Способ получения диальдегиддекстрана

011718 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу получения производных природных соединений - декстранов, которые применяются в качестве носителей и модификаторов природных и синтетических биологически активных веществ и фармакологических субстанций. Уровень техники В предшествующем уровне техники широко известно использование декстранов и их производных,в частности диальдегиддекстрана, в качестве носителей лекарственных препаратов, а также модификаторов активных веществ. В частности, известно использование диальдегиддекстрана для получения конъюгата с таким лекарственным средством, как изониазид, с целью получения эффективного противотуберкулезного препарата. Для эффективного использования диальдегиддекстрана в составе лекарственных препаратов исходный диальдегиддекстран должен удовлетворять определенным требованиям по составу примесных компонентов. Он не должен содержать токсичных примесей и примесей, взаимодействующих с активным веществом при хранении лекарственного препарата, что приводит к снижению активности лекарственного препарата. Формула диальдегиддекстрана (ДАД) известна, например, из статьи Торчилин В.П. и др. Иммобилизация ферментов на биосовместимых носителях. III. Иммобилизация -химотрипсина на растворимых декстранах. Биоорганическая химия, т. 2,9, 1976 г., с. 1252-1257. Для анализа полученного ДАД в нем определяют карбонильные группы каким-либо общепринятым методом, например широко распространенным методом количественного анализа карбонилсодержащих продуктов по реакции с 2,4 динитрофенилгидразином. Из документа RU 2087146 известен способ получения диальдегиддекстрана, включающий выделение фракций декстрана с молекулярной массой 20-40 кДа из коммерческого препарата Реополиглюкин путем осаждения этанолом (десятикратным объемом охлажденного до 10C этанола), окисление декстрана периодатом натрия, остановку реакции окисления путем связывания окислителя этиленгликолем,осаждение диальдегиддекстрана этанолом (путем добавления десятикратного объема охлажденного до 10C этанола). Недостатком известного способа является наличие в диальдегиддекстране йодсодержащих примесей, которые обладают токсическим действием и снижают эффективность использования диальдегиддекстрана в составе лекарственного препарата. Кроме того, конъюгаты диальдегиддекстрана,полученного по изложенному выше способу, с таким лекарственным средством как изониазид являются нестойкими при хранении и содержат низкое количество связанного активного вещества изониазида. В патенте RU 2143900 описан способ получения диальдегиддекстрана, включающий облучение раствора коммерческого препарата Реополиглюкин тормозным -излучением в дозах 2,5-3,5 Мрад на ускорителе электронов ЭЛВ-2. При действии -излучения на водный раствор декстрана происходит радиационно-химическое окисление декстрана с образованием диальдегиддекстрана. Способ осуществляют в одну стадию, он не предполагает использования токсичных реагентов. Недостатком способа является использование сложного и дорогостоящего оборудования типа ускорителя электронов, которое, дополнительно, является весьма энергоемким (потребляемая мощность при работе ускорителя электронов составляет более 100 кВт). Другим недостатком известного способа является содержание в облученном продукте органических и неорганических перекисей, которые образуются при радиолизе водных растворов. Присутствие в диальдегиддекстране перекисей даже в микроколичествах значительно снижает стабильность диальдегиддекстрана. Это не позволяет в дальнейшем эффективно использовать его для получения конъюгатов с лекарственными средствами и фармацевтическими субстанциями, поскольку полученные конъюгаты оказываются нестабильными при хранении. Известен способ получения диальдегиддекстрана, включающий окисление декстрана периодатом натрия, остановку реакции окисления путем связывания окислителя этиленгликолем, удаление непрореагировавшего периодата натрия и других примесей с помощью диализа смеси против дистиллированной воды, осаждение диальдегиддекстрана этанолом (путем добавления охлажденного до 4-6 С этанола в течение 24 ч), очистку полученного диальдегиддекстрана путем трехкратного промывания ацетоном с последующим переосаждением, высушивание на воздухе. Выход конечного продукта составляет 54% от теоретического. Окислению может быть подвергнут декстран с молекулярной массой 65-75 кДа, как это описано в патентных документах RU 2163120, RU 2168994 и RU 2185166, или коммерческий декстран с молекулярной массой 40 кДа ("Fluka", Швейцария), как это описано в патентном документе RU 2125451. Последний выбран в качестве прототипа изобретения. Недостатком известного способа является многостадийность и длительность процедуры, обусловленные необходимостью отделения целевого вещества от токсичного периодата натрия и иных примесных компонентов, к которым относятся соли иодной кислоты и этиленгликоль. Раскрытие изобретения Задачей, на решение которой направлено изобретение, является предложение простого способа получения диальдегиддекстрана, не содержащего токсичных иодсодержащих примесей, с высоким выходом целевого продукта. Поставленная задача решается тем, что в способе получения диальдегиддекстрана, включающем-1 011718 окисление декстрана, удаление примесей, осаждение диальдегиддекстрана, промывание и высушивание диальдегиддекстрана, декстран окисляют перманганатом калия в кислой среде при нагревании, удаление примесей осуществляют путем отделения жидкости от осадка, выпавшего на стадии окисления декстрана и содержащего двуокись марганца и осаждение диальдегиддекстрана проводят из указанного раствора. Преимущественно в качестве исходного продукта используют декстран с молекулярной массой 2075 кДа в виде 5-15% водного или водно-солевого раствора. Для создания кислой среды предпочтительно используют уксусную или муравьиную кислоту в концентрации 5-35% и количестве 0,5-2,0% от исходного объема раствора декстрана, а для окисления декстрана используют 0,5-10% водный раствор перманганата калия в количестве от 1 до 6% от объема раствора декстрана. Окисление декстрана проводят при температуре 80-100C. В соответствии с настоящим изобретением в качестве окислителя декстрана используют перманганат калия. Использование перманганата калия вместо периодата натрия приводит к получению продукта,не загрязненного соединениями иода. Кроме того, при окислении декстрана перманганатом калия образуется осадок диоксида марганца, который в ходе образования захватывает примесные компоненты, подлежащие удалению. По отношению к способу-прототипу это позволило исключить протяженную во времени стадию диализа окисленной смеси, предназначенную для отделения непрореагировавшего периодата и иных примесей, и отделить примеси путем отделения жидкости, содержащей диальдегиддекстран,от осадка, содержащего диоксид марганца. В качестве исходного продукта может быть использован любой декстран, однако, предпочтительно использовать декстран с молекулярной массой 20-75 кДа в виде 5-15% водного или водно-солевого раствора. Декстран является доступным соединением, например, таким как коммерческий препарат Реополиглюкин, представляющий собой водно-солевой раствор декстрана с молекулярной массой 20-40 кДа с содержанием основного вещества 10% (по массе) или коммерческий препарат декстрана с молекулярной массой 40 кДа ("Fluka", Швейцария), или декстран с молекулярной массой 65-75 кДа (производство Сигма, США) и др. Преимущественно декстран используют в виде водного или водно-солевого раствора. При использовании декстрана с мМ более 75 кДа его водные растворы имеют высокую вязкость,пропорционально мМ, что затрудняет фильтрацию (чем выше мМ тем ниже скорость фильтрации) при отделении раствора окисленного декстрана от двуокиси марганца. Кроме того, биологические эффекты декстранов с мМ более 75 кДа малоизученны и они не применяются в медицине, возможно вследствие их кумуляции в организме за счет длительного периода выведения. Использование декстранов с мМ ниже 20 кДа не позволяет использовать их для последующей конъюгации с биологически активными веществами, так как они не будут обладать пролонгированным фармакологическим действием за счет быстрого выведения из организма. Технологическим недостатком получения окисленных низкомолекулярных декстранов с мМ менее 20 кДа является необходимость использования больших объемов этанола для его осаждения (1:5 и более). Перманганат калия следует использовать в количестве, достаточном для полного окисления декстрана до целевого продукта, которое легко может быть опеределено специалистом в данной области техники. Предпочтительно перманганат калия используют в виде 0,5-10% водного в количестве от 1 до 6% от объема раствора декстрана. При использовании раствора перманганата в количестве менее 1% в окисленном декстране образуется недостаточно много карбонильных групп с тем, чтобы использовать его для последующей коньюгации с биологически активными веществами. При использовании раствора перманганата в количестве 6% от раствора окисляемого декстрана карбонильная емкость окисленного декстрана по реакции с 2,4 динитрофенилгидразином (см. С. Сиггиа, Дж.Г. Ханна Количественный органический анализ по функциональным группам, Москва, Изд-во Химия, 1983 г., 672 с.) достигает максимального значения и не увеличивается при увеличении количества перманганата, напротив избыток перманганата может привести к деструкции полимера (см. табл. 1). В качестве контрольного раствора при определении карбонильной емкости окисленного декстрана используют неокисленный декстран, который не вступает в реакцию с 2,4-динитрофенилгидразином. Окисление декстрана перманганатом калия проводят в слабокислой среде, где образуется осадок диоксида марганца. Предпочтительно стадию окисления проводят при рН 3-5, более предпочтительно при рН 4-4,5. Для создания требуемой величины рН могут быть использованы любые кислоты, предпочтительно используют органические кислоты или их смесь, более предпочтительным является использование уксусной или муравьиной кислоты. Так, например, при использовании в качестве исходного декстрана 10% водного раствора декстрана к нему последовательно добавляют слабокислую органическую кислоту в концентрации 5-35% и в количестве 0,5-2,0% от исходного объема раствора декстрана и 2% раствор перманганата калия в количестве от 1 до 6% от объема исходного раствора декстрана. При рН 3,0 может происходить частичная кислотная деструкция полимера, что приведет к снижению его молекулярной массы, в то же время выход карбонильных групп будет таким же, как в диапазоне рН 3,0-5,0. При увеличении рН в нейтральную и щелочную сторону количество карбонильных групп при окислении перманганатом калия снижается, особенно в области нейтрального значения рН. Кроме того,при увеличении рН растворимость двуокиси марганца, ввиду ее амфотерности, увеличивается, что соответственно может вызвать загрязнение окисленного декстрана растворимыми солями марганца. При нейтральных и, особенно, щелочных значениях рН осаждение окисленного декстрана этанолом сильно замедляется ввиду формирования тонкодисперсной трудно осаждаемой взвеси. В используемом диапазоне рН 3,0-5,0 не происходит деструкции декстрана, карбонильная емкость окисленного декстрана максимально высока и он легко осаждается этанолом. Окисление декстрана перманганатом калия проводят при нагревании, т.к. увеличение температуры реакции увеличивает ее скорость. Преимущественно температура на стадии окисления декстрана составляет 80-100C, однако может быть использована и иная температура. Специалист в данной области техники может без труда подобрать рабочие значения температуры стадии окисления. Целевым продуктом окисления декстрана является диальдегиддекстран, который находится в водной фазе, при этом на стадии окисления образуется осадок диоксида марганца, который в процессе его образования захватывает примесные компоненты. Осадок отделяют от раствора целевого продукта любым известным специалисту методом, например центрифугированием, фильтрованием, декантированием и т.д. Диальдегиддекстран выделяют из надосадочной жидкости методом осаждения. Наиболее простым,быстрым и количественным является осаждение диальдегиддекстрана этанолом при нагревании. Условия и количества добавляемого этанола известны из уровня техники. Так, например, если этанол добавляют в виде 95%-ного раствора, то объемное соотношении этанола к указанной жидкости составляет около 2:1. Температура на стадии осаждения диальдегиддекстрана предпочтительно составляет 60-80C. Для осаждения диальдегиддекстрана могут быть использованы и иные, известные из уровня техники методы осаждения, например, путем использования охлажденного этанола, как это раскрыто в документах RU 2163120, RU 2168994, RU 2185166 и RU 2125451, однако эти методы требуют большего времени. Осажденный диальдегиддекстран промывают и высушивают. Промывку диальдегиддекстрана проводят этанолом, однако промывка может быть выполнена любым известным из уровня техники методом,например с использованием ацетона с последующим переосаждением целевого продукта, как это раскрыто в документах RU 2163120, RU 2168994, RU 2185166 и RU 2125451. Однако известные из уровня техники методы требуют большего времени, чем метод с использованием этанола. Высушивание целевого продукта может быть выполнено любым способом, известным специалисту в данной области техники. В частности, высушивание может быть проведено на воздухе, либо при небольшом нагревании в сушильном шкафу, или в иных условиях с использованием традиционного для этой цели оборудования. Так как в примерах осаждение продукта проводят этанолом, то осадок представляет собой сам окисленный декстран, а не низкомолекулярные продукты (например, олигосахариды, глюкоза, глиоксаль), которые этанолом не осаждаются. В осажденном этанолом окисленном декстране после его повторного растворения в воде определяли количество карбонильных групп по реакции с 2,4 динитрофенилгидразином. В качестве контрольного раствора при определении карбонильной емкости окисленного декстрана используют неокисленный декстран, который не вступает в реакцию с 2,4-3 011718 динитрофенилгидразином. Таким образом, осажденный полимер не содержит низкомолекулярных примесей, которые остаются в этаноле, и содержит альдегидные группы, свойственные для ДАД, получаемого периодатным методом. Выход готового продукта, окисленного декстрана, рассчитывали по отношению к количеству взятого декстрана. Примеры осуществления изобретения Пример 1. Коммерческий препарат Реополиглюкин нагревают на кипящей водяной бане до температуры 100C, прибавляют к нему 35%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 0,5% от объема раствора Реополиглюкина для получения рН 4,5, смесь перемешивают и прибавляют 10%-ный раствор перманганата калия в количестве 1% от исходного объема Реополиглюкина. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца, надосадочную жидкость сливают, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют, например, с помощью фильтровальной бумаги. К полученному фильтрату (надосадочной жидкости) прибавляют двойной объем 95%-го раствора этанола, смесь нагревают до температуры 60-80C и перемешивают, после выпадения осадка (диальдегиддекстрана) надосадочную жидкость сливают, выпавший в осадок диальдегиддекстран промывают небольшим количеством 95%-го раствора этанола (например, в количестве 25% от объема слитой надосадочной жидкости), высушивают, например, при температуре 50C в термостате. Выход целевого продукта составляет 82%. Пример 2. 5%-ный раствор декстрана с молекулярной массой 40 кДа нагревают на кипящей водяной бане до температуры 80C, прибавляют к нему 5%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 2,0% от объема исходного раствора декстрана для получения рН 4,0, смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 3% от объема исходного раствора декстрана. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют,например, через бумажный фильтр. К полученному фильтрату добавляют двойной объем 95%-го раствора этанола, смесь нагревают до температуры 60-80C и перемешивают, после выпадения осадка надосадочную жидкость сливают, осадок промывают небольшим количеством 95%-го раствора этанола (например, в количестве 20% от объема слитой надосадочной жидкости), высушивают, например, при температуре 2 С. Выход целевого продукта составляет 88%. Пример 3. 15%-ный раствор декстрана с молекулярной массой 65-75 кДа нагревают на кипящей водяной бане до температуры 90C, прибавляют к нему 35%-ный раствор муравьиной кислоты в количестве 0,5% от объема исходного раствора декстрана до получения рН 4,5, полученную смесь перемешивают и прибавляют 10%-ный раствор перманганата калия в количестве 6% от объема исходного раствора декстрана. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, например, через бумажный фильтр. К полученному фильтрату добавляют двойной объем 95%-го раствора этанола, смесь нагревают до температуры 60-80C и перемешивают до выпадения осадка, надосадочную жидкость сливают, осадок промывают небольшим количеством 95%-го раствора этанола (например, в количестве 20% от объема слитой надосадочной жидкости), высушивают,например, при температуре 40C. Выход целевого продукта составляет 85%. Пример 4. Коммерческий препарат Реополиглюкин нагревают на кипящей водяной бане до температуры 100C, прибавляют к нему 5%-ный раствор муравьиной кислоты в количестве 2% от исходного объема Реополиглюкина до получения рН 4,0, смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 5% от исходного объема Реополиглюкина. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. К полученному фильтрату добавляют двойной объем 95%-го раствора этанола, смесь нагревают до температуры 60-80C и перемешивают до выпадения осадка. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают небольшим количеством 95%-го раствора этанола (не менее 15% от объема слитой надосадочной жидкости), высушивают. Выход целевого продукта составляет 84%. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения диальдегиддекстрана, включающий окисление декстрана, удаление примесей,осаждение диальдегиддекстрана, промывание и высушивание диальдегиддекстрана, отличающийся тем,что декстран окисляют перманганатом калия в кислой среде при нагревании, удаление примесей осуществляют путем отделения жидкости от осадка, выпавшего на стадии окисления декстрана и содержащего двуокись марганца, и осаждение диальдегиддекстрана проводят из указанной жидкости. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного продукта используют декстран с молекулярной массой 20-75 кДа в виде 5-15% водного или водно-солевого раствора. 3. Способ по пп.1, 2, отличающийся тем, что для создания кислой среды используют уксусную или муравьиную кислоту в концентрации 5-35% и количестве 0,5-2,0% от исходного объема раствора декст-4 011718 рана. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что для окисления декстрана используют 0,5-10% водный раствор перманганата калия в количестве 1-6% от объема раствора декстрана. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что окисление декстрана проводят при температуре 80-100C.