Способ получения экстракта клюквы, обогащенного проантоцианидинами

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА КЛЮКВЫ, ОБОГАЩЕННОГО ПРОАНТОЦИАНИДИНАМИ Настоящее изобретение относится к способу получения экстракта клюквы, содержащего высокие количества проантоцианидинов, включающему применение в качестве исходных ингредиентов размятой клюквы или уже предварительно очищенных экстрактов клюквы. 017501 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к экстрактам, содержащим высокие количества проантоцианидинов, и способам их получения, включающим применение в качестве исходных ингредиентов размятых фруктов, растений или уже предварительно очищенных экстрактов, обогащенных проантоцианидинами. Предшествующий уровень техники Проантоцианидины, а именно конденсированные танины, повсеместно распространены и находятся среди наиболее изобильных природных производных фенола. Проантоцианидины являются смесью олигомеров и полимеров, составленных из флаван-3-оловых повторяющихся единиц, связанных посредством С 4-С 8 или С 4-С 6 связи. Флаван-3-оловые единицы могут также быть связаны дополнительной двойной связью между С 2-О 7 (А-типа). Размеры проантоцианидинов определяются степенью полимеризации(СП). Наиболее распространенными флаван-3-олами, содержащимися в проантоцианидинах, являются афзалехин, эпиафзалехин, катехин, эпикатехин, галлокатехин, эпигаллокатехин. Проантоцианидинами,построенными исключительно из катехина и эпикатехина, являются так называемые процианидины, тогда как теми, что содержат афзалехин и эпиафзалехин или галлокатехин и эпигаллокатехин, являются пропеларгонин и продельфинидин. Процианидины наиболее часто встречаются в природе. Биологические активности проантоцианидинов, описанные в литературе, включают противоопухолевую, препятствующую старению, антиоксидантную, антиаллергическую, антибактериальную активность, особенно в мочеполовом тракте, усиление роста волос и т.д. (Bart Schwitters/Jack Masquelier "21-stcentury Biophylaxis substance OPC, Fragrance Journal, 50-135 (1997); Tomoya Takajashi et al., Journal of Investigative dermatology, 112, 310-316 (1999. Известны многие способы получения экстракта, обогащенного проантоцианидинами из растений или фруктов различного происхождения, таких как клюква (Vaccinium macrocarpon), виноградные косточки, чайные листья, арахис, сосновая кора и т.д. Некоторые из этих способов охватывают стадии экстракции, выполненные с водно-спиртовыми растворителями в присутствии минеральных кислот, такие как, например, способ в CN 1454896, или они охватывают применение сверхкритических растворителей, таких как СО 2, как описано в CN 174923, или они требуют применения ультрафильтрационной мембраны, или включают фильтрацию с обратным осмосом, как в способе, описанном в JP 63267774. Другие способы требуют комбинации множества стадий экстракции с применением нескольких типов органических растворителей либо по отдельности, либо вместе с каждым другим, связанными по крайней мере с одной стадией, где раствор, включающий экстракты, абсорбируют на макроретикулярной полимерной смоле, абсорбированную жидкость далее элюируют, концентрируют и распыляют, как раскрыто в способе, описанном в US 6608102 и US 6440471. В соответствии с другими способами возможно получить экстракты, включающие очень высокие количества проантоцианидинов. Например, возможно получить экстракты с общим содержанием проантоцианидинов в диапазоне 80-90%, с олигомерными проантоцианидинами (ОПЦ) в количествах от 23 до 45%, в способе, раскрытом в СА 2539724, включающем обработку растения, такого как кора сосны или его экстракта или сока, по крайней мере двумя типами абсорбирующей смолы, отличающимися по крайней мере одной из следующих характеристик, а именно типом материала, радиусом пор, удельной площадью поверхности и диапазоном распределения молекулярной массы; или возможно получить экстракты, имеющие общее содержание проантоцианидинов от 67 до 85% и содержание ОПЦ от 12,5 до 51%, со способом, раскрытым в ЕР 1602653, включающим воздействие на выжатый сок растения комбинацией обработки солью или алкалоидом и обработку синтетической абсорбирующей смолой. Не противопоставляя множеству способов предшествующего уровня техники, позволяющих получить экстракт, имеющий высокий титр проантоцианидинов, коммерчески доступные экстракты имеют титр проантоцианидинов, не превышающий 7%. Таким образом, это означает, что способы предшествующего уровня техники для получения экстрактов, имеющих высокий титр проантоцианидинов, нелегко реализовать в промышленном масштабе по многим причинам, таким как, например, применение токсичных экстрагирующих растворителей или экстремальная температура экстракции (около 100 С) в течение длительного периода времени (около 24 ч), применение приборов под давлением, таких как в случае суперкритических жидкостей, или применение ультрафильтрующей мембраны. Таким образом, существует необходимость способа для получения экстрактов, имеющих высокие титры проантоцианидинов, не обладающего недостатками способов предшествующего уровня техники и таким образом, способного легко реализоваться в промышленном масштабе.-1 017501 Краткое описание изобретения Заявитель нашел способ, легко реализуемый в промышленном масштабе, позволяющий получить экстракт, имеющий высокое содержание проантоцианидинов. Данный способ позволяет получить экстракт, обогащенный проантоцианидинами, начиная от уже предварительно очищенных экстрактов или из фруктов или растений, обогащенных проантоцианидинами, и включает следующие стадии:(a) экстракция при комнатной температуре размятых фруктов или растений, включающих высокие количества проантоцианидинов, или уже предварительно очищенного экстракта, обогащенного проантоцианидинами, в водном растворе этанола, имеющем концентрацию этанола от 50 до 80 об.%;(b) фильтрация смеси, полученной на стадии (а);(c) концентрирование профильтрованного раствора, полученного на стадии (b), под вакуумом;(d) дополнительное хранение концентрированного продукта, полученного на стадии (с), где продукт дополнительно предварительно разводят деминерализованной водой, в течение времени от 5 до 24 ч;(e) разбавление деминерализованной водой концентрированного хранящегося продукта, полученного на стадии (с) или на стадии (d), в случае чего данное разведение водой на стадии (d) не проводят;(f) фильтрация смеси, полученной на стадии (е);(g) нанесение раствора на макроретикулярную алифатическую перекрестно-сшитую полимерную смолу;(h) промывание указанной смолы водой;(i) элюция полимерной макроретикулярной алифатической перекрестно-сшитой смолы, полученной на стадии (h), водным раствором этанола, содержащим от 50 до 80 об.% этанола;(j) концентрирование элюированного раствора, полученного на предыдущей стадии, под вакуумом;(k) высушивание концентрированного продукта, полученного на стадии (j), под вакуумом, или посредством высушивания при распылении. Данный способ позволяет получить экстракты, содержащие более 10% проантоцианидинов, предпочтительно более 15% и даже более предпочтительно более 20% путем применения мягких условий экстракции в водном растворе этанола, а также только одной абсорбции на макроретикулярной полимерной смоле с применением стадии десорбции с нетоксичными растворителями, такими как водный раствор этанола. Описание графических материалов На фиг. 1 приведена ВЭЖХ хроматограмма. На фиг. 2 - время удержания и площадь, соответствующая концентрациям, выраженным в мг/мл для каждого пика, и наконец, общая концентрация анализируемого образца, как подготовлено и описано в примере 1. Подробное описание изобретения Фрукты или растения, обогащенные проантоцианидинами, для целей настоящего изобретения, означают, например, клюкву, яблоки, ежевику, виноград, сливу, гранат, малину, землянику, фасоль, чечевицу, чай. Предпочтительно в способе в соответствии с настоящим изобретением в качестве исходного материала применяют клюкву (Vaccinium macrocarpon). На стадии а) экстрагирующий растворитель предпочтительно имеет содержание этанола от 60 до 75%, более предпочтительно 70 об.%. Время экстракции предпочтительно занимает от 10 мин до 2 ч, более предпочтительно 30 мин. Способ в соответствии с настоящим изобретением, где исходным материалом на стадии (а) являются размятые фрукты или растения, включает дальнейшую стадию, где указанные размятые фрукты или растения, полученные на стадии экстракции (а) с водным раствором этанола, прессуют перед проведением стадии фильтрации (b). Стадия (d) является дополнительной стадией, и в некоторых случаях, когда эта стадия выполняется,время хранения предпочтительно занимает от 8 до 20 ч, более предпочтительно 15 ч. Отмывание деминерализованной водой смолы, содержащей абсорбированный раствор, а именно стадию (h) способа настоящего изобретения, проводят с целью удаления сахаров и фенольной кислоты. В случае, когда фрукты также обогащены антоцианинами, способ может включать дальнейшую стадию промывания, после стадии промывания водой, для удаления антоцианинов со смолы, водным раствором метанола, с содержанием метанола 60% (об./об.). На стадии (i) концентрация элюирующего растворителя, а именно водного раствора этанола, составляет от 60 до 75 об.% этанола, более предпочтительно 70 об.%. Макроретикулярная алифатическая перекрестно-сшитая смола, используемая на указанной стадии, может быть выбрана из уже известных и коммерчески доступных. Стадию (j) предпочтительно проводят под вакуумом при температурах, включающих от 35 до 45 С,более предпочтительно 40 С. Заявитель также оптимизировал способ анализа для определения с помощью ВЭЖХ титра проантоцианидинов в конечном экстракте.-2 017501 Данный способ включает две отдельные стадии. 1. Очистка экстракта, предназначенного для анализа. 2. Анализ. Стадия 1. Очистка экстракта, предназначенного для анализа. Подготовка колонки с Сефадексом LH20. 10 г Сефадекса LH20 замачивали в деминерализованной воде (примерно 50 мл) в течение по крайней мере 3 ч, а затем вносили в стеклянную колонку С 16 (Pharmacia Biotech). Смолу промывали примерно 130 мл деминерализованной воды. Подготовка раствора для загрузки на Сефадекс LH20. Чтобы загрузка на колонку соединений, абсорбирующих при =280 нм, была всегда примерно одинаковой, проводили спектрофотометрический анализ. Экстракт раствора разбавляли в 20% метаноле до получения поглощения в диапазоне от 32 до 48(или после разведения 1/50 поглощение=0,820%) при =280 нм. Очистка Сефадекса LH20. Раствор, разбавленный 20% метанолом, с поглощением в вышеуказанном диапазоне центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин. 20 мл этого декантированного раствора наносили на вышеупомянутую смолу и проводили три элюции: элюция 1: 80 мл 20% метанола; элюция 2: 160 мл 60% метанола; элюция 3: 240 мл 100% метанола. Эти элюции проводили со скоростью потока примерно 2 мл/мин. Элюированный раствор, полученный при элюциях 1 и 2, отбрасывали. Первые 20-30 мл раствора, полученного при элюции 3, отбрасывали, затем собирали оставшийся элюируемый раствор. Растворитель удаляли испарением из элюированного раствора и высушивали полученный осадок. Сухой экстракт разводили смесью ацетон/вода/уксусная кислота, имеющей следующее объемное отношение 79:29,5:0,5 для анализа на ВЭЖХ, до получения конечного объема от 1 до 1,7 мл, этот объем обозначали как V1. 2. ВЭЖХ анализ. Калибровочная таблица. Стандартом, используемым для анализов проантоцианидинов, является Процианидин В 2 (Эпикатехин 48). Готовили следующие растворы, как описано в следующей таблице. Подсчет концентрации процианидина В 2.CB2=(m1000)/V где CB2 является концентрацией процианидина В 2, мг/л;-3 017501 Скорость потока элюции: 1 мл/мин. Диапазон спектра: 200-700 нм. Длина волны: =280 нм. Вводимый объем = 5 мкл. Анализ стандартного раствора. Вышеупомянутые стандартные растворы анализировали с помощью ВЭЖХ. После анализа калибровочную таблицу вносили в программное обеспечение ВЭЖХ (площадь как функция концентрации процианидина В 2). Анализ образца. Образец, разбавленный в ацетоне/воде/уксусной кислоте (70:29,5:0,5), анализировали с помощью ВЭЖХ. Анализ хроматограммы. Проантоцианидины из ягод клюквы Vaccinium macrocarpon, полученные после очистки и анализа ВЭЖХ и идентифицированные посредством масс-спектрометрии, являются пиками со временем удержания от 13,5 до 50 мин. Метод интегрирования был взят из "Fractionation of polymeric from low bush blueberry and quantification of procyanidins in selected foods; with optimized normal phase HPLC. MS fluorescent detection method",Gu L. Kelm et al., J. Agr. Food Chem. 2002, 50, 4852-4860. На фигурах имеется линия плоского основания от начала пробега до конца. Перпендикулярная линия нарисована из нижней точки промежутка между смежными пиками олигомеров к линии плоского основания. Площадь, включающую кривые пиков двух смежных перпендикулярных линий и плоского основания, интегрировали. Площадь должна быть включена в верхнюю калибровочную таблицу. Анализ полученных данных. Программное обеспечение ВЭЖХ позволяет подсчитать концентрацию проантоцианидинов (мг/л) в анализируемом растворе. Калибровочная таблица для процианидина В 2 позволяет получать концентрацию проантоцианидинов, соответствующую площади каждого пика. Добавляли концентрацию каждого пика проантоцианидинов, результаты соответствовали концентрации проантоцианидинов в анализируемом растворе (CLUE, мг/мл). А именно, концентрацию проантоцианидинов С (мг/л) в растворе, нанесенном на Сефадекс, выраженную в виде эквивалента проантоцианидина В 2, можно получить из следующего уравнения:C=(CLUEV1)/20,где V1 - объем анализируемого раствора (1-1,7 мл). Авторы приводят здесь для иллюстративных, но не ограничивающих целей, примеры получения,начиная от размятой клюквы (пример 1) и от уже предварительно очищенных экстрактов (пример 2). Пример 1. Получение экстракта, обогащенного проантоцианидинами, из размятой клюквы. 50 кг размятой клюквы (Vaccinium macrocarpon), 100 л водного раствора этанола 70% (О/О) перемешивали в течение 30 мин, затем размятые фрукты прессовали и цельную смесь фильтровали через сито 25 мкм, получая, таким образом, прозрачный этанольный экстракт весом около 120 кг. Этот этанольный экстракт концентрировали под вакуумом при температуре 40 С, получая, таким образом, осадок весом около 10 кг. Его затем разводили 10 л деминерализованной воды, получая, таким образом, разбавленный экстракт весом около 20 кг, который хранили при комнатной температуре в течение 15 ч. Разбавленный экстракт затем фильтровали через сито 10 мкм. 25 л коммерческой макроретикулярной алифатической перекрестно-сшитой смолы отмывали 75 л деминерализованной воды, затем загружали в стеклянную колонку и добавляли 20 кг вышеупомянутого профильтрованного водного раствора. Смолу с абсорбированным экстрактом промывали 100 л деминерализованной воды, а затем элюировали 100 л этанола 70% О/О. Элюированный раствор затем концентрировали под вакуумом при 40 С, таким образом, получая примерно 20 кг концентрированного экстракта, который окончательно распыляют, таким образом, получая порошок. Экстракт анализировали с помощью вышеуказанного метода анализа, на фиг. 1 и 2 приведены хроматограммы ВЭЖХ, время удержания площади каждого пика и соответствующая концентрация, выраженная в мг/мл для каждого пика, и окончательно общая концентрация проантоцианидинов или CLUE,составившаяся 6824,24 мг/л.(41,76/201,5)100=20,73%. Пример 2. Получение экстракта из предварительно очищенных экстрактов Экстрактом клюквы, использованным для этих испытаний, был EXOCYAN CRAN 10, произведенный Tournay technologies, серияL7015, который анализировали раскрытым выше методом. Содержание проантоцианидинов 7%. 607,7 мг экстракта клюквы обрабатывали 100 мл 70% этанолом (О/О) в течение 30 мин. Раствор фильтровали, а затем концентрировали под вакуумом с применением модальностей примера 1 и хранили в течение ночи. Концентрированный раствор разбавляли 10 мл деминерализованной воды, а затем фильтровали. Раствор загружали на коммерческую макроретикулярную алифатическую перекрестно-сшитую смолу, затем промывали водой (200 мл) и элюировали 70% этанолом, полученный раствор концентрировали под вакуумом. Полученный концентрат высушивали и анализировали конечный экстракт (158,2 мг). Содержание проантоцианидинов, оцененное вышеуказанным методом, составило 18,0%. Таким образом, концентрация проантоцианидинов в конечном экстракте была в 2,6 раз выше, чем в исходном экстракте. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения экстракта клюквы, обогащенного проантоцианидинами, из клюквы (Vacciniummacrocarpon) или предварительно очищенных экстрактов клюквы, включающий следующие стадии:(a) обработку измельченной клюквы или предварительно очищенного экстракта клюквы водным раствором этанола, имеющим содержание этанола от 50 до 80 об.%, в течение от 10 мин до 2 ч;(b) фильтрацию смеси, полученной на стадии (а);(c) концентрирование профильтрованного раствора, полученного на стадии (b), под вакуумом;(d) при необходимости хранение концентрированного продукта, полученного на стадии (с), в течение от 5 до 24 ч;(e) разведение деминерализованной водой концентрированного продукта, полученного на стадии(с), или концентрированного продукта, полученного на стадии (d);(f) фильтрацию разведенного продукта, полученного на стадии (е);(g) нанесение раствора со стадии е) на макроретикулярную алифатическую перекрестно-сшитую полимерную смолу;(h) промывание указанной смолы водой;(i) элюцию полимерной макроретикулярной алифатической перекрестно-сшитой смолы, полученной на стадии (h), водным раствором этанола, содержащим от 50 до 80 об.% этанола;(j) концентрирование элюированного раствора, полученного на предыдущей стадии, под вакуумом;(k) высушивание концентрированного продукта, полученного на стадии (j), под вакуумом или посредством высушивания при распылении. 2. Способ по п.1, где указанный водный раствор этанола, применяемый на стадии (а), имеет содержание этанола от 60 до 75 об.%. 3. Способ по п.2, в котором указанный водный раствор этанола имеет содержание этанола 70 об.%. 4. Способ по п.1, в котором обработку этанолом осуществляют в течение 30 мин. 5. Способ по п.1, в котором обработанную водным раствором этанола измельченную клюкву прессуют перед проведением стадии (b). 6. Способ по п.1, в котором время хранения на стадии (d) включает от 8 до 20 ч. 7. Способ по п.6, в котором указанное время хранения составляет 15 ч. 8. Способ по п.1, в котором на стадии (i) используемый водный раствор этанола имеет содержание этанола от 60 до 75 об.%. 9. Способ по п.8, в котором указанный водный раствор этанола на стадии (i) имеет содержание этанола 70 об.%.