Штамм-продуцент растворимой формы рекомбинантного хепсина человека (hpntm-a)

011695 Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства рекомбинантной сериновой протеазы хепсин для применения в здравоохранении, в частности для диагностирования и лечения рака предстательной железы. В настоящее время рак предстательной железы (РПЖ) - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний у мужчин, частота которого напрямую связана с возрастом. Так, начиная с 45 лет заболеваемость РПЖ растет в геометрической прогрессии и у мужчин в возрасте 70 лет и выше встречается более чем у 60%. В связи с этим стоит задача выбора из общей массы потенциальных маркеров РПЖ тех, которые обладают наиболее высокой прогностической ценностью и специфичностью и могут быть использованы в клинической практике без усложнения методики использования при диагностике и существенного ее удорожания. Из уровня техники известно, что таким маркером может служить хепсин (1). Хепсин представляет собой сериновую протеазу, которая не экспрессируется клетками здоровой предстательной железы, но присутствует в значительном количестве на поверхности клеток РПЖ. Это обстоятельство позволяет с высокой степенью достоверности использовать хепсин в диагностике и лечении заболевания (2). Другая важная особенность хепсина связана с его ферментативной активностью, обусловливающей его роль в процессе онкогенеза опухоли предстательной железы. В экспериментальных данных было показано, что при использовании моноклональных антител для связывания хепсина на поверхности клеток значительно уменьшалась способность опухоли к метастазированию (3). Следовательно, тест, основанный на определении именно этой его функции (ферментативной), наиболее полно характеризует стадию заболевания и развитие опухолевого процесса. Для решения поставленной задачи использования хепсина для диагностики РПЖ и стадии этого заболевания необходимо создание штамма-продуцента растворимого хепсина, поскольку из него предусмотрено последующее получение белка в активной форме. Из уровня техники не известен штамм-продуцент хепсина, но на сегодняшний день в мире получена полноразмерная форма неактивного рекомбинантного хепсина с глутатион-c-трансферазой (Abnova,кат.Н 00003249-Р 01). Данный продукт используется в качестве концентрационного стандарта при постановке методик ИФА и вестерн-блот. Однако он не является активной формой белка и не пригоден для осуществления ферментативных реакций, специфичных для полноценного хепсина, и, соответственно,не применим для диагностики РПЖ. Штамм-продуцент E.coli, несущий плазмидную ДНК pHPNTM-A со встроенным геном, кодирующим хепсин человека, получен методом кальциевой трансформации клеток BL21(DE3)CodonPlusRIL. Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) подВ-10098. Условия хранения. Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре -70 С в среде следующего состава: 1% бактотриптона,0,5% дрожжевого экстракта,0,5% NaCl,pH 7,0,15% глицерина,7% ДМСО не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже одного раза в 2 месяца. Культурально-морфологические признаки штамма. Клетки представляют собой короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор. На мясопептонном бульоне дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легко разбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На мясопептонном агаре колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины с темным металлическим блеском. Физиолого-биохимические свойства. Факультативный аэроб. Температурный диапазон роста - 18-38 С. Оптимальная температура роста 37 С. Растет при значениях рН среды - 5,0-8,0. Оптимум рН роста - 6,5-7,5. Отрицательная реакция Фогис-Параскау; положительная реакия на образование индола; отрицательная реакция на образование сероводорода; отрицательная реакция на цитрат; отрицательная реакция на образование малоната; отрицательная реакция на образование мочевины; положительная реакция на лизиндекарбоксилазу; отрицательная реакция на орнитин; положительная реакция на газообразование; отрицательная реакция на синтез лактозы; положительная реакция на расщепление маннита. Вид E.coli, к которому отнесен штамм BL21(DE3)CodonPlusRIL (Stratagen, U.S. патент. 6706525), не числится в качестве патогенного в Положении о порядке учета, хранения, обращения,-1 011695 отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения, отсутствует в списках патогенных бактерий по Положению Минздрава и в списках патогенных бактерий в Official Journal of the European CommunitiesNC 217/3237, 24.08.92. Характеристика штамма: семейство Enterobacteriaceae; род Escherichia; вид Escherichia coli; происхождение Protogene; источник выделения - желудочно-кишечный тракт крупного рогатого скота; генотип: Е.coli В F- ompT hsdS(rB- mB-) dcm+ Tetr gal (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]; Биотехнологическая характеристика. Штамм-продуцент содержит плазмидную ДНК, полученную на основе вектора рЕТ 28 а (карта плазмиды, нуклеотидная и аминокислотная последовательности представлены на чертеже фигуры). Общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены. Включенные в состав гены: внеклеточная часть хепсина (5128 bp-6246 bp),сайт разрезания тромбином (5464 bp-5481 bp),6 His-tag (5089 bp-5106 bp),сайт разрезания фактором X (5107 bp-5127 bp). Генетическая карта клонированного фрагмента (размер - 1175 bp) Продуцируемое полезное вещество - внеклеточный фрагмент хепсина, трансмембранной сериновой протеазы II типа. Обладает всеми характерными признаками сериновых протеаз, гидролизует пептидную связь по аргинину в положении Lys P2P3 Arg , где Р 2 предпочтительно Asn, Leu или Thr, Р 3 предпочтительно Lys или Gln (4). Уровень продуктивности 20%. Пример осуществления изобретения. Плазмидная ДНК pHPNTM-A, несущая ген, кодирующий хепсин человека, создана в соответствии с представленной на чертеже фигуры картой и заданными нуклеотидной и аминокислотной последовательностями с использованием стандартных методов молекулярной биологии известных из научнотехнической литературы (5). Полученную плазмиду, содержащую ген HPNTM-A, трансформировали в клетки E.coli штамма BL21(DE3)CodonPlus RIL. Проводили аналитическую экспрессию целевого белка с использованием химического индуктора. Для этого колонии E.coli, несущие ген целевого белка, выращивали на жидкой питательной среде LB с антибиотиком в пробирках в течение 152 ч при температуре 37 С при постоянном покачивании в качалке. Добавляли 0,5 мл в колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл жидкой среды LB с антибиотиком. Растили при температуре 37 С при постоянном покачивании до оптической плотности 0,50,1 (OD540). Затем добавляли химический индуктор - ИПТГ (изопропилD-тиогалактопиранозид) и наращивали далее в течение 3 ч. Биомассу собирали центрифугированием в пластиковых пробирках на 50 мл (центрифуга ОПН-8, 4,000 об/мин 8 мин). Проводили электрофоретический анализ клеточного белка в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Для этого к аликвоте клеток 10 мг добавляли 40 мкл воды, перемешивали на встряхивателе и добавляли 40 мкл 2 буфера для образцов для белкового денатурирующего электрофореза. Образец прогревали при 95 С в течение 4 мин и наносили на денатурирующий гель с концентрацией акриламида 12%. После проведения электрофоретического разделения гель промывали дистиллированной водой, после чего окрашивали краской, содержащей краситель Кумасси. Избыток краски отмывали раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту. Анализ наличия целевого белка проводили визуально, сравнивая набор клеточных белков в неиндуцированных клетках и клетках, индуцированных ИПТГ. Для определения молекулярной массы полученного целевого белка использовали набор белков с известными молекулярными весами. Проводили анализ количества целевого белка по отношению к общему клеточному белку. Для этого гель сканировали на сканере Epson 1660 Photo. Полученное изображение обрабатывали с помощью программы Onedscan.-3 011695 Результаты экспрессии показывают высокий уровень синтеза целевого белка, целевой белок составляет не менее 20% от общего клеточного белка (в среднем составляет 20-25%). Источники информации 1. Leytus S.P., Loeb K.R., Hagen F.S., Kurachi K., Davie E.W. A novel trypsin-like serine proteasehepsin, a membrane-anchored serine protease implicated in prostate and ovarian cancers. Biochemistry Journal 2005; 390 (Pt. 1): 125-36. 5. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) By Joseph Sambrook, Peter MacCallum,David Russell. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий Escherichia coli pHPNTM-A - продуцент растворимой формы рекомбинантного хепсина человека (HPNTM-A). Физическая карта плазмиды pHPNTM-A