Лекарственный препарат парентерального применения

1 Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лекарственным препаратам для парентерального применения с широким спектром биологической активности. Известны лекарственные препараты для парентерального применения, содержащие в качестве активного вещества солиNакридонуксусной кислоты. Так, лекарственный препарат для парентерального применения (патент РФ 2031650 приор. от 17.03.92, А 61 К 31/33, "Противовирусное лекарственное средство и способ его получения") содержит в качестве активного вещества натриевую соль акридонуксусной кислоты, растворнную в трис-буфере, и в качестве стабилизатора - трилон Б (динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Известен лекарственный препарат "Неовир" (М.Д. Машковский, Лекарственные средства, 13-е издание, Харьков, Торсинг, 1997, т. 2,с. 352), который содержит в качестве активного вещества натриевую соль N-акридонуксусной кислоты в концентрации 12,5 мас.%, а в качестве стабилизатора - лимонную кислоту. Известные лекарственные препараты на основе натриевой соли N-акридонуксусной кислоты обладают интерфероногенной активностью, однако, вызывают местнораздражающий и болевой эффект, обусловленный высоким значением рН, а также являются светочувствительными и, следовательно, неустойчивыми при изготовлении и хранении готовой лекарственной формы. Известен также лекарственный препарат для парентерального применения на основе 1 дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он-10-илацетат)]-аммоний-Д-глюцитола в виде 22,5% водного раствора, обладающий широким спектром биологической активности ("Циклоферон 12,5% для инъекций: итоги и перспективы клинического применения", изд. "Аполлон", СПб,1999 г.). Лекарственный препарат указанного состава выбран в качестве прототипа. Однако данный препарат в ряде случаев не обладает достаточной биологической активностью, особенно при лечении хронических заболеваний системного характера. Кроме того, данный препарат не является стабильным. Так, в процессе его изготовления на стадиях розлива, запайки и термической стерилизации ампул, а также при хранении на свету активное вещество разлагается с образованием осадка, что делает лекарственную форму непригодной для использования. Задачей изобретения является повышение биологической активности лекарственного препарата для парентерального применения при одновременном повышении стабильности лекарственной формы в процессе производства и хранения. 2 Поставленная задача решается тем, что лекарственный препарат для парентерального применения, содержащий в качестве активного вещества 1-дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9 он-10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол, в качестве растворителя - воду для инъекций, согласно изобретению, дополнительно содержит в качестве стабилизатора - N-метилглюкамин, при следующем соотношении компонентов, мас.%: 1-Дезокси-1-N-[метил-(2 акридон-9-он-10-ил-ацетат)]аммоний-Д-глюцитол 8,5-25,0N-Метилглюкамин 0,05-1,00 Вода для инъекций До 100 Заявляемый лекарственный препарат для парентерального применения содержит в качестве активного вещества 1-дезокси-1-N-[метил(2-акридон-9-он-10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол, известный как биологически активное вещество, обладающее иммуномодулирующим действием (ЕА патент 000382, приор. от 22.01.98 г., С 07 Н 5/06). В качестве стабилизатора заявляемый лекарственный препарат содержитNметилглюкамин (ФС 42-2465-89), который известен как солеобразователь. Авторами настоящего изобретения впервые показано влияние N-метилглюкамина в свободном состоянии как на биологическую активность лекарственного препарата, так и на его физико-химические свойства. Технический результат изобретения заключается в том, что добавление Nметилглюкамина в свободном состоянии к раствору соли акридонуксусной кислоты (1 дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он-10-илацетат)]-аммоний-Д-глюцитол) приводит к увеличению проникающей способности активного вещества внутрь клетки через мембрану и способствует связыванию его с внутриклеточными структурами, что повышает биологическую активность препарата. Так же, при добавлении N-метилглюкамина в свободном состоянии к раствору соли акридонуксусной кислоты происходит процесс самоструктурирования раствора с образованием крупных межмолекулярных комплексов, что приводит к повышению фотостабильности и термостабильности лекарственной формы. Таким образом, заявляемый лекарственный препарат для парентерального применения при экспериментально установленном оптимальном соотношении компонентов является препаратом, обладающим повышенной биологической активностью, а также фото- и термостабильностью в процессе производства и хранения. Изобретение осуществляют следующим образом. Для приготовления 100 л лекарственного препарата берут 70 л воды для инъекций, 22,5 кг 3 1-дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он-10-илацетат)]-аммоний-Д-глюцитола. Полученную смесь перемешивают до полного растворения компонентов, затем добавляют 0,5 кг N-метилглюкамина до достижения рH=7,6 и воду для инъекций до получения объема 100 л. Полученный раствор фильтруют через стерилизующий фильтр типа Палл, разливают в стерильные емкости объемом 1, 2 и 5 мл. Выход готового препарата 96,5%. мкость объмом 5 мл содержит 22,5 маc.% 1-дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он 10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитола; 0,5 мас.%N-метилглюкамина и 77,00 мас.% воды для инъекций. В табл. 1-7 представлены результаты экспериментальных и клинических исследований заявляемого лекарственного препарата для парентерального применения. В табл. 1, 2 - данные по выбору оптимального состава и по исследованию биологической активности заявляемого лекарственного препарата. В табл. 3, 4, 5 - результаты экспериментальных исследований фото- и термостабильности заявляемого препарата. В табл. 6, 7 - результаты лечебной эффективности заявляемого препарата. Опыт 1. Перед выбором оптимального соотношения компонентов, входящих в заявляемый препарат, было определено допустимое содержание каждого компонента. Допустимое содержание активного вещества (1-дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он-10 ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол) установили путм экспериментальных исследований по эффективной разовой дозе, которая составляет 434-1279 мг на человека массой 70 кг, что соответствует концентрации раствора 8,5-25,0 мас.% для однократно вводимого объма 5 мл. Допустимое содержание стабилизатора (Nметилглюкамина), которое обеспечивает физиологически приемлемый уровень рН 7,8-8,0, составляет 0,05-1,00 мас.%. Выбор оптимального соотношения компонентов, входящих в заявляемый препарат, проводили на 70 кроликах породы Шиншилла массой 2,8-3,3 кг, разбитых на 14 групп по 5 животных, и исследовали действие 14 вариантов состава лекарственного препарата с содержанием 1-дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он-10-илацетат)]-аммоний-Д-глюцитола в пределах от 8,5 до 34,2 мас.% и с содержанием Nметилглюкамина от 0,05 до 1,00 мас.%. Оптимальные пределы содержания активного вещества определяли по отсутствию местно-раздражающего действия при введении внутримышечно 5 мл препарата (максимально переносимая доза). Полученные результаты представлены в табл. 1. 4 Заявляемый лекарственный препарат не вызывает местно-раздражающего действия при внутримышечном введении при содержании активного вещества 8,5-25,0 мас.% и содержании N-метилглюкамина 0,05-1,00 мас.%. При этом препарат представляет собой прозрачную жидкость жлтого цвета. При содержании активного вещества 30 мас.% на месте введения препарата наблюдалась болевая реакция и покраснение участка кожи. С увеличением содержания активного вещества до 34,2 мас.% при различном содержании стабилизатора наблюдалась продолжительная болевая реакция и отк на месте введения препарата, при этом он представляет собой сироп жлтого цвета с кристаллами активного вещества. Таким образом, оптимальным соотношением компонентов для решения поставленной задачи в лекарственном препарате для парентерального применения является состав со следующим соотношением компонентов, мас.%: 1-Дезокси-1-N-[метил(2-акридон-9-он-10-илацетат)]-аммоний-Д-глюцитол 8,5-25,0N-Метилглюкамин 0,05-1,00 Вода для инъекций До 100 Исследования биодоступности и биологической активности заявляемого препарата проводили в опытах 2 и 3. Опыт 2. Биодоступность заявляемого лекарственного препарата оценивали по степени проникновения активного вещества (1-дезокси 1-N-[метил-(2-акридон-9-он-10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол) внутрь клетки путм исследования лимфоцитов, разделнных на Т- и Всубпопуляции, периферической крови доноров. Для фракционирования лимфоциты пропускали через стерильную колонку с синтетическим волокном, после чего сорбированные на волокне В-лимфоциты смывали 0,1% раствором натриевой соли этилендиаминтетраацетата(ЭДТА). Клетки были инкубированы с водными растворами прототипа и заявляемого препарата в разведении 1:1000. О степени проникновения активного вещества внутрь клетки через мембрану оценивали по характерной флюоресценции при ультрафиолетовом облучении с помощью люминесцентного микроскопа. Исследования лимфоцитов под микроскопом показали, что в прототипе проникновение активного вещества внутрь клеток было небольшим, так как флюоресценция клеток была слабой, а свечение ядра не наблюдалось. После отмывки клеток 0,1% раствором ЭДТА флюоресценция клеток отсутствовала,что говорит о слабом связывании активного вещества с внутриклеточными структурами. 5 При исследовании лимфоцитов, инкубированных с заявляемым препаратом, в клетках наблюдалось яркое сине-зеленое свечение, особенно заметное в ядрах, которое не исчезало при двукратной отмывке клеток 0,1% раствором ЭДТА. Данный факт свидетельствует о влиянииN-метилглюкамина на повышение биодоступности заявляемого лекарственного препарата за счт проникновения активного вещества внутрь клетки и последующем связывании с ядром. Опыт 3. Биологичесскую активность заявляемого лекарственного препарата по сравнению с прототипом оценивали по динамике образования суммарной рибонуклеиновой кислоты(РНК), отражающей общую активность клетки. В качестве тест-системы использовали стандартную культуру клеток моноцитов И-397. Клетки выращивали в пластиковых пробирках на ростовой среде RPMI 1640 с 20% фетальной телячьей сывороткой, в конечной концентрации моноцитов 2 х 107 клеток/мл. Затем, клетки инкубировали при температуре 37 С в атмосфере 5% углекислого газа в 96-луночной планшете с последующей сменой питательной среды в течение 7 дней. Равное количество клеток брали через 2, 4,6 и 8 ч инкубации с препаратом, изготовленным согласно прототипу, и заявляемым препаратом с различным содержанием стабилизатора и выделяли в них суммарную РНК (Chomczynski P.,Sachi N., "One-step metod for RNA isolation fromcells and tissues". Analytical Biochemystry, 1987,v. 162, N 2, p. 156-159). Количество суммарной РНК определяли спектрофотометрически по оптической плотности инкубированного раствора при длине волны 260 нм. Результаты исследований, приведенные в табл. 2, показывают, что при инкубации клеток моноцитов с прототипом происходило нарастание количества суммарной РНК и через 8 ч достигало максимальной величины в 1,8 раза превышающей исходный уровень. Динамика образования суммарной РНК в инкубированном растворе с заявляемым препаратом при содержании стабилизатора в интервале от 0,05 до 3,0 мас.% была следующая. При содержании стабилизатора от 0,05 до 1,0 мас.% происходило резкое нарастание суммарной РНК, достигало максимального значения через 8 ч и в 9,2-10,4 раза превышало исходный уровень. При дальнейшем увеличении содержанияN-метилглюкамина от 1,0 до 3,0 мас.% динамика образования РНК заметно снижалась. Снижение динамики образования суммарной РНК наблюдалось также через 12 ч после инкубирования растворов при разном содержании N-метилглюкамина. Таким образом, динамика образования суммарной РНК показывает, что биологическая 6 активность заявляемого препарата превышает биологическую активность прототипа. Стабильность заявляемой лекарственной формы исследовали в опытах 4 и 5. Опыт 4. Оценка фотостабильности заявляемого лекарственного препарата по сравнению с прототипом проводилась путм облучения ртутной лампой со спектром, аналогичным солнечному свету, мощностью 300 Вт в течение 6 ч в стандартной кварцевой кювете объмом 10 мл. Фотостабильность препаратов определяли визуально по изменению окраски раствора, выпадению осадка, а также по количественному содержанию активного вещества после центрифугирования осадка и продуктов разложения путм спектрофотометрического определения характерного максимума при 255 нм. Фотостабильным считали препарат, выдержавший экспозицию более 2 ч без помутнения и разложения активного вещества. Полученные результаты эксперимента представлены в табл. 3. Лекарственный препарат, изготовленный согласно прототипу, был стабилен в течение 1 ч,при этом концентрация активного вещества снизилась на 6,2%. Заявляемый лекарственный препарат был стабилен 2 ч, при содержании активного вещества в пределах от 8,5 до 25,0 мас.% и содержании N-метилглюкамина 0,05 маc.%. При содержании N-метилглюкамина 1,0 мас.% заявляемый препарат был стабилен 6 ч,при этом уровень содержания активного вещества не изменялся. Исследование влияния N-метилглюкамина на физико-химические свойства заявляемого препарата проводили путм определения интегральных показателей - осмоляльности и относительной вязкости раствора. Как правило, при увеличении концентрации, связанной с добавлением вещества к готовому раствору, его вязкость и осмоляльность также увеличиваются. Данные исследования, представленные в табл. 4, показывают, что при увеличении содержания N-метилглюкамина в заявляемом препарате наблюдалось уменьшение осмоляльности и вязкости: при содержании N-метилглюкамина 0,05 мас.% осмоляльность раствора снизилась на 18 ммоль/л, а при содержании Nметилглюкамина 1,0 мас.% - на 30 ммоль/л. Относительная вязкость раствора снижается при содержании N-метилглюкамина 0,05 мас.% - на 4,5%, а при содержании N-метилглюкамина 1,0 мас.% - на 6,9%. Таким образом, с повышением содержанияN-метилглюкамина от 0,05 до 1,0 мас.% наблюдается повышение фотостабильности заявляемого препарата при одновременном снижении его осмоляльности и вязкости, что объясняется 7 процессом структурирования раствора с образованием крупных межмолекулярных комплексов. Опыт 5. В данном опыте исследовали влияние N-метилглюкамина на термостабильность заявляемого препарата в условиях промышленной стерилизации и его стабильность при последующем хранении. В заявляемом лекарственном препарате для парентерального применения активное вещество (1-дезокси-1-N-[метил-(2-акридон-9-он 10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол) является термически нестабильным соединением. В условиях промышленной стерилизации ампул происходит частичная деструкция акридонуксусной кислоты с образованием примесиN-метилакридона. В процессе хранения ампул,особенно на холоде, происходит кристаллизация из раствора нерастворимого в воде Nметилакридона и препарат не может быть применен для парентерального введения из-за возможных побочных реакций - болевого шока,образования инфильтрата и васкулита. Для оценки термоустойчивости и стабильности при хранении использовали две серии стеклянных ампул объмом 5 мл. Одна серия - с раствором, изготовленным согласно прототипу. Другая серия - с раствором, изготовленным согласно заявляемому препарату, с содержанием активного вещества 22,5 мас.% и с содержанием стабилизатора в пределах 0,05-1,0 мас.%. Серии ампул с указанными растворами подвергали стерилизации острым паром (120 С,30 мин) в автоклаве. После стерилизации определяли количество примеси N-метилакридона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Миллихром-1. Затем ампулы с растворами хранили в тмном месте при 0 и 30 С в течение 4 лет. Раз в месяц ампулы просматривали в отраженном свете и определяли наличие осадка Nметилакридона. За срок хранения серии принимали период, при котором не происходило выпадения осадка. Результаты исследования, представленные в табл. 5, показывают, что при стерилизации ампул с прототипом происходит термическая деструкция активного вещества с образованиемN-метилакридона в концентрации 0,24 мас.%. После стерилизации ампул с заявляемым препаратом образование N-метилакридона уменьшается на 66,6%. В результате хранения при температуре 0 С N-метилакридон выпадает в осадок в прототипе через 25 месяцев, а в заявляемом препарате- через 37 месяцев. В результате хранения при температуре 30 С осадок N-метилакридона в прототипе образуется через 29 месяцев, а в заявляемом препарате - через 38 месяцев. При увеличении содержанияNметилглюкомина от 0,1 до 1,0 мас.% срок хранения заявляемого препарата при обеих температурах составляет 48 месяцев.Nметилглюкамина в качестве стабилизатора повышает термостабильность и увеличивает срок хранения препарата. Заявляемый лекарственный препарат для парентерального применения при установленном оптимальном соотношении компонентов обладает фото- и термостабильностью в процессе производства и хранения. Эффективность лечебного действия заявляемого препарата оценивали при лечении больных псориазом, которое является хроническим заболеванием системного характера. Лечение псориаза в стадии обострения осуществляли у 41 человека - мужчин в возрасте от 18 до 58 лет, разделнных на 2 группы(опытную и контрольную). Длительность заболевания составила от 2 до 20 лет. У всех больных наблюдалось наличие папулзнобляшечных элементов с выраженной инфильтрацией и шелушением. Патологические очаги были локализованы преимущественно на коже туловища, конечностей и волосистой части головы. Лечение проводили путм внутримышечных инъекций по 4 мл 1 раз в сутки на 1, 2, 4, 6,8, 10 дни в контрольной группе (20 больных) прототипом, в опытной группе (21 больной) заявляемым препаратом с содержанием активного вещества(1-дезокси-1-N-[метил-(2 акридон-9-он-10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол), соответствующим содержанию его в прототипе (22,5 мас.%) и с содержанием стабилизатора (N-метилглюкамина) 0,5 мас.%. Эффективность лечения оценивалась по клиническим показателям на 10 день лечения и по времени, прошедшем до следующего обострения (среднее время ремиссии), а также по иммунологическим показателям (содержанию цитокинов в сыворотке крови). Результаты лечения представлены в табл. 6 и 7. В контрольной группе (прототип) в результате лечения у 65% больных регрессировали псориатические очаги и исчезло чувство зуда, у 50% прекратилось шелушение кожи. Среднее время ремиссии составило 128 дней. У 12 больных улучшения клинических показателей было подтверждено иммунологическими показателями. У больных контрольной группы в результате лечения уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО- и гранулоцитарномакрофагального колонестимулирующего фактора TGF-1 снизилась в 1,4; 1,38 и 2,38 раза соответственно. Уровень противоспалительного цитокина ИЛ-10 возрос в 1,29 раза. В опытной группе (заявляемый препарат) у 100% больных прекратилось образование новых высыпаний и исчезло чувство зуда, у 90,4% 9 больных регрессировали псориатические очаги. Среднее время ремиссии увеличилось по сравнению с прототипом и составило 187 дней. У 19 больных улучшение клинических показателей было подтверждено иммунологическими показателями. Анализ динамики цитокинового статуса показал (табл. 7), что при лечении заявляемым препаратом происходит снижение уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО- иTGF-1 в 1,9; 2,7 и 2,1 раза соответственно. Уровень противоспалительного цитокина ИЛ-10 возрос в 1,87 раза. 10 Таким образом, результаты лечения в опытной группе больных оказались лучше, чем в контрольной. Применение заявляемого препарата способствовало значительному улучшению клинической картины заболевания и увеличению среднего времени ремиссии заболевания,что свидетельствует о повышении эффективности лечения псориаза. Лекарственный препарат для парентерального применения заявляемого состава является препаратом, обладающим повышенной биологической активностью при стабильности лекарственной формы в процессе производства и хранения. Таблица 1 Содержание активного вещестМестно-раздражающее ва (1-дезокси-1-N-[метил-(2- Содержание стабилизатора Внешний вид препарата акридон-9-он-10-ил-ацетат)]- (N-метилглюкамин), мас.% действие аммоний-Д-глюцитол), мас.% 0,05 Прозрачная жидкость Отсутствует 8,5 жлтого цвета 1,0 0,05 Прозрачная жидкость Отсутствует 10,0 жлтого цвета 1,0 0,05 Прозрачная жидкость Отсутствует 15,0 жлтого цвета 1,0 0,05 Прозрачная жидкость Отсутствует 20,0 жлтого цвета 1,0 0,05 Прозрачная жидкость Отсутствует 25,0 жлтого цвета 1,0 Сиропообразная прозрач 0,05 Болевая реакция и по 30,0 ная жидкость жлтого краснение участка кожи 1,0 цвета Сироп жлтого цвета с Продолжительная болевая 0,05 34,2 кристаллами активного реакция и отк на месте 1,0 вещества введения Препарат Прототип Заявляемый препарат Таблица 2 Количество суммарной РНК на 20 млн. клеток, мкг при инСодержание стабилизатора кубации клеток с препаратом, ч Содержание активного вещества (1-дезокси-1-N-[метил-(2 Содержание акридон-9-он-10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол) после облустабилизатора чения ртутной лампой, мас.% Препарат Вывод по фотостабильности препарата не стабилен стабилен стабилен стабилен стабилен стабилен стабилен Показатели физикохимических свойств препарата Осмоляльность,ммоль/л Относительная вязкость Таблица 4 Содержание стабилизатора (N-метилглюкамин) в препарате, мас.% прототип заявляемый препарат 0,0 0,05 0,1 0,5 1,0 810 Таблица 5 Содержание стабилизатора (N-метилглюкамин) в препарате,мас.% прототип заявляемый препарат 0,0 0,05 0,1 0,5 1,0 Показатели термостабильности Содержание осадка в препарате после стерилизации, мас.% Срок хранения при 0 С, месяцев Срок хранения при 30 С, месяцев Таблица 6 Результат лечения, человек/% от общего количества в группе Контрольная группа Опытная группа Клинические показатели заболевания псориазом Регресс псориатических бляшек Прекращение новых высыпаний Уменьшение интенсивности зуда Прекращение озноба Прекращение шелушения Среднее время ремиссии, дней Таблица 7 Количество больных с ИЛ-1 пкг/мл ФНО-, пкг/мл изменением иммунолодо после до после гических показателей,лечения лечения лечения лечения чел. 12 контрольная группа 9,11,5 6,40,4 76,52,7 55,13,4 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Лекарственный препарат для парентерального применения, содержащий в качестве активного вещества 1-дезокси-1-N-[метил-(2 акридон-9-он-10-ил-ацетат)]-аммоний-Д-глюцитол, в качестве растворителя - воду для инъекций, отличающийся тем, что он дополнительно содержит в качестве стабилизатора - N ИЛ-10, пкг/мл метилглюкамин, при следующем соотношении компонентов, мас.%: 1-Дезокси-1-N-[метил(2-акридон-9-он-10-илацетат)]-аммоний-Д-глюцитол 8,5-25,0N-Метилглюкамин 0,05-1,00 Вода для инъекций До 100