Лиганды, включая антитела, проявляющие реактивность в отношении эндокринных клеток

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение описывает формирование уникальных аутоантител, которые обусловливают некоторые аутоиммунные и другие заболевания. Оно представляет диагностическое и профилактическое применение таких антител в их моноклональной и поликлональной форме,а также молекулы, распознаваемые этими антителами. Более конкретно, настоящее изобретение представляет применение этих антител и распознаваемых ими молекул в качестве специфических ингибиторов формирования у детей и взрослых аутоантител, обладающих той же специфичностью. Эти антитела и их молекулымишени заявляются как пригодные для диагностического, профилактического и лечебного применения в отношении широкого круга аутоиммунных и других заболеваний. Однако большая часть настоящего изобретения посвящена диабету, что является иллюстрацией и примером, но не ограничивает в чм-либо настоящее изобретение. Спектр аутоиммунных заболеваний человека Заболевания, связанные с аутоиммунными процессами, могут быть классифицированы в пределах спектра, варьирующегося от состояний, при которых нарушения затрагивают отдельный орган, до тех, при которых происходит широкая деструкция органов и тканей. В специфичном для отдельных органов"конце" данного спектра определяется то, что наиболее часто поражаемыми органами являются щитовидная железа, надпочечники, желудок и островки Лангерганса в поджелудочной железе (которые включают инсулино-производящие клетки), в то время как в группе не специфичных в отношении отдельных органов заболеваний превалируют ревматологические или системные (например, системная красная волчанка) заболевания. Аутоиммунные заболевания в редких случаях связаны со скоротечными вирусными инфекциями, которые также могут приводить к деструкции органов. При аутоиммунном процессе деструкция происходит медленно и иногда растягивается на годы до того момента,когда заболевание манифестирует(проявляется). Далее отмечены специфичные для отдельных органов аутоиммунные заболевания, обусловливаемые аутоиммунными процессами, включающие нарушение иммунологической невосприимчивости собственных антигенов. Щитовидная железа. Связанные с щитовидной железой аутоиммунные заболевания вовлекают ряд клинических состояний, в результате которых образуется общая гистопатологическая картина. Отмечается диффузная инфильтрация железы моноядерными лимфоидными клетками. Соответствующими заболеваниями являются первичная микседема, тироидит Хасимото и болезнь Грейвза. Не является 2 чем-то необычным и переход из одного заболевания в другое. Первичная микседема (гипотиреоидный отк) является наиболее распространнной формой спонтанного гипотиреоза и представляет собой терминальную стадию хронического воспалительного процесса. При этом не образуется зоб, а сама железа почти полностью атрофируется. Тироидит Хасимото также связан с гипотиреозом, но ассоциированным с образованием зоба. При его различных клинических формах уровни тироидных гормонов могут быть либо компенсированы возрастающими уровнями тироид-стимулирующего гормона (TSH), вырабатываемого гипофизом, либо может иметь место клинический гипотиреоз, не зависящий от возрастания уровня TSH. При обоих патологических аутоиммунных состояниях женщины поражаются в пять раз чаще мужчин. Наиболее часто встречающейся формой тиротоксикоза является болезнь Грейвза, связанная или не связанная с развитием зоба или экзофтальма. Это заболевание характеризуется ремиссиями и обострениями. Несмотря на это,аутоиммунный процесс приводит к гиперстимуляции железы из-за выработки тироидстимулирующих антител: часто происходит окончательное разрушение железы. Также имеется более частая встречаемость у женщин по сравнению с мужчинами в соотношении 5:1. При всех связанных с щитовидной железой аутоиммунных заболеваниях выявление различных аутоантител к этой железе подтверждает клинический диагноз. Аутоантитела могут быть специфичны в отношении цитоплазматических тироидных антигенов, таких как тироглобулин,поверхностно-клеточных компонентов, таких как тироидная пероксидаза, поверхностных тироцитарных ТSН-рецепторов (т.е. болезнь Грейвза). Желудок. Аутоиммунные заболевания желудка вовлекают его дно или полость, что приводит к различной степени воспалениям, поражающим эти два участка железы. В целом такой процесс называют гастритом. При фундальном гастрите имеется отчтливая атрофия слизистой с последующей утратой выработки внутреннего фактора (IF), что приводит к малабсорбции витамина B12 и последующему развитию пернициозной (злокачественной) анемии. При этих состояниях вырабатываются антитела к IF и париетальным клеткам - эти антитела присутствуют у 90% пациентов. Париетальные клетки разрушаются, однако главные клетки и слизистые клетки слизистой оболочки желудка также разрушаются, несмотря на отсутствие циркулирующих антител к этим двум типам клеток. Заболевание в 3 три раза чаще встречается у женщин по сравнению с мужчинами. Аутоантитела к вырабатывающим гастрин клеткам полости желудка были обнаружены у некоторых пациентов с антральным гастритом. Этот тип гастри 3 та связан с язвой желудка, а у части пациентов также обнаруживаются антитела, стимулирующие желудочные клетки. Надпочечники, половые железы и плацента. Аутоиммуное заболевание надпочечников(болезнь Аддисона) характеризуется сильной инфильтрацией моноядерных клеток в железу, в надпочечники и присутствием аутоантител к надпочечниковым антигенам. Симптомами являются гиперпигментация, слабость, утомляемость, пониженное артериальное давление,симптомы желудочно-кишечных поражений и гипогликемия, обусловленная дисфункцией надпочечников. Опять-таки заболевание в основном отмечается у женщин. При иммунофлуоресцентном анализе штамма аутоантител окрашиваются три слоя коры надпочечников,однако соответствующий подтип может перекрстно реагировать с аналогичными вырабатывающими стероиды клетками яичников, семенников и плаценты. Когда эти последние специфичности презентированы, то они коррелируют с преклиническим или клиническим проявлениями дисфункции половых желез. Гипофиз. Лимфоцитарное воспаление гипофиза является редким аутоиммунным состоянием, проявляющимся в гипофункции гипофиза(гипопитуитаризме), нуждающемся в гормонзамещающем лечении. Заболевание чаще встречается у женщин: оно обнаруживается наряду с другими специфичными в отношении отдельных органов аутоиммунными явлениями или связанными заболеваниями. Во многих случаях могут быть выявлены аутоантитела к секретирующим пролактин клеткам, равно как и другие орган-специфичные антитела. Полиэндокринные аутоиммунные реакции. Пациенты со специфичным в отношении отдельного органа аутоиммунным заболеванием могут характеризоваться наличием симптомов,связанных с дисфункцией эндокринных органов или других органов-мишеней, (например, желудка). Однако, симптомы множественных поражнных органов не являются редкими, а аутоантитела к непоражнным органам также выявляются у пациентов, у которых диагностировано одно из орган-специфичных заболеваний. Тироидные и желудочные аутоиммунные реакции часто отмечаются у одного и того же пациента. Пернициозная анемия, являющаяся результатом фундального гастрита, встречается в пять раз чаще у пациентов с поражениями щитовидной железы, 30-50% пациентов с пернициозной анемией также характеризуются заболеваниями щитовидной железы в анамнезе. Также имеется связь между воспалением надпочечников и тироидитом, а также между воспалением надпочечников и инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД). Обычно такие случаи начинаются тиреотоксикозом одновременно болезнью Аддисона, у многих пациентов с болезнью Аддисона наблюдается, по 4 крайней мере, одно аутоиммунное заболевание. Хотя воспаление гипофиза и витилиго (состояние, которое проявляется в зональной депигментации кожи, что наиболее вероятно связано с аутоиммунным разрушением резидентных меланоцитов) встречаются редко, они обычно сосуществуют с другими специфическими состояниями отдельных органов. Серологические параметры (например, присутствие циркулирующих аутоантител), которые перекрываются при сравнении различных аутоиммунных заболеваний, являются гораздо более частым явлением, чем сосуществование разных проявившихся заболеваний. Например, антитела к париетальным клеткам имеются у половины пациентов, характеризующихся поражениями щитовидной железы, и у 30% пациентов с ИЗСД. Современные взгляды на патологию ИЗСД Современное состояние исследований по этиологии ИЗСД (диабет I типа) фокусируется на имеющем аутоиммунную природу разрушении -клеток островков Лангерганса в среде циркулирующих различных аутоантител, аутореактивных Т-клеток в крови и в воспаленных островках поджелудочной железы (инсулит) и различных цитокинов. Патогенная роль аутоантител пока не была определена, хотя их присутствие, как было показано, является предсказательным для идентификации преклинического диабета по отношению собственно к пациентам ИЗДС. Полагают, что иммунологическое поражение, приводящее к ИЗСД, приводит к разрушению -клеток под воздействием Т-клеток(TischMcDevitt, 1996). Подтверждением такой точки зрения, что присутствие инфильтратов моноядерных клеток (при инсулите) в островках Лангерганса, способствует развитию заболевания (Gepts, 1965; RoepDeVries,1992), является отсрогенное развитие заболевания под воздействием иммуносупрессорных лекарственных препаратов (Bougneres et al.,1988), разрушение трансплантатов поджелудочной железы у пациентов с ИЗСД, ассоциированным с инсулитом (Sibley et al., 1985) и данные анализа на животных моделях, указывающие на то, что селезночные Т-лимфоциты способны передавать диабет, а необходимыми являютсяCD4- и СВ 8-позитивные Т-лимфоциты (Bendelac et al., 1987). Линии клонированных CD4 позитивных Т-клеток, характеризующиеся специфичностями по отношению к антигенам клеток островков Лангерганса, как было показано,также могут быть диабетогенными (HaskinsMcDuffie, 1992). К настоящему времени нет доказательств того, однако, что Т-клетки обусловливают исходное повреждение -клеток островков Лангерганса, а также нет определений того,какие мишени такие антигены могут представлять. Недавно было показано, что аутореактивность циркулирующих Т-лимфоцитов в отно 5 шении антигенов клеток островков Лангерганса не ограничивается пациентами с ИЗСД, но также присутствует у здоровых доноров разного возраста, хотя и в меньшей степени. Следовательно, весьма вероятным является то, что Тклеточные аутоиммунные реакции являются последствием дисфункции -клеток, приводящей к поражениям -клеток. Анализ профилей цитокинов и баланса Th1 и Тh2 в ходе развития заболевания у мышей линии NOD показал, что Th1-клетки и цитокины Тh1-типа преобладают при развитии ИЗСД. Подробный анализ вероятной корреляции между сдвигом уровня цитокинов и ИЗСД был осуществлн Шимадой с соавт. (Shimada et al.,1996). Спленоциты, выделенные у мышей линийNOD и NOD-IAk и контрольной линии BALB/c при различном времени во время течения заболевания, были разделены таким образом, чтобы выделить CD4-позитивные Т-клетки с низким титром CD45RB (память); они активировались антителами к CD3, после чего тестировали секретируемые цитокины. Высокое значение соотношения -интерферон/интерлейкин-4 было выявлено у мышей NOD в момент или даже до развития гипергликемии. Авторы предположили, что ИЗСД у мышей линии NOD прогрессирует в форме воспалительной дисфункции клеток без реального разрушения -клеток вплоть до самых поздних стадий заболевания. Дисфункция -клеток, определяемая повышенным содержанием сывороточного проинсулина по отношению к количеству инсулина или С-пептида, была отмечена при клиническом анализе юношеского ИЗСД (LudvigssonHeding, 1982). Роудер с соавт. (Roder et al., 1994) исследовал 23 пары близнецов-пациентов с ИЗСД, позитивных по аутоантителам: их разделили на две группы в соответствии с первой фазой инсулинового ответа (ПФИО) на внутривенные инъекции глюкозы. Одиннадцать пар близнецов характеризовались сниженным ПФИО, а уровень соотношения проинсулина с инсулином или С-пептидом у них был в 2-3 раза выше, чем у остальных пар близнецов, характеризовавшихся нормальными уровнями ПФИО. У девяти из 11 пар близнецов с низкими ПФИО и высоким соотношением проинсулина с инсулином или С-белком, диабет развился спустя 128 месяцев после обследования, в то время как диабет отсутствовал у всех близнецов второй группы. Дисфункция и возможное разрушение клеток характерно для ИЗСД, однако и недавно проявившийся, и давно развивающийся диабет I типа также характеризуется дефектами ответной секреции глюкагона и эпинефрина и выработки глюкозы печенью при гипогликемии (Kleinbaumet al., 1983). Тщательные исследования с использованием методики фиксации гиперинсулинемии/гипогликемии показали, что уро 003131 6 вень глюкагона возрастает в течение 180 мин после инфузии инсулина у здоровых доноров,но не у диабетиков (Barrou et al., 1994). Выработка глюкозы в печени также в существенной степени нарушена у пациентов из последней группы. Этот дефект контррегуляции гипогликемии является весьма устойчивым к интенсивному лечению у многих пациентов с диабетом I типа. Хотя ясно, что секреция глюкагона нарушена при долговременном диабете, ничего более не известно о секреции глюкагона у предиабетических пациентов. Было продемонстрировано нарушение секреции глюкагона на моделях диабета у животных. Исследование на мышах NOD, у которых диабет ещ не проявился или уже проявился, показал, что у особей с непроявившимся диабетом при голодании уровни глюкозы в крови и инсулин в плазме находятся в норме, а содержание глюкагона в плазме крови существенно повышено по сравнению с контрольными мышами (Ohneda et al., 1984). Следовательно, являющееся причиной метаболическое нарушение имело место до того, как диабет проявился. Глюкагон, секретируемый -клетками поджелудочной железы, является важным фактором поддержания нормального контроля эугликемии путм стимулирования выработки глюкозы печенью, а также обеспечения индукции глюкозой секреции инсулина. Это было подтверждено падением секреции инсулина вслед за иммунологической нейтрализацией глюкагона у голодающих крыс, что однако не сопровождалось падением уровня глюкозы в крови (Brand et al., 1995). Секреция инсулина отдельными клетками, разделнными с помощью флуоресцентного клеточного сортера, оказывается слабой в ответ на повторную пищевую индукцию. Это секреторный дефект может быть полностью восстановлен путем повторного сочетания клеток с отделенными -клетками или путм добавления (Вu)2-цАМФ или глюкагона(Pipeleers et al., 1985). Глюкагон является основным фактором повышения уровня цАМФ в клетках (Rasmussen et al., 1990). Выделенные клетки характеризуются меньшим уровнем цАМФ, чем -клетки в цельных островках Лангерганса; увеличение или уменьшение уровня цАМФ в островках сопровождается одновременным повышением или падением секреторного ответа на глюкозу (Howell et al., 1973). Уровни цАМФ могут быть восстановлены путм повторного агрегирования с неклетками островков Лангерганса или добавления глюкагона(SchuitPipeleers, 1985). Соответствующим прямому влиянию глюкагона на -клетки является выявление рецепторов глюкагона на поверхности -клеток (Van Schravendijk et al.,1985). Также для глюкагона было показано уси 7 ление амплитуды пульсирующей секреции инсулина в ответ на глюкозу без нарушения периодичности пульсов секреции (Marchetti et al.,1994). С учтом того, что точно установлено, что повышение концентрации в цитоплазме Са 2+ для секреции инсулина (PrentkiMatschinsky,1987), индуцируемое глюкагоном повышение уровня цАМФ предположительно также опосредуется повышением уровня Ca2+. Комплексные эксперименты по измерению потоков Са 2+ под влиянием фотосекретируемого внутриклеточного цДМФ из закрытого предшественника показали, что увеличение потоков Са 2+ составляет до 10% от общего увеличения при экзоцитозе, вызываемом цАМФ (Ammala et al., 1993). С помощью аналогичного метода Аммала с соавт. (Ammala et al., 1993) показали, что цАМФ инициирует экзоцитоз при концентрации Ca2+,которая сама по себе не способна обусловливать секрецию, а также усиливает экзоцитоз при более высоких концентрациях Ca2+. Вестерлунд с соавт. (Westerlund et al., 1997) также показал,что секреция инсулина продолжала оставаться пульсирующей в условиях, когда уровень [Ca2+]i оставался стабильным. Эти эксперименты показывают, что цАМФ определяет порог чувствительности для секреторного влияния активации кальциевых каналов, а, значит, роль глюкагона в повышении уровня цАМФ в -клетках приобретает первостепенное значение в контроле за амплитудой индуцируемых глюкозой пульсов секреции инсулина при голодании. Секреция глюкагона также имеет пульсирующий тип. Ранее было установлено (Storch etal., 1993), что концентрация глюкагона в плазме у пациентов с циррозом печени также существенно варьируется в интервале времени 4,1-6,5 минут. Перфузируемая in vitro поджелудочная железа крысы секретировала инсулин и глюкагон пульсами по 5,8 и 6,5 мин, соответственно; реверсия направления перфузии в поджелудочной железе собаки и крысы не нарушала периодичность секреции этого гормона (StagnerSamols, 1988). Это не допускает вероятности того, что прямые гормональные взаимодействия между островками или механизм венозоной гормон-чувствительной рецепции связаны с периодичностью секреции. Отдельные островки Лангерганса мыши секретируют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой в виде и медленных, и быстрых колебательных пульсов(Bergsten et al., 1994). Следовательно, механизм пульсирующей секреции инсулина существует в пределах отдельных островков Лангерганса: этим он отличается от потоков [Са 2+]i, исследованных в экспериментах при активации протеинкиназы-С, влияние которой увеличивает амплитуду колебаний без нарушения их частоты или изменений уровня [Ca2+]i (Deeney et al.,1996). Эти данные показывают, что водитель ритма пульсирования секреции инсулина и глю 003131 8 кагона расположен в пределах островков Лангерганса и является независимым от внешней иннервации и прямого гормонального взаимодействия. Это также было установлено у человека, когда были выявлены и низкочастотные, и высокочастотные пульсации в успешных трансплантатах поджелудочной железы (Sonnenberget al., 1992). Роль водителя ритма в ИНСД Дисфункция -клеток отчтлива при диабете 2-го типа инсулиннезависимого диабета(ИНСД), - который является заболеванием, также связанным с инсулиновой резистентностью. Относительное значение этих двух компонентов является спорным. На ранних этапах заболевания имеет место отчтливое нарушение пульсирующей секреции инсулина, связанное с утратой высокочастотных пульсов и со снижением амплитуды низкочастотных колебаний (Leahy,1990; Guil-lausseau, 1994). Утрата пульсирующей секреции может быть важным потенциальным фактором инсулиновой резистентности. Различные исследования, нацеленные на идентификацию механизмов развития ИНСД, позволили заключить, что дисфункция -клеток в большей степени, нежели инсулиновая невосприимчивость, является главным фактором, определяющим предрасположенность к ИНСДal., 1996). Следовательно, причина ИНСД должна быть связана с тем событием, которое индуцирует дисфункцию. В данном исследовании предполагается, что дисфункция является следствием нарушения водителя ритма, который в норме поддерживает пульсирующую секрецию и инсулина, и глюкагона. Парксен с соавт. (Parksen et al., 1995) проанализировал вклад пульсирующей секреции инсулина по отношению к непрерывной у голодавшей в течение ночи собаки и показали, что основная часть инсулина (70%) секретируется пульсами. Разрушение этой системы должно,таким образом, обладать основным влиянием на общий уровень секреции инсулина. Естественную природу предшествования дисфункции -клеток диабету ИЗСД исследовать труднее из-за прерывистости и деструктивности этого заболевания в момент диагностирования. Однако O'Меара с соавт. (O'Meara et аl.,1995) смогли исследовать пациента в течение 13-месячного периода развития ИЗСД. При голодании концентрации глюкозы и гликозилированного гемоглобина оставались в целом в пределах нормы, а инсулиновые ответы на внутривенное введение глюкозы были снижены. Пульсирующая природа секреции сохранялась, хотя уровень секреторного ответа был редуцирован. Описание изобретения Настоящее изобретение представляет новую концепцию обусловливания аутоиммунных заболеваний и конкретно описывает е приме 9 нение в отношении диабета 1 и 2 типов, выбранных в качестве иллюстративных примеров,но не ограничивающих настоящее изобретение. Настоящее изобретение представляет моноклональные или поликлональные антитела или функционально эквивалентные им лиганды,обладающие реактивностью по отношению к антителу, специфичному в отношении TCR-V,применимые в качестве фармацевтических или диагностических агентов. Эти молекулы также могут проявлять реактивность в отношенииGPI-связанных V- субъединиц TCR, фосфолипидов, фосфолипидгликанов, одноцепочечных ДНК и (или) двухцепочечных ДНК. Настоящее изобретение также представляет применение этих антител в производстве лекарственного средства, предназначенного для лечения ИЗСД,ИНСД или специфичных или неспецифичных в отношении отдельных органов аутоиммунных и связанных заболеваний. Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением применяется моноклональное антитело. Что касается диабета, настоящее изобретение подразумевает нарушение регуляции функции -клеток новыми идентифицированными аутоантителами, характеризующимися сходной специфичностью с упомянутыми моноклональными антителами, что рассматривается как основной фактор процесса развития диабета. Для подтверждения этой новой концепции настоящее изобретение демонстрирует то, что упомянутые моноклональные антитела распознают общий эпитоп в составе группы сигнальных молекул, имеющихся на -клетках (которые могут функционировать как водители ритма для островков Лангерганса), которые являются мишенями для упомянутых патогенных аутоантител. Настоящее изобретение также представляет выявление упомянутых аутоантител и далее представляет применение этих и упомянутых моноклональных антител, а также молекул, распознаваемых этими моноклональными антителами, для профилактических и терапевтических воздействий на аутоиммунные и связанные заболевания, включая ИЗСД и ИНСД. Моноклональные антитела нарушают регуляцию секреции инсулина из культивируемых клеток островков Лангерганса человека (см. подробности в экспериментальном разделе и табл. 1). Они были картированы на -клетках путм одновременного окрашивания срезов поджелудочной железы с использованием упомянутых моноклональных антител (иммуноглобулины-М), а также моноклональных антител(иммуноглобулин-G) к глюкагону, которые выявляют связывание флуоресцирующих антимышиных IgM и родаминированных антимышиныхIgG, соответственно; параметры окрашивания антител оказались идентичными - это показало, 003131 10 что оба антитела метили одни и те же вырабатывающие глюкагон -клетки. Предполагается, что нарушение патогенных аутоантител на поверхности -клеток обусловливает утрату и контррегуляторные ответы на глюкозу, а также тонкую настройку секреции инсулина. Нарушение регуляции секреции инсулина приводит в результате к гибели клеток, обусловливающей ИЗСД, или же к сохранению жизнеспособности -клеток с нарушенным регуляторным статусом, обусловливающей ИНСД. Эти два варианта зависят от генетической предрасположенности конкретного пациента. В случае с ИЗСД сенсибилизация Т-лимфоцитов является вторичной в отношении повреждений -клеток, что может ускорять гибель остальных -клеток. Однако заявитель не желает связывать данный материал с обсуждением этой теории. Моноклональные антитела, которые идентифицировали поверхностные молекулы клеток, были сформированы путем иммунизации мышей моноклональными антителами кTCR-V в соответствии с описаниями, приведенными ниже в экспериментальном разделе. Моноклональные антитела, вырабатываемые полученными клонами, либо распознавали только анти-V иммуноген, либо распознавали иммуноген наряду с фосфатидилинозитолом,фосфатидилсерином, кардиолипином (диацилглицерином) и двухцепочечной и одноцепочечной ДНК. Эти последние моноклональные антитела также распознавали панкреатические клетки человека (фиг. 1), фолликулярные клетки щитовидной железы (фиг. 2), клетки мозговой области надпочечников (фиг. 3), желудка и кишечного тракта (фиг. 4), желудка, слюнных желез, яичника, поперечно-полосатых мышц, соединительной ткани, исследованных здесь в качестве не являющихся ограничениями примеров. По использованию в данном тексте термин функциональный эквивалент призван определить соединения, которые имеют желательный сайт связывания, и включает любую макромолекулу или молекулярный компонент, который связывает антитело к TCR-V при константе диссоциации 10-4 М или менее, предпочтительно 10-7M или менее, а наиболее предпочтительно 10-9M или менее, и который характеризуется эквивалентной комплементарностью структуры по отношению к таковой, которую имеет связывающий сайт идентифицированных здесь антител к TCR-V. Известные методы получения соединений,обладающих аффинностью по отношению к желательной молекуле, до недавнего времени характеризовались значительным примитивизмом. Внедрение комбинаторной химии и создание комбинаторных библиотек, однако, происходит быстрыми темпами: они способны облег 11 чить и рационализировать улучшение параметров молекул по их желательным свойствам. Эти методики могут быть применены для создания молекул, характеризующихся сайтами связывания, идентичными или сходными с таковыми у антител, идентифицированных в настоящем изобретении. Такие соединения могут быть получены с применением рационального плана с использованием, например, стандартных методик синтеза в сочетании с молекулярным моделированием и компьютерными визуализующими программами. В этих методиках "ведомое" соединение, имеющее структуру, сходную с сайтом связывания антитела, оптимизуется сочетанием разнообразия основных структур и замещающих компонентов. С другой стороны или в качестве одного из этапов искусственного конструирования дизайна молекулярного компонента методы комбинаторной химии могут быть использованы для создания или уточнения структуры соединения,которое имитирует нужный сайт связывания,путм создания структурно сходных комбинаторных построений вокруг базового скелета. Эти этапы могут включать синтез стандартной пептидной или органической молекулы с применением процесса расщепления и рекомбинации в тврдой фазе или синтеза параллельных комбинаторных единиц с применением методик синтеза в тврдой фазе или в растворе (см., например, Ноgаn, 1997, и работы, цитированные в этой статье). С другой стороны или в качестве части молекулы в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения функциональные эквиваленты могут включать фрагменты или варианты идентифицированных антител или близкородственных белков, проявляющих высокий уровень гомологии. Под фрагментами понимаются любые части целой последовательности белка, которые сохраняет способность связываться с антителом к TCR-V при константе диссоциации 10-4 М или менее, предпочтительно 10-7 М или менее, а наиболее предпочтительно 10-9 М или менее. Соответственно, фрагменты,несущие одиночные или множественные аминокислотные делеции с какого-либо конца белка или во внутренних участках первичной аминокислотной последовательности, образуют один из аспектов настоящего изобретения. Варианты могут включать, например, мутантные формы,включающие аминокислотные замены, вставки или делеции по сравнению с аминокислотной последовательностью антитела дикого типа. Биологически активные пептиды, имеющие сайты связывания, которые имитируют описанные здесь антитела, могут быть созданы с использованием фаговых библиотек. Нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотные остатки, определенные в качестве элементов сайта связывания, наряду с нуклеиновой кисло 003131 12 той, кодирующей окружающие каркасные аминокислотные остатки, могут быть соединены так, чтобы образовать полипептидную единицу,состоящую из 10-1000 остатков, предпочтительно из 25-100 остатков. Путем слияния этого нуклеотидного фрагмента с таким фрагментом,который кодирует фаговый белок, например белок pIII бактериофага fd, слитая молекула может быть расположена на поверхности фаговой частицы. Скрининг фаговой библиотеки с использованием антитела к TCR-V позволит после этого идентифицировать представляющие интерес клоны. Эти клоны затем могут быть подвергнуты повторяющимся циклам мутагенеза и скринингу с целью улучшения показателя аффинности созданных молекул по отношению к соответствующей мишени. Антитела или функционально эквивалентные лиганды по настоящему изобретению могут происходить от позвоночного или беспозвоночного животного. Предпочтительно антитела получают от В-клеток, иммортализованных вирусом Эпштейна-Барр, или с использованием Вклеток, выделенных от здоровых или заболевших людей или животных. Антитело или эквивалентный лиганд могут быть выделены путм пассивирования жидкости тела человека или животного через связанную с антигеном колонку. Животные перед этим могут быть иммунизованы данным антигеном, могут быть заражены или они подвергаются воздействию химических препаратов или к ним применяют определенную диету для развития заболевания. В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляется пептид,олигопептид, полипептид или белок, который связывается моноклональным или поликлональным антителом или эквивалентным лигандом в соответствии с первым аспектом по настоящему изобретению, которые не являются антителом к TCR-V, для использования в качестве фармацевтического или диагностического агента. Конкретным предпочтением с точки зрения применения в данном аспекте настоящего изобретения обладают белки, кодируемые клонами 1.1, 1.2, 1.3, 3.1, 4.1, 5.1, 5.2 или 5.3,описанными ниже, их фрагменты или их функциональные эквиваленты. Такие молекулы также могут быть использованы в производстве лекарственных препаратов, предназначенных для лечения ИЗСД, ИНСД или других аутоиммунных заболеваний, специфичных или неспецифичных в отношении отдельных органов, и связанных заболеваний. Эти молекулы распознаются моноклональными анти-анти-V антителами: они были идентифицированы во время скрининга gt11 библиотеки кДНК поджелудочной железы человека. Восемь кДНК-клонов были очищены и секвенированы. Клоны 1.1, 1.2 и 1.3 кодируют 13 белок, сходный с секретогранином-1; клоны 3.1,4.1 и 5.1 кодируют белок, сходный с рецептором ламинина с молекулярной массой 67 кД; клон 5.2 кодирует новую молекулу, которую заявители обозначили ESRP1 (белок-1, регулирующий эндокринную секрецию). Клон 5.3 кодирует белок, сходный с предшественником гранулярного белка GP2. Унифицирующими характеристиками всех этих молекул является то, что связано с их связыванием с клеточной мембраной через новый гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) якорь. Регуляция и экспрессия GPI-связанных молекул на клеточной поверхности были описаны ранее(Low, 1989; Uden-friendKodukula, 1995). Эти ацильные остатки являются чувствительными к действию инсулина за счт действия активированных инсулином фосфолипаз (Chan et al.,1988). Продукты расщепления этих молекул интернализуются -клетками и, как считается в настоящем изобретении, регулируют секрецию глюкагона. Молекулы требуют определнного времени для того, чтобы быть ресинтезированными и реэкспрессированными на клеточной мембране, что объясняет периодичность секреции глюкагона и, соответственно, пульсирующую секрецию и глюкагона, и инсулина. Такой тип механизма может объяснять природу водителя ритма в островках Лангерганса. Антитела,которые связываются с участком этих молекул,которые претерпевают ферментативное расщепление, могут служить помехой действию фермента и тем самым нарушает регуляцию секреции глюкагона и инсулина. Имеется ряд механизмов, благодаря которым у человека могут физиологическим путм образовываться антитела, обладающие сходной специфичностью. Во-первых, факторы внешней среды, такие как инфекции или суперантигены,могут индуцировать клональную экспансию Тклеток, и в ходе такой фазы пролиферации аномальные сформированные неполные TCRкомплексы сохраняются во внеклеточном пространстве и разрушаются. Т-клетки могут переходить в фазу апоптоза при некоторых условиях и секретировать аномальные TCR-продукты,которые могут быть иммуногенными и опосредующими каскад анти-V и анти-анти-V комплексов в процессе выработки антител. Вовторых, было сообщено Беллом с соавт. (Bell etal., 1994) о том, что сигнальный пептид для прикрепления к GPI-якорю имеется в составе последовательности -цепи TCR и что -цепиTCR, лишнные С-концевой цитоплазматической последовательности экспрессируются в зрелой Т-клеточной гибридомной линии в виде прессия таких субъединиц V может индуцировать каскад комплексных ответов, в результате чего появляются антитела, обладающие сходной специфичностью по сравнению с анти-анти-V реагентами. Такие антитела были выявлены в человеческой сыворотке в другом варианте настоящего изобретения (см. табл. 2 в экспериментальном разделе). Упоминавшиеся выше клоны кДНК и кодируемые ими белки более подробно описаны ниже. Клоны 1.1, 1.2, 1.3. Эти три клона имеют длину 1500, 1400 и 900 нуклеотидов, соответственно, и кодируют молекулу, сходную с секретогранином-1 (Sgl). Секретогранин-1 - полипептид, состоящий из 657 аминокислот с молекулярной массой 76 кД и претерпевающий Nконцевое отщепление сигнального пептида,включающего 20 остатков (Benedum et al.,1987). Этот полипептид включает поддерживаемую дисульфидной связью выпетленную структуру и он является секретируемым белком,попадающим в секреторные гранулы эндокринных клеток и нейронов. Как было показано Пимпликаром и Хаттнером (PimplikarHuttner,1992), в линии нейроэндокринных клеток PC 12 фракция экзоцитированного Sg 1 не секретируется, но остатся связанной с клеточной мембраной. Поверхностный Sg 1 (приблизительно 10% от общего количества клеточного белка) был интернализован и разрушался, что указывает на его вероятные сигнальные функции. Этот полипептид характеризуется свойствами кавеолярного белка (Chang et al., 1994). Промоторный участок гена Sg 1 мыши включает цАМФконтролируемый элемент (Pohl et al., 1990). Секретогранины образуют семейство кислых белков. Поскольку они не обнаруживаются в экзокринных клетках, они были использованы в качестве иммуногистохимических диагностических маркров опухолей органов эндокринной системы. Дополнением к Sg 1 является гепаринсвязывающий адгезионный белок, для которого было показано опосредование субстратной адгезии (Chen et al., 1992). Интересно, что у грызунов накопление мРНК Sg 1 начинается на 13-14 й день эмбрионального развития, а пики отмечены после 20-го дня после рождения (FossPeters et al., 1989). Клоны 3.1, 4.1, 5.1. Три других клона 3.1(1000 нуклеотидов) кодируют белок с молекулярной массой 67 кД, сходный с рецептором ламинина. Ламинин является главным компонентом базальных мембран, который играет важнейшую роль в различных клеточных функциях, таких как адгезия, тканевое ремоделирование, заживление ран, воспалительные процессы, метастазирование опухолевых клеток и т.д. Взаимодействие внеклеточного матрикса(ЕСМ) с клетками в случае контакта, опосреду 15 ется различными поверхностно-клеточными рецепторами, такими как ламининовый рецептор 67-кД. Этот связывающийся с ламинином белок также связывает эластин, коллаген IV-го типа; он является галактолектином, который можно очистить на соответствующей аффинной колонке, несущей -галактозиды. -галактозные сахара, такие как галактоза и лактоза, могут элюировать этот белок из эластиновых или ламининовых аффинных колонок (Hinek, 1994). Связывание галактосахаров на лектиновом сайте молекулы не только влияет на замещение лигандов внеклеточного матрикса с их сайта связывания, но также отделяет белок 67-кД от клеточной мембраны (Hinek et al., 1992). Также было показано, что имеется взаимосвязь между дефицитом по этому белку в клетках гладкой мускулатуры боталлова (артериального) протока, их отделения от эластина и их способности к миграции. Поверхностная экспрессия этого белка, повидимому, находится под трансляционным контролем. Трансфицированные клетки, которые экспрессировали высокие уровни мРНК, не всегда экспрессировали соответствующие высокие уровни этого белка на своих поверхностях(Landowski et al., 1995). Эксперименты по микроспектрофлуорометрии и видеомикроскопии показали, что связывание эластина или активного пептида VGVAPG на гладкой мускулатуре аорты приводит к перемежающемуся увеличению содержания свободных ионов кальция внутри клеток. Это подтверждает то, что белок,связывающий на клеточных поверхностях ламинин или эластин, действует как реальный рецептор, опосредующий внутриклеточные сигнальные процессы (Hinek, 1994). Имеется ещ и противоположный взгляд на характер прикрепления этого белка к клеточной мембране, потому что анализ предсказываемой аминокислотной последовательности не позволил выявить каких-либо гидрофобных доменов, характерных для трансмембранного сегмента. Метильная этерификация очищенного белка с последующим анализом методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии показала, что белок ацилируется путм ковалентного присоединения жирных кислот, пальмитатов,стеаратов и олеатов, хотя химия такого присоединения пока точно не определена (Landowski etal., 1995). Ацилирование этого белка определяет для него ряд дополнительных параметров, не связанных непосредственно со связыванием ламинина. Липидные модификации, как было показано, нарушают межбелковые взаимодействия, а модифицирующие ацильные группы также могут приводить к образованию вторичных промежуточных компонентов в передаче сигналов. Полипептид, кодируемый клоном кДНК,длиной приблизительно 1200 нуклеотидов не имеет существенного сходства с функционально 16 охарактеризованным белком. Таким образом невозможно получить какое-либо функциональное сравнение с какими-либо известными белками. Однако полагают, что у этого белка существует общий эпитоп с белками, идентифицированными моноклональным антителом антианти-V, применяемым при скринировании библиотеки поджелудочной железы, и тем самым этот белок обладает сходными функциональными свойствами. Этот белок в дальнейшем будет назван белком 1, регулирующим эндокринную опредию (ESRP1). Клон 5.2. В соответствии со следующим вариантом настоящего изобретения представляется белок ESRP1, его фрагменты и функциональные эквиваленты. Аминокислотная последовательность этого белка показана ниже на фиг. 7. Нуклеотидная последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты образует ещ один аспект данного варианта настоящего изобретения и представляется ниже на фиг. 6. В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения белок ESRP1 представляется для применения для лечения или диагностики. Белок ESRP1 или его функциональный эквивалент в соответствии с настоящим изобретением может быть производным от любого организма, имеющего белок из состава такого же семейства, что и идентифицированные здесь соединения. Под "семейством белков" понимается группа полипептидов, проявляющих общую функцию и гомологию аминокислотных последовательностей в составе мотивов, присутствующих в этих полипептидных последовательностях. Предпочтительно, чтобы белок, фрагмент белка или функциональный эквивалент был производным от млекопитающего, предпочтительно - от человека. В соответствии с ещ одним аспектом этого варианта настоящего изобретения представляется применение белка ESRP1, его фрагментов и функциональных эквивалентов в производстве лекарственного препарата, предназначенного для лечения ИЗСД, ИНСД, специфичного или неспецифичного в отношении отдельных органов аутоиммунного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, связанной с раковой опухолью кахексии и рака, а также любых других заболеваний, при которых имеет место присутствие антифосфолипидных антител и (или) гиперинсулинемия и инсулиновая резистентности. По использованию в настоящем описании термин "специфичное или неспецифичное в отношении отдельных органов заболевание" призвано включить ИЗСД, ИНСД, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, надпочечников, половых желез, желудка и гипофиза, системную красную волчанку, рассеянный склероз и синдром Шгрена. "Сердечно-сосудистое за 17 болевание" призвано включить в себя заболевания коронарных и сонных артерий, макро- и микроваскулярные ангины, заболевание периферических сосудов, атеросклероз и гипертензию. Под "раковым заболеванием" подразумевается рак молочной железы, колоректальный рак,рак желудка, рак эндометрия, рак простаты, рак головы и шеи, рак лгких. "Другие подходящие заболевания" призваны включить синдром поликистоза яичников, ожирение, синдром Кушинга и метаболический синдром X. Эти заболевания названы в качестве примеров и не являются ограничивающими. Клон 5.3. Этот клон кДНК, состоящий примерно из 2000 нуклеотидов, кодирует белок,который характеризуется высоким уровнем сходства с экзокринным предшественником гранулярного мембранного белка GP-2 человека. Однако клон 5.3 характеризуется некоторыми отличиями параметров нуклеотидной и соответствующих аминокислотной последовательностей и локализован в той части поджелудочной железы, которая выполняет функции железы внутренней секреции. Поскольку антитело, реактивное по отношению к этому клону кДНК, окрашивает эндокринную часть поджелудочной железы, то кодируемый этим клоном белок предположительно является эндокринным дубликатом экзокринного белка GP-2. Это, однако, не обеспечивает данному белку той же функции в эндокринных клетках, которая характерна для него в экзокринной ткани. Для белка GP-2 крысы, экспрессируемого в клеточных линиях эндокринного или экзокринного происхождения вследствие трансфекции кДНК, было показано связывание с секреторными гранулами в экзокринных клетках, но не в эндокринных клетках (Hoops et al.,1993). Основным белком в выделенных зимогенных гранулярных мембранах экзокринной части поджелудочной железы является белок GP-2,доля которого достигает 40% от общего количества белка (Ronzio et al., 1978). Белки крысы и человека присоединяются к гранулярной мембране путм GPI-связывания (гликозилфосфатидилинозитол) и могут быть секретированы с мембраны с участием специфичной для фосфатидилинозитола фосфолипазы-С (PI-PLC). Высокий уровень содержания GP-2 в зимогенных гранулярных мембранах позволяет выдвинуть гипотезу, в соответствии с которой этот белок играет важную роль в образовании гранул. Однако были опубликованы данные о том, что мРНК GP-2 отсутствует в поджелудочной железе эмбрионов крыс, а GP-2 экспрессируется только после рождения в доотьмный период(период молочного вскармливания). Поскольку поджелудочная железа эмбрионов крыс содержит много гранул, можно предположить, что белок GP-2 несуществен с точки зрения образования гранул (DittieКеrn, 1992). Эти наблю 003131 18 дения были подтверждены исследованиями на поджелудочной железе свиньи: в этом случае белок GP-2 и соответствующая мРНК отсутствуют у плода и начинают вырабатываться только на 21-й день после опороса. Таким образом,плодные гранулы полностью свободны от белкаGP-2 (Laine et al., 1996). При исследовании диабета на животных моделях появление антигенов во время отъма может объяснить сопутствующее развитие в тот же момент и инсулита. Точное функциональное название белкаGP-2 неизвестно, однако, с учтом того, что этот белок существует и в цитоплазматической форме (40%), и связанный с мембраной (60%) в зимогенных гранулах, он должен обладать и внутриклеточными, и внеклеточными функциями. Поскольку белок GP-2 экспрессируется у грызунов и свиней после рождения, толерантность к этой молекуле должна быть индуцирована в процессе эмбрионального развития периферически, а не в пределах гипофиза. Было показано(Pulendran et al., 1995; ShokatGoodnow, 1995),что В-клетки в зародышевом центре лимфатического узла становятся апоптотическими в ответ на появление растворимого антигена. Следовательно, растворимая (цитоплазматическая) форма белка GP-2 может играть роль в индукции толерантности путм связывания с иммуноглобулиновым рецептором на реактивных поGP-2 В-клетках зародышевого центра лимфатического узла, опосредуя тем самым апоптоз. Связывающаяся с мембраной форма белкаGP-2 может быть секретирована с мембраны с участием протеаз и фосфолипаз: присутствие инозитол-1,2-(циклического) монофосфата на секретируемом гидрофильном GP-2, как было показано, подтверждает активность фосфолипазы-С в отщеплении GP-2 от мембраны (Paul etal., 1991). Липидные продукты, такие как 1,2 диацилглицерин и фосфатидная кислота или инозитолгликан, производные от липидных якорей поверхностно-клеточных белков с участием фосфолипаз, протеаз или гидролаз, могут быть интернализованы и участвовать в механизме вторичных переносчиков сигнала.GPIсвязанные белки также могут быть напрямую вовлечены в передачу сигналов путм перекрстного сшивания их N-концевых доменов. Передача сигнала опосредуется тирозинкиназами семейства src-p56-lck и p59-fyn - и связана с участием якоря GPI (Shenoy-Scaria et al., 1992). Белок GP-2 также, как было показано, обладает каталитическими свойствами: он был определн как нуклеозидфосфатаза, проявляющая активности ди- и трифосфатазы в пределах мембран зимогенных гранул у свиньи. Это указывает на то, что он вовлечн в энергопотребляющие процессы в цитозоле (SorianiFreiburghaus, 1996). Белок GP-2 характеризуется 53%-ной идентичностью и 85%-ным сходством с белком ТНР (Уромодулину/Тамма-Хорсфалла) человека на участке, состоящем из 450 аминокислот в их 19 С-концевой части. ТНР также является GPIсвязывающимся белком, и оба белка относятся к семейству белков, включающему спермические рецепторы Zp2 и Zp3 (факторы вителлинового слоя яйцеклеток, участвующие в адгезии сперматозоидов) и -гликан (рецептор III типа TGF), и характеризуются 260-аминокислотным доменом, общим для таких разных белков (BorkSander, 1992). Новый идентифицированный здесь -клеточный белок, кодируемый клоном кДНК, состоящим из 2000 нуклеотидов, также должен принадлежать к этому семейству белков и должен характеризоваться важной ролью в контроле секреторных процессов в -клетках. В случае различных путей применения антитело или эквивалентный лиганд в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, пептид, олигопептид, полипептид или белок, распознаваемый таким антителом, могут быть соединены с эффекторной или репортерной молекулой, такой как метка, токсин или биологически активная молекула. В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляется антитело или эквивалентный лиганд в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения или пептид, олигопептид, полипептид или белок, распознаваемый таким антителом, которые являются химически модифицированными, связанными с биологическим или синтетическим соединением, или соединнные с ферментом, индикаторным соединением, лекарственным соединением, токсином или радиоактивной меткой, с целью применения в качестве фармацевтического или диагностического агента. Подходящие метки должны быть хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, такие метки могут включать дополнительный белок или полипептид, присоединнный к антителу, его фрагменту или эквивалентному лиганду по его С- или N-концу,или встроенный внутрь него. Целью такого присоединения дополнительного полипептида может быть облегчение выявления, экспресси, разделения или очистки данного антитела, его фрагмента или эквивалентного лиганда или они могут быть использованы для придания дополнительных свойств данному антителу, его фрагменту или эквивалентному лиганду в соответствии с желаемым. Конкретными подходящими "кандидатами" для такого присоединения должны быть такие репортерные молекулы, как люцифераза,зелный флуоресцирующий белок или пероксидаза редьки. Метками могут быть радиоактивные метки или молекулы, которые можно обнаружить спектроскопическим путм, например,флуоресцирующие или фосфоресцирующие химические группы. Также могут быть использованы такие линкерные молекулы, как стрептавидин или биотин. Кроме того, другие пептиды 20 или полипептиды могут быть использованы в качестве "кандидатов" для присоединения. Подходящими пептидами могут быть, например, галактозидаза, глутатион-S-трансфераза, люцифераза, полигистидиновые "метки", секреторносигнальные пептиды, Fc-фаргмент антитела,пептид FLAG, целлюлозо-связывающие домены, кальмодулин и мальтозо-связывающийся белок. Эти слитые молекулы могут быть слиты химическим путм с использованием таких методов, как перекрстное химическое сшивание. Подходящие методы хорошо известны специалистам в данной области техники и могут включать, например, перекрстное сшивание по тиоловым группам в составе остатков цистеина или перекрстное сшивание формальдегида. Химическое перекрстное сшивание может во многих случаях быть использовано для соединения небелковых компонентов, такие как циклические пептиды и "простые" метки. Когда является желательным соединять две или большее число белковых молекул, избираемый метод должен быть обычно связан с соединением молекул генетическим путм. С целью создания рекомбинантного слитого белка, гены или генные продукты, которые кодируют белки или интересующие белковые фрагменты, конструируются таким образом, чтобы образовывать один протяжнный ген, выстроенный так, чтобы все кодоны обеих генных последовательностей транскрибировались в составе единой кодирующей рамки. Соединения по настоящему изобретению также могут быть соединены с подложкой, которая могла бы быть использована для отделения, выделения или экстракции анти-анти-TCRV антител из тканей тела. Подложка может включать любой подходящий инертный материал, например, гели, намагниченные и иные шарики, микросферы, связывающие колонки и смолы. Белковые или пептидные соединения в соответствии с настоящим изобретением должны по преимуществу быть экспрессированы в рекомбинантной форме за счт экспрессии кодирующей ДНК в экспрессирующем векторе в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области техники, а многие из них подробно описаны в руководствах "DNA Cloning: A Practical Approach", Vol. II, "Expression Systems", ed. D. M.Practical Approach", Vol. IV, "Mammalian Systems", ed. D. M. Glover, IRL Press, 1995. Белковые соединения также могут быть получены с применением методик генной инженерии, таких как направленный или случайный индуцированный мутагенез в соответствии с описанным,например, в "Molecular Cloning: A Laboratoryal., IRL Press, 1993. Подходящие экспрессирующие векторы могут быть подобраны с учтом выбранного организма-хозяина. Вектор может включать рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую соединения по настоящему изобретению, функционально присоединнную к последовательности, регулирующей экспрессию, или клонирующий носитель рекомбинантной ДНК, или вектор, включающий такую рекомбинантную молекулу ДНК, находящуюся под контролем промотора, распознаваемого собственной контролирующей транскрипцию системой организма-хозяина. Выбор подходящих организмов-хозяев обычно связан с использованием прокариотических видов, таких как E.coli, или являющихся эукариотами дрожжей, которые могут быть модифицированы таким образом, чтобы экспрессировать на высоком уровне рекомбинантные белки, и которые могут быть выращены в большом количестве. Также подходящими являются растущие in vitro линии клеток млекопитающих,в частности, в тех случаях, когда применяются опосредуемыми вирусами экспрессионные системы, такие как бакуловирусные экспрессионные системы, которые вовлекают использование клеток насекомых в качестве клеток-хозяев. Соединения также могут быть экспрессированыin vivo, например, в личинках насекомых или в тканях млекопитающих. В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляется фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное или поликлональное антитело или функционально эквивалентный лиганд, обладающий реактивностью по отношению к антителу к TCR-V, или пептид, олигопептид, полипептид или белок, распознаваемый такими антителами (которые сами не являются анти-ТСRV антителами) в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем. Подходящие наполнители хорошо известны специалистам в данной области техники и могут, например,включать фосфатный буфер (0,01 М фосфорных солей, 0,0027 М КСl, 0,138 М NaCl рН=7,4). Фармацевтические композиции также могут содержать дополнительные консерванты, обеспечивающие длительность их хранения. Моноклональное или поликлональное антитело или функционально эквивалентный лиганд, обладающий реактивностью по отношению к антителу к TCR-V, или пептид, олигопептид, полипептид или белок, распознаваемый таким антителом, может представлять единственный активный компонент композиции или может образовывать часть фармацевтической упаковки для местного (например, как компо 003131 22 нент крема), перорального или парентерального введения. В соответствии с ещ одним аспектом настоящего изобретения представляется применение антитела или эквивалентного лиганда, обладающего реактивностью к анти-TCRV антителу, в производстве лекарственного препарата, предназначенного для лечения ИЗСД, ИНСД или другого аутоиммунного заболевания, специфичного или неспецифичного в отношении отдельного органа, сердечнососудистого заболевания, связанной с раковой опухолью кахексии и рака, а также любых других заболеваний, при которых имеет место присутствие антифосфолипидных антител и (или) гиперинсулинемия и инсулиновая резистентность. В соответствии с ещ одним аспектом настоящего изобретения представляется способ лечения ИЗСД, ИНСД или другого аутоиммунного заболевания, специфичного или неспецифичного в отношении отдельного органа, сердечно-сосудистого заболевания, связанной с раковой опухолью кахексии и рака, а также любых других заболеваний, при которых имеет место присутствие антифосфолипидных антител и (или) гиперинсулинемия и инсулиновая резистентность. В соответствии с ещ одним аспектом настоящего изобретения представляется применение пептида, олигопептида, полипептида или белка, который связан с моноклональным или поликлональным антителом или эквивалентным лигандом, обладающим реактивностью в отношении анти-TCR-V антитела, которое не является анти-TCR-Vp антителом, в производстве лекарственного препарата, предназначенного для лечения ИЗСД, ИНСД или другого аутоиммунного заболевания, специфичного или неспецифичного в отношении отдельного органа,сердечно-сосудистого заболевания, связанной с раковой опухолью кахексии и рака, а также любых других заболеваний, при которых имеет место присутствие антифосфолипидных антител и (или) гиперинсулинемия и инсулиновая резистентность. В соответствии со следующим вариантом настоящего изобретения представляется способ выявления естественно встречающегося аутоантитела, включающий обеспечение контакта образца крови, плазмы или сыворотки или другой жидкости тела с моноклональным или поликлональным антителом или эквивалентным лигандом в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения и с молекулами-мишенями, и оценку количества упомянутого естественно встречающегося аутоантитела, которое специфически связывается с молекулой-мишенью. Моноклональное или поликлональное антитело или эквивалентный лиганд могут быть помечены, например, ферментом, таким образом, что 23 бы помеченное антитело или эквивалентный лиганд конкурировал с аутоантителами за образование комплекса с молекулами-мишенями. Количество связанной метки в упомянутых комплексах, таким образом, обратно пропорционально концентрации аутоантител, присутствующих в упомянутом образце. Если для мечения используется фермент, то образование комплектов будет ингибировать, инактивировать активность фермента так, что уровень его активации или ингибирования оказывается обратно пропорциональным концентрации аутоантител, которые присутствуют в данном образце. В одном из аспектов данного варианта настоящего изобретения молекула-мишень, которая может быть, например, поликлональной или моноклональной молекулой иммуноглобулина кTCR-V или любой е частью, которая идентифицирует, по крайней мере, один эпитоп в составе V-субъединицы Т-клеточного рецептора человека или любого другого вида животного,связывается с ферментом, сцепленным с субстратом таким образом, что связывание антитела с молекулами-мишенями активирует этот фермент и обусловливает изменение окрашивания, которое можно оценить спектрофотометрическим путм. Молекулы-мишени могут быть соединены с ферментом, который связан с субстратом, и могут присутствовать на погружающейся палочке, с помощью которой может быть осуществлн контакт с упомянутым образцом. Также настоящее изобретение представляет применение антитела или эквивалентного лиганда, обладающего реактивностью по отношению к анти-TCR-V антителу, или пептид,олигопептид, полипептид или белок, который связан с моноклональным или поликлональным антителом или эквивалентным лигандом, обладающим реактивностью по отношению к антиTCR-V антителу (например, ESRP1), в качестве компонента для набора, предназначенного для выявления или количественного анализа уровня естественно встречающихся аутоантител у пациента. Такой набор должен быть сходным с набором для радиоиммунного тестирования или ТИФА и должен дополнительно содержать средства детекции, которые позволяют вести точный количественный анализ представляющего интерес соединения. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области техники. Антитело или эквивалентный лиганд, или пептид, олигопептид, полипептид или белок,который связан с моноклональным или поликлональным антителом или эквивалентным лигандом, может быть соединн с намагниченными шариками, агарозными шариками или они могут быть зафиксированы на дне многолуночных планшетов. Это должно позволить удалять несвязанные соединения из образца после инкубации. С другой стороны, белок может быть 24 связан с SРА-шариками (применяются в тесте на сходство сцинтилляций): в этом случае отсутствует необходимость удаления несвязанного материала. С использованием набора непомеченных стандартов данные, полученные с их использованием, могут быть подвергнуты сравнению с результатами, полученными на измеряемом образце. Антитело или эквивалентный лиганд, обладающий реактивностью по отношению к анти-TCR-V антителу, или пептид, олигопептид, полипептид или белок, который связан с моноклональным или поликлональным антителом или эквивалентным лигандом, обладающим реактивностью по отношению к анти-TCR-V антителу, также могут быть использованы для выявления естественно встречающихся аутоантител в ткани пациента. Любая методика, обычная в данной области техники, может быть использована в такой детекции и может включать любые способы блоттинга (промакивания)(Towbin et al., 1979), связывающие колонки,разгонку в геле, хроматографию или любые иные подходящие методы, широко применяемые в данной области техники. Настоящее изобретение также представляет последовательность кДНК, РНК или геномной ДНК, включающую последовательность,кодирующую антитело или эквивалентный лиганд в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения или кодирующую пептид,олигопептид, полипептид или белок в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, предназначенные для применения в составе фармацевтического или диагностического агента. В связи с белком ESRP1 предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты включает фрагмент нуклеотидной последовательности, идентичный или комплементарный любому сегменту в составе любой из нуклеотидных последовательностей, показанных на прилагаемой фиг. 1,или последовательность, которая является вырожденной или в существенной степени гомологичная им, или которая гибридизует с упомянутой последовательностью. Под "существенной гомологией" понимается то, что последовательности проявляют, по крайней мере, 50%ный уровень гомологии, а предпочтительно 60%-ный уровень гомологии. "Гибридизуемые последовательности", включенные в объм настоящего изобретения, это те, которые гибридизуют в стандартных не являющихся жсткими условиях (6xSSC + 50% формамида при комнатной температуре) и подвергаются промывке в условиях низкой жсткости (2xSSC, комнатная температура; или 2xSSC, 42 С), или, что предпочтительнее, в стандартных условиях высокой жсткости: например, 0,1xSSC при 65 С (где 25 Последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением может быть одно- или двухцепочечной ДНК,кДНК или РНК. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты является ДНК. Настоящее изобретение также представляет клонирующие и экспрессирующие векторы,включающие последовательности ДНК по настоящему изобретению. Такие экспрессирующие векторы должны включать последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию, например, энхансерные элементы, промоторно-операторные сегменты,стоптерминирующие последовательности, последовательности, обеспечивающие стабильность мРНК, старт- и стоп-кодоны или сайты связывания рибосом, связанные в единую рамку в составе молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Кроме того, в отсутствие естественного эффективного сигнального пептида в данной аминокислотной последовательности может быть применн стандартный способ обеспечения секреции рекомбинантного белка различными организмами-хозяевами. Соответственно,дополнительные компоненты таких векторов могут включать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности,контролирующие и обеспечивающие секрецию. Векторы в соответствии с настоящим изобретением включают плазмиды и вирусы(включая и бактериофаги, и вирусы эукариот). Многие такие векторы и экспрессионные системы хорошо известны и описаны в данной области техники. Конкретными подходящими вирусными векторами являются векторы, основанные на бакуловирусах, аденовирусах и вирусе коровьей оспы. Экспрессия гетерологичных полипептидов и полипептидных фрагментов в прокариотических клетках, таких как E.coli, хорошо известны в данной области техники: см., например, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed Cold Spring Harbor Lab.Press; или "DNA Cloning: A Practical Approach",Vol. II, "Expression systems", ed. D.M. Glover,IRL Press, 1995. Экспрессия в культивируемых эукариотических клетках также является подходом, известным специалистам в данной области техники в связи с получением гетерологичных белков: см., например, O'Reilly et al., 1994, "Baculovirus expression vectors - a laboratory manual",Oxford Univ. Press; или "DNA Cloning: A Practical Approach", Vol. IV, "Mammalian systems", ed.D.M. Glover, IRL Press, 1995. Подходящие векторы могут быть выбраны или сконструированы для экспрессии пептидов или белков, пригодных для использования в соответствии с настоящим изобретением, так,чтобы они включали подходящие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминирующие последова 003131 26 тельности, полиадениловые сигналы, энхансеры, маркерные гены и другие последовательности, если это нужно. Векторами могут быть плазмиды, вирусы, например, бактериофаги,или фагмиды, если это удовлетворяет поставленной задаче. Более подробно описание этого можно найти в руководстве "Molecular Cloning:A Laboratory Manual". Многие известные методики и протоколы воздействия на нуклеиновую кислоту, например, связанные с получением нуклеотидных конструкций, мутагенезом, секвенированием, внесением ДНК в клетки и экспрессией генов, а также анализом белков, подробно описаны в руководствах Ausubel et al.,1992, "Short Protocols in Molecular Biology", 2dPress, 1993. Например, для эукариотических клеток, предпочтительными являются векторы,основанные на вирусах. В другом аспекте настоящего изобретения представляется клетка-хозяин, несущая антитело или эквивалентный лиганд в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, или кодирующая пептид, олигопептид, полипептид или белок в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения. В ещ одном аспекте представляется способ, включающий внесение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или организм. Внесение нуклеиновой кислоты может быть выполнено с помощью любой пригодной методики. В эукариотических клетках подходящими методиками являются трансфекция фосфатом кальция, DEAE-декстран, электропорация, трансфекция, опосредуемая липосомами, или трансдукция с использованием ретровирусов или других вирусов, таких как вирус коровьей оспы или, в случае с клетками насекомых, бакуловирус. В бактериальных клетках подходящие методики могут включать трансформацию хлоридом кальция, электропорацию или трансфекцию с помощью бактериофага. После внесения нуклеиновой кислоты может быть обусловлена экспрессия этой нуклеиновой кислоты, например, путм культивирования клеток-хозяев в условиях, благоприятствующих экспрессии этого гена. В одном из вариантов нуклеиновая кислота по настоящему изобретению интегрируется непосредственно в состав генома (например, в хромосому) данной клетки-хозяина. Интеграция в геном может быть обеспечена включением последовательностей, которые способствуют рекомбинации в пределах генома, с применением стандартных методик. Трансгенные животные, трансформированные таким образом, чтобы экспрессировать и сверхэкспрессировать в зародышевой линии одной или большего числа соединений в соответствии с описанным здесь, представляют ещ один аспект настоящего изобретения наряду со способами их получения. В настоящее время 27 существуют различные методики внесения трансгенов в эмбрион или зародышевую линию организма, такие, например, как те, которые описаны у Watson et al., 1994, "RecombinantDNA", 2d ed., Sci. American Books. Терапевтическое применение настоящего изобретения и использование его для ответа на пока неразрешнные вопросы о диабете. Нижеследующий материал дан здесь в качестве примера и ни в чм не ограничивает настоящее изобретение. Нарушенная контррегуляция глюкозы Основная проблема лечения пациентов с ИЗСД связана с наличием у них гипогликемии,которая может быть, по крайней мере, отчасти ятрогенной (т.е. вызванной самим лечением) вследствие интенсивного терапевтического использования инсулина, неосознанно приводящего к гипогликемии, однако в основном она определяется компромиссным контррегулированием содержания глюкозы. Дефект контррегуляции глюкозы обусловлен комбинированным дефицитом глюкагоновых и эпинефриновых ответов на падение уровней содержания глюкозы. Ранее было показано, что скрупулзное избегание гипогликемии может, наоборот, приводить к неосознанной гипогликемии, но не к дефектной контррегуляции (Сrуеr, 1995). Не только у пациентов с длительной историей ИЗСД, но и у пациентов со "свежим" его диагнозом имеет место нарушенная контррегуляция. Сравнение контррегуляторных ответов у двадцати детей с только что проявившимся ИЗСД (5-6 дней) и 47 детей с долговременным ИЗСД показало, что глюкагоновый ответ на гипогликемию в обеих группах слабее, чем у контрольных доноров. Эпинефриновые ответы также были пониженными у "новых" пациентов с диагнозом ИЗСД по сравнению с контролем(Hoffman et al., 1994). В данной заявке предполагается, что причиной данных дефектов контррегуляции является персистенция у пациентов с ИЗСД анти-антиV аутоантител, что обусловливает негативную регуляцию описанных выше сигнальных молекул и аннулирует реакцию -клеток и мозговых клеток надпочечников на падающий уровень глюкозы. Это согласуется с выявлением утраты окрашивания на анти-анти-V антитела на срезах ткани поджелудочной железы, полученных от внезапно скончавшихся пациентов, у которых незадолго до этого был диагностирован диабет (см. экспериментальный раздел на стр. 62). Это также совпадает с наблюдениями Бретта с соавт. (Brett et al., 1996), согласно которым лечение пациентов с ревматоидным артритом с использованием Саm-path-1H, активного в отношении GPI-связанного белка CD52, приводит к исчезновению CD52 и других GPI-связанных белков и на В-, и на Т-лимфоцитах у некоторых пациентов, подвергавшихся лечению. CD52 003131 28 негативные В-клетки исчезали из циркуляции в течение 3 месяцев; однако, СD52-негативные Тклетки сохранялись на протяжении по крайней мере 20 месяцев. Следовательно, предотвращение сохранения этих антител у пациентов с ИЗСД должно сглаживать дефекты контррегуляции, предотвращая гипогликемию. Блокирование е развития от рождения должно предотвращать развитие ИЗСД у предрасположенных к нему пациентов. ИНСД должен вылечиваться полностью. Этого можно достигнуть с применением способа, аналогичного введению антитела к D-иммуноглобулину (анти-IgD) матерям с отрицательным резус-фактором, вынашивающим резус-положительных детей (Davey, 1979). Возможные механизмы, которые вовлечены в блокирование выработки антител при этом способе лечения, описаны Хейманом (Heyman, 1990). Как дополнительная мера, иммунизованные пациенты, имеющие патогенные антитела,должны вырабатывать защитные антиидиопатические антитела, которые способны образовывать комплексы с патогенными антителами тогда, когда те появляются. Диабетическая нейропатия Вовлечение почек в диабет I типа характеризуется гипертрофией эпителия и базальных клеточных мембран в клубочках и канальцах и накоплением компонентов межклеточного матрикса в мезангии клубочков (Lane et al., 1990). Развитие заболевания приводит к закупорке просвета клубочковых капилляров, протеинурии и утрате способности к фильтрации. Гипергликемия и выработка TGF- (трансформирующий -фактор роста) вовлечены в механизмы диабетической нефропатии. Высокие концентрации глюкозы приводят к увеличению количества мРНК TGF- и белков в культурах мезангиальных и проксимальных канальцевых клеток; TGF- косвенно опосредует влияние глюкозы на рост клеток и синтез коллагена. Введение антисыворотки к TGF-P, как было показано, подавляет гломерулонефрит в эксперименте (Border, 1990). По-видимому, гипергликемия индуцирует экспрессию TGF-P на начальных стадиях диабета: это подтверждается тем, что и при диабете у человека, и в животных моделях ВВ и NOD возросшая почечная экспрессия TGF- была выявлена в течение нескольких дней после проявления гипергликемии и гипертрофии почек (Yamamoto et al., 1993; SharmaZiyadeh, 1994). В связывании TGF- с его рецептором участвует якорный мембранный протеогликан (гликан), который презентирует TGF- на сигнальный рецептор II типа, являющийся трансмембранной серин-треонинкиназой (LopezCastillas et al., 1994). -Гликан характеризуется наличием внеклеточного участка, которыйTGF-, но не может презентировать его на сиг 29 нальный рецептор - т.е., соответственно, он работает как потенциальный ингибитор такого связывания. -Гликан принадлежит к семейству белков, которое также включает уромодулин и панкреатический мембранный гранулярный белок GP-2. Ранее была продемонстрирована роль уромодулина в связи с участком связывания в составе TGF- (Fukushima et al., 1993). Одним из белков, вовлечнных в подавление действия TGF-, может быть -клеточная молекула, родственная белку GP-2 (кодируемая клоном 5.3), которая существует и в цитоплазматической, и в мембранной формах. Негативная регуляция этих молекул вследствие продолжительного влияния патогенных антител может приводить к аннулированию подавленияTGF-, тем самым обеспечивая проявление его трофических свойств в печени. Введение растворимых пептидов, представляющих молекулы, распознаваемые патогенными антителами,должно проявляться двояко - в подавленииTGF- и в супрессии выработки антител. Пересадка поджелудочной железы Пересадка получает вс большее распространение при диабете I типа, связанного со склонностью к тяжлой гипогликемии. Она призвана решать двуединую задачу - поддержание инсулиновой независимости и частичное восстановление нормального уровня глюкозы(нормогликемии). Если же трансплантация, однако, осуществляется без учта соответствующих параметров диабета, то проблемы, связанные с контррегуляцией глюкозы, могут вновь проявляться при каждом эффективном формировании патогенных антител. В недавнем исследовании 13 успешных случаев пересадки поджелудочной железы при использовании методики поэтапного подавления гипогликемии было показано, что глюкагоновые ответы на гипогликемию восстанавливались. Однако, и стимулированные, и вызванные голоданием уровни глюкагона оказывались существенно выше у пациентов с пересаженной поджелудочной железой по сравнению со здоровым контролем и с пациентами, которым была пересажена почка. Более того, содержание Сбелка также возрастало по сравнению со всеми остальными группами индивидуумов (Kendall etal., 1997). Авторы исследования не комментируют эти данные, которые весьма напоминают преддиабетические состояния. Они сообщают,однако, что эпинефриновые ответы на гипогликемию у пациентов с пересаженной поджелудочной железой улучшались, хотя они были существенно меньшими по сравнению со здоровыми лицами или реципиентами-недиабетиками, которым пересаживали почку. Из этих наблюдений с очевидностью следует, что пересадка от нормального донора (недиабетика) поджелудочной железы пациенту-диабетику "переводит часы" на время преддиабетического состоя 003131-клетками и надпочечниками. Такой пациентдиабетик с пересаженной поджелудочной железой должен быть до пересадки подвергнут такому лечению, которое позволит предотвратить дальнейшие случаи повышения уровня патогенных антител, что должно обеспечить необходимый успех данному мероприятию. Вегетативная нейропатия Диабет, имеющий место в течение длительного времени, может быть осложнн вегетативной нейропатией, являющейся необратимой и обособленной от неосознанной гипогликемии(Сrуеr, 1994; Dagogo-Jack et al., 1993). Подавление гипогликемии путм пересадки поджелудочной железы в исследовании Кендалла с соавт. (Kendall et al., 1997) привело к улучшению и эпинефринового ответа, и гипогликемическому состоянию, несмотря на сохранение вегетативной сердечной дисфункции. При пересадке поджелудочной железы норэпинефриновый ответ, который отсутствует при длительном периоде наличия диабета, не восстанавливался. Хотя реактивность диабетогенных моноклональных антител, специфичных в отношении тел нейронов в вегетативных ганглиях, до сих пор не была исследована, предполагается, что в этих клетках присутствуют соответствующие антигены, которые распознаются этими антителами. На материале различных первичных нейронов была продемонстрирована экспрессия уникального набора GPI-связанных белков. Для некоторых из них было показано соответствие различным параметрам нервных оболочек(Rosen et al., 1992). Такие молекулы должны обладать сходными сигнальными свойствами и могут сходным образом подвергаться влиянию,что и молекулы на -клектах и мозговых клетках надпочечников.GPI-связанный мембранный белок - рецептор цилиарного нейротрофного фактора (CNTF)- ранее уже был выявлен при ряде форм периферической нейропатии, связанной с диабетом. При гипергликемии, индуцированной скармливанием галактозы или обработкой экспериментальных животных стрептозотоцином, уровниCNTF-подобной активности в седалищном нерве снижались спустя 1-2 месяца после проявления гипергликемии. Это было связано со снижением содержания белка CNTF, а не мРНК. Дефицит CNTF вследствие повреждения шванновских клеток может участвовать в проявлении некоторых функциональных и структурных аномалий при экспериментальной диабетической нейропатии. Некоторые из этих аномалий обусловлены метаболизмом гексоз с участием альдозоредуктазы (AR) и могут быть предотвращены с использованием ингибиторов AR. Однако дефицит CNTF только частично восполняется действием таких ингибиторов: это указывает на наличие других, помимо фактора 31 накопления полиолов вследствие активностиAR, факторов ослабления экспрессии CNTF(Mizisin et al. , 1997). Это указывает на то, чтоGPI-связанные молекулы могут играть важную роль в связанной с диабетом периферической нейропатии, равно как и в вегетативной нейропатии. Терапевтическое значение настоящего изобретение и применение его для решения проблем СКВ и первичного антифосфолипидного синдрома Нижеследующее описание приведено в качестве примера и ни в чм не ограничивает настоящее изобретение. Антитела, специфичные в отношении анионных фосфолипидов, таких как кардиолипинHarris et al., 1986). Сходные заключения были сделаны в отношении антител, ассоциированных с системной красной волчанкой (СКВ), называемых волчаночным антикоагулянтом, которые выявляются по их частичному тромбопластиновому времени (Thiagarajan et al., 1980;LoveSantoro, 1990). Как было показано, антикоагулирующее действие обусловливается специфичной реактивностью этих антител в отношении с анионными фосфолипидами (Sammaritano et al., 1990). Кроме того, пациенты с СКВ характеризуются наличием антител, специфичных в отношении нативной двухцепочечной ДНК, которые рассматриваются как диагностические маркры СКВ (Veinstein et al., 1983). Большинство пациентов, имеющих антифосфолипидные антитела, характеризуются СКВ или родственным аутоиммунным состоянием; однако, у некоторых пациентов нет каких-либо других выявляемых заболеваний, поэтому их диагностируют как "первичный синдром антифосфолипидных антител" (PAPS) (Asherson et al.,1989; Branch et al., 1990). Недавно патогенная роль этих антител была установлена при индукции выкидышей у беременных мышей путм пассивного переноса поликлональных антифосфолипидных антител человека (Branch et al.,1990). Синдром PAPS также был индуцирован у неподвергавшихся какому-либо иному воздействию мышей путм пассивного переноса человеческих поликлональных и мышиных моноклональных антител, специфичных в отношении кардиолипина (Blank et al., 1991). Антитела к фосфолипидам или к кардиолипину также встречаются при ряде нейрологических состояний, и их роль была подчркнута при локальной церебральной ишемической болезни, мигренях, хорее, припадках и других состояниях LevineWelch, 1987). К настоящему времени происхождение антител, специфичных в отношении фосфолипидов и двухцепочечной ДНК, неизвестно. Исследования в этой области должны быть сосредо 003131 32 точены на параметрах связывания с лигандами,характерных для антител к фосфолипидам. Поликлональные антифосфолипидные антитела,выделенные у пациентов, характеризуются перекрстной реактивностью по отношению к большинству анионных фосфолипидов Lafer etal., 1981; Pengo et al., 1987). Однако внимание было отвлечено на другие лиганды: было показано, что моноклональные антитела, которые связываются с полинуклеотидами, такими как ДНК, также связываются с кардиолипином и другими анионными фосфолипидами (Schoenfeld et al., 1983; Rauch et al., 1984; Smeenk et al.,1987). Такая перекрстная реактивность предположительно обусловливалась сходством химической структуры у ДНК и фосфолипидов,каждый из которых включают фосфодиэфирноподобные фосфатные группы, разделнные тремя атомами углерода (Lafer et al., 1981). Липотейхоевые кислоты некоторых грамположительных бактерий и эндотоксин грамотрицательных бактерий также включают фосфорные эфиры: предполагается, что такие молекулы,входящие в состав чужеродных антигенов, могут опосредовать образование антифосфолипидных антител (Carroll et al., 1985). Недавно было показано, что образование антител к двухцепочечной ДНК коррелирует с частой реактивацией полиомавирусов (опухолеродных вирусов) у пациентов с СКВ. Однако высокое содержание антител к двухцепочечной ДНК было выявлено и в отсутствие вирусной ДНК (Rekvig et al., 1997). Уже было продемонстрировано здесь, что и кардиолипиновые, и анти-дцДНК реактиваты входят в круг специфичностей анти-анти-TCRV антител (см. табл. 3; описания методов даны в экспериментальном разделе). Это является характерным и для поликлональных антител мышей, иммунизованных моноклональными антителами к TCR-V, и для моноклональных анти-анти-TCR-V антител, вырабатываемых такой иммунизованной мышью. Более того,упомянутая поликлональная мышиная антисыворотка обладает мощным противосвртывающим действием. Вероятные механизмы патофизиологической роли анти-анти-TCR-V антител уже обсуждались здесь выше (см. стр. 20). Использование поликлональных или моноклональных анти-анти-TCR-V антител для предотвращения их же выработки или для индукции выработки защитных антител было уже заявлено выше (см. стр. 40). Такие способы должны предотвращать образование сочетания патогенных антител к ДНК и фосфолипидам, в результате чего должно происходить ослабление заболевания, вызываемого этими антителами. 33 Применение настоящего изобретения в отношении других заболеваний, связанных с нарушением гормональной регуляции, и состояний, при которых имеет место дисфункция -клеток или гиперинсулинемия и инсулиновая резистентность Как отмечалось выше, анти-анти-TCR-V антитела связываются с -клетками островков Лангерганса поджелудочной железы и других эндокринных органов: это предполагает то, что соответствующие молекулы-мишени вовлечены в их секреторные механизмы. Это должно объяснять то, что эндокринные аутоиммунные заболевания могут затрагивать более одного органа у отдельного пациента, или же могут присутствовать аутоантитела, специфичные в отношении клинически "незатронутого" органа. Заболевания, которые могут в этом смысле "сосуществующими" - это, помимо прочего, гипотиреоидоз, гипертиреидоз (болезнь Грейвза), сахарный диабет, болезнь Аддисона, первичный гипогонадизм, гастрит с аутоиммунной этиологией и пернициозная анемия, - при том, что параметры заболеваний отражают индивидуальную генетическую предрасположенность данного пациента. Нижеследующее описание дано в качестве примера и ни в чм не ограничивает настоящее изобретение. Аутоиммунное заболевание щитовидной железы Встречаемость аутоиммунного заболевания щитовидной железы существенно выше у пациентов с ИЗСД по сравнению с общим населением (PayamiThomson, 1989). Аномальная толерантность к глюкозе и увеличенная выработка глюкозы печенью часто наблюдается при гипертиреоидозе (Wennlund et al., 1986). Ускорение глюконеогенеза является индикатором гиперглюкагонемии, которая была выявлена и в исходном состоянии, и после инфузии инсулина у 8 пациентов, у которых только что был диагностирован гипертиреоидоз (Moghetti et al.,1994). Количественное снижение уровня глюкагона после введения глюкозы или после прима пищи оказывается существенно меньшим у пациентов с гипертиреоидозом, независимо от наличия у них гипергликемии (KabadiEisenstein, 1980; Bech et al., 1996). Регуляции секреции инсулина у пациентов с гипертиреоидозом также нарушена. При ряде состояний, таких как блокировка гипергликемии (O'Меаrа et al.,1993), при голодании или после прима пищи(Bech et al., 1996) концентрации иммунореактивного инсулина были выше у пациентов с тиеротоксикозом по сравнению с контролем. Такое повышение иммунореактивного инсулина было объяснено интенсификацией секреции проинсулина. Также имеется подтверждение повышения секреции АСТН (адренокортикотропный гормон), кортизола и гормона ростаet al., 1994; Gallagher et al., 1971): это согласуется с гипотезой о том, что нарушение регуляции нормального негативного контроля секреции гормонов по типу обратной связи обусловливается связыванием анти-анти-V антител на антигенах-мишенях в этих органах. Нарушение регуляции секреции глюкагона и инсулина при тиретоксикозе сходно с преддиабетическим и собственно диабетическим состояниями; аналогично ночной выброс TSH сглажен у большинства пациентов-диабетиков (Coiro et al., 1997). Синдром поликистоза яичников (СПКЯ) У женщин с СПКЯ (=синдромом ШтейнаЛевенталя) имеет место постоянный усиленный ранний инсулиновый ответ на внутривенное введение глюкозы: это указывает на наличие первичного нарушения инсулиновой секреции(Holte, 1995). Такие женщины также характеризуются гипергликемическим и гиперинсулинемическим ответами в процессе тестирования по пероральному введению глюкозы (ТПВГ) (Dunaif et al., 1987). Однако было сообщено, что женщины с СПКЯ характеризуются сглаженными глюкагоновыми ответами, не зависящими от гипергликемии, обусловливаемой тестом ТПВГ (Golland et al., 1990). Это указывает на то,что гормон контррегуляции глюкозы "второго эшелона" - а именно эпинефрин - должен характеризоваться увеличенным содержанием у женщин с СПКЯ. С этим утверждением согласуется обнаружение гиперандрогенизма надпочечников у половины женщин, характеризующихся избытком андрогенов (Ehrmann et al.,1992). Влияние адреналина на выработку стероидных гормонов было продемонстрировано и на материале изолированных перфузируемых надпочечниках, и на молекулярной уровне (EhrhartBomstein et al., 1994; Guse-Behling et al., 1992). Гистологическое выявление иммунологического окрашивания смеси кортикальных надпочечниковых клеток в пределах целой мозговой части надпочечника и наоборот подтверждает роль мозгового вещества надпочечников, как регулятора адренокортикотропной функции по паракринному типу (Bomstein et al., 1994). Молекулы, распознаваемые патогенными аутоантителами, описанными в настоящем изобретении, в большом количестве представлены в мозговых клетках надпочечников (фиг. 3). Появление таких аутоантител может быть обусловлено усилением секреции адреналина, обусловливающим гиперандрогенизм надпочечников при СПКЯ. Гиперандрогенизм надпочечников часто сопровождается гиперандрогенизмом яичников,что, как правило, сопровождается увеличением количества ЛГ. Аномальные параметры выработки стероидных гормонов яичниками могут быть лишь отчасти объяснены гиперстимуляцией ЛГ в оболочковых клетках и гиперответом на рилизинг-фактор гонадотропинов. Инсулин и 35 инсулиноподобный фактор роста усиливают андрогенный ответ оболочковых клеток на ЛГ за счт увеличения содержания ферментов, от которых зависит скорость метаболических реакций, участвующих в стероидогенезе в яичниках, и за счт реверсии ЛГ, индуцированного негативной регуляцией этих ферментов (Hernandez et al., 1988; Magoffin et al., 1990). Следовательно, гиперинсулинемия предположительно является основным фактором нарушения регуляции яичников (Ehrmann et al., 1995). Гиперинсулинемия также, по-видимому,играет роль в гиперандрогенизме надпочечников, однако не напрямую, а за счт синергизма со стимуляцией АСТН (Moghetti et al., 1996). Секреция являющихся гликопротеинами гормонов гипофиза является пульсирующей, а нарушение е пульсов может изменять репродуктивные функции (Samuels et al., 1990; Santoro et al., 1986). Было показано, что культивируемые гипофизарные лактотрофы (клетки, вырабатывающие пролактин) экспрессируют GPIсвязанные молекулы, которые быстро гидролизуются при обработке TRH (Benitez et al., 1995). Ингибирование фосфолипазы-С предотвращает действие TRH и образование вторичного предшественника (Peerz et al., 1997). Секреция АСТН клетками передней части гипофиза крыс,как было показано, блокируется путм подавления активности фосфолипазы-С (WonOrth,1995). Влияние АСТН также имитируется фосфолипазой-С (FosterVeitl, 1995). Было сообщено (Villa et al., 1995), что накопление альдостерона в адренокортикотропных клетках подавлялось в дозозависимом режиме инозитолфосфогликанами: это показывает регуляторную активность этих молекул. Полученные данные показывают наличие далеко простирающегося эффекта блокирующих сайтов фосфолипазы-С,опосредуемых анти-анти-TCR-V антителами,описанными здесь. Ожирение Гиперинсулинемия характерна и для юношеского, и для взрослого ожирения. Сообщалось (Le StunffBougneres, 1994) о том, что 76%-ное возрастание инсулинового ответа имеет место после стандартного прима пищи у детей при долговременном или кратковременном течении ожирения; уровни инсулина при голодании возрастают параллельно продолжительности ожирения. У детей с ожирением при его длительном или кратковременном течении также отмечается гипергликемия после стандартного прима пищи по сравнению с контролем, что согласуется с сообщением об интенсификации глюконеогенеза у детей, у которых ожирение было диагностировано недавно (LeStunnfBougneres, 1996). Увеличение выработки инсулина в ответ на прим пищи, как было показано, персистирует у женщин, характеризующихся мощным ожирением после того, как был достигнут нор 003131 36 мальный вес тела (Fletcher et al., 1989). Следовательно, гиперинсулинемия, по-видимому, является первопричиной возникновения ожирения. При ожирении у взрослых гиперинсулинемия также ассоциирована с увеличенным содержанием свободных жирных кислот как во время голодания, так и сразу после прима пищи (Golay et al., 1986). Усиленный глюконеогенез и гиперинсулинемия предположительно являются следствием нарушения регуляции секреции глюкагона при ожирении. Сообщалось (Borghiet al., 1984) о том, что у пациентов с ожирением глюкоза не способна подавлять секрецию глюкагона. Голланд с соавт. (Golland et al., 1990) показали, что женщины с ожирением характеризуются существенно более сильным глюкагоновым ответом спустя 60, 90 и 120 мин после перорального введения глюкозы по сравнению с индивидуумами, не характеризующимися ожирением. Все эти данные указывают на отсутствие регуляторных сигналов в -клетках поджелудочной железы, что аналогично преддиабетическому и диабетическому состояниям. Синдром Кушинга Это заболевание обычно ассоциировано с непереносимостью глюкозы, диабетом, генерализованным ожирением, гирсутизмом и повышенным артериальным давлением. Основной диагностический признак - это "гиперкортизолизм" (повышенная выработка кортизола), которая может быть следствием долговременной гиперсекреции АСТН у 20-40% пациентов(Doppman et al., 1988); это может происходить в отсутствие аденомы гипофиза, а повышенная секреция кортизола может быть обусловлена односторонней или двусторонней гиперплазией надпочечников, сопровождающейся или несопровождающейся наличием автономных секретирующих микро- или макроузелков (Hermus etal., 1988). В недавнем комплексном анализе 90 пациентов с ожирением и диабетом распространнность синдрома Кушинга, как сообщалось, составило 3,3% (Leibowitz et al., 1996). Преклинические и субклинические случаи симптомов Кушинга, которые имеют место в слабо контролируемых группах диабетиков, могут существенно повышать данную оценку. Аналогично была установлена связь слабого хронического гиперкортиколизма с диабетом I типа: она отражается повышенным уровнем кортизола при голодании и содержания свободного кортизола в моче и увеличеным ответом на овечий рилизинг-фактор кортикотропина (Roy et al., 1993). Гиперсекреция АСТН может иметь место в отсутствие аденомы гипофиза, но при наличии гиперкортизолемии (GrantLiddle, 1960): это предполагает нарушение регуляции нормальной негативной регуляции по типу обратной связи. В некоторых сообщениях рассматривается рольGPI-связанных молекул и высвобождаемых в ответ на активацию фосфолипазы-С инозитол 37 фосфогликанов в регуляции и секреции гормонов гипофиза, и секреции гормонов, которые их стимулируют, из надпочечников, щитовидной железы, половых желез и т.п. (Fanjul et al., 1993;Shaver et al., 1993; Villa et al., 1995). Таким образом, предполагается, что аутоантитела, описанные в данной заявке, должны обладать патогенными эффектами в пределах от нарушения пульсирующей секреции гормонов до ингибирования или усиления секреции и даже образования опухолей, поскольку антитела, специфичные к связанным на GPI молекулам, как было показано, индуцируют пролиферацию клеток за счт обусловливания утраты ингибиторного вклада в активирующиеся сигналы (RobinsonHederer, 1994; Benitez et al., 1995). Метаболический Х-синдром и сердечнососудистые заболевания Х-синдром является сочетанием (симптомокомплексом) гиперинсулинемии, непереносимости глюкозы, повышением содержания очень низкомолекулярных липопротеинов и триглицеридов, снижением содержания высокомолекулярных липопротеинов и гипертензии. С этим синдромом также ассоциировано генерализованное ожирение. Первопричиной данного синдрома предположительно является резистентность к инсулину (Reaven, 1988; Reaven,1995). По оценке (Hrnciar et al., 1992) встречаемость синдрома у населения в целом составляет 5-10%, в группе пациентов с повышенным артериальным давлением - 15-30%, у пациентов с ИНСД - 65-90%, у женщин с гирсутизмом -1020%, и пациентов с инфарктом миокарда - 3050%. По данным (Piedrola et al., 1996), у 82,5% из 40 пациентов с только что диагностированным поражением коронарной артерии имеет место резистентность к инсулину, а у 27 из 40 имеется аномальный ответ в тесте на восприимчивость к перорально вводимой глюкозе. Гиперинсулинемия и резистентность к инсулину коррелируют с тяжестью поражения периферических сосудов, коронарных и сонных артерий(Standl, 1995; Reaven, 1995) и они также вовлечены в проявление микрососудистой ангины и индуцированной физическими упражнениями ишемии коронарных сосудов (Vertergaard et al.,1995). При обследовании 2930 пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и Хсиндромом было сообщено (Ferrannini et al.,1991) о том, что обособленные формы каждого из состояний этого синдрома были редкими, в то время как часто они были ассоциированы с гиперинсулинемией: это подтверждает то, что это является ключевым параметром данного синдрома. Также было предположено (Sowers etal., 1993), что гиперинсулинемия может участвовать в индукции развития гипертензии путм обусловливания атеросклероза и перерождения сосудов. Резистентность к инсулину, как было выявлено, ассоциирована с утолщением стенок 38 сонной артерии (Suzuki et al., 1996) и увеличением количества бляшек на сонных артериях(Salonen et al., 1998) подтверждают справедливость гипотезы, в соответствии с которой невосприимчивость инсулина является фактором этиологии гипертензии и дислипидемии. Было показано (Moller et al., 1996), что чистый дефект сигналов, опосредованных мышечным рецептором инсулина, обусловливает невосприимчивость инсулина, гиперинсулинемию, ожирение,повышение концентрации триглицеридов и свободных жирных кислот в плазме у трансгенных мышей. При взятии биопсийных проб у мышей с ИНСД была выявлена общая недостаточность инозитолфосфогликановых посредников активности инсулина (Asplin et al., 1993). Патогенные антитела, описанные в данной заявке, могут перекрстно реагировать с такими посредниками и индуцировать невосприимчивость инсулина как за счт его негативной регуляции, так и также путм нарушения пульсирующей секреции инсулина. Иммунологически опосредуемые мультисистемные заболевания Гиперинсулинемия и невосприимчивость инсулина, как также было продемонстрировано ранее, существенны в связи с мультисистемными заболеваниями, такими как системная красная волчанка и прогрессирующий рассеянный склероз. Сывороточная концентрация инсулина при голодании у 21 такого пациента была вдвое выше, чем у нормального контроля: также у них было отмечено существенное более высокое содержание триглицеридов и пониженное содержание уровней холестерола высокомолекулярных липропротеинов (Mateucci et al., 1996). Рак Гиперинсулинемия, как диабетический симптом непереносимости глюкозы, повышенный темп HGP и резистентность к инсулину ассоциированы со многими типами, включая рак молочной железы, колоректальную карциному, желудочно-кишечный рак, саркому, рак эндометрия, рак простаты, рак головы-шеи и рак лгких (Tayek, 1992; Copeland, Leinster et al.,1987; Copeland, Al-Sumidaie et al., 1987; Tayek,1995; Nagamani et al., 1988). Брюнинг с соавт.(Bruning et al., 1992) показали, что между логарифмированным относительным риском развития рака молочной железы и логарифмированным содержанием С-пептида имеется прямая зависимость. Это соотношение не зависит от индекса веса тела (BMI) или отношения WHR(талия/бдра): у 223 женщин, характеризующихся 1-й или 2-й стадией рака молочной железы, имелась инсулиновая резистентность и существенно более высокий уровень С-пептида по сравнению с контролем (441 донор). В недавнем обследовании 2569 гистологически подтвержднных случаев рака молочной железы и 2588 39 здоровых женщин также была отмечена взаимосвязь между раком молочной железы и диабетом с поздним проявлением (Talamani et al.,1997). Прямая роль инсулина в развитие опухолей была показана на модели крыс, характеризующихся опухолью прямой кишки (Тrаn et al.,1996). Связанная с раковой опухолью кахексия также, по-видимому, характеризуется непереносимостью глюкозы, послевсасывательной гипергликемией, сниженным общим уровнем утилизации глюкозы в организме, что согласуется с резистентностью к инсулину и повышенной выработкой периферической молочной кислоты. Отношение инсулина к глюкагону также понижено: повышение уровня глюкагона в крови ассоциировано с состоянием наличия раковой опухоли (Cersosimo et al., 1991): это согласуется с повышенным содержанием HGP при многих типах раковых опухолей. Было продемонстрировано (Bartlett et al., 1995), что повышение отношения "инсулин/глюкагон" в ответ на гормональную терапию избирательно поддерживает анаболизм в организме и подавляет рост опухоли у крысы, взятой в качестве модели. Следовательно, предотвращение развития диабетогенного комплекса нарушений метаболизма должно снижать проявление раковых опухолей и ослаблять симптомы раковой кахексии. Диагностическое, профилактическое и лечебное применение настоящего изобретения Нижеследующее описание дано в качестве примера и ни в чм не ограничивает настоящее изобретение. Настоящее изобретение может быть применено при решении задач профилактики и лечения аутоиммунных и схожих заболеваний путм инъецирования фармацевтических препаратов моноклональных или поликлональных анти-анти-TCR-V антител или эквивалентных лигандов, пептидных фрагментов или молекул,распознаваемых этими антителами, и функционально активных векторов, включающих последовательности РНК или ДНК, кодирующие такие пептиды или молекулы. Инъецирование антител должно быть предпринято с целью предотвращения формирования аутоантител, обладающих той же специфичностью, за счт механизма обратной связи, подавляющих имеющиеся В-клетки, или за счт формирования ряда идиопатических антител, обеспечивающих повышение количества защитных антител (см. стр. 27 и 42). Цитоплазматические пептиды и другие молекулымишени, распознаваемые патогенными антианти-V антителами также могут быть использованы для индукции толерантности к низких дозам, специфического блокирования уже активированных В-клеток (см. стр. 27) или, при более высоких предетерминированных дозах, для блокирования действия посредников специфи 003131 ческой нефропатии, таких как TGF- (см. стр. 42). Векторы, включающие подходящие последовательности нуклеиновых кислот, также могут быть инъецированы согласно заранее определнным режимам с целью обеспечения долговременной секреции in vivo растворимых продуктов, которые бы могли действовать в качестве "толерогенов" (индукторов толерантности). Пептиды, белки или другие молекулы, распознаваемые анти-анти-V патогенными антителами, и анти-V иммуногенные факторы, использовавшиеся для формирования этих антител, могут быть использованы в формировании диагностических наборов, предназначенных для детекции присутствия анти-анти-TCRV антител в крови, плазме, сыворотке, слюне или других жидкостях тела с целью оценки предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям или в качестве прогностических индикаторов развития заболевания или эффективности лечения. Различные аспекты и варианты настоящего изобретения далее будут описаны более подробно в следующих примерах. Должно быть понятно, что модификации отдельных элементов могут быть выполнены без отхода от масштаба настоящего изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Окрашивание среза нормальной поджелудочной железы человека моноклональным анти-анти-TCR-V антителом, выявленное с помощью второго флуоресцирующего реагента. Фиг. 2. Окрашивание среза нормальной щитовидной железы человека моноклональным анти-анти-TCR-V антителом, выявленное с помощью второго флуоресцирующего реагента. Фиг. 3. Окрашивание среза нормального надпочечника человека моноклональным антианти-TCR-V антителом, выявленное с помощью второго флуоресцирующего реагента. Фиг. 4. Окрашивание среза нормального кишечника человека моноклональным антианти-TCR-V антителом, выявленное с помощью второго флуоресцирующего реагента. Фиг. 5. Окрашивание моноклональным анти-анти-TCR-V антителом и вторым флуоресцирующим реагентом среза поджелудочной железы, взятой у ребнка, умершего из-за неконтролируемого кетоацидоза сразу после диагностирования диабета. Фиг. 6. Нуклеотидная последовательность гена ESRP1. Фиг. 7. Расшифрованная аминокислотная последовательность белка ESRP1. Экспериментальный раздел Нижеследующие примеры даны только с целью иллюстрации и ни в чм не ограничивают настоящее изобретение. Получение моноклональных антител 41 Мышей иммунизировали путм 4 еженедельных внутрибрюшинных инъекций по 0,1 мл надосадочной фракции гибридомной культуры моноклонального антитела, специфичного в отношении TCR-V. Затем удаляли селезнку и готовили моноклеточные суспензии. Проводили слияние этих клеток с миеломными клетками линии Sр 2 с использованием стандартных процедур, хорошо известных специалистам, работающим в данной области. Вырабатывающие антитела клоны были идентифицированы методом ТИФА (тврдофазный иммуноферментный анализ) с использованием антииммуноглобулиновых реагентов, соединнных с пероксидазой. Далее клоны были подвергнуты скринингу против иммунизующего фактора, двухцепочечной и одноцепочечной ДНК и анионных фосфолипидов. При этом были использованы стандартные методики, хорошо известные специалистам в данной области техники. Выявление антител к фосфолипидам Плоскодонные гибкие 96-луночные планшеты "Фалькон" (Falcon, Becton-Dickinson) были покрыты с использованием 50 мкл раствора кардиолипина, фосфатидилхолина, фосфатидилсерина в этаноле (50 мкг на 1 мл этанола) и фосфатидилинозитола в метаноле (50 мкг в 1 мл метанола) (Sigma). Контрольные лунки были покрыты только растворителем. Планшеты оставляли при 4 С до полного испарения. Несвязанные сайты были заблокированы 0,1%-ным сывороточным альбумином человека в фосфатном буфере (PBS). Планшеты промывали PBS,содержащем 0,05% Твин-20 (RTM) и инкубировали с серийными разведениями сыворотки вRTM (фосфатный буфер + Твин) или с надосадочными фракциями культур моноклональных антител. После инкубации в течение 1 ч при 37 С или в течение ночи при 4 С планшеты промывали снова так же, как это было описано выше, и связанные антитела выявляли с использованием разведения 1:500 биотинилированного антимышиного иммуноглобулина (AmershamIntern, p1c), инкубировали в течение 30 мин при 37 С с последующей подходящей промывкой и новой инкубацией в течение 30 мин при 37 С с 1:500 стрептавидинбиотинилированным комплексом пероксидазы редьки (Amersham Intern,p1c). O-фенилендиамин (Sigma) был использован в качестве субстрата: окраска была красной при 450 нм при использования считывающего устройства Anthos-ELISA. Выявление антител к ДНК Лунки плоскодонного гибкого 96 луночного планшета были покрыты 50 мг/мл поли-L-лизина в воде путм инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре. После удаления раствора поли-L-лизина 50 мкл раствора одноцепочечной или двухцепочечной ДНК (Sigma) (10 мкг/мл фосфатного буфера,содержащего 1 мМ EDTA) добавляли в расчте на каждую лунку и планшеты инкубировали в 42 течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали в фосфатном буфере. Оставшиеся сайты связывания были заблокированы 0,1%-ным сывороточным альбумином в фосфатном буфере. Планшеты промывали PBS,содержащим 0,05% Твин-20 (RTM), и инкубировали с серийными разведениями сыворотки или надосадочных фракций культуры моноклональных антител. Связывание антитела выявляли так же, как это описано выше для антител к фосфо-липидам. Тестирование противосвртывающего действия анти-анти-V антител Были протестированы антисыворотки, полученные в ряде инбредных линий мышей, иммунизованных различными моноклональными анти-TCR-V антителами. По 5 мкл каждой антисыворотки были смешаны с 95 мкл жстко раскрученной нормальной плазмы человека и инкубировали при 37 С в течение 1 ч. К этой смеси добавляли 100 мкл разведнного подходящим образом яда гадюки Рассела (Diagen) и 100 мкл разведнного заместителя тромбоцитов(Diagen) и инкубировали в течение 30 с. Затем добавляли 100 мкл 0,025 М CaCl2 и определяли время свртывания. Время свртывания в присутствии нормальной мышиной сыворотки составило приблизительно 55 с, в то время как в присутствии упомянутой иммунной сыворотки время свртывания варьировалось в пределах от 10 до 30 мин. Контрольная мышиная антисыворотка не продлевала процесс свртывания свыше того времени, которое было определено для нормальной сыворотки мыши. Окрашивание срезов поджелудочной железы при диабете Срезы поджелудочной железы были получены от пациента, у которого накануне был диагностирован инсулинозависимый диабет и который скончался внезапно (по причинам, не зависящим от диабета), а также от доноров нормального трупного органа: срезы окрашивали моноклональными анти-анти-TCR-V антителами. Срезы нормальной поджелудочной железы, как и ожидалось, характеризовались окрашиванием внутриостровковых областей (см. фиг. 1), однако на срезах поджелудочной железы диабетика окрашивание не было выявлено вовсе или было очень слабым. Это указывает на то, что у данного пациента соответствующие клеточные антигены подвергаются негативной регуляции или выключению. В противоположность этому, окрашивание анти-анти-V антителами поджелудочной железы, взятой у трх детей, скончавшихся от кетоацидоза, показало пролиферацию позитивно окрашивающихся клеток за пределами участков,ограничивающих островки Лангерганса (фиг. 5). Это может быть обусловлено большими количествами аутоантитела, реагирующего in vivo с белком, сходным с рецептором ламинина, или с 43 другими белками-мишенями, обусловливая пролиферацию и миграции -клеток за пределы островков Лангерганса. Оба описанных выше сценария могут попадать в спектр ответов, формирующихся у индивидуумов, различающихся по своей генетической конституции, которые обусловливают молниеносный неконтролируемый кетоацидоз и последующую гибель или ИЗСД у индивидуумов с короткоживущими -клетками, или ИНСД у тех пациентов, которые характеризуются более мощными -клетками. Влияние моноклональных анти-антиV антител на целые островки Лангерганса человека in vitro Изолированные островки Лангерганса из трупного органа были промыты средой RPMI1640, содержащей 10% плодной телячьей сыворотки: их культивировали при концентрации примерно 200 островков на лунку в той же среде в 24-луночном планшете. Через три дня среду из пар лунок тщательнейшим образом отделяли и сохраняли при -20 С. Затем контрольные лунки культивировали только в среде или в тестовой среде, содержащей супернатант гибридомной культуры с анти-анти-V антителом, разведнным в равном объме свежей культуральной среды. Спустя 24 ч надосадочную фракцию каждой лунки отделяли и хранили так же, как это было описано выше, и снова заполняли либо только средой, либо так же разведнным гибридомным супернатантом. Эту процедуру повторяли ежедневно на протяжении 2 недель, за исключением того, что надосадочные фракции не отделяли в выходные. По окончании периода эксперимента инсулин в сохраннных образцах был определн количественно с использованием инсулинового набора реактивов (DAKO) в соответствии с инструкциями производителя. Полученные результаты показали, что уровни инсулина в тестерных и контрольных лунках были практически идентичными в начале эксперимента. Через 24 ч после добавления антитела содержание инсулина в тестерной лунке возрастало гораздо быстрее, чем в контрольной лунке. На третий день секреция инсулина в лунке, содержащей антитело, падала до уровня примерно 50% от контроля. На четвртый день секреция инсулина в тестерной лунке вновь превышала,контрольный показатель, однако на 5-й день его уровни были почти одинаковыми. Результаты,приведнные в табл. 1 в виде измерений оптической плотности (OD), показывают, что, хотя выход инсулина в контрольных лунках был практически стабильным, в тестерной лунке он характеризовался резкими колебаниями в ходе первой недели эксперимента. На протяжении второй недели уровень инсулина в тестерной лунке падал и на 10-й день не выявлялся сколько-нибудь значимый уровень секреции инсулина, в то время как в контрольной лунке секреция 44 была отчтливо выше фонового OD-показателя. Даже при том, что последующие измерения уровня секреции в контрольных лунках не проводились, медленный темп снижения инсулиновой секреции в контрольной лунке указывает на то, что секреция могла бы продолжаться ещ в течение нескольких дней. Таблица 1. Влияние моноклональных анти-анти-TCR-V антител на островки Лангерганса человека in vitro Оптическая плотность День Тест Контроль 1 2,117 2,063 2,042 1,848 2 2,784 2,751 2,143 2,044 3 1,236 1,057 2,256 2,240 4 2,513 2,377 2,124 2,187 5 2,446 2,450 2,506 2,545 8 0,699 1,114 9 0,777 1,049 10 0,585 0,979 11 0,482 0,842 Оптическая плотность была измерена с использованием планшетного сканера Anthos-2001 при 450 нм с ссылочным фильтром для 650 нм. Оптическая плотность культуральной среды 0,532. Выявление естественно встречающихся анти-анти-TCR-V аутоантител в сыворотке человека Анти-анти-V антитела были получены из селезнок мышей, иммунизованных надосадочной фракцией гибридомных линий клеток, которые секретировали антитела к TCR-V. Для этих моноклональных анти-анти-V антител было показано связывание с анти-V иммуногеном в тесте ТИФА: соответственно, было определено использование этого иммунизующего реагента в качестве антигена для выявления присутствия анти-анти-V аутоантител в сыворотке человека. Анти-V иммуноген был использован для покрытия 96-луночного плоскодонного планшета в течение ночи; несвязанные сайты блокировали, а сыворотку человека добавляли к этим лункам в разведении 1:30. Спустя 2 ч инкубации планшеты промывали и связывание сыворотки человека определяли с использованием антииммуноглобулина человека, соединнного с пероксидазой редьки. В табл. 2 показаны результаты, полученные при тестировании сыворотки, взятой от трх доноров, характеризующихся преддиабетическим состоянием (через некоторое время после взятия проб у них было подтверждено проявление диабета). Образцы сыворотки от донора 3 были разделены случайным образом: они показывают наивысший уровень аутоантител за год до установления диагноза. Повышение индекса связывания (определяемого как отношение оптических плотностей"тест/контроль") от 4,4 до 6,1 было отмечено на 7-м месяце в образце 1 и снижалось до 2,9 за 2 месяца до установления диагноза. Это указывает на перемежающуюся природу выработки 45 этого аутоантитела и на то, что оно может не проявлять длительной персистенции, приводящей к развитию заболевания, а, по-видимому,отдельные случаи повышения его титра могут быть обусловлены вирусными или иными инфекциями, приводящими к пролиферации Тклеток и возникновению аномальных GPIсвязывающихся полипептидов TCR-V. Однако предположительно эти аутоантитела персистируют на протяжении, по крайней мере, от семи месяцев до года, характеризуясь у пациента 3 высоким уровнем содержания. Это может приводить к негативной регуляции сигнальных молекул в панкреатических -клетках, на что было указано выше (стр. 39 и 63). Таблица 2. Присутствие анти-анти-TCR-V аутоантител в сыворотке человека Дата взяДата Оптическая плотность Донор тия сыво- диагноза ТестТест/ Контр. ротки ИЗСД антиген контроль (среда) 1 Май 1989 Янв.1991 0,082; 0,124; 0,080 0,134 2 Февр.1989 Янв.1993 0,087; 1,5 0,058; 0,076 0,054 Июнь 1989 0,079; 0,076; 0,074 0,063 3 Май 1987 Дек.1988 0,074; 4,4 0,016; 0,072 0,017 Дек.1987 0,109; 6,1 0,016; 0,097 0,018 Окт.1988 0,060; 2,9 0,021; 0,057 0,019 Тест-антигеном являлась надосадочная фракция клеточной линии, вырабатывающей анти-TCR-V моноклональные антитела. Индекс "тест/контроль" был определн путм деления средней величины оптической плотности в тесте на среднюю величину оптической плотности в контроле. Таблица 3. Специфичность связывания моноклональных анти-анти-TCR-V антител Оптическая плотность Реагент покрытия лунок Эксперимент Эксперимент 1 2 0,413 0,399 Анти-TCR-V (иммуноген) Культуральная среда 0,046 0,040 Оптическая плотность была измерена с использованием планшетного сканера Anthos-2001 при 450 нм с референсным фильтром для 650 нм. В качестве надосадочной фракции культуры было использовано анти-TCR-V антитело. Скрининг библиотеки клеток поджелудочной железы с использованием моноклональных антител Библиотеки на gt11-носителях включали последовательности ДНК, встроенные по EcoRIсайту: они могли быть экспрессированы в качестве слитых белков под контролем промотораlac. Соответственно, они могут быть подвергнуты скринингу с использованием антител. В данном случае описанный ранее методM.Manson) был применн для скрининга gt11 библиотеки клеток поджелудочной железы человека (Promega). Вкратце, бактериальный штамм Y1090 был трансфицирован бактериофагом в смеси с расплавленной агарозой и после этого высеян на пластины со средой. Погруженные в агарозу бактерии росли и образовывали непрерывные газоны, за исключением тех участков, в которых фаг лизировал клетки с образованием прозрачных бляшек. При соответствующем подборе разведений фага каждая отдельная бляшка образуется от одного фага, инфицировавшего одну бактерию. Агаровые пластины затем накрывают слоем интроцеллюлозной мембраны (Protran BA85: 0,45 мкм х 82 мм;SchleicherSchuell), которая была пропитана изопропилD-тиогалактозидом (IPTG), которые является индуктором гена -галактозидазы(в составе вектора gt11), в состав которого кДНК была встроена по уникальному сайтуEcoRI. Если кДНК находится в составе правильной кодирующей рамки и правильной ориентации, то слитый белок должен вырабатываться таким образом, что белок галактозидазы удлинн по своему С-концу. Накрытые мембранами пластины затем инкубируют при немного пониженной температуре, что обеспечивает увеличение выработки слитого белка. Мембраны затем снимают и промывают с целью удаления бактериального клеточного дебриса, а затем зондируют моноклональными антителами с целью идентификации клонов кДНК, которые кодируют белковые последовательности, способные реагировать с этими антителами. Для этой процедуры мембраны вначале инкубировали в промывочном растворе(5% сухого молока в фосфатном буфере, содержащем 0,02% Твин-20-RTM) в течение 30 мин с целью предотвратить неспецифическое связывание антитела. Затем их споласкивали в промывочном растворе и помещали на чашки Петри, содержащие беспримесное моноклональное антитело: затем их переносили в шейкер на 2-3 ч. Затем антитело удаляли и мембраны промывали в шейкере в 3 сменах промывочного буфера при общей продолжительности 30 мин. Раствор антитела затем удаляли и мембраны погружали в соответствующим образом разведнное антимышиное антитело, помеченное пероксидазой редьки (Sigma), на 1 ч в шейкере. Затем раствор антитела удаляли и мембраны промывали в 3 сменах промывочного буфера общей продолжительностью 30 мин в шейкере. Связывание антитела затем выявляли с использованием реагентов для ECL (усиленная хемолюминесценция) (Amersham. Life Sciences). Равные 47 объмы двух реагентов смешивали и наносили на "белковую сторону" мембраны на 1 мин. Избыток детекционного реагента затем промакивали, а мембраны закрывали обрткой Saran и экспонировали на рентгеновскую плнку в кассете (Hyperfilm-ECL). Плнки затем проявляли и наносили на агаровые пластины, содержащие бляшки. Позитивно реагирующие бляшки отбирали с помощью пастерок и переносили в 0,5 мл фагового элюента (0,1 М NaCl, 0,01 МMgSO4, 7H2O/0,05M Трис, 0,01% желатина [весовые проценты; кожный свиной желатин 1 типа], рН доводили до 7,5), включая 50 мкл хлороформа в качестве консерванта. Позитивные бляшки скринировали повторно до тех пор, пока все бляшки на мембране не давали позитивный ответ. Амплификация клонов кДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) Восемь клонов кДНК, очищенных с бляшек в соответствии с ранее описанным, были амплифицированы с использованием следующей амплификационной смеси Taq Plus (Stratagene): 10 х низкосолевой реакционный буфер - 5 мкл, по 200 мкM каждого из дезоксинуклеотидтрифосфата (Pharmacia), по 25 пкМ прямой и обратной затравок (прямая: GTA GAC CCA(Stratagene), кДНК-матрица - 2 мкл, дистиллированная вода - 50 мкл. ДНК-полимеразу добавляли в течение 7 мин при 94 С, т.е. использовали метод "горячего старта". Реакционную смесь накрывали плнкой минерального масла (100 мкл). Пробирки помещали в ДНК-амплификатор (Perkin-ElmerCetus, Emeryville, СА, США), запрограммированный следующим образом: 94 С в течение 1 мин (денатурация), 55 С в течение 2 мин (отжиг), 72 С в течение 3 мин (достройка цепи) на протяжении 36 циклов. Последняя достройка продолжалась 7 мин. Полученные продукты ПЦР сохраняли при 4 С до момента их использования в анализе. Анализ ПЦР-продуктов Агарозный 1%-ный гель, содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия, получали буфере ТАЕ (Трис - 242 г, ледяная уксусная кислота 57,1 мл, 0,5 М EDTA [pH 8,0] - 100 мл, дистиллированная вода до 1 л). ПЦР-продукт в количестве 10 мкл загружали с 2 мкл буфером образца. Также в качестве ссылочного маркра для одного из концов ПЦР-продуктов загружали 2 мкл(Gibco BRL). Гель разгоняли при напряжении 100 В в течение 1 ч. Продукты ПЦР визуализовали в ультрафиолетовом свете и фотографировали с использованием плнки Поляроид-667 48 Секвенирование ДНК Идентичность ПЦР-продуктов проверяли путм прямого секвенирования с использованием набора реактивов ABI PRISM Dye TerminatorCycle Sequencing ready reaction kit и автоматического секвенсора АВ 1-373 А (Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA, США). Реакционная смесь для секвенирования была следующей: терминаторная реакционная смесь - 8 мкл, продукты ПЦР (10-30 нг/мкл) - 36 мкл, затравка -3,2 пкМ, дистиллированная вода до 20 мкл с покрытием минеральным маслом (50 мкл). Пробирки помещали в ДНКамплификатор и реакцию проводили в соответствии с такой программой: 96 С в течение 30 с,50 С в течение 15 с, 60 С в течение 4 мин при 25 циклах. По 20 мкл продукта окончательной достройки цепи переносили в 1,5-мл микроцентрифужные пробирки и добавляли 2 мкл 3 М ацетата натрия (рН=4,6) и 50 мкл 95%-ного этанола. Пробирки встряхивали и помещали на лд на 10 мин, а затем центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15-30 мин. Раствор этанола удаляли и осадок промывали в 75%-ном этаноле. Пробирки снова центрифугировали и раствор этанола тщательно удаляли, а осадок высушивали в вакуумной центрифуге. Приготовление и загрузка образцов Высушенные образцы ресуспендировали в 6 мкл загрузочного буфера (деионизированный формамид - 5 объмов: 50 мг/мл голубого декстрана в 25 мМ EDTA [рН 8,0] - 1 объм). Образцы встряхивали и центрифугировали. Затем их нагревали до 90 С на 2 мин и выдерживали на льду до готовности к загрузке. Образцы загружали в 6%-ный акриламидный гель, предварительно в течение получаса подвергнутый действию напряжения 1500-2000 В. После загрузки проводили электрофорез при напряжении 2000 В в течение 12 ч. Данные секвенирования анализировали на компьютере. Восемь клонов кДНК были очищены и секвенированы. В соответствии с тем, что обсуждалось выше, клоны 1.1, 1.2 и 1.3, как было обнаружено, кодируют секретогранин-1-подобный белок; клоны 3.1, 4.1 и 5.1 кодируют белок,сходный с рецептором ламинина 67-кД; клон 5.2 кодирует новую молекулу, которая была обозначена как ESRP1 (белок-регулятор-1 эндокринной секреции). Нуклеотидная последовательность гена ESRP1 показана на фиг. 7, а предназначенная аминокислотная последовательность, им кодируемая, показана на фиг. 6 Клонирование кДНК в эукариотический экспрессирующий вектор (pCR3-Uni:Invitrogen) Это было осуществлено с использованием набора реактивов для однонаправленного клонирования в состав эукариотического вектора(Invitrogen). Линеаризованный вектор pCR3Uni не нест 5'-фосфатную группу на свом левом конце и, соответственно, может лигиро 49 ваться только на те ПЦР-продукты, которые имеют 5'фосфат. Прямая затравка, использовавшаяся для амплификации кДНК, была с учтом этого фосфорилирована до реакции лигирования следующим образом: прямая ПЦРзатравка (50-100 пкМ) - 0,5-1 мкг, 10 хкиназный буфер - 1 мкл, 10 мМ АТФ - 1 мкл, стерильная вода - до 9 мкл, полинуклеотидкиназа Т 4 (10 ед./мкл) (1 мкл); полученная смесь была тщательно перемешана в стерильной 0,5-мл микроцентрифужной пробирке и проинкубирована при 37 С в течение 30-40 мин и при 94 С в течение 5 мин, а затем помещена на лд. Затем фосфорилированная прямая затравка была немедленно использована в получении ПЦРпродукта в соответствии с описанным выше, а 10 мкл ПЦР-продукта после этого анализировали в агарозном геле. Реакцию лигирования проводили следующим образом: свежий ПЦР-продукт (приблизительно 10 нг) - 0,5-1,0 мкл, стерильная вода 5,0-5,5 мкл, 10 хлигационный буфер - 1 мкл, вектор pCR3-Uni (60 нг) - 2 мкл, ДНК-лигаза фага Т 4 - 1 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 14 С в течение 4 ч или в течение ночи. Реакции лигирования использовали для трансформации клеток Top-10F' ("доза"). Клетки одной "дозы" помещали на лд и добавляли в пробирку 2 мкл 0,5 М -меркаптоэтанола. Эти клетки перемешивали с 1-2 мкл лигационной реакционной смеси и инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 42 С ровно в течение 30 с. Затем в пробирки добавляли 450 мкл среды SOC. Затем их инкубировали на боку при 37 С в течение 1 ч во вращающемся инкубаторе при 225 об/мин. Трансформированные клетки высевали на пластины LB с ампициллином и инкубировали в течение ночи при 37 С. Трансформанты отбирали и культивировали с целью выделения плазмид. Очистка плазмид Трансформированные клетки Top-10F' культивировали в культуральном бульоне LB,содержащем ампициллин, а плазмидную ДНК очищали с использованием набора реактивовWizard Miniprep Kit (Promega) или набора Endotoxin Free Plasmid Kit (Qiagen), предназначенных для работы с ультрачистой ДНК. Плазмидную ДНК анализировали на присутствие и ориентацию вставки с помощью ПЦР и секвенирования. БиблиографияAcad. Sci. USA 90,1814-1818. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Поликлональное антитело или его фрагмент, обладающее реактивностью по отношению к анти-TCR-V антителу и к эпитопу связывания гликозил-фосфатидилинозитола (GPI). 2. Моноклональное антитело или его фрагмент, обладающее реактивностью по отношению к анти-TCR-V антителу и к эпитопу связывания гликозил-фосфатидилинозитола(GPI). 3. Пептид, не являющийся антителом к анти-TCR-V антителу, обладающий реактивностью к анти-TCR-V антителу и к эпитопу связывания гликозил-фосфатидилинозитолаNO:2. 4. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по п.3 и имеющая последовательность SEQID NO:1. 5. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.4. 6. Штамм эукариотической клеткихозяина, трансформированный вектором по п.5. 7. Штамм прокариотической клеткихозяина, трансформированный вектором по п.5 8. Применение антитела по п.1 или 2 в качестве фармацевтического или диагностического агента. 9. Применение пептида по п.3 в качестве фармацевтического или диагностического агента. 10. Применение антител по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения ИЗСД, ИНСД, органоспецифического и неорганоспецифического аутоиммунного заболевания,сердечно-сосудистого заболевания, кахексии,связанной с раком, рака или другого заболевания, связанного с антифосфолипидными антителами и/или гиперинсулинемией, и заболевания, связанного с инсулиновой невосприимчивостью. 11. Применение полипептида по п.3 для получения лекарственного средства для лечения ИЗСД, ИНСД, органоспецифического и неорганоспецифического аутоиммунного заболевания,сердечно-сосудистого заболевания, кахексии,связанной с раком, рака или другого заболевания, связанного с антифосфолипидными антителами и/или гиперинсулинемией, и заболевания, связанного с инсулиновой невосприимчивостью. 12. Композиция, содержащая эффективное количество антитела по п.1 или 2 в сочетании с приемлемым носителем. 13. Композиция, содержащая эффективное количество пептида по п.3 в сочетании с приемлемым носителем. 14. Способ лечения заболевания, связанного с антифосфолипидными антителами и/или гиперинсулинемией или инсулиновой невосприимчивостью у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества антитела по п.1 или 2. 15. Способ лечения заболевания, связанного с антифосфолипидными антителами и/или гиперинсулинемией или инсулиновой невосприимчивостью у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества пептида по п.3. 16. Способ лечения заболевания, связанного с антифосфолипидными антителами и/или гиперинсулинемией или инсулиновой невосприимчивостью у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции по п.12. 17. Способ лечения заболевания, связанного с антифосфолипидными антителами и/или гиперинсулинемией или инсулиновой невосприимчивостью у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции по п.13. 18. Способ выявления естественного встречающегося аутоантитела в жидкости тела,включающий обеспечение контакта указанной жидкости тела с антителом по п.1 или 2 и с молекулой-мишенью и оценку количества указанного аутоантитела, которое специфически связывается с указанной молекулой-мишенью.