и связывают приблизительно тот же эпитоп, что и анти-hPG MAb10; и анти-hPG MAb11 и MAb14 связывают приблизительно тот же эпитоп. Специфические воплощения N-терминальных анти-PG антител, полезных в способах и наборах,описанных в данном документе, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки от 10 до 14 hPG (SEQ ID NO:28), остатки от 9 до 14 hPG (SEQ ID NO:29), остатки от 4 до 10 hPG(SEQ ID NO:30), остатки от 2 до 10 hPG (SEQ ID NO:31) или остатки от 2 до 14 hPG (SEQ ID NO:32). Специфические воплощения N-терминальных анти-PG антител, полезных в способах и наборах,описанных в данном документе, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки от 71 до 74 hPG (SEQ ID NO:33), остатки от 69 до 73 hPG (SEQ ID NO:34), остатки от 76 до 80 hPG(SEQ ID NO:35) или остатки от 67 до 74 hPG (SEQ ID NO:36).N-терминальные и С-терминальные анти-hPG антитела, полезные в способах и наборах, раскрытых в данном описании, в дополнение к тем, которые обеспечиваются в табл. 4 А и 4 В, могут быть идентифицированы в конкурентных анализах связывания с типичными MAbs 1-23 или с другими эталонными антителами, которые связывают N- или С-терминальные эпитопы, как будет описываться более подробно в следующем разделе. Некоторые из гибридом, полезных для получения антител, были депонированы 6 октября 2010 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) в соответствии с Будапештским Договором. Обозначения этих гибридом, которые продуцируют анти-hPG MAbs 1-23, и номера, присвоенные депозитарием этим депонированным гибридомам, обеспечиваются в табл. 4 А и 4 В. Кроме того, для некоторых антител были определены аминокислотные последовательности их вариабельных тяжелых цепей (VH), вариабельных легких цепей (VL), участки, определяющие комплементарность (CDRs) VL иCDRs VH. Эти аминокислотные последовательности и их условное обозначение, используемое для ссылки на них в данном раскрытии, также обеспечиваются в табл. 4 А и 4 В. Кратко, мышиные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данном описании как mVH и mVL, после чего следует номер соответствующего моноклонального антитела, например mVH.3 и mVL.3 для вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепей анти-hPG MAb3, соответственно. Подобно этому, человеческие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данном описании как hVH и hVL, после чего следует номер соответствующего моноклонального антитела. Три CDR вариабельной тяжелой цепи и три CDR вариабельной легкой цепи обозначаются как VH CDR 1, 2 или 3, и VL CDR 1, 2 или 3 соответственно, после чего следует номер специфического анти-hPG моноклонального антитела. Например, VHMAb3 обозначается как VH CDR 2.3, a VL CDR 2 MAb3 обозначается как VL CDR 2.3. Ожидается, что соответствующие CDR и/или VH и VL цепи анти-hPG моноклональных антител, которые связывают приблизительно те же эпитопы, могут быть взаимозаменяемыми и обеспечивают получение нового анти-hPG моноклонального антитела, полезного в способах и наборах, описанных в данном документе. Например, как указано выше, типичные анти-hPG моноклональные антитела MAb5 и MAb6 связывают тот же эпитоп. Анти-hPG моноклональные антитела могут быть сконструированы так, что включают в своих VL цепях различные комбинации VL CDRs этих двух антител и/или в своих VH цепях включают различные комбинации VH CDRs этих двух антител. В качестве специфического нелимитирующего примера для иллюстрации различных возможных комбинаций такое антитело может включать в своих VL цепях CDRs 1 и 2 MAb5 (VL CDR 1.5 и VL CDR 2.5 соответственно) и CDR 3 MAb6 (VL CDR 3.6), а в своих VH цепях CDR 1 MAb6 (VH CDR 1.6) и CDRs 2 и 3 MAb5 (VH CDR 2.5 и VH CDR 3.5 соответственно). Аминокислотные последовательности CDRs антител, которые вырабатываются гибридомами и которые были депонированы, могут быть получены при использовании традиционных средств. См.,например, Coligan (1996), Current Protocols in Immunology, vol. 3, New York: John WileySons.Co ссылкой на табл. 3 А специфические воплощения N-терминальных анти-hPG антител, полезных в способах и наборах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения таковыми, следующие:(a) антитела, имеющие VL CDRs, которые соответствуют по последовательности VL CDRs MAb1,MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 или MAb20, и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VH CDRs MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18,MAb19 или MAb20;(b) антитела, имеющие VL CDRs и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VL и(i) VL CDR 1 является выбранным из QSIVHSNGNTY ("VL CDR 1.3"; SEQ ID NO:4),QSLVHSSGVTY ("VL CDR 1.4"; SEQ ID NO:10), QSLLDSDGKTY ("VL CDR 1.16"; SEQ ID NO:50) и(ii) VL CDR2 является выбранным из KVS ("VL CDR 2.3" и ("VL CDR 2.4"; SEQ ID NO:5), LVS(iii) VL CDR3 является выбранным из FQGSHVPFT ("VL CDR 3.3"; SEQ ID NO:6), SQSTHVPPT(iv) VH CDR1 является выбранным из GYIFTSYW ("VH CDR 1.3"; SEQ ID NO:1), GYTFSSSW(v) VH CDR2 является выбранным из FYPGNSDS ("VH CDR 2.3"; SEQ ID NO:2), FLPGSGST(vi) VH CDR3 является выбранным из TRRDSPQY ("VH CDR 3.3"; SEQ ID NO:3), ATDGNYDWFAY(d) антитела, имеющие VL, который соответствует по последовательности VL MAb1, MAb2, MAb3,MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 или MAb20, и VH, который соответствует по последовательности VH MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 или MAb20; и(e) антитела, имеющие VL и VH, которые соответствуют по последовательности VL и VH MAb1,MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 или MAb20. Со ссылкой на табл. 3 В специфические воплощения С-терминальных анти-hPG антител, полезных в способах и наборах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения таковыми, следующие:(f) антитела, имеющие VL CDRs, которые соответствуют по последовательности VL CDRs MAb5,MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 или MAb23, и VHCDRs, которые соответствуют по последовательности VH CDRs MAb5, MAb6, MAb7, МАВ 8, МАВ 9,MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 или MAb23;(g) антитела, имеющие VL CDRs и VH CDRs, которые соответствуют по последовательности VL и(i) VL CDR1 является выбранным из KSLRHTKGITF ("VL CDR 1.8"; SEQ ID NO:49) и(ii) VL CDR2 является выбранным из QMS ("VL CDR 2.8"; SEQ ID NO:52) и LVS ("VL CDR 2.13";(iii) VL CDR3 является выбранным из AQNLELPLT ("VL CDR 3.8"; SEQ ID NO:55) и WQGTHFPQT(iv) VH CDR1 является выбранным из GFTFTTYA ("VH CDR 1.8"; SEQ ID NO:37) и GFIFSSYG(v) VH CDR2 является выбранным из ISSGGTYT ("VH CDR 2.8"; SEQ ID NO:41) и INTFGDRT(vi) VH CDR3 является выбранным из ATQGNYSLDF ("VH CDR 3.8"; SEQ ID NO:45) и ARGTGTY(i) антитела, имеющие VL, который соответствует по последовательности VL MAb5, MAb6, MAb7,MAb8, MAb9, MAb1 О, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 или MAb23, и VH, который соответствует по последовательности VH MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb1 О, MAb1 1, MAb12,MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 или MAb23; и(j) антитела, имеющие VL и VH, которые соответствуют по последовательности VL и VH MAb5,MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 или MAb23. Как отмечено в табл. 4 А и 4 В, было идентифицировано несколько N-терминальных и С-терминальных моноклональных анти-hPG антител. Все эти антитела являются специфическими дляhPG, и все, кроме MAb14, демонстрируют нейтрализующую активность на клетках колоректального рака. Несмотря на то что нейтрализующая активность может быть важной для терапевтических применений, она не является необходимой для диагностических целей в соответствии с данным раскрытием. Таким образом, как не нейтрализующие, так и нейтрализующие антитела, которые специфически связывают hPG, являются полезными для различных диагностических способов, описанных в данном документе. Аффинность анти-hPG антитела не является критической для диагностических способов в соответствии с данным изобретение, но антитела с высокой аффинностью улучшают чувствительность определения прогастрина. Более того, антитела с высокой аффинностью являются необходимыми для терапевтических применений. В соответствии с этим могут существовать преимущества использования антител,которые демонстрируют аффинности по крайней мере приблизительно 1 нМ; например аффинность по крайней мере приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,1, 0,01, 0,001 нМ или даже выше. Измеренные аффинности анти-hPG моноклональных антител, идентифицированных в табл. 4 А и 4 В, колеблются в интервале от 10-6 до 10-12 М, как показано в табл. 5. Таблица 5 Анти-PG моноклональное антитело, имеющее аффиность, особенно приемлемую для определенного желаемого применения, может быть легко выбрано среди указанных, или получено, или сконструировано при использовании различных иммуногенов, последовательностей участка, определяющего комплементарность (CDR), последовательностей вариабельной тяжелой (VH) и вариабельной легкой (VL) цепей анти-hPG антител, описанных в данном документе. Аффинность какого-либо определенного антиPG моноклонального антитела может быть определена при использовании методик, известных в области техники или описанных в данном документе, таких как, например, ELISA, изотермальная титрационная калориметрия (ITC), BIAcore или анализы флуоресцентной поляризации. Специфический анализ обеспечивается в примере 5. Как будет признано средними специалистами в данной области техники, анти-hPG антитела, имеющие свойства специфического связывания, такие как способность связывать специфический эпитоп,который представляет интерес, могут быть легко получены при использовании различных антигенов и иммуногенов, описанных в данном документе, и оценки их способности конкурировать за связываниеhPG с эталонным антителом, которое представляет интерес. Любое из анти-hPG антител, описанных в данном документе, может использоваться в качестве эталонного антитела в таком конкурентном анализе. Специфический анализ, полезный для оценки способности антитела конкурировать за связывание hPG с биотинилированным эталонном анти-hPG антителом, которое представляет интерес, обеспечивается в примере 6. При осуществлении конкурентного анализа антитела между эталонным анти-hPG антителом и любым исследуемым антителом (вне зависимости от вида или изотипа) можно сначала пометить эталонное антитело с помощью метки, которая является способной либо к непосредственному определению, такой как, например, радиоизотоп или флуорофор, либо к опосредованному определению, такой как, например,- 14029653 биотин (определяется путем связывания с флуоресцентно меченым стрептавидином) или фермент (определяется путем ферментативной реакции), для того, чтобы позволить осуществить последующую идентификацию. В этом случае меченое эталонного анти-hPG антитело (в фиксированной или повышающихся концентрациях) инкубируют с известным количеством hPG, формируя комплекс hPG-меченое антиhPG антитело. Немеченное исследуемое антитело потом прибавляют к комплексу. При этом измеряется интенсивность комплексированной метки. Если исследуемое антитело конкурирует с меченым эталонным анти-hPG антителом за hPG путем связывания с перекрывающимся эпитопом, то интенсивность комплексированной метки будет снижаться по сравнению с контрольным экспериментом, который осуществляют при отсутствии исследуемого антитела. Многочисленные способы для осуществления анализов конкурентного связывания являются известными и могут быть адаптированы для получения результатов, сравнимых с анализом, описанным выше и в примере 6. Считается, что антитело конкурирует за связывание hPG с эталонным анти-hPG антителом, и, таким образом, считается, что оно связывает приблизительно тот же или перекрывающийся эпитоп hPG и что эталонное анти-hPG антитело, если оно снижает связывание эталонного анти-hPG антитела с hPG в конкурентном анализе связывания, в частности в конкурентном анализе связывания примера 6, по крайней мере на 50% при концентрации исследуемого антитела в интервале от 0,01 до 100 мкг/мл (например,0,01, 0,08, 0,4, 2, 10, 50 или 100 мкг/мл или другая концентрация в пределах указанного интервала), несмотря на то, что более высокие уровни снижения, например 60, 70, 80, 90 или даже 100%, могут быть желательными. Как будет оценено средними специалистами в данной области техники, анти-hPG антитела, полезные в диагностических способах, могут иметь любое происхождение, включая, например, от млекопитающих (например, человека, примата, грызуна, козы или кролика), немлекопитающего, могут быть химерными по природе (получены из более чем одного вида происхождения) и/или могут быть CDRпривитыми (например, гуманизированными). Способы гуманизации антител, включая способы конструирования гуманизированных антител,также являются хорошо известными в области техники. См., например, Lefranc et al. (2003), Dev. Comp.Immunol. 27: 55-77; Lefranc et al. (2009), Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Lefranc (2008), Mol. Biotechnol. 40: 101-111; Riechmann et al. (1988), Nature, 332: 323-7; патенты США 5530101, 5585089, 5693761,5693762 и 6180370, которые относятся к Queen et al.; ЕР 239400; РСТ публикация WO 91/09967; патент США 5225539; ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan (1991), Mol. Immunol. 28: 489-498; Studnicka et al. (1994),Prot. Eng. 7: 805-814; Roguska et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973 и патент США 5565332,полное раскрытие которых является введенным в данное описание в качестве ссылки в своей целостности. Гуманизированные варианты антител, имеющих CDR последовательности, соответствующие CDR нечеловеческого анти-hPG антитела, включая в качестве примера и без ограничения, различныеN-терминальные анти-hPG моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 3 А, и различные С-терминальные анти-hPG моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 3 В, могут быть получены при использовании этих хорошо известных способов. Спрогнозированные последовательности для гуманизированных VL и VH цепей выбранного анти-hPG антитела обеспечиваются в табл. 4 А и 4 В. Либо мышиные, либо гуманизированные антитела могут использоваться для диагностических целей в соответствии с данным изобретением. Специфические примеры гуманизированных антител включают антитела содержащие:(b) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:22;(c) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:23, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:24;(d) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:75, 77 и 79, и вариабельный участок легкой цепи,включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из(e) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:80 и 82, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:81 и 83;(f) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:84, 86 и 88, и вариабельный участок легкой цепи,включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из(g) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO:90, 92 и 94, и вариабельный участок легкой цепи,включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит изSEQ ID NO:91, 93 и 95. Анти-PG моноклональные антитела и фрагменты антитела, используемые в способах в соответствии с настоящим описанием, могут быть дериватизованными, например ковалентно модифицированными или конъюгированными с другими молекулами. В некоторых воплощениях анти-PG антитела или их фрагменты конъюгируют с диагностическим агентом. Определение анти-PG антитела, связанного с hPG, может быть улучшено путем слияния антитела с веществом, которое может определяться непосредственно или опосредованно. Примеры способных к определению веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы,испускающие позитроны металлы при использовании разнообразных способов томографии на основе материалов, испускающих позитроны, и ионов нерадиоактивного парамагнитного металла. Способное к определению вещество может быть слито или конъюгировано либо непосредственно с антителом (или его фрагментом), либо опосредованно с помощью промежуточного соединения (такого как, например, линкер, известный в области техники) при использовании методик, известных в области техники. Примеры приемлемых ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бетагалактозидазу или ацетилхолинэстеразу. Биолюминесцентные, хемилюминесцентные и/или хромогенные субстраты для этих ферментов являются известными в области техники. Например, когда фермент представляет собой щелочную фосфатазу, субстрат может включать хемилюминесцентные вещества, такие как AMPPD (3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3"-фосфорилокси)фенил-1,2-диоксетан), CDP-star(динатрий 4-хлоро-3-(метоксиспиро 1,2-диоксетан-3,2'-(5'-хлоро)трицикло[3.3.1.13,7]декан-4-ил)фенил фосфат) и CSPD (динатрий 3-(4-метоксиспиро 1,2-диоксетан-3,2-(5'-хлоро)трицикло[3.3.1.13,7]декан 4-ил)фенил фосфат); хромогенные субстраты, такие как п-нитрофенил фосфат, 5-бромо-4-хлоро-3 индолил-фосфат (BCIP), 4-нитроголубой хлорид тетразолиния (NBT) и йоднитротетразолиний (INT) и т.п. Примеры ионов металлов, которые могут быть конъюгированы с анти-hPG антителами для применения в диагностических способах в соответствии с данным описанием, являются раскрытыми в патентной заявке США 4741900. Примеры приемлемых комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин. Примеры приемлемых флуоресцентных материалов включают умбелиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, данзил хлорид или фикоэритрин. Пример флуоресцентного материала представляет собой люминол. Примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин. Примеры приемлемых радиоактивных материалов включают 125I, 131I, 111In или 99 Тс. Способы слияния антитела со способными к определению субстратами являются известными в области техники. Типичные методики являются описанными Kennedy et al. (1976), Clin. Chim. Acta 70: 1-31;(2008). Антитела могут также присоединяться к твердым основам, которые являются особенно полезными для иммуноанализов или очистки hPG. Такие твердые подложки включают, но без ограничения таковыми, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинил хлорид или полипропилен. Несмотря на то что различные анти-hPG антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данном документе, были представлены примерами антител полного размера, средний специалист сможет оценить, что связывание фрагментов или суррогатных антител, сконструированных или имеющих происхождение от антител полной длины или связывающих фрагментов, могут также использоваться. Приемлемые фрагменты, суррогаты и т.д. включают, но без ограничения таковыми, Fab', F(ab')2, Fab, Fv,vIgG, scFv фрагменты и сурротела. Наборы. В аспекте в соответствии с данным изобретением обеспечиваются наборы для применения в диагностических и исследовательских применениях, как предлагается выше. В некоторых воплощениях обеспечивается набор, который включает анти-hPG антитела и реагенты, необходимые для определения и/или количественной оценки hPG в образце, указанные наборы могут также включать аналитические реагенты и буферы. Кроме того, наборы могут включать инструктивные материалы, содержащие инструкции (например, протоколы) для осуществления диагностических способов. Хотя инструктивные материалы типично включают письменные или распечатанные материалы, они не являются ограниченными таковыми. Средство, которое является способным к хранению таких инструкций и к осуществлению передачи их конечному пользователю, предполагается данным изобретением. Такие средства включают, но без ограничения таковыми, электронные средства для хранения информации (например, магнитные дис- 16029653 ки, ленты, картриджи, чипы), оптические средства (например, CD ROM) и т.п. Такие средства могут включать отсылки к Internet сайтам, которые обеспечивают такие инструктивные материалы. Наборы могут быть адаптированы для диагностики или скрининга пациентов, которые уже были диагностированы с одним или более заболеваний. Например, набор может содержать инструктивные материалы для пациентов, диагностированных с гепатитом С, так, что может быть поставлен диагноз дополнительных печеночных патологий на основе уровней hPG. Материалы могут также быть адресованы пациентам, диагностированным с другими заболеваниями печени, такими как цирроз и/или рак печени. Наборы могут также адаптированы для скрининга популяций высокой степени риска, включая популяции, в которых гепатит C или другие печеночные патологии являются более преобладающими. Автоматизированные способы и реализация. В некоторых воплощениях в соответствии с данным изобретением способ диагностики или определения указанного риска для одной или более печеночных патологий реализуется полностью или частично с помощью устройства. Например, способ можно осуществлять с помощью диагностической единицы, включающей устройство для введения образца крови. Образец крови потом обрабатывается устройством для получения уровня прогастрина. Такая обработка может включать связывание прогастрина в образце крови с одним или более антителами. Образец прогастрин-антитело может включать способный к определению маркер. Измерение способного к определению маркера обеспечивает получения результата ввода данных, который может выводиться на дисплей. Альтернативно, устройство для вывода данных может соотносить с помощью компьютера уровень прогастрина с одной или более печеночных патологий. В другом воплощении вывод данных может сравниваться с пороговым значением hPG, например 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 пМ. Если определенный уровень hPG выше порогового значения,то ставят диагноз одной или более печеночных патологий. Компьютер может дополнительно включать базу данных статистической или практической информации. Информация может использоваться для соотнесения количественно оцененного уровня прогастрина и дополнительных данных, которые могут быть введены пользователем для обеспечения более подробного или точного диагноза указания риска одной или более печеночных патологий. База данных может также включать информацию в отношении рекомендованного лечения или дополнительных диагностических возможностей. В соответствии с этим способы в соответствии с данным изобретением могут реализовываться в форме компьютеризированного медицинского диагностического способа. Типичные автоматизированные системы, полезные для реализации диагностического анализа в соответствии с настоящим изобретением, включают те, которые описаны в патентах США 6063026, 6063340 и 7381370. В общем случае такие автоматизированные системы могут включать один или более из следующих: единицу для введения крови или образца, единицу для обработки крови или образца, единицы маркера определения hPG и/или hPG, CPU с хранилищем для одной или более баз данных, дисплей и/или коммуникативную единицу или единицы, объединяющие функциональность какой-либо одной из предыдущих единиц. Единицы соединяют для получения образца, обработки образца при использовании реагентов для обеспечения способного к определению маркера, показательного для уровней hPG, определения уровня маркера, корреляции уровня маркера с уровнем hPG и обеспечения вывода информационных данных, в частности определенных уровней hPG, и, необязательно, диагностики на основе определенного уровня hPG. Единицы могут быть также интегрированы с CPU и базой данных для обеспечения дополнительной информации, такой как диагноз рака печени, гепатита С, цирроза или их комбинации на основе определенного уровня hPG, и необязательной дополнительной информации, которая обеспечивается путем автоматизированного анализа, или такой, которая вводится пользователем. В некоторых аспектах единицы могут быть интегрированы с неавтоматическими способами. Например, частично автоматизированный способ может включать единицы для получения и обработки образца. Обработанный образец может потом подвергаться анализу с помощью неавтоматического способа. Примеры Пример 1. Количественная оценка прогастрина в плазме. Планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью 0,5-10 мкг/мл С-терминального анти-hPG антитела,например кроличьего С-терминального анти-hPG поликлонального антитела, и потом инкубировали в течение ночи. Потом планшеты трижды промывали в PBS-Твин (0,05%) и блокировали при использовании 2% (вес./об.) обезжиренного сухого молока в PBS-Твин (0,05%). Отдельно готовили исследуемые образцы, контрольные образцы (чистый образец или негативный по PG образец крови или сыворотки) и от приблизительно 5 пМ (0,5 10-11 М) до приблизительно 0,1 нМ (110-10 М) эталонного стандартногоhPG (лиофилизированный hPG, разведенный в негативной по PG плазме или сыворотке) в приемлемом разбавителе (например, PBS-Твин 0,05%). Образцы инкубировали на покрытых планшетах в течение 2-4 ч при 37 С или, альтернативно, от 12 до 16 ч при 21 С. После инкубации планшеты трижды промывали с помощью PBS-Твин (0,05%) и инкубировали с 0,001-0,1 мкг/мл N-терминального анти-hPG моноклонального антитела, как описано в данном документе, слитого с пероксидазой хрена (HRP) (Nakane etal., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091) в течение 30 мин при 21 С. Потом планшеты трижды промывали в PBS-Твин (0,05%) и инкубировали с субстратом HRP в течение 15 мин при 21 С. Реакцию останавливали путем прибавления 100 мкл 0,5 М серной кислоты и осуществляли измерения оптической плотности при 405 нМ. Уровни hPG исследуемого образца определяли путем сравнения со стандартной кривой, построенной из измерений, полученных с эталонным стандартом hPG. Другие анализы по исследованию конкуренции являются известными и могут быть адаптированы для получения сравнимых с анализом, описанным выше, результатов. Пример 2. Идентификация повышенного риска или диагноза одной или более печеночных патологий у пациента. Пациент, который предполагается как такой, который имеет печеночную патологию, или пациент,который подвергается скринингу, например скринингу, осуществляемому как часть обычного исследования, обеспечивает биологический образец, такой как плазма, сыворотка или кровь. Уровни прогастрина подвергаются количественной оценке, например, как показано в примере 1, для получения числа, которое соответствует концентрации прогастрина в образце крови. В способах в соответствии с данным изобретением число представляет собой в общем случае в пределах от 1 до 5% (или менее) истинного количества прогастрина, поскольку используются анализы, специфические для прогастрина, а не для его предшественников или продуктов. Это число потом сравнивают со списком печеночных патологий, ассоциированных с уровнями прогастрина в пределах определенного интервала. Другими словами, уровни прогастрина, показательные для определенных печеночных патологий, сравнивают с количественным выражением. Некоторые субинтервалы являются показательными для различных уровней риска. Например, низкий, но повышенный уровень прогастрина, может свидетельствовать о слабом риске одной или более патологий, в то время как высокий уровень прогастрина может свидетельствовать о высоком риске одной или более патологий. Уровень может сравниваться с пороговым значением, обеспечивая, таким образом, позитивный или негативный результат анализа. Необязательно, может подвергаться исследованию второй биомаркер для подтверждения диагноза или показания. Например, пациент, который представляет умеренный, но не высокий, риск печеночной патологии может быть проверен на второй биомаркер. Если второй биомаркер также свидетельствует о той же печеночной патологии, то диагноз такой патологии с большей вероятностью является точным. Способы определения уровней прогастрина могут обеспечиваться в наборе. Набор может также обеспечивать статистические или другие данные в отношении корреляции уровней прогастрина с одной или более патологиями, в частности печеночными патологиями и, необязательно, дополнительно содержит одним или более дополнительных биомаркеров. Пациенты, которые уже были диагностированы с печеночной патологией, могут также подвергаться анализу hPG. Например, пациент, диагностированный с печеночным раком, может подвергаться анализу hPG для определения, имеет ли пациент также дополнительные печеночные патологии, такие как гепатит C и цирроз. Поскольку уровни гепатита C не являются в норме повышенными, за исключением случая, когда пациент представляет множественные печеночные патологии, например рак печени, цирроз и гепатит С, прогастрин представляет собой полезный биомаркер для диагностики гепатита C у таких пациентов. Кроме того, пациенты, которые уже были диагностированы с гепатитом С или циррозом, могут подвергаться скринингу на дополнительные патологии путем определения, являются ли уровни hPG патологическими. Уровни hPG могут использоваться в некоторых случаях для подтверждения диагноза. Например,пациент, который имеет патологические результаты исследования на один или более биомаркеров, показательных для печеночного рака или другой печеночной патологии, может подвергаться скринингу на патологически высокие уровни hPG для подтверждения исходного диагноза. Уровни hPG могут быть количественно оценены в популяциях риска в качестве части обычной программы скрининга. Например,очень высокие уровни hPG коррелируют с множественными печеночными патологиями, и поскольку пациенты, представляющие гепатит С, типично, сочетанно представляют по крайней мере одну другую печеночную патологию, популяции с высокими уровнями гепатита С, являются вероятными кандидатами для скрининга на hPG. Уровни hPG могут также использоваться для мониторинга курса лечения одной или более печеночных патологий. Сниженные уровни hPG будут коррелировать с эффективным лечением. Пример 3. Наборы, единицы, анализы и диагностические агенты для диагностики одной или более печеночных патологий. Изделия, включающие один или более диагностических агентов, могут также использоваться в способах диагностики, описанных в данном документе. Например, блоттер или хроматографическая лента могут приспосабливаться для изменения цвета при связывании с кровью или компонентами крови от пациента, где уровень прогастрина является выше порогового значения. Альтернативно, набор может включать реагенты для связывания маркера с прогастрином в крови. Такой маркер может представлять собой, например, радиоизотоп или хромофор. Определение и количественная оценка излучения (индуцированного возбуждением или иным путем) может потом использоваться для получения позитивного результата анализа, если эмиссия маркера является достаточной интенсивности для измерения уровней прогастрина, выше порогового значения. Результаты анализа могут быть адаптированы для измерения интервалов, таких как значения риска. Например, набор может включать анализ, приспособленный для демонстрации первого сигнала для одного интервала уровней прогастрина и дополнительных сигналов для других интервалов уровней прогастрина. Частный пример диагностической единицы или системы включает одну или более камер для обработки образца крови либо с помощью лаборанта, либо при использовании автоматизированного механизма. Единица или система дополнительно включают один или более реагентов, таких как антитела,которые специфически связываются с прогастрином. В единице или системе для проведения специфического анализа прогастрина сэндвич-анализ может осуществляться при использовании множества антител, которые обеспечиваются в единице или системе. Единица или система могут включать детектор для определения количества маркера, используемого для количественной оценки уровня связанного прогастрина. Единица или система могут дополнительно включать процессор, такой как компьютер, запрограммированный с инструкциями для соотнесения уровня определенного маркера с уровнем связанного прогастрина и для соотнесения уровня связанного прогастрина с диагнозом. В завершение, единица или система могут включать единицу для выведения или коммуникации результатов исследования и/или диагноза. В альтернативной единице или системе единица включает хранилище для образца крови и один или более реагентов, которые связываются с прогастрином. Например, тестовая лента, импрегнированная или покрытая с помощью реагентов, которая контактирует с прогастрином и приводит к изменению цвета может использоваться для обеспечения теста одной капли для печеночной патологии. Пример 4. ELISA анализ для оценки специфичности анти-hPG антител. Специфичность анти-hPG антител может быть традиционно определена при использовании ELISA анализов, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек инкубировали в течение ночи при 4 С с приемлемой(ыми) концентрацией(ями) исследуемого полипептида (например, 25 и 50 нг рекомбинантного человеческого PG и 50 и 250 нг CTFP или других продуктов, имеющих происхождение от гена гастрина) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), после чего ячейки трижды промывали промывочным раствором (PBS и 0,1% Твин-20) и потом инкубировали в течение 2 ч при 22 С с 100 мкл блокирующего раствора (PBS, 0,1% Твин-20, 0,1% бычьего сывороточного альбумина или гидролизата казеина) на ячейку. После блокирования ячейки трижды промывали и прибавляли антитело, которое подвергается анализу (исследуемое антитело). 100 мкл исследуемого антитела (при концентрации от 0,3 до 1 нг/мл) в PBS и 0,1% Твин-20 прибавляли к каждой ячейке. Потом планшеты инкубировали в течение 2 ч при 22 С, после чего раствор исследуемого антитела отбрасывали и заменяли, после этапа промывания (3100 мкл промывочного раствора, как указано выше) с помощью блокирующего раствора, содержащего вторичное антитело, прибавляли козье антимышиное IgG (Fc) антитело, слитое с пероксидазой хрена. Через 1 ч инкубации со вторичным антителом 100 мкл раствора субстрата (например, Fast OPD или О-фенилендиамин дигидрохлорид, доступный от Sigma-Aldrich Co., приготовленный в соответствии с инструкциями производителя) прибавляли к каждой ячейке и инкубировали в темноте в течение 20 мин при 22 С. Реакцию останавливали путем прибавления 50 мкл 4 н. серной кислоты и определяли количество катализированного субстрата путем измерения оптической плотности (OD) при 492 нм. Превращение субстрата является пропорциональным количеству первичного (исследуемого) антитела, связанного с антигеном. Эксперименты проводили в двукратной повторности и измерения OD выстраивали как функцию концентрации антигена. Исследованные антитела считали высокоспецифическими для PG, если измеренное значение OD составляло от 0,2 до 1,5 для hPG и не существовало статистически значимого сигнала, выше фона с CTFP или каким-либо другим пептидом, имеющим происхождение от гена гастрина, где фон представлял собой среднее значение сигнала от контрольных ячеек, содержащих толькоPBS. Пример 5. Анализ для оценки аффинности анти-hPG антитела. Константа аффинности анти-hPG антител может измеряться при использовании методики Proteon(BioRad) в соответствии с Nahshol et al. (2008), Analytical Biochemistry, 383: 52-60, которая является введенной в данное описание в качестве ссылки в своей целостности. Кратко, для мышиных анти-PG антител антимышиное IgG антитело (50 мкг/мл) сначала наносили на сенсорный чип, убеждаясь, что определяемый чипом сигнал после введения антитела находится в интервале от 10,000 до 11,500 единиц ответа(RU). Потом вводили мышиное анти-hPG антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело) (при типичной концентрации 30 мкг/мл). Если исследуемое антитело связывается достаточно, то будет наблюдаться дополнительный сигнал, по крайней мере 500. Процесс связывания между исследуемым антителом и hPG потом получали путем введения варьирующих концентраций hPG, например 200, 100,50, 25 и 12,5 нМ, и определения уровня ассоциации. Типично некоторые каналы были доступными для исследуемого множества антител параллельно в одном эксперименте, делая возможным анализ связывания единственного исследуемого антитела при различных концентрациях hPG параллельно. Один канал будет заполняться мышиным моноклональным антителом, которое не является специфическим для hPG,в качестве контрольного для неспецифического связывания, а другие каналы будут заполняться буфером для разведения, взятым отдельно в качестве базовой линии для фонового сигнала. В общем случае никакого связывания не определяют в канале, в который вводится неспецифическое мышиное антитело. Антитела, которые демонстрируют высокий уровень ассоциации в анализе, что может приводить к насыщению захваченного моноклонального антитела hPG, могут анализироваться против более низких концентраций hPG (50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 нМ), позволяя осуществлять более точное измерение. Константы аффинности (KD) подсчитывают как соотношение между константой диссоциации (kd) и константой ассоциации (ka). Экспериментальные значения могут быть подтверждены путем анализа статистически релевантного подобия между экспериментальными кривыми на основе измерений связывания и теоретических профилей. Константы аффинности немышиных анти-hPG антител могут быть оценены в подобном формате при использовании IgG, специфических для видов происхождения анти-hPG исследуемого антитела. Пример 6. Анализ для оценки конкурентного связывания с эталонным анти-hPG антителом. Анализ со специфичностью для оценки, конкурирует ли антитело, которое представляет интерес(исследуемое антитело), за связывание hPG с биотинилированным эталонным анти-hPG антителом, может осуществляться так, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек покрывали при использовании иммобилизованного анти-hPG антитела (поликлональное или моноклональное антитело, которое узнаетN- или С-терминальный участок hPG, отличающийся от эпитопа, который узнается биотинилированным эталонным анти-hPG антителом) при концентрации, выбранной в пределах 1-10 мкг/мл, в течение ночи при 4 С (от 0,1 до 1 мкг/ячейка). После блокирования с помощью блокирующего буфера (0,1% Твин-20,0,1% BSA в PBS) в течение 2 ч при 22 С прибавляли рекомбинантный hPG при концентрации, которая колеблется от 10 пМ до 1 нМ (от 10 до 1000 пг/ячейка) и инкубировали в течение 2 ч при 22 С. После этого прибавляли биотинилированное референтное анти-hPG антитело (или смесь, содержащую биотинилированное эталонное анти-hPG антитело), наряду с увеличивающимися концентрациями немеченного исследуемого антитела и инкубировали в течение 1 ч при 22 С. После промывания для удаления несвязанного антитела определение связанного меченого эталонного анти-hPG антитела осуществляли путем инкубации смеси с 50 нг/мл стрептавидина-HRP в течение 1 ч при 22 С, после чего осуществляли инкубацию с флуорогенным субстратом для пероксидазы хрена и осуществляли количественную оценку относительных световых единиц (RLU) в люминометре. Анализы осуществляли в двукратной повторности. Антитела, которые конкурируют с эталонным анти-hPG антителом, ингибируют связывание эталонного антитела с hPG. Антитело, которое связывается существенно с тем же эпитопом или с перекрывающимся эпитопом, что и эталонное антитело, значительно снижает (например, по крайней мере на 50%) количество связанного эталонного анти-hPG антитела, как следует из снижения наблюдаемых значений RLU. Высокое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченого эталонного антитела с рекомбинантным hPG без исследуемого антитела. Низкое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченого эталонного антитела с рекомбинантным hPG в присутствии избыточных концентраций немеченного эталонного антитела (немеченное эталонное антитело, таким образом, конкурирует с меченым антителом за связывание с hPG). Способность исследуемого антитела конкурировать с эталонным анти-hPG антителом потом анализируют путем инкубации меченого эталонного антитела с рекомбинантным hPG в присутствии повышающихся концентраций немеченного исследуемого антитела. В исследовательском анализе значительное снижение наблюдаемых RLU в присутствии исследуемого антитела свидетельствует о том, что антитело узнает существенно тот же эпитоп, что и эталонное анти-hPG антитело. Ингибирование связывания может быть выражено в виде константы ингибирования, или Ki, которую подсчитывают в соответствии со следующей формулой: где "IC50" представляет собой концентрацию исследуемого антитела, которая обеспечивает 50% снижение связывания эталонного антитела;Rc представляет собой концентрацию эталонного анти-hPG Ab;Kd представляет собой константу диссоциации эталонного анти-hPG антитела, меру аффинности для hPG. Полезные исследуемые антитела, которые конкурируют с эталонным анти-hPG антителом (например, одним из анти-hPG антител, описанных в данном документе), будут типично иметь Kis, которое колеблется в интервале от 10 пМ до 100 нМ при условиях анализа, описанных в данном документе. Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, приведенные в данном описании,являются введенными в качестве ссылки в своей целостности для всех целей до такой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка и другой документ были индивидуально указаны для включения в качестве ссылки для всех целей. Несмотря на то что различные специфические воплощения были проиллюстрированы и описаны, будет понятным, что могут быть внесены различные изменения без отступления от духа и объема данного(ых) изобретения(ий).