Твердая композиция, содержащая споры непатогенных бактерий рода bacillus

006847 Настоящее изобретение относится к твердой композиции, содержащей споры непатогенных бактерий, для применения в областях фармацевтики, ветеринарии или питания, в частности к композиции,содержащей споры бактерий рода Bacillus. Приготовление препарата спор с целью их введения людям или животным является сложным и проблематичным, поскольку ввиду того, что в него вовлечен живой материал, при использовании неподходящих процессов существует риск потери значительной части активного начала. Известны различные твердые композиции на основе спор. Их получают в соответствии с разными методиками, такими как, например, лиофилизация или "распылительная сушка"; аналогично, в области фармации известны жидкие суспензии спор или простые смеси спор с общепринятыми эксципиентами,такие как, например, в WO 99/49877, в которой описаны композиции спор бацилл, продуцирующих молочную кислоту, для снижения холестерина. Один из главных недостатков предшествующего уровня техники представляет собой плохую стабильность получаемых композиций, которая является критическим фактором, не позволяющим осуществлять хранение в течение достаточно продолжительных периодов времени, и которая создает необходимость хранения и консервирования композиции, перед ее использованием, при низких температурах, для того чтобы сохранить свойства спор по возможности неизмененными. Другим недостатком композиций предшествующего уровня техники является низкая концентрация активного начала и, следовательно, спор, которые могут быть введены в настоящую композицию. В продаже имеются жидкие композиции на основе спор, например, суспензия спор Bacillus, которая долгое время продавалась в Италии под товарным знаком "Enterogermina". Хотя она является эффективной и долгое время пользовалась спросом у потребителей, эта суспензия не может содержать очень высокую концентрацию активного начала (более чем 2 миллиарда спор/5 мл). Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить твердую композицию на основе спор непатогенных бактерий, называемых далее просто "спорами", которую просто приготавливать и легко хранить и которая содержит большое количество активного начала и стабильна во времени. Авторами настоящего изобретения обнаружено, что путем адсорбции спор на подходящую матрицу с использованием методики псевдоожиженного слоя можно получить твердую форму спор с очень высокой концентрацией, которую легко обрабатывать в промышленных условиях и которая очень стабильна. В частности, обнаружено, что эта твердая форма, называемая далее "композицией", делает возможным прикрепление к матрице большого количества спор, создавая твердую композицию с высокой концентрацией, причем ее размер частиц и удельная поверхность делают эту композицию особенно подходящей для высвобождения спор in vivo на протяжении всего желудочно-кишечного тракта. Кроме того, обнаружено, что эта композиция имеет превосходные свойства текучести, и, в результате этого, ее можно обрабатывать в промышленных условиях в целях приготовления ее в виде композиций с однократными и многократными дозами без необходимости подвергать ее дальнейшей обработке. Таким образом, согласно одному из его аспектов, данное изобретение относится к композиции спор непатогенных бактерий рода Bacillus, адсорбированных на матрице, изготовленной из по меньшей мере одного не растворимого в воде соединения и производного целлюлозы, которую можно получать посредством методики псевдоожиженного слоя. Более конкретно, данное изобретение относится к композиции спор непатогенных бактерий родаBacillus, которую можно получать способом, при котором жидкую суспензию указанных спор вместе с матрицей, изготовленной из не растворимого в воде адсорбирующего соединения и производного целлюлозы, обрабатывают по методике псевдоожиженного слоя. Согласно настоящему изобретению, выражение "адсорбирующее соединение" означает любое химическое соединение или смесь химических соединений, которое(ую) можно принимать внутрь и которое(ая) имеет свойства адсорбента; предпочтительно это не растворимое в воде адсорбирующее соединение выбрано из группы, состоящей из глин, каолина, карбоната кальция, коллоидных кремнеземов,силиката магния или алюминия и производных целлюлозы и бентонита, причем наиболее преимущественным является каолин. Согласно данному изобретению, выражение "производное целлюлозы" означает любое производное целлюлозы, которое можно принимать внутрь, такое как, например, микрокристаллическая целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и так далее, которые имеются в продаже в широких ассортиментах, причем особенно предпочтительной является микрокристаллическая целлюлоза. Следует понимать, что даже если нет явного указания, все компоненты композиции по данному изобретению таковы, что люди и/или животные могут принимать их внутрь, то есть "нетоксичны". В частности, природу и качество этих компонентов надо выбирать в соответствии с конечным применением данной композиции, и поэтому их тип и чистота должны быть подходящими и совместимыми с конечными применениями композиции; следовательно, для иллюстрации, когда композиция предназначена для фармацевтического лечения, тип и чистота компонентов должны быть приемлемыми с фармацевтической точки зрения и так далее. Выражения "адсорбированные споры", "адсорбция" или "адсорбировать" предназначены для обозначения, согласно настоящему изобретению, удержания спор на поверхности матрицы, с которой ука-1 006847 занные споры высвобождаются в пищеварительном тракте. Споры можно удерживать на матрице посредством любого присоединения, а именно, любого возможного присоединения (химического, биологического, физического и так далее), в зависимости от типа используемой матрицы. Относительные количества двух компонентов, которые составляют матрицу, могут варьировать в широких пределах. Например, соотношение по массе между адсорбирующим соединением и производным целлюлозы может составлять от 90:10 до 10:90, предпочтительно от 70:30 до 30:70, даже еще более предпочтительно от 60:40 до 40:60, причем преимущественно эти два компонента присутствуют в матрице в соотношении приблизительно 50:50 по массе. В любом случае матрица по данному изобретению представляет собой не растворимую в воде смесь, которая инертна по отношению к спорам, причем выражение "инертна по отношению к спорам" предназначено для обозначения того, что она не оказывает отрицательного влияния на споры. Споры, которые можно использовать в настоящем изобретении, предпочтительно представляют собой споры непатогенных бактерий, которые особенно полезны в областях фармацевтики, ветеринарии и/или питания. Композиция по настоящему изобретению может содержать споры одной Bacillus или споры разных смешанных бацилл. Согласно предпочтительному аспекту, композиция по данному изобретению содержит споры Bacillus subtilis или Bacillus clausii. Предпочтительно композиция по данному изобретению содержит споры одного или более чем одного штамма Bacillus clausii (прежним таксономическим названием которой было Bacillus subtilis), депонированных в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM), Институт Пастера, под депозитарными номерами I-273, I-274, I-275 и I-276. Для приготовления композиции используют методику псевдоожиженного слоя, хорошо известную специалистам в данной области техники. Согласно этой методике, содержащую споры водную суспензию, называемую далее "концентрированной суспензией", распыляют на матрицу, получаемую путем смешивания по меньшей мере одного адсорбирующего соединения с производным целлюлозы, при постоянном перемешивании потоком воздуха на протяжении всего процесса в устройстве, оснащенном для этой цели, таком как, например, аппарат для гранулирования в псевдоожиженном слое. Концентрированная суспензия является водной суспензией, которая демонстрирует очень высокую концентрацию спор. Согласно особенно предпочтительному аспекту данного изобретения, концентрированную суспензию получают путем инокуляции одного или более чем одного штамма Bacilli в культуральную среду(например на основе пептонов и минеральных солей), инкубации этой смеси при подходящей температуре в течение 48-72 ч в аэробных условиях, отделения клеток от истощенной среды с дистиллированной водой, центрифугирования и затем пастеризации полученной суспензии. Пример такого препарата дан в экспериментальном разделе. Приготовленная таким образом концентрированная суспензия имеет концентрацию спор Bacillus более чем 10 миллиардов на грамм, обычно от приблизительно 15 до приблизительно 25 миллиардов на грамм или даже больше. В общем, концентрированную суспензию предпочтительно консервируют после замораживания изза ее высокой нестабильности при температуре окружающей среды. В этом конкретном случае концентрированную суспензию следует размораживать перед ее использованием в способе по настоящему изобретению. Альтернативно, концентрированная суспензия может представлять собой приготовленную для немедленного использования суспензию спор, сохраняемую в форме, которая лиофилизирована в воде. Температура потока воздуха, используемого в способе по настоящему изобретению, составляет от температуры окружающей среды до максимальной температуры, которую выдерживают споры; согласно предпочтительному аспекту, способ предпочтительно осуществляют при температуре от 40 до 90 С,преимущественно от 60 до 80 С. Как только распыление и адсорбция на концентрированную матрицу закончены, полученную композицию затем удерживают в суспензии посредством нагретого потока воздуха, пока содержание остаточной воды не достигнет желаемого значения, предпочтительно пока содержание воды не будет составлять менее 3%, преимущественно менее или равное 2%. Продолжительность этого процесса определяется количеством распыляемой концентрированной суспензии, скоростью распыления, а также температурой потока воздуха. Обычно для обработки количеств, составляющих около 30 кг матрицы, для окончания процесса необходимо приблизительно 2 ч. Способ приготовления композиции составляет следующий объект настоящего изобретения. Как указано выше, композиция по данному изобретению может быть получена в высококонцентрированной форме и иметь концентрацию от, например, 3 до 30 миллиардов спор на грамм готовой композиции, например от 5 до 20 миллиардов спор на грамм готовой композиции, преимущественно приблизительно 10 миллиардов спор на грамм, что делает возможным введение совместимых количеств спор в-2 006847 малых объемах. Это важное свойство означает, что эту композицию особенно легко применять и, например, можно вводить в маленькие желатиновые капсулы или саше или включать в состав пищевых продуктов или в другие композиции. При необходимости, эту композицию можно также вводить после того,как она вновь суспендирована в воде или других подходящих жидкостях. Композиция по данному изобретению оказалась стабильной и в то же время сохраняющей свой титр неизменным в течение продолжительного периода времени даже при температурах выше температуры окружающей среды (приблизительно 40 С). Определение титра спор композиции по данному изобретению можно выполнять в соответствии с любой процедурой, например, путем подсчета на традиционных культуральных планшетах. Как указано выше, композиция по данному изобретению имеет большую удельную поверхность благодаря тому, что размер частиц очень мелкий, причем до 90% частиц композиции имеют размер частиц менее или равный 130 микрометров, причем предпочтительно 60% частиц этой композиции имеют размер частиц менее или равный 60 мкм. Кроме того, данная композиция не имеет запаха или вкуса и, таким образом, ее можно добавлять к пище или напиткам или к другим композициям без изменения их исходных вкусовых характеристик. Если желательно, композиция может содержать добавки, подходящим образом выбранные в зависимости от конечного потребителя, способа абсорбции или типа последующей обработки, которой желательно ее подвергнуть, при единственном условии, что эти добавки инертны по отношению к спорам. Например, должно быть возможным добавление смазывающих веществ, разбавителей и так далее,или любого другого агента, способного увеличить ее текучесть, или улучшить другие конкретные физические свойства с целью облегчения последующих обработок композиции. Например, когда желательно ввести композицию в твердые желатиновые капсулы, может быть полезным добавление стеарата магния и/или микрокристаллической целлюлозы. Альтернативно, либо вместе с упомянутыми выше добавками, можно добавлять агенты, улучшающие запах, способные придать композиции специфические ароматы, или корригенты. Возможные дополнительные компоненты можно добавлять к матрице до адсорбции спор или даже просто к готовой композиции, полученной способом по данному изобретению. Если необходимо, композицию можно подвергнуть дальнейшим модификациям; таким образом,композицию можно гранулировать в соответствии с хорошо известными методиками, когда желательно осуществить ее прессование, или обрабатывать так, чтобы получить композиции с контролируемым высвобождением в соответствии с хорошо известными методиками, с целью модификации периода, в течение которого она высвобождается в кишечнике. Композицию можно вводить в различных количествах в соответствии с потребностями, для которых ее вводят. В общем, в случае введения людям возможно давать 10 млрд спор/сутки и даже больше,преимущественно от 1 до 8 млрд в сутки, например 2, 4 или 6 млрд спор в сутки, причем возможно введение в виде однократной дозы или повторяющимся образом. Для целей ее введения композицию по данному изобретению можно в подходящих случаях готовить в виде препаратов единичной дозы; например, благодаря ее качествам, ее можно легко приготовить в виде препарата в желатиновых капсулах, таких как желатиновые капсулы формата 0, 1 или 2, выбранные экспертом в данной отрасли в соответствии с дозировкой. Единичные дозы в форме желатиновых капсул или саше, содержащие композицию по данному изобретению, представляют собой следующий объект настоящего изобретения. Например, эти единичные дозы могут содержать от 1 до 10 млрд указанных спор, преимущественно от 2 до 5 млрд, от 50 до 500 мг, например от 50 до 250 мг каолина и, например, от 50 до 600 мг, например от 50 до 300 мг микрокристаллической целлюлозы. Эти единичные дозы можно вводить один или более чем один раз в сутки, как требуется, и в зависимости от концентрации единичной дозы. Например, возможно готовить единичные дозы, содержащие 5-7 млрд спор, преимущественно приблизительно 6 млрд спор, и вводить указанные единичные дозы всего один раз в сутки. Ввиду вовлечения живого материала очевидно, что микробиологический титр может быть подвержен вариациям; следовательно, предпочтительно добавлять к препарату композиции избыток спор, составляющий 10-20% относительно предполагаемой дозы. Принимая во внимание отсутствие токсичности продукта, такой избыток, однако, не вызывает какие-либо проблемы. Некоторые партии композиций поданному изобретению, упакованные в стекло или полиэтилен,подвергали исследованиям на стабильность, с тем чтобы оценить их поведение при разных температурах(от 5 до 40 С) и уровнях влажности (до 75% относительной влажности). Результаты через 24 месяца показали, что титр композиции не был значительно нарушен в любых тестированных условиях. В дополнение, в тех же условиях оценивали устойчивость к антибиотикам и биохимические характеристики, и было показано, что они соответствуют исходным свойствам данного продукта. Композиция по данному изобретению полезна в областях фармацевтики, ветеринарии и/или питания. В частности, она имеет такое же применение, что и у имеющегося в продаже продукта Enteroger-3 006847mina; в частности композиция по данному изобретению оказывает полезное действие на кишечник и на иммунную систему и особенно подходит для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника и эндогенного дисвитаминоза, а также для коадъювантного лечения при восстановлении микробной флоры кишечника, измененной после лечения антибиотиками или химиотерапии, поскольку она адаптирована,например, к ее применению в комбинации с антибиотиками для борьбы с Helicobacter pylori. Объектом данного изобретения также является лекарственный продукт, содержащий композицию бактериальных спор, как определено выше. Приведенные ниже примеры иллюстрируют данное изобретение, однако не ограничивая его. Приготовление концентрированной суспензии Предварительную ферментацию 600 мл суспензии четырех штаммов Bacillus clausii I-273, I-274, I275 и I-276 (в равных пропорциях) при концентрации 500 миллионов спор/мл проводят в 30 л ферментационной среды в течение 7 ч. Предварительно ферментированную суспензию инокулируют в 1000 л ферментационной среды на основе пептонов и минеральных солей; инкубацию проводят при 37 С в течение 48-72 ч в аэробных условиях; отделяют клетки от культуральной среды с дистиллированной водой путем центрифугирования, пока не будет получен конечный объем 100 л, и пастеризуют эту суспензию при 70 С в течение 30 мин. Таким образом получают концентрированную суспензию, содержащую концентрацию спор Bacillus clausii приблизительно 20 миллиардов спор на грамм. Пример 1. 15 кг каолина фармацевтического качества и 15 кг микрокристаллической целлюлозы фармацевтического качества загружают в систему для осуществления процесса в псевдоожиженном слое и эту смесь нагревают в течение нескольких минут потоком воздуха при 60 С. Под вытяжным шкафом с ламинарным потоком 15 кг водной суспензии смеси спор Bacillus clausii I-273, I-274, I-275 и I-276 (концентрированная суспензия, приготовленная, как указано выше) при концентрации 20 млрд спор на грамм загружают в контейнер, снабженный перистальтическим насосом, подсоединенным к распылительным насадкам, которые имеют диаметр 1,2 мм и подсоединены к установке псевдоожиженного слоя. Концентрированную суспензию спор распыляют таким образом на нагретую смесь при давлении 200 кПа (2 бар) и со скоростью потока 135 мл/мин, поддерживая эту смесь в суспензии с воздухом при 60 С. Приблизительно через 110 мин останавливают систему, оставляют охлаждаться и извлекают композицию. Таким образом получена композиция, показывающая следующие характеристики: титр - определяемый подсчетом на планшетах: 10 млрд спор/г; содержание остаточной воды 2%; размер частиц - определяемый с использованием лазерного анализатора размеров частиц Malvern в деминерализованной воде: 90% частиц 100 мкм, 60% частиц 50 мкм; удельная площадь поверхности: 3-5 м 2/г. Пример 2. При выполнении процедуры, описанной в примере 1, но с использованием только штамма Bacillusclausii I-274, получен продукт, имеющий следующие характеристики: титр - определяемый подсчетом на планшетах: 10 миллиардов спор/г; содержание остаточной воды 2%; размер частиц - определяемый с использованием лазерного анализатора размеров частиц Malvern в деминерализованной воде: 90% частиц 130 мкм, 60% частиц 60 мкм; удельная площадь поверхности 3,5 - 5 м 2/г. Пример 3. При выполнении процедуры, описанной в примере 1, но с использованием только штамма Bacillusclausii I-276, получен продукт, имеющий следующие характеристики: титр 12 миллиардов спор/г; содержание остаточной воды 3%; размер частиц - определяемый с использованием лазерного анализатора размеров частиц Malvern в деминерализованной воде 90% частиц 130 мкм, 60% частиц 60 мкм; удельная площадь поверхности 3-5 м 2/г. Пример 4. К 240 г композиции примера 1 добавляют 57 г микрокристаллической целлюлозы и 3 г стеарата магния. После перемешивания полученную таким образом композицию распределяют в твердые желатиновые капсулы формата 1 с крышечкой, причем каждая содержит 300 мг следующей композиции: Матрица (каолин + микрокристаллическая целлюлоза), содержащая приблизительно 2 млрд спорBacillus clausii (I-273, I-274, I-275, I-276) 240,00 мг Микрокристаллическая целлюлоза 57,00 мг Стеарат магния 3,00 мг Пример 5. Твердые желатиновые капсулы формата 1, содержащие 275 мг композиции Матрица (каолин + микрокристаллическая целлюлоза), содержащая приблизительно 2 млрд спорBacillus clausii (I-273, I-274, I-275, I-276) 200,00 мг Микрокристаллическая целлюлоза 72,25 мг(в производственном составе 220,00 мг, что соответствует 10% избытка дозировки) Пример 6. Твердые желатиновые капсулы формата 1, содержащие 255 мг композиции Матрица (карбонат кальция + микрокристаллическая целлюлоза), содержащая приблизительно 2 млрд спор Bacillus clausii (I-273, I-274, I-275, I-276) 200,00 мг Микрокристаллическая целлюлоза 52,25 мг Стеарат магния (растительного происхождения) 2,75 мг(в производственном составе 220,00 мг, что соответствует 10% избытка дозировки). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая или пищевая твердая композиция, содержащая споры непатогенных бактерий рода Bacillus, адсорбированные на матрице, образованной по меньшей мере одним не растворимым в воде адсорбирующим соединением и производным целлюлозы, причем данная композиция получена смешиванием суспензии указанных спор в псевдоожиженном слое. 2. Композиция по п.1, полученная смешиванием жидкой суспензии спор. 3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что она содержит от 3 до 30 млрд указанных спор на грамм композиции. 4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что она содержит от 5 до 20 млрд указанных спор на грамм композиции. 5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что она содержит приблизительно 10 млрд указанных спор на грамм композиции. 6. Композиция по пп.1-5, отличающаяся тем, что указанное адсорбирующее соединение представляет собой каолин. 7. Композиция по пп.1-5, отличающаяся тем, что указанное адсорбирующее соединение представляет собой карбонат кальция. 8. Композиция по пп.1-7, отличающаяся тем, что указанное производное целлюлозы представляет собой микрокристаллическую целлюлозу. 9. Композиция по пп.1-8, отличающаяся тем, что соотношение по массе между указанным адсорбирующим соединением и указанным производным целлюлозы составляет от 90:10 до 10:90. 10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что указанное соотношение составляет от 70:30 до 30:70. 11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что указанное соотношение составляет приблизительно 50:50. 12. Композиция по пп.1-11 в форме единичной дозы в желатиновых капсулах или саше. 13. Композиция по п.12, содержащая для каждой единичной дозы от 1 до 10 млрд указанных спор,от 50 до 500 мг каолина и от 50 до 600 мг микрокристаллической целлюлозы. 14. Композиция по п.13, содержащая для каждой единичной дозы от 2 до 5 млрд указанных спор, от 50 до 250 мг каолина и от 50 до 300 мг микрокристаллической целлюлозы. 15. Композиция по п.12, содержащая для каждой единичной дозы приблизительно 2 млрд указанных спор в желатиновых капсулах. 16. Композиция по п.12, содержащая для каждой единичной дозы приблизительно 6 млрд указанных спор в желатиновых капсулах. 17. Композиция по пп.1-16, отличающаяся тем, что указанные споры представляют собой спорыBacillus subtilis или Bacillus clausii. 18. Композиция по п.17, отличающаяся тем, что указанные споры имеют происхождение от одного или более чем одного штамма, выбранного из Bacillus clausii I-273, I-274, I-275 и I-276. 19. Композиция по п.1-16, отличающаяся тем, что указанные споры представляют собой смесь спор разных бацилл. 20. Лекарственный продукт, содержащий композицию по любому из пп.1-19, для лечения и предупреждения дисбактериоза кишечника и эндогенного дисвитаминоза, а также для восстановления микробной флоры кишечника.