Применение остеопротегерина для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания

Номер патента: 7927

Опубликовано: 27.02.2007

Авторы: Платер-Циберк Кристине, Пауэр Кристин

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Применение вещества для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, причем вещество выбрано из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;

b) полипептида, содержащего аминокислоты 22-401 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;

c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;

d) полипептида, содержащего аминокислоты 22-194 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;

e) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (a)-(d);

f) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(d), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;

g) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (a)-(d); и

h) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с круговыми перестановками любого из полипептидов (а)-(g).

2. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани.

3. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является склеродермия.

4. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи.

5. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является фиброз печени.

6. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.

7. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого.

8. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где вещество является мономером или димером.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где вещество гликозилировано в одном или нескольких положениях.

11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок содержит слияние с иммуноглобулином (Ig).

12. Применение по п.11, где слияние с Ig представляет собой Fc-слияние.

13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где функциональное производное содержит по меньшей мере один радикал, связанный с одной или несколькими функциональными группами, которые составляют одну или несколько боковых цепей на аминокислотных остатках.

14. Применение по п.13, где радикал является полиэтиленгликолевым радикалом.

15. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;

b) полипептида, содержащего аминокислоты 22-401 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;

c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;

d) полипептида, содержащего аминокислоты 22-194 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;

e) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (a)-(d);

f) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (a)-(d), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;

g) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (a)-(d); и

h) изоформы, слитого белка или активной фракции любого из полипептидов (a)-(g).

16. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани.

17. Применение по п.15 или 16, где фиброзным заболеванием является склеродермия.

18. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи.

19. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз печени.

20. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.

21. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого.

22. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы.

23. Применение по любому из пп.15-22, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность экспрессирующего вектора.

24. Применение по п.23, где последовательность вектора является последовательностью вектора для генной терапии.

25. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции полипептида, охарактеризованного в п.1, в клетке для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии.

26. Применение клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в любом из пп.15, 23 или 24, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы.

27. Применение клетки, экспрессирующей вещество, охарактеризованное в любом из пп.1 или 9-13, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы.

28. Применение клетки, генетически модифицированной таким образом, чтобы продуцировать полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1 или 9-13, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы.

29. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или раздельного применения.

30. Применение по п.29, где интерферон является интерфероном-b.

31. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит антагонист фактора некроза опухолей (TNF) для одновременного, последовательного или раздельного применения.

32. Применение по п.31, где антагонистом TNF является TBPI и/или TBPII.

33. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит средство против склеродермии для одновременного, последовательного или раздельного применения.

34. Применение по п.33, где средство против склеродермии выбрано из группы, состоящей из ингибиторов АСЕ, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов протонных насосов, НПВС, ингибиторов СОХ, кортикостероидов, тетрациклина, пентоксифиллина, буцилламина, ингибиторов геранилгеранилтрансферазы, роттерлина, ингибиторов пролил-4-гидроксилазы, ингибиторов с-протеиназы, ингибиторов лизилоксидазы, релаксина, галофугинона, простагландинов, простациклинов, эндотелина-1, окиси азота, ингибиторов ангиотензина II, антиоксидантов или SARP-1.

35. Способ лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, предусматривающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества вещества, охарактеризованного в любом из пп.1, 9-15 или 23-34, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

36. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является склеродермия.

37. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи.

38. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз печени.

39. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.

40. Способ пю я.35, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого.

41. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы.

 

Текст

Смотреть все

007927 Область изобретения Данное изобретение относится к области фиброзных заболеваний и заболеваний соединительной ткани. Более конкретно, изобретение относится к применению остеопротегерина для лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии. Комбинации остеопротегерина с интерфероном, антагонистом TNF или дополнительным противофиброзным агентом, таким как SARP-1, также входят в объем данного изобретения. Предпосылки изобретения Фиброз является состоянием, связанным с сверхпродукцией коллагена, например, во внутренних органах, включая почки, сердце, легкие, желудок и суставы. Фиброз легких является одним из распространенных фиброзных заболеваний. Идиопатический легочный фиброз (IPF) характеризуется хроническим воспалением стенок альвеол с прогрессирующим фиброзом неизвестной этиологии. IPF или криптогенный фиброзирующий альвеолит является причиной 50-60% случаев идиопатической интерстициальной легочной болезни. Типичная интерстициальная пневмония (UIP), конкретный гистопатологический пример интерстициальной пневмонии, представляет собой классическую картину, выявляемую в биоптате легкого приIPF. При небольшом увеличении ткань выглядит гетерогенной с чередованием областей нормального легкого, интерстициального воспаления, фиброза и областей с ячеистой структурой. Интерстициальное воспаление состоит из инфильтрата перегородок альвеол лимфоцитами, плазматическими клетками и гистиоцитами, вместе с гиперплазией пневмоцитов типа II. Фиброзные зоны главным образом состоят из плотного внеклеточного коллагена, хотя также могут быть видны отдельные очаги пролиферирующих фибробластов (фибробластные очаги), которые являются местами раннего и активного заболевания,обычно во внутриальвеолярном положении. Области с ячеистой структурой состоят из кистознофиброзных воздушных пространств, часто покрытых бронхиолярным эпителием и заполненных слизью. В слизи может создаваться пул нейтрофилов. В областях фиброза и ячеистой структуры часто возникает гладкомышечная гиперплазия. Подплевральное и парасептальное распределение, неоднородный характер и временная гетерогенность являются наиболее полезными признаками для идентификации UIP. Идентичная картина интерстициального воспаления и фиброза имеет место при коллагенозах сосудов (например, РА, СКВ, прогрессирующий системный склероз, смешанное соединительнотканное заболевание, сахарный диабет), пневмокониозе (например, асбестозе), лучевом повреждении и некоторых индуцированных лекарственными средствами заболеваниях легких (например, нитрофурантоином). Клиническое течение IPF является прогрессирующим; средняя продолжительность жизни составляет от 4 до 6 лет после постановки диагноза. Обычным лечением в случае IPF является лечение преднизоном. Реакция на лечение варьирует, но, по-видимому, улучшение у пациентов при кортикостероидной или цитотоксической терапии более вероятно на более ранней стадии заболевания, когда в большей степени преобладает клеточная стадия, чем рубцевание. Поддерживающее и паллиативное лечение включает O2 в высоких концентрациях, чтобы уменьшить гипоксемию, и в том случае, если имеет место бактериальная инфекция, антибиотики. Трансплантация легкого была успешной у пациентов на конечной стадии легочного заболевания. Фиброз легкого связан с накоплением в печени соединительной ткани в результате дисбаланса между образованием и деградацией внеклеточного матрикса и обостряется спаданием сосудов и уплотнением предсуществующих волокон. Фиброз печени является распространенной реакцией на некроз или повреждение клеток печени, которые могут быть индуцированы широким множеством агентов, например, любым процессом, нарушающим гомеостаз печени (особенно воспалением, токсическим повреждением или измененным потоком крови в печени), и инфекциями печени (вирусными, бактериальными, грибковыми и паразитическими). Многочисленные болезни накопления, возникающие в результате врожденных аномалий метаболизма, часто связаны с фиброзом, включая липидные аномалии (болезнь Гаучера); заболевания, связанные с депонированием гликогена (особенно типа III, IV, VI, IX и X); недостаточность 1-антитрипсина; депонирование экзогенных веществ, которое наблюдается при синдромах перегрузки железом (гемохроматоз) и заболеваниях, связанных с депонированием меди (болезнь Вильсона); накопление токсичных метаболитов (как в случае тирозинемии, фруктоземии и галактоземии); и нарушения пероксисом (синдром Зельвегера). Многочисленные химические вещества и лекарственные средства вызывают фиброз,особенно спирт, метотрексат, изониазид, оксифенизатин, метилдопа, хлорпромазин, толбутамид и амиодарон. Нарушения циркуляции в печени (например, хроническая сердечная недостаточность, синдром Бадда-Киари, веноокклюзионная болезнь, тромбоз портальной вены) и хроническая обструкция путей желчевыделения могут приводить к фиброзу. Наконец, врожденный фиброз печени является аутосомнорецессивным пороком развития. Нормальная печень образована из гепатоцитов и синусоидов, распределенных во внеклеточном матриксе, состоящем из коллагена (преимущественно типов I, III и IV) и неколлагеновых белков, включая гликопротеиды (например, фибронектин, ламинин) и несколько протеогликанов (например, сульфат гепарана, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гиалуронат). Фибробласты, обычно обнаруживаемые только в портальных трактах, могут продуцировать коллаген, крупные гликопротеиды и протеогликаны.-1 007927 Другие клетки печени (в частности, гепатоциты и жиросохраняющие клетки Купфера и эндотелиальные клетки) также могут продуцировать компоненты внеклеточного матрикса. Жиросохраняющие клетки, расположенные под эндотелием синусоидов в пространстве Дисса, являются предшественниками фибробластов, способных к пролиферации и продуцированию избытка внеклеточного матрикса. Развитие фиброза из активного отложения коллагена является следствием повреждения клеток печени, в частности некроза, и воспалительных клеток. Точные факторы, высвобождаемые из указанных клеток, неизвестны, но вероятно это один или несколько цитокинов или продуктов перекисного окисления липидов. Клетки Купфера и активированные макрофаги продуцируют воспалительные цитокины. Вокруг некротических клеток печени образуются новые фибробласты; повышенный синтез коллагена приводит к рубцеванию. Фиброз может возникать в результате активного фиброгенеза и нарушенной деградации нормального и измененного коллагена. Жиросохраняющие клетки, клетки Купфера и эндотелиальные клетки имеют важное значение в клиренсе коллагена типа I, нескольких протеогликанов и денатурированных коллагенов. Изменения активностей указанных клеток могут модифицировать степень фиброза. Для гистопатолога фиброзная ткань может стать более очевидной на основании пассивного коллапса и уплотнения предсуществующих волокон. Таким образом, повышенный синтез или сниженная деградация коллагена приводит к активному отложению избыточной соединительной ткани, которое влияет на функционирование печени: (1) перицеллюлярный фиброз ухудшает питание клеток и приводит к гепатоклеточной атрофии; (2) в пространстве Дисса фиброзная ткань накапливается вокруг синусоидов и препятствует свободному прохождению веществ из крови в гепатоциты; (3) фиброз вокруг венул печени и портальных трактов нарушает поток крови в печени. Венозное сопротивление вдоль печени увеличивается от ответвлений портальной вены к синусоидам и, наконец, к печеночным венам. Могут быть вовлечены все три пути. Фиброзные полосы, которые связывают портальные тракты с центральными венами, также создают условия для анастомозных каналов: артериальная кровь, обходя нормальные гепатоциты, шунтируется к выносящим венам печени, что дополнительно нарушает функционирование печени и может усугублять гепатоклеточный некроз. Степень, в которой проявляются указанные процессы, определяет величину дисфункции печени: например, при врожденном фиброзе печени большие фиброзные полосы преимущественно охватывают портальные области, но обычно скудно представлены в паренхиме печени. Таким образом, врожденный фиброз печени проявляется в виде портальной гипертензии при сохранении гепатоклеточной функции. Склеродермия является заболеванием соединительной ткани, характеризующимся фиброзом кожи и внутренних органов, приводящим к органной недостаточности и смерти (Black et al., 1998; Clements andFurst, 1996). Склеродермия имеет спектр проявлений и множество терапевтических последствий. Она включает очаговую склеродермию, системный склероз, подобные склеродермии нарушения и склеродермию без склеродермии (Smith, 2000). В то время как очаговая склеродермия является редким дерматологическим заболеванием, связанным с фиброзом, и проявления ограничены кожей, системный склероз является заболеванием, затрагивающим многие системы, с варьирующим риском поражения внутренних органов и варьированием степени кожного заболевания. Системный склероз может быть диффузным или ограниченным. Ограниченный системный склероз также называют CREST (кальциноз, дисфункция пищевода Рейно, склеродактилия, телеангиэкстазия). Полагают, что подобные склеродермии нарушения связаны с воздействием производственной среды. При заболевании без склеродермии имеет место поражение внутренних органов без изменений кожи. Основным проявлением склеродермии и, в частности, системного склероза является несоответствующий синтез и отложение избыточного коллагена, дисфункция эндотелия, спазм, коллапс и облитерация в результате фиброза. Склеродермия является редким заболеванием со стабильной частотой заболеваний примерно 19 случаев на 1 миллион человек. Причина склеродермии неизвестна. Однако важное значение имеет генетическая предрасположенность. Аномалии включают аутоиммунную реакцию и изменение функционирования эндотелиальных клеток и фибробластов. В действительности системный склероз, вероятно, является наиболее тяжелым из аутоиммунных заболеваний, причем сообщалось о 50% смертности в течение 5 лет после постановки диагноза (Silman, 1991). Что касается диагноза, то важным клиническим параметром является уплотнение кожи вблизи пястно-фаланговых суставов. Феномен Рейно является частым, почти универсальным компонентом склеродермии. Он диагностируется по изменениям окраски кожи при воздействии холодом. Ишемия и уплотнение кожи являются симптомами болезни Рейно. Несколько лежащих в основе биологических процессов вовлечены в инициацию, тяжесть и прогрессирование болезни и включают дисфункцию сосудов, активацию и повреждение эндотелиальных клеток, накопление лейкоцитов, продукцию аутоантител и имеющую критическое значение неконтролируемую фиброзную реакцию, которая может привести к смерти (Clements and Furst, 1996). Фибробласты играют основную роль в патогенезе данного заболевания. Первичные фибробласты, полученные от пациентов со склеродермией, проявляют много характерных свойств заболевания, наблюдаемых in vivo,особенно увеличенный синтез и отложение внеклеточного матрикса, особенно коллагена и фибронекти-2 007927 на, и измененную продукцию фактора роста и цитокинов, таких как TGF и CTGF (Strehlow and Korn,1998 и LeRoy, 1974). Не существует радикального лечения склеродермии. В качестве инновационного, но связанного с высоким риском лечения предлагалась трансплантация аутологичных стволовых клеток (Martini et al.,1999). В частности, в настоящее время не существует способов лечения склеродермии, нацеленных на процесс фиброза (Wigley and Boling, 2000). Идентификация генов, связанных с риском заболевания и прогрессированием склеродермии, может привести к разработке эффективных способов вмешательства на различных стадиях заболевания. Остеопротегерин (OPG) впервые идентифицирован в 1997 г. как новый цитокин, секретируемый фибробластами (Simonet et al., 1997). OPG человека является белком, состоящим из 401 аминокислоты и содержащим сигнальный пептид из 21 аминокислоты, который отщепляется перед глутаминовой кислотой 22, приводя к зрелому белку из 380 аминокислот. Таким образом, OPG является растворимым белком. Он является членом семейства рецепторов TNF (Morinaga et al., 1998, Yasuda et al., 1998), содержащим четыре богатых цистеином TNFR-подобных домена в своей N-концевой части (Simonet et al., 1997). Показано, что OPG играет роль в развитии костей, и мыши, у которых отсутствовал ген OPG, имели остеопорозный фенотип и грубые аномалии скелета (Min et al., 2000). Остеопротегерин, который продуцируется остеобластами и клетками стромы костного мозга, не имеет трансмембранного домена и действует как секретируемый рецептор-ловушка, который не обладает способностью к прямой передаче сигнала. OPG действует посредством связывания со своим природным лигандом - лигандом остеопротегерина (OPGL), который также известен как RANKL (активатор рецептора лиганда NF-каппаВ). Связывание между OPG и OPGL препятствует тому, чтобы OPGL активировал свой родственный рецептор RANK, который является рецептором остеокластов, необходимым для дифференцировки, активации и жизнеспособности остеокластов.OPG человека является членом семейства TNFR и представлен однокопийным геном, который состоит из 5 экзонов и охватывает 29 т.п.о. генома (Simonet et al., 1997). Рекомбинантный OPG существует в мономерной и димерной формах с кажущимися молекулярными массами 55 и 110 кДа, соответственно(Simonet et al., 1997). Укорочение N-концевого домена до цистеина 185 вызывает инактивацию, вероятно в результате разрушения дисульфидной связи SS3 TNFR-подобного домена, тогда как укорочение Сконцевой части белка до аминокислоты 194 не изменяет биологической активности. Таким образом, Nконцевой TNFR-подобный домен OPG достаточен для предотвращения остеокластогенеза (Simonet et al.,1997). Сверхэкспрессия OPG у трансгенных мышей приводит к глубокому остеопетрозу вторично по отношению к почти полному отсутствию остеокластов. Наоборот, удаление гена OPG вызывает тяжелый остеопороз у мышей. Удаление OPGL или RANK также вызывает глубокий остеопетроз, что свидетельствует о важной физиологической роли указанных белков в регуляции резорбции костей. Секреция OPG и OPGL из остеобластов и клеток стромы регулируется множеством гормонов и цитокинов, часто реципрокным образом. Предполагают, что относительные уровни продукции OPG и OPGL в конечном счете обусловливают степень резорбции костей. Избыток OPGL увеличивает резорбцию костей, тогда как избыток OPG подавляет резорбцию. Рекомбинантный OPG блокирует действие практически всех факторов, которые стимулируют остеокласты, in vitro и in vivo. OPG также ингибирует резорбцию костей во многих моделях заболевания на животных, включая индуцированный овариэктомией остеопороз, гуморальную гиперкальциемию злокачественной опухоли и экспериментальное метастазирование кости. Следовательно, OPG может представлять собой эффективное альтернативное средство в случае заболеваний, связанных с избыточной активностью остеокластов (Kostenuik and Shalhoub, 2001). Однако еще не предполагалось участие остеопротегерина в фиброзных заболеваниях. Сущность изобретения Изобретение основано на полученных данных о том, что введение остеопротегерина приводит к значительному ослаблению заболевания в разработанной модели фиброза легкого у животных. Фиброз легкого является одним из проявлений склеродермии. Таким образом, первой целью данного изобретения является применение остеопротегерина для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии. Второй целью изобретения является применение клетки, экспрессирующей остеопротегерин, или экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность остеопротегерина,для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности системного склероза. Фармацевтические композиции, содержащие остеопротегерин и дополнительные противофиброзные лекарственные средства, такие как галофугинон, и способы лечения, включающие в себя введение остеопротегерина в организм человека, также входят в объем данного изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Экспрессия мРНК OPG в нормальных (заштриховано) и больных (заштриховано горизонтально) фибробластах 6 пациентов со склеродермией, определенная с помощью анализа на микрочипе генов на фильтрах. Средний уровень экспрессии приведен на фиг. (а) и медиана приведена на фиг. (b).-3 007927 Фиг. 2. ПЦР-анализ в режиме реального времени мРНК OPG у 9 пациентов со склеродермией. Для каждого пациента результаты выражены в виде отношения экспрессии мРНК OPG в поврежденных/неповрежденных фибробластах. Фиг. 3. Экспрессия мРНК OPG в биоптатах, взятых из поврежденной и неповрежденной кожи у 5 пациентов со склеродермией, определенная с помощью ПЦР в режиме реального времени. Столбики означают медианное значение экспрессии в каждой группе. Фиг. 4. Вестерн-блот-анализ экспрессии OPG в поврежденных и нормальных фибробластах кожи. Поврежденные фибробласты (А 1-А 4) и нормальные фибробласты (N1-N4). Стрелки с левой стороны геля указывают положение нативного OPG (мономер 55 кДа) и его димерной формы (110 кДа). Слитый белок OPG-Fc (приобретенный из RD systems) использовали в качестве позитивного контроля для антитела. Фиг. 5. Влияние OPG на синтез коллагена в фибробластах человека AG1518. Клетки AG1518 либо совсем не обрабатывали, либо предварительно обрабатывали 10, 20 или 40 нг/мл OPG в течение 24 ч, или 40 нг OPG + анти-OPG нейтрализующее моноклональное антитело (1 мкг/мл), или анти-OPG нейтрализующим моноклональным антителом отдельно, затем 2 нг/мл TGF1 в течение 24 ч. Синтез коллагена определяли с помощью ELISA. Результаты представляют собой среднее из трех определений + S.E.M. Фиг. 6. Влияние трансфекции OPG на синтез 2-коллагена типа I в первичных фибробластах человека (клетки ОВНС). Клетки ОВНС трансфицировали pcDNA3.1/OPG (OPG) или отдельно pcDNA3.1(имитация) как описано в способах. Коллаген в кондиционированной среде измеряли через 24 ч после обработки TGF1 с помощью ELISA. Результаты представляют собой среднее из трех определенийS.E.M. Фиг. 7 А. Влияние OPG на активность промотора 2 коллагена типа 1 в фибробластах эмбрионов мышей. Фибробласты эмбрионов мышей (клетки S3) трансфицировали вектором pGL3, содержащим 3,5 т.п.о. промотора 12 коллагена, связанного с кДНК люциферазы. После трансфекции клетки переносили в свежую среду и либо не обрабатывали (контроль), либо обрабатывали галофугиноном (10-10 М) отдельно (HF); TGF1 (5 нг/мл) (TGF1); или TGF1 (5 нг/мл) + HF (10-8 M) (HF+TGF1) в течение 12 ч с возрастающими концентрациями остеопротегерина. Результаты представляют собой среднее из трех определений.означает Р 0,05 иозначает Р 0,01. Фиг. 7 В показывает степень экспрессии репортерного гена под контролем промотора CTGF после инкубации либо с TGF отдельно, либо в комбинации с различными количествами OPG. Фиг. 8. Анализ ПЦР с обратной транскриптазой мРНК остеопротегерина после обработки in vitro поврежденных и неповрежденных фибробластов от пациентов со склеродермией галофугиноном. Однопроцентный агарозный гель, окрашенный бромидом этидия, показывающий продукты реакции ОТ-ПЦР в случае остеопротегерина (верх) и GAPDH (низ) в поврежденных (индекс А) или неповрежденных (индекс N) фибробластах. Фиг. 9. Влияние введения остеопротегерина in vivo на развитие фиброза легкого у мышей, обработанных блеомицином. А: Изменение массы тела мышей после обработки остеопротегерином. Результаты выражены в виде средней массы в г/группу, измеряемой каждый день после внутритрахеальной инстилляции блеомицина. В: Смертность в результате введения блеомицина. Результаты выражены в виде процента количества смертей на группу из 10 животных. Фиг. 10. Влияние введения остеопротегерина in vivo на развитие фиброза легкого у мышей, обработанных блеомицином. А: степень фиброза в легких, измеренная через 12 дней после введения блеомицина. Легкие красили трихромом. Результаты выражены в виде % характерной доли легкого, пораженной фиброзом, для каждого выжившего животного. В: степень отложения коллагена в легких, измеренная через 12 дней после введения блеомицина. Содержание гидроксипролина измеряли в характерной доли легкого, взятой от каждого выжившего животного. Описание изобретения Согласно данному изобретению использовали методику микрочипов ДНК-генов на фильтрах, чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены в фибробластах кожи из фиброзных повреждений, полученных от пациентов с системным склерозом (склеродермией) по сравнению с нормальными фибробластами кожи от тех же пациентов. Одним геном, который одинаковым образом подвергался понижающей регуляции в фибробластах, пораженных склеродермией, был остеопротегерин (OPG),также называемый ингибирующим фактором остеокластогенеза. Аномальные фибробласты экспрессировали значительно более низкие уровни мРНК OPG по сравнению с нормальными фибробластами у 7 из 9 тестированных пациентов. Полученные результаты подтвердились анализом ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, ОТ-ПЦР-анализ в режиме реального времени суммарной РНК, выделенной из целых образцов биоптат аномальной кожи пациентов со склеродермией, показал более низкие уровни мРНК OPG по сравнению с клинически нормальными контрольными биопсиями, совпадающими по возрасту, полу и анатомическому положению. Количество белка OPG в поврежденных фибробластах также снижалось по сравнению с нормальными фибробластами, выделенными у тех же самых пациентов. Invitro OPG способен снижать опосредованный TGF синтез коллагена после трансфекции фибробластов-4 007927 кДНК OPG или после обработки рекомбинантным белком. Дополнительная активность OPG in vitro заключается в ингибировании индуцированной TGF экспрессии фактора роста соединительной ткани(CTGF). CTGF обычно индуцирует синтез компонентов внеклеточного матрикса в фибробластах. Полученные данные in vitro далее подтверждены данными in vivo в разработанной модели на животных. Введение остеопротегерина снижало фиброз легких и уменьшало отложение коллагена в модели индуцированного блеомицином фиброза легких. На гистологическом уровне легкие обработанных остеопротегерином животных были похожи на легкие нативных, не подвергаемых обработке мышей. Таким образом изобретение относится к применению вещества для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, при этом вещество выбрано из группы, состоящей из: а) полипептида, содержащего SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;e) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40% или 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей в (а)-(d);f) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(d), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;g) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (а)-(d);h) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с круговыми перестановками любого из (а)-(g). Специалисту в данной области будет понятно, что согласно данному изобретению вещество, которое стимулирует высвобождение или увеличивает активность эндогенного остеопротегерина, в равной мере можно использовать для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности склеродермии. Указанным веществом может быть сам зрелый остеопротегерин или любой фрагмент остеопротегерина, связывающийся с OPGL и, следовательно, препятствующий связыванию OPGL с RANK и предотвращающий инициацию передачи сигнала через RANK. Таким веществом может быть, например,антитело, направленное к OPGL. Известно, что OPG связывается с OPGL и что указанное взаимодействие препятствует связыванию OPGL с его рецептором RANK. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что любое вещество, препятствующее связыванию OPGL с его рецептором RANK,или любой другой агент, блокирующий активность RANK или передачу сигнала, будет обладать такой же активностью, как и остеопротегерин, в случае профилактики и/или лечения фиброзного заболевания,в частности склеродермии. Агентами, блокирующими связывание OPGL с RANK, могут быть, например,антагонистические антитела, направленные к OPGL. Кроме того, агентами, блокирующими активностьRANK, например, могут быть антагонистические антитела, направленные к RANK. Следующими агентами, блокирующими взаимодействие OPGL/RANK, могут быть, например, химические соединения,препятствующие связыванию указанных белков друг с другом, но также любой другой химический или биологический ингибитор передачи сигнала через рецептор RANK. Полноразмерная кДНК остеопротегерина человека клонирована и изображена в виде SEQ ID NO:1 в прилагаемом списке последовательностей. Соответствующая аминокислотная последовательность приведена в виде SEQ ID NO:2 в прилагаемом списке последовательностей. Последовательности описаны на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov под номером АВ 008821, а также в Morinaga et al. (1998). Изоформа или полиморфная форма остеопротегерина описана Simonet et al. (1997). кДНК согласно Simonet et al. (1997) изображена в виде SEQ ID NO:3 в прилагаемом списке последовательностей, а соответствующая аминокислотная последовательность приведена в виде SEQ ID NO:4. Обе последовательности, кроме того, доступны из www.ncbi.nlm.nih.gov под номером U94332. Единственное различие между белками, обнаруженными Morinaga et al. и Simonet et al., касается положения аминокислоты 263, которое может быть представлено аспарагиновой кислотой или аланином соответственно. Термин остеопротегерин в используемом в данном описании смысле относится к веществам, рассматриваемым выше в (а)-(h). Термин лечение и/или профилактика в используемом в данном описании смысле охватывает любое ослабление, снижение или частичное, значительное или полное предотвращение или блокирование возникновения, развития, прогрессирования заболевания или возникновения, развития или прогрессирования любого одного или нескольких или всех симптомов заболевания. Термин фиброзное заболевание в используемом в данном описании смысле относится к заболеваниям, в которые вовлечен фиброз, которые могут быть, например, следствием хронического воспаления или репарации и реорганизации тканей. Фиброз может поражать любой орган в организме человека,такой как, например, кожа, легкое, поджелудочная железа, печень или почка. Таким образом, изобрете-5 007927 ние также относится к лечению и/или профилактике фиброзных заболеваний, таких как цирроз печени,интерстициальный легочный фиброз, контрактура Дюпюитрена, келоид и другие аномалии рубцевания/заживления ран, послеоперационные спайки и реактивный фиброз, а также хроническая сердечная недостаточность, в частности после инфаркта миокарда. Следующие заболевания или расстройства, которые можно лечить остеопротегерином, включают заболевания, связанные с заживлением ран, в частности заживлением ран в легком, включая хроническое воспаление легких и конечно фиброз или рубцевание легочных поверхностей. Заболевания, в которые вовлечено воспаление легкого, включают, например, идиопатический легочный фиброз, саркоидоз, бронхолегочную дисплазию, фибропролиферативныйARDS, а также легочные проявления или системные заболевания, такие как ревматоидный артрит (Kreinet al., 2001). Фиброз обычно включает образование или пролиферацию соединительной ткани, которая замещает функционально специализированную ткань данного органа. Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани. В предпочтительном варианте фиброзным заболеванием является склеродермия. Термин склеродермия в используемом в данном описании смысле относится к заболеванию, также называемому системным склерозом или системной склеродермией. Указанные термины в данной заявке на выдачу патента используются как синонимы. Системный склероз является хроническим заболеванием неизвестной причины, характеризующимся диффузным фиброзом; дегенеративными изменениями; и аномалиями сосудов в коже, структуры суставов и внутренних органов (особенно, например, пищевода, желудочно-кишечного тракта, легкого, сердца и почки). Он может быть очаговым или смешанным, системным, ограниченным или диффузным. Термин склеродермия предпочтительно относится к очаговой, системной, ограниченной и диффузной склеродермии, а также перекрывающимся синдромам. Очаговая склеродермия главным образом затрагивает кожу, но также может влиять на подлежащие мышцы и кости. Однако обычно она не поражает внутренние органы. Очаговая склеродермия является относительно умеренной и может быть отнесена к системной склеродермии по сходным внешним симптомам, таким как вид биоптата кожи под микроскопом. Системная склеродермия включает несколько типов симптомов или групп симптомов, такие какCREST, ограниченный или диффузный. Заболевание также может быть названо как прогрессирующий системный склероз или семейный прогрессирующий системный склероз. Системная склеродермия может, например, поражать кожу, кровеносные сосуды и/или внутренние органы. В том случае, когда она поражает кожу, это может приводить к тому, что кожа становится твердой, в большинстве случаев на руках и/или лице. При поражении кровеносных сосудов она может вызвать болезнь Рейно. Наиболее серьезные формы системного склероза поражают внутренние органы и могут приводить к нетрудоспособности или даже смерти. Наряду с прочим системный склероз включает в себя: склеродермическое легочное заболевание, склеродермический почечный криз, сердечные проявления, мышечную слабость,включая утомление или ограниченный CREST, нарушение моторики и спазм желудочно-кишечного тракта и нарушения в центральной, периферической и автономной нервной системе. Что касается нарушений нервной системы, то наиболее распространен синдром канала запястья с последующей невралгией тройничного нерва. Ограниченная склеродермия может быть ограничена, например, руками, хотя также могут быть затронуты лицо и шея. Диффузная склеродермия включает уплотнение кожи и также возникает выше запястья (или локтей). Существует несколько подкатегорий диффузного системного склероза, такие как склеродермия без склеродермии, при которой имеет место фиброз внутренних органов, но нет уплотнения кожи; и семейный прогрессирующий системный склероз, редкая форма, встречающаяся в семьях. Перекрывающиеся синдромы указывают в том случае, если у пациента со склеродермией имеется другое аутоиммунное заболевание (такое как волчанка, ревматоидный артрит и т.д.), как, например, при диффузной склеродермии, совмещенной с волчанкой. Склеродермические симптомы также могут быть частью смешанного заболевания соединительной ткани (MCTD) или недифференцированного заболевания соединительной ткани (UCTD). Термин остеопротегерин в используемом в данном описании смысле относится к белку, содержащему всю или часть последовательности SEQ ID NO:2 или 4 (обе последовательности человека) из прилагаемого списка последовательностей, а также к его солям, изоформам, мутеинам, активным фракциям, функциональным производным и производным с круговыми перестановками. OPG вида, отличного от человека, такого как крыса, можно использовать согласно данному изобретению при условии, что имеет место достаточная идентичность между белками, которая позволяет белку проявлять его биологическую активность и не вызывать существенного иммунного ответа у человека. Предпочтительно термин остеопротегерин относится к зрелому белку, в котором отсутствует сигнальный пептид. Сигнальный пептид содержит 21 N-концевую аминокислоту OPG, которые приведены в SEQ ID NO:2 или 4, т.е. зрелый белок содержит аминокислоты 22-401 SEQ ID NO:2 или 4. Термин остеопротегерин в используемом в данном описании смысле, кроме того, относится к любому фраг-6 007927 менту, части, домену или субдомену SEQ ID NO:2 или 4, проявляющему требуемую активность при склеродермии или других фиброзных заболеваниях. Фрагменты белка, изоформы, дифференциально гликозилированные или сиалированные формы или один или несколько доменов белка можно использовать согласно изобретению при условии, что они проявляют какое-либо целебное действие в случае фиброзного заболевания, предпочтительно действие, которое по меньшей мере сравнимо с действием полноразмерного белка. Целебное действие можно измерить в одном из тестов in vitro или in vivo, описанных в примерах ниже, или в любом другом анализе, адекватно демонстрирующем действие на фиброзные заболевания, в частности склеродермию. Например, остеопротегерин содержит богатый цистеином TNFR-подобный домен в своей Nконцевой части, как описано Simonet et al., 1997. Показано, что фрагмент, содержащий указанный домен,сохраняет биологическую активность OPG в тесте in vitro. Следовательно, предпочтительный фрагментSEQ ID NO:2 или 4. Согласно данному изобретению остеопротегерин может быть природного происхождения, т.е. нативным белком, или рекомбинантным белком. Получение рекомбинанта можно осуществить в эукариотических клетках, таких как дрожжевые клетки или клетки млекопитающих, предпочтительно в клетках СНО, клетках НЕК (клетки эмбриональной почки человека) или в клетках или клеточных линиях фибробластов человека. Кроме того, его можно получить в прокариотических клетках, таких как Е. coli. Описано, что остеопротегерин встречается в мономерной и димерной форме (Simonet et al., 1997). Таким образом, согласно данному изобретению OPG может быть мономером, димером или мультимером. Предпочтительно остеопротегерин гликозилирован в одном или нескольких сайтах. Он также может быть негликозилированным, в зависимости от конкретной потребности и источника получения или выделения белка. Термин соли в данном описании относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогрупп молекулы остеопротегерина или его аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобные, и соли органических оснований, как соли, образованные, например, аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин,пиперидин, прокаин и тому подобные. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли минеральных кислот, таких, например, как хлористоводородная кислота или серная кислота, и соли органических кислот, таких, например, как уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любые такие соли должны сохранять биологическую активность остеопротегерина, важную для данного изобретения, т.е. оказывать целебное действие на фиброзные заболевания, в частности склеродермию. Изоформы или варианты сплайсинга остеопротегерина также можно использовать согласно изобретению при условии, что они способны ингибировать прогрессирование заболевания и/или симптомы данного заболевания. В используемом в данном описании смысле термин мутеины относится к аналогам остеопротегерина, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного остеопротегерина заменены другими аминокислотными остатками или делетированы или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности остеопротегерина, обладающим предпочтительно по меньшей мере такой же активностью, что и остеопротегерин дикого типа, или даже обладающим намного более сильной активностью. Биологическую активность OPG можно, например, измерить с помощью анализа связывания OPG с его природным лигандом OPGL. Анализы для оценки белок-белковых взаимодействий хорошо известны специалисту в данной области. Примерами таких анализов являются анализы связывания типа ELISA, анализы иммунопреципитации или измерение в любой другой подходящей системе, такой как система BIAcore. Указанные мутеины получают посредством известного синтеза и/или посредством способов сайт-направленного мутагенеза или другим известным подходящим для этого способом. Предпочтительно любой такой мутеин содержит последовательность аминокислот, в достаточной степени копирующую последовательность зрелого остеопротегерина, так что обладает активностью, по меньшей мере, в значительной степени сходной с активностью остеопротегерина. Активность мутанта остеопротегерина, кроме того, можно тестировать в анализах, которые объясняются в примерах ниже. Например, количественное измерение синтеза коллагена в фибробластах, обработанных OPG, может быть подходящим тестом для оценки активности мутеинов остеопротегерина. Мутеины согласно данному изобретению включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с ДНК или РНК, которая кодирует остеопротегерин согласно данному изобретению, в жестких условиях. Термин жесткие условия относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые специалисты в данной области обычно называют жесткими. См. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.,6.3 and 6.4Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Без ограничения примеры жестких условий включают условия промывки при температуре на 12-7 007927 20 С ниже рассчитанной Тm гибрида при исследовании, например, в 2xSSC и 0,5% SDS в течение 5 мин,2xSSC и 0,1% SDS в течение 15 мин; 0,1xSSC и 0,5% SDS при 37 С в течение 30-60 мин и затем 0,1xSSC и 0,5% SDS при 68 С в течение 30-60 мин. Специалисту в данной области понятно, что условия жесткости также зависят от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как длиной 1040 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. В случае использования смешанных зондов предпочтительно применение хлорида тетраметиламмония (ТМАС) вместо SSC. См. Ausubel, выше. Предпочтительно любой такой мутеин имеет последовательность аминокислот, в достаточной степени копирующую последовательность остеопротегерина, так что обладает в значительной степени сходной или даже лучшей биологической активностью, чем остеопротегерин. Одной из легко измеряемых активностей остеопротегерина является его способность снижать синтез коллагена. При условии, что мутеин обладает значительной активностью, снижающей синтез коллагена, можно считать, что он обладает активностью в значительной степени сходной с активностью остеопротегерина. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин по меньшей мере по существу такой же активностью, что и остеопротегерин с помощью стандартного эксперимента,включающего в себя обработку таким мутеином. В предпочтительном варианте любой такой мутеин обладает по меньшей мере 40% идентичностью или гомологией с последовательностью зрелого остеопротегерина. Более предпочтительно, он обладает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью или гомологией с указанной последовательностью. Идентичность отражает родство между двумя или несколькими полипептидными последовательностями или двумя или несколькими полинуклеотидными последовательностями, определяемое при сравнении последовательностей. В общем, идентичность относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностей, соответственно, на протяжении длины сравниваемых последовательностей. В случае последовательностей, когда нет точного соответствия, можно определит % идентичности. В общем две последовательности, которые необходимо сравнить, выравнивают, получая максимальную корреляцию между последовательностями. При этом может быть включено встраивание пробелов либо в одной, либо в двух последовательностях, чтобы увеличить степень выравнивания. % идентичности можно определить по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное выравнивание), что особенно подходит для последовательностей одной и той же или очень сходной длины, или на протяжении более коротких, определенных длин (так называемое локальное выравнивание), что более подходит для последовательностей неравной длины. Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в данной области. Таким образом, можно использовать, например, программы, имеющиеся в пакете программ для анализа последовательностей Wisconsin, версия 9.1 (Devereux J. et al., 1984), например, программы BESTFIT и GAP, чтобы определить % идентичности между двумя полинуклеотидами и% идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями. BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Smith and Waterman (1981) и находит наилучшую отдельную область сходства между двумя последовательностями. В данной области также известны другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями, например, семейство программ BLAST (Altschul S.F. et al., 1990, Altschul S.F. et al., 1997, доступные через домашнюю страницу NCBI на www.ncbi.nlm.nih.gov) и FASTA (Pearson W.R., 1990; Pearson 1988). Мутеины остеопротегерина, которые можно использовать согласно данному изобретению, или кодирующие их нуклеиновые кислоты, включают ограниченный набор по существу соответствующих последовательностей, как, например, пептидов или полинуклеотидов с заменами, которые могут быть получены обычными способами специалистом в данной области без большего, чем необходимо экспериментирования на основании указаний и руководств, представленных в данном описании. Предпочтительными изменениями в случае мутеинов согласно данному изобретению являются изменения, известные как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов или белков остеопротегерина могут включать синонимичные аминокислоты в пределах группы,которые обладают, по существу, сходными физико-химическими свойствами, так что замена между членами группы будет сохранять биологическую функцию молекулы (Grantham, 1974). Понятно, что инсерции и делеции аминокислот также можно осуществить в определенных выше последовательностях без изменения их функции, особенно если инсерции или делеции затрагивают только небольшое количество аминокислот, например, до тридцати и предпочтительно до десяти, и аминокислоты, которые важны для функциональной конформации, например, остатки цистеина, не удаляются и не заменяются. Белки и мутеины, получаемые при таких делециях и/или инсерциях, входят в объем данного изобретения. Предпочтительными группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. I. Более предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. II; и наиболее предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. III.-8 007927 Таблица I Предпочтительные группы синонимичных аминокислот Таблица II Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот-9 007927 Таблица III Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для получения мутеинов полипептидов или белков остеопротегерина для применения в данном изобретении включают любые известные методические стадии, такие как представленные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462, Mark et al.; 5116943 Koths et al., 4965195 Namen et al.; 4879111 Chong et al.; и 5017691 Lee et al.; и замещенные лизином белки, представленные в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Термин слитый белок относится к полипептиду, содержащему остеопротегерин или его мутеин,слитый с другим белком, который, например, имеет более продолжительное время пребывания в жидкостях организма. Слитые белки, содержащие полный белок или функциональную часть остеопротегерина,слитую с полным белком или частью белка, способного повышать биологические активности молекулы,например, подобные времени полужизни в организме человека, являются предпочтительными согласно изобретению. В предпочтительном варианте слитый белок содержит слияние с иммуноглобулином (Ig). Слитые белки, содержащие полный белок или часть остеопротегерина, слитого с полным белком или частью иммуноглобулина, являются в высокой степени предпочтительными. Слитые белки могут быть мономерными или мульмерными, гетеро- или гомомультимерными. Преимущественно слитый белок содержит константную область иммуноглобулина, в частности, Fc-часть иммуноглобулина. Кроме того,варианты, в которых иммуноглобулин относится к изотипу IgG1 или IgG2, являются предпочтительными согласно изобретению. Предпочтительно слияние представляет собой слияние с Fc. Таким образом, остеопротегерин может быть слит с другим белком, полипептидом и тому подобным, например, с иммуноглобулином или его фрагментом. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может составлять до 1-3 аминокислотных остатков в длину или может быть более длинным, например, 13 аминокислотных остатков в длину. Указанный линкер может быть трипептидом, например, с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met), или 13-аминокислотной линкерной последовательностью, содержащей Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, введенными между последовательностью остеопротегерина и последовательностью иммуноглобулина. Функциональные производные в используемом в данном описании смысле охватывают производные остеопротегерина и их мутеины и слитые белки, которые могут быть получены с использованием функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках, или N- или С-концевых групп способами, известными в данной области, и которые включены в изобретение при условии, что они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая по меньшей мере в значительной степени сходна с активностью остеопротегерина, и не придают токсичные- 10007927 свойства содержащим их композициям. Следовательно, в предпочтительном варианте функциональное производное содержит по меньшей мере один остаток, связанный с одной или несколькими функциональными группами, которые встречаются в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Согласно данному изобретению высоко предпочтительными остатками являются боковые цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ). Боковые цепи ПЭГ могут скрывать антигенные сайты и продлевать время пребывания вещества, с которым они связаны, в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп в результате реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с остатками ацила (например, алканоильные или карбоциклические ароильные группы) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серила или треонила), образованные с остатками ацила. Активные фракции остеопротегерина и его мутеинов и слитых белков охватывают любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе со связанными молекулами или связанными с ними остатками, например, остатками сахара или фосфата, или агрегатами молекулы белка или остатками сахара непосредственно, при условии, что указанная активная фракция обладает, по меньшей мере, активностью, в значительной степени сходной с активностью остеопротегерина. Изобретение, кроме того, относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики склеродермии, при этом молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;e) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40% или 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (а)-(d);f) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (a)-(d), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;g) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (a)-(d);h) изоформы, слитого белка или активной фракции любого из полипептидов (a)-(g). Изобретение предпочтительно относится к применению указанных молекул нуклеиновых кислот для лечения и/или профилактики заболеваний соединительной ткани, и в частности склеродермии. Согласно данному изобретению остеопротегерин также можно вводить в организм человека в форме вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к применению вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики склеродермии или другого фиброзного заболевания. Предпочтительно вектор является экспрессирующим вектором, содержащим промотор, оперативно связанный с полной или с частью кодирующей последовательности остеопротегерина. В следующем предпочтительном варианте вектор является вектором для генной терапии. Векторы для генной терапии известны в данной области, большинство из них являются векторами, полученными из вирусов, такие как аденовирусные или лентивирусные векторы. Согласно изобретению остеопротегерин также можно вводить в организм человека в форме клетки,продуцирующей и/или секретирующей остеопротегерин. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к применению клетки, экспрессирующей остеопротегерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики склеродермии или любого другого фиброзного заболевания, т.е. к клеточной терапии для лечения и/или профилактики склеродермии или других фиброзных заболеваний. Клетка может быть клеткой, природно продуцирующей остеопротегерин, и/или трансфицированной клеткой, которая продуцирует рекомбинантный остеопротегерин. Предпочтительными являются клетки,экспрессирующие и секретирующие высокие количества белка, такие как сверхэкспрессирующие клетки,несущие большие количества копий экспрессирующего вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую остеопротегерин. Так как фибробласты представляют механизм фиброза, они являются наиболее подходящими клетками для противофиброзной терапии и терапии склеродермии. Таким образом согласно данному изобретению предпочтительно используют фибробласты, экспрессирующие остеопротегерин. Изобретение, кроме того, относится к клетке, содержащей вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полный белок или часть остеопротегерина, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности склеродермии. Клет- 11007927 ка, которая была генетически модифицирована, так, чтобы она продуцировала полипептид согласно изобретению, также входит в объем данного изобретения. Применение экспрессирующего вектора для индуцирования и/или усиления эндогенной продукции остеопротегерина в клетке, обычно молчащей или экспрессирующей количества ингибитора, которые недостаточны, также рассматривается в данном изобретении. Таким образом, в изобретении используется способ, известный как активация эндогенных генов (EGA), для получения требуемого белка. Согласно данному изобретению предпочтительны несколько комбинированных способов лечения. Таким образом, предпочтительно лекарственное средство согласно изобретению дополнительно содержит: интерферон, в частности интерферон-; антагонист фактора некроза опухолей (TNF), в частности растворимые TNFR, такие как растворимый р 55 (TBPI) и/или растворимый р 75 (ТВРII); дополнительный противосклеродермический агент; противосклеродермический агент, выбранный из группы, состоящей из галофугинона, ингибиторов АСЕ, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов протонных насосов, НПВС, ингибиторов ЦОГ, кортикостероидов, тетрациклина, пентоксифиллина, буцилламина, ингибиторов геранилгеранилтрансферазы, роттерлина, ингибиторов пролил-4-гидроксилазы, ингибиторов с-протеиназы, ингибиторов лизилоксидазы, релаксина, простагландинов, простациклинов, эндотелина-1, окиси азота, ингибиторов ангиотензина II, антиоксидантов или SARP-1. Показано, что SARP-1 является белком, обладающим целебным действием в случае фиброзных заболеваний, таких как склеродермия (WO 02/46225). Фрагменты, изоформы, активные фракции, слитые белки или функциональные производные SARP-1, которые описаны в WO 02/46225, также можно использовать в комбинации с остеопротегерином согласно данному изобретению. Все средства терапии предназначены для одновременного, последовательного или раздельного применения. Фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько из указанных выше веществ вместе с остеопротегерином, входят в объем данного изобретения. Хотя в настоящее время не существует способов излечения склеродермии, несколько агентов или терапевтических способов используются в настоящее время для лечения симптомов склеродермии. Такие противосклеродермические агенты, которые можно использовать в виде комбинированной терапии согласно изобретению, суммированы, например, в Leighton (2001) или Wigley and Sule (2001), которые включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Интерфероны преимущественно известны из-за ингибирующего действия на репликацию вирусов и пролиферацию клеток. Интерферон-, например, играет важную роль в стимулировании иммунных и воспалительных ответов. Указывается, что интерферон(IFN-, интерферон типа I), играет противовоспалительную роль. Еще в одном варианте изобретения остеопротегерин используют в комбинации с антагонистомTNF. Антагонисты TNF проявляют свою активность несколькими путями. Во-первых, антагонисты могут с достаточной аффинностью и специфичностью связывать или секвестрировать саму молекулу TNF,частично или полностью нейтрализуя эпитоп или эпитопы TNF, ответственные за связывание с рецептором TNF (в дальнейшем называемые секвестрирующими антагонистами). Секвестрирующим антагонистом, например, может быть антитело, направленное против TNF. Альтернативно антагонисты TNF могут ингибировать путь передачи сигнала TNF, активируемый рецептором клеточной поверхности после связывания TNF (в дальнейшем называемые антагонистами передачи сигнала). Антагонисты TNF легко идентифицировать и охарактеризовать с помощью обычного скрининга кандидатов в отношении их влияния на активность нативного TNF на чувствительных линиях клеток in vitro, например, В-клетках человека, в которых TNF вызывает пролиферацию и секрецию иммуноглобулина. В анализ включают композиции TNF с разными разведениями выбранного для исследования антагониста, например, соответствующими 0,1-100-кратному молярному количеству TNF, используемому в анализе, и контроли без TNF или только с антагонистом (Tucci et al., 1992). Секвестрирующие антагонисты являются предпочтительными антагонистами TNF, используемыми согласно данному изобретению. Из числа секвестрирующих антагонистов предпочтительны те полипептиды, которые связывают TNF с высокой аффинностью и обладают низкой иммуногенностью. Особенно предпочтительны растворимые молекулы рецептора TNF и нейтрализующие антитела к TNF. Например,в данном изобретении применимы растворимые формы TNF-RI (р 55) и TNF-RII (р 75). Укороченные формы данных рецепторов, содержащие внеклеточные домены рецепторов или их функциональные части, являются более предпочтительными антагонистами согласно данному изобретению. Укороченные растворимые рецепторы TNF типа I и типа II описаны, например, в ЕР 914431. Укороченные формы рецепторов TNF являются растворимыми и были выявлены в моче и сыворотке в виде ингибирующих связывающих TNF белков 30 кДа или 40 кДа, которые названы TBPI и TBPII, соответственно (Engelmann et al., 1990). Согласно данному изобретению предпочтительно одновременное, последовательное или раздельное применение остеопротегерина с антагонистами TNF и/или интерфероном.- 12007927 Согласно изобретению TBPI и TBPII являются предпочтительными антагонистами TNF, используемыми в комбинации с остеопротегерином. Если производные, фрагменты, области и биологически активные части молекул рецепторов функционально сходны с молекулами рецепторов, то они могут быть также использованы в данном изобретении. Такой биологически активный эквивалент или производное молекулы рецептора относится к части полипептида или последовательности, кодирующей молекулу рецептора, которая имеет достаточный размер и способна связывать TNF с такой аффинностью, при которой связанный с мембраной рецептор TNF ингибируется или блокируется. В следующем предпочтительном варианте антагонистом TNF, используемым согласно изобретению, является растворимый TNF-RI (TBPI) человека. Природные и рекомбинантные растворимые молекулы рецептора TNF и способы их получения описаны в европейских патентах ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 433900. Несмотря на то, что может быть полезным блокирование TNF- на ранних стадиях заболевания,высказывалось мнение, что на более поздних стадиях TNF сам по себе может оказывать целебное действие на склеродермию (Abraham et al., 2000). Таким образом изобретение, кроме того, относится к комбинации остеопротегерина и TNF для лечения или профилактики склеродермии, особенно запущенных стадий болезни. Согласно данному изобретению можно использовать TNF- или TNF-. Изобретение, кроме того, относится к фармацевтической композиции, содержащей остеопротегерин, необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности склеродермии. Фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать любой из идентифицированных выше дополнительных компонентов и в частности интерферон, ТВР или ингибитор ЦОГ. Фармацевтическая композиция согласно изобретению также может включать в себя вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению или клетку, экспрессирующую остеопротегерин. Активные ингредиенты фармацевтического средства, т.е. полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки согласно изобретению или их комбинации, а также комбинации веществ, указанных выше, можно вводить индивидууму различными способами. Пути введения включают внутрикожный, трансдермальный (например, в препаратах медленного высвобождения), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и интраназальный пути. Можно использовать любой другой терапевтически эффективный путь введения, например, поглощение через эпителиальные или эндотелиальные ткани или с помощью генной терапии, при которой пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, с помощью вектора), что приводит к экспрессии и секреции активного агента in vivo. Кроме того, белок(ки) согласно изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнители. Имеется в виду, что определение фармацевтически приемлемый охватывает любой носитель, который не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Например, в случае парентерального введения активный белок(ки) может быть приготовлен в дозированной лекарственной форме для инъекции в таких наполнителях как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточного альбумина и раствор Рингера. В случае парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок(ки) может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным наполнителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность(например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Препарат стерилизуют обычно используемыми способами. Биодоступность активного белка(ков) согласно изобретению также можно улучшить, используя способы конъюгации, которые увеличивают время полужизни молекулы в организме человека, например,связывая молекулу с полиэтиленгликолем, как описано в заявке на выдачу патента РСТ WO 92/13095. Терапевтически эффективное количество активного белка(ков) будет представлять собой функцию многих переменных, включая тип рецептора, аффинность вещества согласно изобретению по отношению к его рецептору, какую-либо проявляемую при этом остаточную цитотоксическую активность, путь введения, клиническое состояние пациента. Терапевтически эффективное количество означает такое количество, в результате введения которого вещество согласно изобретению оказывает целебное действие на развитие или прогрессирование заболевания in vivo. Доза, вводимая индивидууму в виде однократной или многократных доз, будет варьировать в зависимости от множества факторов, включая фармакокинетические свойства OPG, путь введения, состояния и характеристики пациента (пол, возраст, массу тела, состояние здоровья, рост),степень проявления симптомов, сопутствующее лечение, частоту, с которой проводится лечение, и требуемый эффект. Корректировка и манипулирование доз в установленных пределах находятся в компетенции специалистов в данной области.- 13007927 Требуемая доза полипептида согласно изобретению будет варьировать примерно от 0,0001 до 100 мг/кг или примерно от 0,01 до 10 мг/кг или примерно от 0,1 до 5 мг/кг или примерно от 1 до 3 мг/кг, хотя, как указано, выше доза будет во многом зависеть от усмотрения терапевта. Лекарственное средство согласно изобретению можно вводить ежедневно, через день или 3 раза в неделю. Ежедневные дозы обычно дают дробными дозами или в форме замедленного высвобождения, эффективной для получения требуемых результатов. Второе или последующие введения можно осуществлять в дозе, которая является такой же, меньше или больше, чем начальная или предыдущая доза, вводимая индивидууму. Второе или последующее введение можно проводить во время или до наступления заболевания. Изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии, включающему в себя введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества вещества согласно изобретению необязательно с фармацевтически приемлемым носителем. Альтернативно или дополнительно согласно изобретению можно вводить клетку, продуцирующую остеопротегерин, или молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно находящуюся в экспрессирующем векторе. Экспрессирующий вектор можно вводить системно. Предпочтительно экспрессирующий вектор вводят путем внутримышечной инъекции. Следующим предпочтительным путем введения является ингаляция, в частности, если в заболевание вовлечен фиброз легкого. Местное введение экспрессирующего вектора, содержащего последовательности OPG, или полипептида OPG согласно изобретению является следующим предпочтительным путем введения, в частности, если имеет место поражение кожи. Изобретение, кроме того, относится к способу приготовления фармацевтической композиции, содержащей смесь эффективного количества остеопротегерина с фармацевтически приемлемым носителем, и к способу лечения и/или профилактики артрита, включающему в себя введение нуждающемуся в этом хозяину эффективно ингибирующего количества остеопротегерина. Все публикации, цитированные в данном описании, включая статьи или рефераты в журналах,опубликованные или неопубликованные заявки на выдачу патентов США или иностранные заявки, национальные патенты США или иностранные патенты или любые другие публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, имеющиеся в цитированных публикациях. Кроме того, полное содержание публикаций, цитированных в публикациях,которые цитированы в данном описании, также включены в виде ссылки в полном объеме. Ссылки на известные методические стадии, традиционные методические стадии, известные способы или обычные способы никоим образом не являются признанием того, что какой-либо аспект, описание или вариант данного изобретения раскрыт, представлен в виде инструкций или предложен в соответствующей области. Приведенное выше описание конкретных вариантов настолько полно раскроет общую природу изобретения, что другие специалисты, используя знания, имеющиеся в данной области (включая содержание цитированных в данном описании публикаций), смогут без труда осуществить модификации и/или адаптировать такие конкретные варианты для различных применений без большего, чем необходимо экспериментирования, не выходя за рамки общей концепции данного изобретения. Таким образом, подразумевается, что такие адаптации и модификации входят в понятие ряда эквивалентов заявленных вариантов, основанных на приведенных в данном описании инструкциях и руководстве. Должно быть понятно, что используемая в данном описании фразеология и терминология приведена в целях описания, но не ограничения, так что терминология или фразеология данного описания должна быть интерпретирована специалистом в данной области в свете приведенных в данном описании инструкций и руководства в сочетании со знаниями специалиста в данной области. Теперь после описания изобретения его будет легче понять благодаря ссылкам на следующие примеры, которые приведены с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения. Примеры Способы. Образцы тканей пациента. Пункционные биоптаты объемом 2 мм 3 брали из поврежденной или неповрежденной кожи (обычно из кожи предплечья) у девяти совпадающих по возрасту и полу пациентов с диффузным кожным склерозом (SSc). Все пациенты удовлетворяли критериям Американского института ревматологии в отношении диагноза SSc. Культуры фибробластов. Фибробласты получали из биоптата с помощью культивирования in vitro, как описано ранее (Abrahamet al., 1991). Коротко, биоптаты нарезали на кусочки и помещали в стерильные пластиковые чашки или флаконы. После 15 мин сушки при комнатной температуре кусочки биоптата прилипали к пластику для культуры ткани, и затем их культивировали в среде роста фибробластов (FGM), состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (FCS), 2 мМL-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 100 единиц в мл пенициллина, 100 мкг в мл стрептомицина, 50 мкг в мл гентамицина и 2,5 мкг в 1 мл амфотерицина В. После 2-3 недель инкубации во влажной атмосфере с 5% СO2 в воздухе, выросшие фибробласты открепляли кратковременной обработкой трипсином и по- 14007927 вторно культивировали в FGM без гентамицина и амфотерицина В. В экспериментах использовали фибробласты между 2 и 5 пассажами. Фенотип фибробластов подтверждался типичной морфологией в монослое и культурами в трехмерном коллагеновом геле. Выделение РНК. Суммарную РНК выделяли из слившихся склеродермических фибробластов раннего пассажа, используя тризол (Life Technologies) согласно протоколу производителя. Конечный осадок РНК ресуспендировали в стерильной обработанной DEPC воде в концентрации 1 мкг/мкл и хранили при -80 С. Синтез кДНК-зондов. 2 мкг суммарной РНК смешивали с 1,3 мкл специфичных для цитокина праймеров (RD systems, в каталоге GAC11) и инкубировали при 70 С в течение 2 мин в пробирке Eppendorf объемом 0,5 мл. Затем пробирки охлаждали до 50 С в течение 2 мин и по истечении указанного времени добавляли реакционную смесь, содержащую 2 мкл 5 Х реакционного буфера (250 мМ Трис-НСl рН 8,3, 375 мМ КСl и 15 мМ МgСl2), 1 мкл 10 Х смеси dNTP (5 мМ dGTP, 5 мМ dCTP и 5 мМ dTTP), 3,5 мкл 32P-dATP (3000 кюри/ ммоль, Amersham,в каталоге РВ 10204), 0,5 мкл DTT (100 мМ) и 1 мкл superscript II (Life Technologies). Реакционную смесь недолго перемешивали пипетированием и инкубировали при 50 С в течение 25 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,1M EDTA, pH 8,0, содержащего 1 мг/мл гликогена. Затем меченую кДНК очищали от не включенных дезоксинуклеотидов, используя колонку Chromaspin-200DEPC-H2O (Clontech) согласно инструкциям производителя. Фракции, содержащие кДНК, идентифицировали подсчетом в счетчике Черенкова. Фракцию пика (обычно фракция 2 из общего количества собранных 6 фракций) обрабатывали 0,1 объема 1 М NaOH, содержащего 1 мМ EDTA, в течение 20 мин при 70 С,чтобы гидролизовать РНК, и затем нейтрализовали равным объемом 1 М NaH2PO4, содержащим 2,5 мкг ДНК Cot-1 человека (Life Technologies), в течение 20 мин при 70 С. Затем подвергнутый тепловой обработке нейтрализованный зонд кДНК добавляли непосредственно к смеси для гибридизации. Гибридизация с микрочипами генов на фильтре. Микрочипы генов на фильтрах (матрица экспрессии цитокинов человека, RD systems, номер в каталоге GA001) предварительно гибридизовали при 68 С в течение 2 ч в 5 мл раствора для экспрессгибридизации (Clontech), содержащего 0,5 мкг/мл ДНК спермы лосося (Life technologies), в роллерных флаконах в печи для гибридизации Hybaid (MWG Biotech). По истечении указанного времени раствор для предгибридизации заменяли свежим раствором для гибридизации, содержащим препарат зонда кДНК с удельной активностью от 0,25 до 1106 имп./мин/мл. Гибридизация проходила в течение 16-20 ч при 68 С. После гибридизации фильтры 4 раза промывали 2 Х SSC/1% SDS при 68 С по 20 мин на промывку и дважды 0,1X SSC/0,5% SDS пo 15 мин на промывку. Затем фильтры герметизировали, используя оберточный материал Saran wrap, и экспонировали с экранами для визуализации на основе люминофора с длительным послесвечением К-типа (Biorad) в течение различных периодов времени (от 4 ч до 4 дней) при комнатной температуре. Анализ изображения. Экраны для визуализации сканировали при разрешении 50 мкм, используя устройство для визуализации люминесценции Biorad Personal FX. Полученный в результате цифровой файл объемом 16 битов переводили в формат TIF и изображение анализировали, используя компьютерную программу Arrayvision(Imaging Research Inc.). Для каждого образца авторы измеряли интенсивность пикселей 384 генов, нанесенных пятнами на фильтр в двух повторах. Фоновый сигнал вычитали и выводили среднюю интенсивность пикселя для каждой пары пятен на матрице (= уровень экспрессии). Подтверждение результатов, полученных на микрочипах, в отношении отдельных генов с помощью ОТ-ПЦР. 1 мкг суммарной РНК из каждого образца, взятого у пациента, обратно транскрибировали, используя олиго-dТ-праймер (Promega), в объеме реакции 20 мкл, содержащем 5 мМ МgСl2, 10 мМ Трис-НСl,50 мМ KСl, 0,1% тритон Х-100, 1 мМ каждого из dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0,5 единиц рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы RNasin (Promega) и 15 единиц обратной транскриптазы AMV (Promega). Реакционную смесь инкубировали при 42 С в течение 60 мин, нагревали при 95 С в течение 5 мин, затем разбавляли до 200 мкл стерильной водой. Затем разбавления реакционной смеси с обратной транскриптазой подвергали ПЦР-анализу в режиме реального времени на Taqman (PE Applied Biosystems 7700),используя специфичные пары праймеров, сконструированные для остеопротегерина с использованием компьютерной программы Primer Express (PE Applied Biosystems) на основании номера доступа в базе данных, предоставленного производителем фильтра для генов: остеопротегерин-112F 5' CTG CGC GCT(SEQ ID NO:6). Результаты нормализованы по отношению к экспрессии гена домашнего хозяйства глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в каждом образце и выражены в виде кратных изменений, определенных в результате деления значения экспрессии в аномальном образце от пациента на значение в соответствующем нормальном образце от пациента. Клонирование полноразмерной последовательности кДНК, кодирующей остеопротегерин человека. Затем полноразмерную кодирующую последовательность кДНК OPG клонировали с помощью ПЦР- 15007927 с обратной транскриптазой, используя следующие праймеры, основанные на последовательности кДНК,доступной в базе данных EMBL (номер доступа U94332) : OPG F 5' CGG GAT CCG CCA CCA TGA АСАAGT TGC TGT GCT (SEQ ID NO:7) и OPG R 5' AAG СТС GAG ТТА ТАА GCA GCT ТАТ ТТТ при концентрации 50 пмоль каждого в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,3 мМ dNTP, 1 мМ MgSO4, 5 мкл матрицы кДНК нормальных фибробластов кожи (крайней плоти) человека (полученной как описано выше), 5 мкл 10 Х буфера для амплификации Pfx (Life Technologies) и 1 мкл ДНК-полимеразы Platinum Pfx(Life Technologies). Реакционную смесь нагревали при 94 С в течение 2 мин, затем подвергали 35 циклам ПЦР следующим образом: 94 С в течение 15 с, 55 С в течение 30 с и 68 С в течение 1 мин. Продукты амплификации анализировали в 1% агарозных гелях в 1X буфере ТАЕ (Life Technologies), и продукты ПЦР, мигрирующие в области рассчитанной молекулярной массы (1205 п.о.), очищали из геля, используя набор для очистки продуктов ПЦР Wizard (Promega). 100 нг очищенной в геле ДНК расщепляли ферментами рестрикции BamHI и XhoI (Pharmacia) согласно условиям производителя, повторно очищали как описано выше и лигировали в расщепленнуюBamHI/XhoI плазмиду pcDNA3.1(+) (Invitrogen), используя ДНК-лигазу Т 4 (New England Biolabs) согласно стандартным способам молекулярной биологии. Продуктами лигирования трансформировали Е. coli штамма ТОР 10 F' (Invitrogen) путем электропорации, используя импульсное устройство для электропорации генов Biorad. Плазмидную ДНК выделяли из 5 мл культур, выращенных из полученных в результате колоний, и подвергали автоматизированному анализу последовательностей на секвенаторе AppliedBiosystems 3700, используя праймеры Т 7 и pcDNA3.1AS (Invitrogen), чтобы подтвердить последовательность OPG. Регистрация остеопротегерина в экстрактах белков, выделенных из поврежденных и нормальных фибробластов кожи. Поврежденные и нормальные фибробласты пациентов со склеродермией и контрольных субъектов после небольшого числа пассажей, культивированные как описано выше, собирали обработкой монослоев клеток PBS, содержащим 1 мМ EDTA, в течение 5 мин при 37 С. Открепившиеся клетки извлекали центрифугированием, ресуспендировали в 50 мкл PBS и обрабатывали 50 мкл буфера для образцов (20%SDS, 0,2% бромфеноловый синий, 50% глицерин, 1 М Трис рН 6,8), замораживали при -80 С и затем размораживали. Содержание белка определяли, используя набор ВСА (Pierce) согласно протоколу производителя. Примерно 10 мкг белка обрабатывали 0,1 объема DTT (0,1 М) и разгоняли в 4-12% SDSполиакриламидных гелях (Novex) согласно инструкциям производителя. Затем полосы белка переносили на нитроцеллюлозные мембраны, используя устройство Novex wetblot при 30 В в течение 1 ч. Затем мембраны блокировали в течение ночи при 4 С в PBS, содержащем 5% обезжиренного порошкового молока, затем промывали в PBST. Мембраны инкубировали с первым антителом (RD systems, моноклональное антитело против OPG,в каталоге МАВ 8051) при концентрации 0,5 мкг/мл в PBST/1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре и встряхивании. По истечении указанного времени мембраны тщательно промывали PBST перед инкубацией со вторым антителом (антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, Sigma) в разведении 1/3000 в PBST/1% БСА. Наконец мембраны тщательно промывали перед проявлением и визуализацией с использованием реагентов ECL и Hyperfilm производства Amersham.ELISA для измерения коллагена типа I в надосадках культур клеток фибробластов, обработанных рекомбинантным OPG, или после трансфекции вектора OPG/pcDNA3.1. Синтез коллагена измеряли in vitro в культивируемых фибробластах человека, используя системуELISA с иммобилизацией, которая описана Shi-Wen et al., (Shi-Wen et al., 1997). Коротко, кожные фибробласты человека AG1518 (приобретенные из АТСС) поддерживали в среде DMEM, содержащей 5%FCS и 2 мМ глутамин (Life Technologies). Клетки собирали с помощью обработки трипсином и высевали при слиянии на 70% в 48-луночные планшеты для культуры ткани (Falcon) в среду, содержащую 5% сыворотки, затем спустя 8 ч переносили в бессывороточную среду. Через 24 ч среду удаляли и заменяли свежей бессывороточной средой, содержащей 50 мкМ L-аскорбата (Wako Pure Chemical Industries) и возрастающие концентрации рекомбинантного остеопротегерина человека (OPG-Fc, приобретенного изRD systems). Через 16 ч в среду добавляли TGF1 (PeproTech) до конечной концентрации 2 нг/мл, и еще через 24 ч среду извлекали, центрифугировали, чтобы удалить обломки клеток, разбавляли и подвергали ELISA в отношении коллагена типа I, как описано ниже. Синтез коллагена также измеряли в первичных фибробластах человека (клетки ОВНС) после трансфекции кДНК OPG (pcDNA3.1-OPG) или после ложной трансфекции (только вектор pcDNA3.1) следующим образом: клетки ОВНС собирали трипсинизацией и высевали при 50% слиянии в 48 луночные планшеты в полную среду. Плазмиды трансфицировали в клетки ОВНС, используя реагент для трансфекции Fugene V (Roche) согласно инструкциям производителя. Через 5 ч после трансфекции среду заменяли свежей бессывороточной средой, содержащей L-аскорбат, на ночь, затем обрабатывали TGF1(10 нг/мл) в течение 24 ч, как описано выше. Планшеты MaxiSorp (Nunc) покрывали в течение ночи при 4 С 5 мкг/мл антитела козы против коллагена человека типа I (Southern Biotechnology Associates. Inc.) в PBS (pH 7,4). Затем раствор антитела- 16007927 удаляли и планшеты блокировали PBS-1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты 4 раза промывали PBS/0,05% твин 20 (PBST). Тестировали образцы 100 мкл кондиционированной среды в трех повторах. Образцы инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре (КТ), затем промывали 4 Х в PBST. Затем образцы инкубировали с биотинилированным антителом козы против коллагена типа I человека в разведении 1:2000 (Southern Biotechnology Associates. Inc.) в течение 1 ч при КТ,затем промывали 4 Х в PBST. Затем образцы инкубировали с конъюгированным с HRP-стрептавидином антителом (Zymed) в разведении 1/4000 в течение 1 ч при КТ и встряхивании. Наконец, образцы промывали 4 Х в PBST. Добавляли субстрат OPD (Sigma,в каталоге Р 9187) и оставляли на 10 мин для развития окраски. Реакцию останавливали смешиванием с 20% H2SO4 и планшеты считывали при 496 нм на счетчике для нескольких меток Victor2 (Wallac). Результаты нормализовали в отношении количества клеток, используя набор для анализа пролиферации клеток CyQuant (C-7026) из Molecular Probes. Анализ промотора CTGF-SEAP. Промоторно-репортерную плазмиду CTGF-SEAP конструировали с помощью ПЦР, проводимой с олигонуклеотидами 5'-ATCTCGAGGGCCACTCGTCCCTTGTCCNO:9) и 5'ATAAGCTTGGAGTCGCACTGGCTGTCTCC (SEQ ID NO:10), чтобы амплифицировать область промотора гена CTGF (фактор роста соединительной ткани) человека (788 п.о.). Очищенный в геле продукт амплификации субклонировали в pSEAP2-basic (Clontech). Фибробласты NIH 3 Т 3 (АТСС) высевали во флаконы Т-75 и котрансфицировали 5 мкг плазмидыCTGF-SEAP и 1 мкг плазмиды pcDNA3.1 (Invitrogen). Клетки высевали в среду с 800 мкг/мл G 418 (Sigma). Устанавливали клоны со стабильно интегрированным промотором-репортером CTGF-SEAP, клоны анализировали и отбирали наиболее чувствительный клон для разработки анализа на основе клеток. Клетки из данного клона (CTGF-SEAP) высевали по 10000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в DMEM, содержащую 0,5% FCS. На следующий день добавляли свежую среду, содержащую или не содержащую различные концентрации TGF и OPG (остеопротегерин), и клетки инкубировали еще в течение 72 ч до сбора надосадков для анализа SEAP. Экспрессию SEAP измеряли согласно протоколу производителя (набор Clontech). Исследования in vivo. Фиброз легких индуцировали у самцов мышей (20-25 г) посредством внутритрахеального введения блеомицина (0,075 IU) в физиологическом растворе в день 1. Мышей делили на 3 отдельные группы по 10 животных. Одна группа получала подкожные (п/к) инъекции ОPG по 5 мг/кг (в физиологическом растворе) ежедневно. Вторая группа ежедневно получала OPG (0,5 мг/кг) п/к. Третья группа ежедневно получала физиологический раствор (п/к). В четвертую группу входили совпадающие по возрасту и полу необработанные нативные мыши. Массу тела измеряли ежедневно и всех мышей забивали на 12 день. Отдельные доли легкого выделяли для определения гидроксипролина (Smith et al., 1994) или фиксировали формалином и заливали в парафин для гистологии. Срезы легкого красили трихромом или красным красителем picro sirius на коллаген (Bancroft and Stevens) и оценивали величину фиброз/легкое. Полуколичественный анализ ПЦР с обратной транскриптазой мРНК OPG в фибробластах пациентов со склеродермией, обработанных in vitro галофугиноном. Поврежденные и неповрежденные фибробласты поддерживали в культуре, как описано выше. Монослои клеток (70% слияние) обрабатывали галофугиноном (10-8 М) (Collgard Pharmaceuticals) в течение 12 ч. После периода обработки клетки собирали и выделяли суммарную РНК, используя метод с тризолом. Затем 1 мкг суммарной РНК подвергали ПЦР с обратной транскриптазой, как описано выше, используя ПЦР-праймеры, специфичные для остеопротегерина (OPG 740 F 5' ACG CCT AAC TGG CTT AGT GT(SEQ ID NO:11) и OPG 1280 R 5' CTG ATT GGA CCT GGT TAC CT SEQ ID NO:12). После 30 циклов ПЦР продукты реакции разгоняли в 1% агарозных гелях, красили бромидом этидия и фотографировали и анализировали, используя компьютерную программу Kodak ID Digital Science. Затем подтверждали, что продукты ПЦР, мигрирующие в области рассчитанной молекулярной массы, являются остеопротегерином, с помощью прямого секвенирования экстрагированной из геля ДНК. В качестве контроля на загрязнение геномной ДНК реакции ПЦР осуществляли на смесях для обратно-транскриптазной реакции, которые содержали соответствующую РНК, но не содержали обратной транскриптазы. Смеси для обратнотранскриптазных реакций также амплифицировали с ПЦР-праймерами, специфичными для GAPDH, в качестве позитивного контроля целостности и количества внесенной РНК в исходной реакции. Активность промотора 2 коллагена типа I. Фибробласты эмбрионов мышей (клетки S3) поддерживали в среде DMEM-F12, содержащей 2%FCS и 2 мМ глутамин. Клетки собирали трипсинизацией и высевали при 50% слиянии в 48-луночные планшеты для культивирования клеток. На следующий день клетки трансфицировали в бессывороточной среде вектором pGL3 (Promega), содержащим 3,5 т.п.о. промотора коллагена 12, связанного с кДНК люциферазы (любезно предоставленным Dr. David Abraham из Royal Free Hospital, London, England), используя реагент Fugene V (Roche) согласно инструкции производителя. После 5 ч трансфекции клетки переносили в свежую среду, содержащую 2% FCS, и обрабатывали отдельно галофугиноном (10-10 М),отдельно TGF1 (5 нг/мл) или HF (10-8 М) + TGF1 (5 нг/мл) в течение 12 ч в присутствии 0, 1, 10 или- 17007927 100 нг/мл рекомбинантного остеопротегерина человека. После периода обработки клетки переносили в полную среду, содержащую 2% FCS и 2 мМ глутатион и через 48 ч измеряли активность люциферазы в каждой лунке, используя систему анализа Bright-Glo, приобретенную из Promega. Результаты выражали в виде относительных единиц люминесценции и нормализовали в отношении количества клеток/лунку,определенного в параллельном эксперименте с использованием набора Cyquant (Molecular Probes). Пример 1. мРНК остеопротегерина подвергается значительной понижающей регуляции в поврежденных фибробластах по сравнению с неповрежденными. Анализ микрочипов генов на фильтре осуществляли на образцах нормальных и аномальных фибробластов 6 пациентов со склеродермией. Средний уровень экспрессии остеопротегерина (OPG) показан на фиг. 1 а, а для каждого пациента - на фиг. 1b. Результаты, полученные на микрочипах, далее подтверждали анализом ПЦР в режиме реального времени образцов РНК, выделенных от 9 пациентов, используя ПЦР-праймеры, специфичные для OPG. Результаты показаны на фиг. 2 и выражены в виде кратного изменения уровня экспрессии (поврежденные делили на неповрежденные). У 7 из 9 тестированных пациентов OPG подвергался понижающей регуляции по меньшей мере в 2 раза в поврежденных фибробластах по сравнению с неповрежденными фибробластами, выделенными от одного и того же пациента. Маловероятно, что различия в экспрессии, наблюдаемые между неповрежденными и поврежденными фибробластами одного и того же пациента, являются следствием различий в условиях культивирования между двумя популяциями, так как экспрессия мРНК OPG в первичных культурах нормальных фибробластов кожи человека существенно не изменяется при пересевах клеток (данные не показаны). Кроме того, анализ ОТ-ПЦР в режиме реального времени суммарной РНК, выделенной из целых образцов биоптата аномальной кожи пациентов со склеродермией, показал низкие уровни мРНК остеопротегерина по сравнению с кожей, которая выглядит клинически нормальной, в анатомически совпадающих местах тех же самых пациентов (фиг. 3). Пример 2. OPG подвергается понижающей регуляции на уровне белка в поврежденных фибробластах по сравнению с неповрежденными фибробластами пациентов со склеродермией. Чтобы определить, отражается ли понижающая регуляция мРНК остеопротегерина в изменении белка остеопротегерина, определяли содержание OPG в совпадающих по анатомическому расположению нормальных и поврежденных фибробластах кожи совпадающих по возрасту и полу субъектов с помощью Вестерн-блот-анализа, используя моноклональные антитела против остеопротегерина человека. Результаты показаны на фиг. 4. Мономер и димер остеопротегерина ясно обнаруживались в 3/4 нормальных фибробластов и слабо экспрессировались в 1 нормальном образце. В аномальных фибробластах полоса мономера слабо видна во всех четырех тестированных образцах. Рекомбинантно экспрессируемый слитый белок OPG-Fc служил в качестве позитивного контроля для окрашивания. Пример 3. Клонирование OPG человека. Чтобы охарактеризовать активность OPG in vitro и in vivo полноразмерную кодирующую последовательность кДНК клонировали с помощью ПЦР с обратной транскриптазой, используя праймеры, основанные на опубликованной последовательности OPG, которые фланкировали рассчитанные стартовый и стоп-кодоны. Анализ последовательности полученных в результате клонов кДНК OPG (в pcDNA3.1) показал 100% идентичность на нуклеотидной уровне последовательности OPG, опубликованной Morinagaet al., (Morinaga et al., 1998), но отличие по 1 аминокислоте от последовательности, опубликованной Simonet et al. (1997) (см. SEQ ID NO:2 и 4). Пример 4. Влияние OPG на синтез коллагена типа I в клеточной линии фибробластов кожи человека. Фибробласты, культивированные в присутствии L-аскорбата, секретируют коллаген в культуральную среду, позволяя выявлять коллаген с помощью ELISA. В фибробластах человека наблюдается повышающая регуляция синтеза коллагена в ответ на стимуляцию профиброзным цитокином TGF1. Поэтому авторы тестировали влияние рекомбинантного остеопротегерина (слитый белок остеопротегеринFc) на индуцированный TGF1 синтез коллагена в фибробластах AG1518C. Остеопротегерин, добавленный к культурам фибробластов перед обработкой TGF1, был способен ингибировать опосредованноеTGF1 увеличение синтеза коллагена зависимым от дозы образом (фиг. 5). В том случае, когда эксперимент проводили в присутствии нейтрализующих моноклональных антител против OPG, не наблюдалось влияния на синтез коллагена. Подобным образом введение отдельно анти-OPG в отсутствие рекомбинантного OPG не оказывало влияния на синтез коллагена, что свидетельствует о том, что наблюдаемое снижение синтеза коллагена являлось специфичным действием OPG. Сходное действие на синтез коллагена наблюдали при трансфекции первичных фибробластов человека (ОВНС) плазмидой, содержащей полную кодирующую последовательность OPG (pcDNA3.1/OPG). В ОВНС, трансфицированных OPG-плазмидой не наблюдали увеличения синтеза коллагена в ответ на стимуляцию TGF1, в отличие от ложно (пустой вектор pcDNA3.1) трансфицированных ОВНС (фиг. 6). Пример 5. Обработка OPG в значительной степени снижает как базальную, так и индуцированнуюTGF1 активность промотора альфа 2 коллагена типа I в фибробластах эмбрионов мышей. Чтобы оценить, являлось ли снижение синтеза коллагена при действии OPG следствием влияния на- 18007927 активность промотора коллагена, авторы исследовали влияние обработки OPG на фибробласты эмбрионов мышей, которые были трансфицированы плазмидой, которая содержала кДНК репортерного гена люциферазы под контролем области размером 3,5 т.п.о. промотора 2 коллагена типа I. Стимуляция промотора коллагена в данной конструкции приводит к транскрипционной активации гена люциферазы,активность которого можно измерить в присутствии его субстрата люциферина светляка в анализе люминесценции. Обработка OPG от 1 до 100 нг/мл способна значительно снижать базальный уровень активности промотора коллагена (фиг. 7 А, контроль). После стимуляции TGF1 имело место по меньшей мере 2-кратное увеличение активности промотора коллагена (фиг. 7 А, TGF1). Данную активность можно было существенно уменьшить, когда клетки одновременно обрабатывали OPG в концентрации 100 нг/мл (Р 0,05). Сообщалось, что растительный алкалоид галофугинон является специфичным ингибитором синтеза коллагена типа I (Granot et al., 1993). Когда фибробласты обрабатывали низкими концентрациями галофугинона (10-10 М), авторы наблюдали зависимое от дозы снижение активности промотора коллагена в случае возрастающих концентраций остеопротегерина (от 1 до 100 нг/мл), которое было в высокой степени значимым при самой высокой тестированной дозе OPG (100 нг/мл, Р 0,01) (фиг. 7 А, HF). Галофугинон может ингибировать индуцированную TGF1 активность промотора коллагена (McGaha et al.,2002). OPG также способен усиливать действие галофугинона посредством ингибирования индуцированного TGF1 увеличения активности промотора коллагена зависимым от дозы образом. Указанное действие было в высокой степени значимым при 100 нг/мл OPG (Р 0,01), и при данной концентрации активность промотора коллагена почти возвращалась к базальным уровням (фиг. 7, HF+TGF1). Пример 6. Опосредованная TGF трансактивация фактора роста соединительной ткани нейтрализуется OPG. Фактор роста соединительной ткани (CTGF), богатый цистеином белок 38 кДа, стимулирует продукцию элементов внеклеточного матрикса фибробластами. Согласно сообщениям, обнаружена сверхэкспрессия CTGF во многих фиброзных тканях человека, включая легкое, кожу, печень, почку и кровеносные сосуды. In vitro TGF активирует транскрипцию гена CTGF в фибробластах легкого человека. Конструировали промотор CTGF-репортер с секретируемой щелочной фосфатазой (SEAP) в качестве репортера, экспрессию которого можно измерить в кондиционированной среде вместо клеточного экстракта. Клетки, экспрессирующие репортерный ген CTGF-SEAP, инкубировали с TGF и 0,46; 1,4 или 4,6 мкг/мл OPG. Результаты данного эксперимента изображены на фиг. 7 В. Инкубация с OPG подавляла индуцированную TGF экспрессию CTGF, таким образом дополнительно свидетельствуя о противофиброзной активности OPG. Пример 7. Экспрессия мРНК OPG в обработанных галофугиноном фибробластах пациентов со склеродермией. Механизм, посредством которого галофугинон способен осуществлять понижающую регуляцию синтеза коллагена в фибробластах, полностью не выяснен. Поэтому авторы исследовали влияние галофугинона на экспрессию мРНК OPG в парных поврежденных и неповрежденных фибробластах пациентов со склеродермией с помощью ПЦР с обратной транскриптазой. Экспрессия мРНК OPG в значительной степени повергается повышающей регуляции (по меньшей мере в 3 раза) как в поврежденных, так и в неповрежденных фибробластах во всех тестированных образцах (3 нормальных и 2 аномальных) при измерении через 12 ч после обработки 10-8 М галофугиноном(фиг. 8). Интересно, что в экспериментах по анализу микрочипов генов на фильтрах OPG был одним из наиболее подверженных повышающей регуляции генов при обработке фибробластов галофугиноном(данные не показаны). Пример 8. Введение OPG in vivo защищает от индуцированного блеомицином фиброза легкого у мышей. Введение однократной внутритрахеальной инъекции блеомицина мышам C57BL/6 приводит к быстрой индукции легочного фиброза в пределах 14 дней, который характеризуется повышенным отложением коллагена в легочном интерстиции (Hattori et al., 2000). Чтобы определить, оказывает ли введениеOPG какое-либо защитное действие, направленное против развития фиброза, или действительно уменьшает тяжесть заболевания, авторы проверяли действие ежедневной инъекции OPG у обработанных блеомицином мышей. Блеомицин вводили путем однократной внутритрахеальной инсталляции в 3 группах по 10 мышей.OPG вводили подкожной инъекцией, начиная через день после обработки блеомицином. Одна группа получала высокую дозу (5 мг/кг), а вторая группа получала более низкую дозу (0,5 мг/кг). Контрольные мыши ежедневно получали физиологический раствор п/к. Для сравнения в исследование включали 4-ю группу мышей, которая состояла из полностью необработанных, совпадающих по возрасту и полу особей (нативные мыши). Животные, обработанные блеомицином, сразу же заболевали. Это приводит к быстрой потере массы тела и может привести в смерти, в отличие от необработанных животных, которые остаются счастливыми и здоровыми и показывают нормальный прирост массы (фиг. 9 А). У мышей, обработанных низкой дозой OPG, наблюдали сравнимую с контрольными животными потерю массы тела. В данной группе- 19007927 также наблюдалась повышенная смертность (фиг. 9 В). Мыши, получавшие высокую дозу OPG, чувствовали себя намного лучше со снижением массы тела только в течение первых 5 дней обработки. Это также отражалось и в виде низкой смертности (10%) в данной группе. Всех выживших мышей забивали через 12 дней после обработки блеомицином. Гистологический анализ легких показал, что у животных, обработанных высокой дозой OPG, значительно меньшая площадь поверхности легкого была поражена фиброзом по сравнению с контрольными животными, которые имели фиброзные повреждения, покрывающие примерно 70% поверхности легкого (фиг. 10 А). У животных, обработанных высокой дозой OPG, также наблюдали значительно меньшее содержание гидроксипролина в легких (Р 0,05) по сравнению с контрольными мышами, и его содержание было сравнимо с содержанием гидроксипролина, наблюдаемым у необработанных мышей (нативная группа, фиг. 10 В). Сниженное содержание гидроксипролина также наблюдали у мышей, обработанных низкой дозой OPG,хотя снижение не достигало статистической значимости вследствие малого числа выживших животных,оставшихся в данной группе. Содержание гидроксипролина является мерой отложения коллагена. Полученные в данной работе результаты показывают, что обработка OPG эффективно приводит к сниженному отложению коллагена в легких.WilliamsWilkins, Philadelphia 2000. 30. Strehlow D. and Korn J. (1998) Biology of the scleroderma fibroblast. Curr. Opin. Rheumatol. 10, 572-578. 31. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784. 32. Von Heijne G. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690. 33. Wigley F.M. and Sule S.D. (2001) Expert Opinions on Investigational Drugs 10(1) 31-48. 34. Wigley P.M. and Boling C.L. (2000) The treatment of scleroderma. 2, 276-292. 35. Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve Т., Breit S., Schweigerer L., Fotsis T. and Mann M. (1996) Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature,379:466-469. 36. Yasuda H., Shima N., Nagakawa N., Mochizuki S., Yano K. et al. (1998). Identity of osteoclastogenesisis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology 139, 1329-1337. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение вещества для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, причем вещество выбрано из группы, состоящей из:c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;e) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (a)-(d);f) мутеина любого из полипептидов (а)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(d), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;g) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (a)-(d); иh) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с круговыми перестановками любого из полипептидов (а)-(g). 2. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани. 3. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является склеродермия. 4. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи. 5. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является фиброз печени. 6. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является фиброз почки. 7. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого. 8. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы. 9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где вещество является мономером или димером. 10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где вещество гликозилировано в одном или нескольких положениях. 11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок содержит слияние с иммуноглобулином (Ig). 12. Применение по п.11, где слияние с Ig представляет собой Fc-слияние. 13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где функциональное производное содержит по меньшей мере один радикал, связанный с одной или несколькими функциональными группами,которые составляют одну или несколько боковых цепей на аминокислотных остатках. 14. Применение по п.13, где радикал является полиэтиленгликолевым радикалом. 15. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;e) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (a)-(d);f) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (a)-(d), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;g) мутеина любого из полипептидов (a)-(d), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (a)-(d); иh) изоформы, слитого белка или активной фракции любого из полипептидов (a)-(g). 16. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани. 17. Применение по п.15 или 16, где фиброзным заболеванием является склеродермия. 18. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи. 19. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз печени. 20. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз почки. 21. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого. 22. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы. 23. Применение по любому из пп.15-22, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность экспрессирующего вектора. 24. Применение по п.23, где последовательность вектора является последовательностью вектора для генной терапии. 25. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции полипептида, охарактеризованного в п.1, в клетке для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии. 26. Применение клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в любом из пп.15, 23 или 24, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы. 27. Применение клетки, экспрессирующей вещество, охарактеризованное в любом из пп.1 или 9-13,для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы. 28. Применение клетки, генетически модифицированной таким образом, чтобы продуцировать полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1 или 9-13, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы. 29. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или раздельного применения. 30. Применение по п.29, где интерферон является интерфероном-. 31. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит антагонист фактора некроза опухолей (TNF) для одновременного, последовательного или раздельного применения. 32. Применение по п.31, где антагонистом TNF является TBPI и/или TBPII. 33. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит средство против склеродермии для одновременного, последовательного или раздельного применения. 34. Применение по п.33, где средство против склеродермии выбрано из группы, состоящей из ингибиторов АСЕ, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов протонных насосов, НПВС, ингибиторов СОХ, кортикостероидов, тетрациклина, пентоксифиллина, буцилламина, ингибиторов геранилгеранилтрансферазы, роттерлина, ингибиторов пролил-4-гидроксилазы, ингибиторов с-протеиназы, ингибиторов лизилоксидазы, релаксина, галофугинона, простагландинов, простациклинов, эндотелина-1, окиси азота,ингибиторов ангиотензина II, антиоксидантов или SARP-1. 35. Способ лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, предусматривающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества вещества, охарактеризованного в любом из пп.1, 9-15 или 23-34, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем. 36. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является склеродермия. 37. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи. 38. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз печени. 39. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.- 22007927 40. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого. 41. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы. Список последовательностей

МПК / Метки

МПК: A61K 31/505, A61K 38/21, A61K 38/17, A61P 29/00, A61P 37/00, A61K 31/65, A61K 48/00

Метки: остеопротегерина, фиброзного, заболевания, лечения, профилактики, применение

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-7927-primenenie-osteoprotegerina-dlya-lecheniya-i-ili-profilaktiki-fibroznogo-zabolevaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Применение остеопротегерина для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания</a>

Похожие патенты