Способы подавления миграции сосудистых гладкомышечных клеток

1 Миграция клеток играет важную роль в заживлении ран, воспалении, респираторном дистресс-синдроме взрослых и распространении злокачественного процесса (Savani et al., J. Clin.al., Cell: 79, 1157-1164, 1994). Миграция сосудистых гладкомышечных клеток (ГМК) из медии в интиму играет главную роль в образовании неоинтимы, ведущей к патогенезу сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, повторный стеноз после ЧТКА и атеросклерозу венозного шунта (Jackson et al., Arteriosclerosis andMadri, Am. J. Pathol. 137: 7-12, 1990). Было обнаружено, что применение антител к факторам роста, стимулирующим миграцию гладкомышечных клеток, или пептидов, которые блокируют миграцию клеток, опосредованную интегрином, подавляет образование неоинтимы в экспериментальных моделях повреждения сосудов (Ferns et al., Science 253: 1129-1132, 1991.,Choi et al., J. Vasc. Surg. 19: 125-135, 1994). Было показано, что повторный стеноз сосудов после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (ЧТКА) является реакцией ткани, характеризуемой ранней и поздней фазой. В раннюю фазу, происходящую в течение часов и дней после ЧТКА, основную роль могут играть тромбоз и/или сосудистые спазмы. Оказывается, что в позднюю фазу преобладает миграция, пролиферация ГМК и перестройка сосудов. При этой патологии возросшее накопление ГМК путем миграции из медии в интиму играет существенную роль в патогенезе заболевания. Избыточная пролиферация и миграция сосудистых гладкомышечных клеток может быть первичным механизмом повторной окклюзии коронарных артерий после ЧТКА,атерэктомии, лазерной ангиопластики и аортокоронарного шунтирования. Это описано в работе Пролиферация в интиме гладкомышечных клеток как объяснение рецидивирующего стеноза коронарных артерий после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики",Austin et al., Journal of the American College ofCardiology 8: 369-375 (Aug. 1985). Повторный стеноз сосудов остается главным отдаленным осложнением после хирургического вмешательства на блокированных артериях с помощью чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (ЧТКА), атерэктомии, лазерной ангиопластики и аортокоронарного шунтирования. Приблизительно у 35% больных, которые подвергаются ЧТКА, повторная окклюзия происходит в пределах от трех до шести месяцев после процедуры. Современные стратегии лечения повторного стеноза сосудов включают механическое вмешательство с помощью устройств, таких как стенты, или фармакологических терапевтических средств, вклю 000190 2 чающих гепарин, низкомолекулярный гепарин,кумарин, аспирин, рыбий жир, антагонисты кальция, стероиды и простациклин. Эти стратегии не смогли снизить частоту повторной окклюзии и были неэффективны в лечении и профилактике повторного стеноза сосудов. Это описано в работе "Профилактика повторного стеноза после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики: поиск "волшебной пули", Hermans et al., American Heart Journal 122:171-187 (July 1991). В патогенезе повторного стеноза избыточная пролиферация и миграция клеток происходит в результате влияния факторов роста, вырабатываемых клеточными компонентами в крови и поврежденной стенкой артериального сосуда,которые опосредуют пролиферацию гладкомышечных клеток при повторном стенозе сосудов. Средства, которые ингибируют миграцию гладкомышечных клеток, могут применяться в лечении и профилактике повторного стеноза. Настоящее изобретение предлагает применение соединений в качестве ингибиторов миграции гладкомышечных клеток. Изобретение относится к способу подавления миграции гладкомышечных клеток у человека или другого млекопитающего, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективной дозы соединения формулы в которой R1 и R3 представляют собой независимо водород, -СН 3,или,в которой Аr представляет собой необязательно замещенный фенил;R2 представляет собой пирролидино, гексаметиленимино или пиперидино; и их фармацевтически приемлемые соли и сольваты. Настоящее изобретение относится к изобретению, заключающемуся в том, что определенная группа соединений формулы I могут применяться для подавления миграции гладкомышечных клеток сосудов. Способы лечения,охватываемые настоящим изобретением, осуществляются с помощью введения человеку или другому нуждающемуся в лечении млекопитающему дозы соединения формулы I и II, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, которая эффективна для подавления миграции гладкомышечных клеток сосудов. 3 Термин "подавлять" обозначает диапазон понятий, включающий его широко принятое значение, которое включает профилактическое лечение человека против угрожающей миграции гладкомышечных клеток и удержание под контролем и/или лечение существующей миграции гладкомышечных клеток. Как таковой, этот способ включает по необходимости и медицинское терапевтическое, и/или профилактическое лечение. Обычно, соединение смешивают с обычными наполнителями, разбавителями или носителями и прессуют в таблетки или изготавливают в виде эликсиров или растворов для удобного перорального введения или введения внутримышечным или внутривенным путем. Соединения могут вводиться трансдермально и могут быть представлены в виде лекарственных форм длительного высвобождения и тому подобное. Соединения формулы I, применяемые в способах настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии с известными способами, такими как способы, подробно описанные в патентах США 4133814, 4418068 и 4380635,все они включены здесь в качестве ссылки. Обычно, способ начинается с бензо[b]тиофена,имеющего 6-гидроксильную группу и 2-(4 гидроксифенильную) группу. Исходное соединение защищено, алкилировано и лишено защиты для образования соединений формулы I. Примеры получения таких соединений предоставлены в обсужденных выше патентах США. В изобретение включено применение следующих соединений: Замещенный фенил включает фенил, замещенный однократно или дважды C1-С 6 алкилом, C1-C4 алкокси, гидрокси, нитро, хлором,фтором или три(хлор или фтор)метилом. Соединения, применяемые в способах настоящего изобретения, образуют фармацевтически приемлемые кислотно- и щелочноаддитивные соли с широким разнообразием органических и неорганических кислот и оснований и включают физиологически приемлемые соли, которые часто применяются в фармацевтической химии. Такие соли также являются частью настоящего изобретения. Типичные не 000190 4 органические кислоты, используемые для образования таких солей, включают хлористоводородную, бромистоводородную, иодистоводородную, азотную, серную, фосфорную, гипофосфорную и подобные им кислоты. Могут также использоваться соли, полученные из органических кислот, таких как алифатические моно и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые и гидроксиалкандиоевые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты. Такие фармацевтически приемлемые соли, таким образом, включают ацетат,фенилацетат, трифторацетат, акрилат, аскорбат,бензоат, хлорбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат,о-ацетоксибензоат, нафталин-2-бензоат, бромид,изобутират, фенилбутират, (-гидроксибутират,бутин-1,4-диоат, гексин-1,4-диоат, капрат, каптрилат, хлорид, циннамат, цитрат, формат, фумарат, гликоллат, гептаноат, гиппурат, лактат,малат, малеат, гидроксималеат, малонат, манделат, мезилат, никотинат, изоникотинат, нитрат,оксалат, фталат, терафталат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрогенфосфат, метафосфат, пирофосфат, пропиолат, пропионат, фенилпропионат, салицилат, себацинат, сукцинат, суберат, сульфат, бисульфат, пиросульфат, сульфит,бисульфит,сульфонат,бензолсульфонат,п-бромфенилсульфонат, хлорбензолсульфонат,этансульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, метансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, п-толуолсульфонат, ксиленсульфонат, тартрат и им подобные. Предпочтительной солью является гидрохлоридная соль. Фармакологически приемлемые кислотноаддитивные соли обычно получаются путем взаимодействия соединения формулы I с эквимолярным или избыточным количеством кислоты. Реагенты в целом объединяются в растворителе, подходящем для всех реагентов, таком как простой диэтиловый эфир или бензол. Соль обычно выпадает в осадок из раствора в пределах приблизительно от одного часа до 10 дней и может быть выделена с помощью фильтрации или растворитель может быть удален с помощью обычных средств. Основания, обычно используемые для образования солей, включают гидроокись аммония и щелочи и гидроокиси, карбонаты и бикарбонаты щелочно-земельных металлов, а также алифатические и ароматические амины, алифатические диамины и гидроксиалкиламины. Основания, особенно пригодные при получении аддитивных солей, включают гидроокись аммония, карбонат калия, бикарбонат натрия, гидроокись кальция, метиламин, диэтиламин, этилендиамин, циклогексиламин и этаноламин. Фармакологически приемлемые соли обычно имеют улучшенные характеристики растворимости в сравнении с соединением, из которого они получены, и таким образом, часто 5 более пригодны для приготовления композиций в виде жидкостей или эмульсий. Фармакологические композиции могут быть получены с помощью процедур, известных в предшествующем уровне техники. Например,соединения могут быть составлены с обычными наполнителями, разбавителями или носителями и образованы в таблетки, капсулы, суспензии,порошки и им подобные. Примеры наполнителей, разбавителей и носителей, которые пригодны для таких композиций, включают следующие наполнители и придающие объем материалы, такие как крахмал, сахара, маннитол и кремниевые производные; связывающие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажняющие вещества, такие как глицерин; разрыхлители,такие как агар-агар, карбонат кальция и бикарбонат натрия; вещества для задержки растворения, такие как парафин; ускорители резорбции,такие как производные четвертичного аммония; поверхностно-активные вещества, такие как цетиловый спирт, глицеринмоностеарат; адсорбционные носители, такие как каолин и бентонит; и смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния и твердые полиэтиленгликоли. Соединения могут также составляться в виде эликсиров или растворов для удобного перорального применения или в виде растворов,подходящих для парентерального введения, например, путем внутримышечного, подкожного или внутривенного введения. Кроме того, соединения хорошо подходят для составления композиций в виде лекарственных форм пролонгированного высвобождения и им подобных. Композиции могут быть составлены таким образом, чтобы они высвобождали активный ингредиент только или предпочтительно в определенной части кишечного тракта, возможно, в течение определенного периода времени. Покрытия, оболочки и защитные матрицы могут быть изготовлены, например, из полимерных веществ или восков. Конкретная доза соединения формулы I,требуемая для подавления миграции гладкомышечных клеток в соответствии с этим изобретением, будет зависеть от тяжести состояния, пути введения и связанных факторов и будет определяться решением наблюдающего врача. В целом, приемлемые и эффективные ежедневные дозы будут от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг/день, более типично, от приблизительно 50 до приблизительно 200 мг/день. Такие дозы будут вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении, от одного до приблизительно трех раз каждый день или при необходимости более для эффективного подавления частой миграции гладкомышечных клеток. Местная доставка подавляющих количеств активного соединения для лечения миграции 6 гладкомышечных клеток сосудов или повторного стеноза может осуществляться с помощью множества методик для введения соединения в пораженный участок или около него. Примеры методик местного применения не предназначены для ограничения, а только для иллюстрации имеющихся методик. Примеры включают катетеры для доставки к очагу поражения, носители к определенному участку, имплантаты, прямую инъекцию или прямые аппликации. Доставка к очагу поражения с помощью катетера позволяет производить введение фармацевтического средства прямо на участок поражения. Примеры доставки к очагу поражения с использованием баллонного катетера описаны в патенте ЕРО 383 492 А 2 и патенте США 4,636,195 (Wolinsky, 13 января 1987 г.). Доставка к очагу поражения с помощью имплантата описывает введение в очаг поражения хирургическим путем матрицы, которая содержит фармацевтическое средство. Имплантированная матрица высвобождает фармакологическое средство с помощью диффузии, химической реакции или растворяющих активаторов.Lange, Science 249: 1527-1533 (сентябрь 1990 г.). Примером доставки к очагу поражения с помощью имплантата является применение стента. Стенты предназначены для механического предотвращения опадания стенок и повторной окклюзии коронарных артерий. Включение фармацевтического средства в стент обеспечивает доставку препарата непосредственно в пораженный участок. Доставка к очагу поражения с помощью этого способа описана в работе Kohn, Pharmaceutical Technology (октябрь 1990 г.). Другим примером является система доставки, в которой полимер, который содержит фармацевтическое средство, в жидкой форме вводится в виде инъекции в очаг поражения. Затем полимер отверждается для образования имплантата in situ. Этот способ описан в патенте РСТ WO 90/03768 (Donn, 19 апреля 1990 г.). Другим примером является доставка фармацевтического средства с помощью полимерного внутрипросветного плотного заполнения. В этом способе используется катетер для нанесения полимерного имплантата на внутреннюю поверхность просвета. Таким образом, фармацевтическое средство, включенное в биодеградируемый полимерный имплантат, высвобождается в участке хирургического вмешательства. Этот способ описан в патенте РСТ WO 90/01969(Schindler, 23 августа 1989 г.). Последним примером доставки в очаг поражения с помощью имплантата является доставка с помощью непосредственной инъекции пузырьков или микрочастиц в пораженный участок. Эти микрочастицы могут быть составлены из веществ, таких как белки, липиды, углеводы или синтетические полимеры. Эти микрочасти 7 цы имеют фармацевтическое средство в виде пропитки всей микрочастицы или в виде покрытия вокруг микрочастицы. Системы доставки,включающие микрочастицы, описаны в работе(1981). Доставка в очаг поражения с помощью прицельных носителей описывает прикрепление фармацевтического средства к носителю, который направит препарат к очагу поражения. Примеры этого способа доставки включают применение носителей, таких как белковый лиганд или моноклональное антитело. Lange, Science 249: 1527-1533 (сентябрь 1990 г.). Доставка в очаг поражения с помощью прямого нанесения включает использование местного применения. Примером доставки в очаг поражения с помощью прямого нанесения является нанесение фармацевтического средства непосредственно на аортокоронарный шунт во время хирургического вмешательства. Обычно предпочтительно вводить соединение формулы I в форме кислотно-аддитивной соли, как принято при введении фармацевтических препаратов, имеющих основную группу,такую как пиперидино кольцо. Также предпочтительно пожилым людям (например, женщинам в постменопаузе) вводить такое соединение пероральным путем. Для таких целей имеются следующие лекарственные формы для перорального введения. Лекарственные формы В следующих ниже композициях "активный ингредиент" обозначает соединение формулы I. Лекарственная форма 1: Желатиновые капсулы. Твердые желатиновые капсулы получают с использованием следующих компонентов: Ингредиент Активный ингредиент 8 Лекарственная форма 2: Капсулы ралоксифена. Ингредиент Количество, мг/капсулу Ралоксифен 1 Крахмал, NF 112 Крахмальный текучий 225,3 порошок Силиконовая жидкость 1,7 350 сантистокс Композиция 3: Капсулы ралоксифена Ингредиент Ралоксифен Крахмал, NF Крахмальный текучий порошок Силиконовая жидкость 350 сантистокс Композиция 4: Капсулы ралоксифена Ингредиент Ралоксифен Крахмал, NF Крахмальный текучий порошок Силиконовая жидкость 350 сантистокс Ингредиенты смешивают, пропускают через сетчатый фильтр 45 (США) и высыпают в твердые желатиновые капсулы. Примеры особых капсулированных лекарственных форм соединения формулы 1, в которых соединение представляет собой ралоксифен, включают лекарственные формы, представленные ниже: Представленные выше особые композиции могут изменяться в соответствии с предоставленными обоснованными разновидностями. Таблетированную лекарственную форму получают с использованием представленных ниже ингредиентов: Лекарственная форма 6: Таблетки Ингредиент Количество,мг/таблетку Активный ингредиент 0,1-1000 Целлюлоза, микрокристаллическая 0-650 Диоксид кремния, мел 0-650 кодисперсный Стеариновая кислота 0-15 Компоненты смешивают и прессуют для образования таблеток. Альтернативно, таблетки, каждая из которых содержит 0,1-1000 мг активного ингредиента, изготавливают следующим образом: Лекарственная форма 7: Таблетки Ингредиент Активный ингредиент Крахмал Целлюлоза, микрокристаллическая Поливинилпирролидон (в виде 10%-ного раствора в воде) Натрийкарбоксиметилцеллюлоза Магний стеарат Тальк Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сетчатый фильтр 45(США) и тщательно смешивают. Раствор поливинилпирролидона смешивают с полученными порошками, которые затем пропускают через сетчатый фильтр 14 (США). Полученные таким образом гранулы высушивают при 50-60 С и пропускают через сетчатый фильтр 18(США). Растворимый крахмал, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сетчатый фильтр 60 (США), затем добавляют в гранулы, которые, после смешивания, прессуются на таблетировочной машине для получения таблеток. Суспензии, каждая из которых содержит 0,1-1000 мг лекарственного препарата на дозу 5 мл, изготавливают следующим образом. Лекарственная форма 8: Суспензии Ингредиент Активный ингредиент Натрийкарбоксиметилцеллюлоза Сироп 1,25 Раствор бензойной кисло 0,10 мл ты Ароматизатор сколько нужно Краситель сколько нужно Очищенная вода до 5 мл Лекарственный препарат пропускают через сетчатый фильтр 45 (США) и смешивают с натрийкарбоксиметилцеллюлозой и сиропом для образования однородной пасты. Раствор бензойной кислоты, ароматизатор и краситель разводят некоторым количеством воды и добавляют при перемешивании. Затем для получения требуемого объема добавляют достаточное количество воды. 10 Методики испытания. Соединения изобретения способны подавлять миграцию гладкомышечных клеток сосудов, что доказывается следующим. Гладкомышечные клетки свиной аорты. Свиную аорту получали у свежезабитых кастрированных самцов свиней в местной скотобойне. Гладкомышечные клетки готовили с использованием процедуры, аналогичной процедуре, описанной ранее (Bonin et al., 1989). Вкратце, аорту продольно рассекали и эндотелий удаляли с помощью аккуратного соскабливания с внутрипросветной поверхности с помощью лезвия для бритья. Затем аорту несколько раз промывали в стерильной питательной среде,состоящей из модифицированной среды Игла Дюбекко (МСИД), 10%-ной бычьей плодной сыворотки, L-глютамина (2 ммоль), пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Затем от адвентиции отслаивают полоски гладкомышечных клеток медии и разрезают на кусочки размером 1-2 мм. Эксплантаты помещали в 24-ячеечные культуральные планшеты, содержащие указанную выше питательную среду. Рост клеток из эксплантатов наблюдали в течение 5-7 дней. Через 10-14 дней эксплантаты удаляли, клетки трипсинизировали и пересевали в колбы T75, содержащие 15 мл питательной среды. Человеческие гладкомышечные клетки. Клетки человеческих коронарных артерий и аорты приобретали в Clonetics Corporation(San Diego, CA). Оба типа клеток культивировали в питательной среде, как описано для свиных гладкомышечных клеток. Количественное определение миграции гладкомышечных клеток. Оценку направленной миграции гладкомышечных клеток, полученных из артерий свиньи и человека, по направлению к градиенту тромбоцитарного фактора роста (ТФР) проводили с помощью модифицированной камерыBoyden с использованием 96-трансячеечной системы и поликарбонатных фильтров с размером пор 8 микрон (Neuro Probe, Inc., Cabin John,NJ). Гладкомышечные клетки, выращенные в колбах Т 75, переносили в лишенную красного фенола модифицированную среду Игла/F12(МСИД/F-12), содержащую 2%-ную бычью плодную сыворотку, L-глютамин (2 ммоль),пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Через 24 ч клетки трипсинизировали с использованием лишенного красного фенола трипсина/ЭДТК (Gibco, BRL). Клетки (2,5 х 10-6 клеток/мл) суспензировали в лишенной красного фенола среде МСИД/F12, содержащей 1%ную плазму с низким содержанием тромбоцитов и различными концентрациями соединений формулы I. 100 мкл клеточной суспензии добавляли в верхние ячейки модифицированной камеры Boyden. Ячейки нижней камеры заполняли 43 мкл МСИД/F-12, содержащей 1%-ную плаз 11 му с низким содержанием тромбоцитов, 5 нг/мл ТФР и различную концентрацию соединений. Камеры инкубировали при 37 С в 5% CO2 в течение 5 ч. Миграционную мембрану удаляли из камеры и клетки с верхней стороны мембраны удаляли хлопковым тампоном. Клетки, мигрировавшие к нижней стороне мембраны, фиксировали в метаноле и окрашивали красящим раствором Diff-Quick (Baxter). Количественную оценку клеточной миграции проводили или спектрофотометрически с использованием считывающего устройства с титрационного микропланшета (ThermoMax, Molecular Dynamics,Inc.), или с помощью подсчета клеток в высокоэнергетическом поле 40 Х (ВЭП) с использованием перевернутого микроскопа (Nikon, Inc.). Для экспериментов с применением преинкубации клеток с соединением препарат помещали в среду для предварительной обработки в указанных концентрациях, в отдельные колбы, и инкубировали в течение 18 ч. Условия количественного определения клеток в этих экспериментах с предварительной обработкой были точно такими же как условия, использовавшиеся в экспериментах, описанных для оценки острого воздействия препарата. Таблица 1 Стимуляция миграции свиных гладкомышечных клеток (ГМК) тромбоцитарным фактором роста (ТФР) ТФР, нг/мл Миграция ГМК(оптическая плотность 650 нм) 0,04 0,016 0,008 0,80 0,009 0,003 1,50 0,013 0,007 3,00 0,028 0,008 6,00 0,058 0,010 12,0 0,052 0,007 25,0 0,047 0,009 Таблица 2 Подавление вызванной ТФР миграции ГМК свиной аорты с помощью Соединения А и миграции ГМК, вызванной -эстрадиолом 12 Соединение А имеет формулу I, в которой R1 и R3 представляют собой водород, а R2 представляет собой пирролидино. Указанная выше активность показывает,что соединения изобретения обладают способностью подавлять миграцию сосудистых гладкомышечных клеток и ее воздействия. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ подавления миграции сосудистых гладкомышечных клеток, включающий введение человеку или другому млекопитающему, нуждающемуся в лечении, фармацевтически эффективного количества соединения,имеющего формулу,где Аr представляет собой фенил или фенил,моно или дизамещенный C1-C6 алкилом, С 1-С 4 алкокси, гидрокси, нитро, хлором, фтором или три(хлор или фтор)метилом;R2 представляет собой пирролидино, гексаметиленимино или пиперидино; и их фармацевтически приемлемых солей и сольватов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой его гидрохлоридную соль. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой или его гидрохлоридную соль. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное введение производится для подавления атеросклероза, повторного стеноза, воспаления или распространения злокачественного процесса.