Метод удаления бета-2 микроглобулина из крови

1 Область применения Настоящее изобретение относится к методам удаления бета-2 микроглобулина из крови. Предпосылки создания изобретения Бета-2 микроглобулин, который относится к протеинам, обнаруживают в больших концентрациях у пациентов с хронической почечной недостаточностью и хроническим диализом. У здоровых людей бета-2 микроглобулин удаляется почками при эндоцитозе в проксимальных трубках. Молекула его является содимером в антигенах класса -1 HLA с димерной структурой. Эти антигены в больших концентрациях обнаруживают в лимфоцитах и находят во всех содержащих ядро клетках млекопитающих. У пациентов с нарушенным функционированием почек содержание бета-2 микроглобулина в 40-60 раз больше нормального. Накопление бета-2 микроглобулина является основным условием инициации связанного с диализом амилоидоза. Это известное в клинике явление вызывает артропатию и невропатию. Первичным результатом их появления является тяжелая деструкция сустава и боль. Для многих пациентов оказывается необходимым проведение хирургической операции, такой, например, как запястно-тунельная и шейно-позвоночная ламинектомия, Кроме того, эти операции требуют применения анальгетиков и противовоспалительных лекарств для лечения симптомов связанного с диализом амилоидоза. Ранее предпринимались попытки удалить бета-2 микроглобулин, как это, например, раскрыто в работе "Новый терапевтический подход к диализу амилоидоза: метод интенсивного удаления бета-2 микроглобулина с помощью адсорбирующей колонны", предложенный Фумитаке Джиджио, Нориюки Ома, Шин Хасегава и Массаки Аракава и опубликованный в издании факультета внутренней медицины (II) медицинского отделения Университета Ниигаты, Япония. Метод удаления бета-2 микроглобулина из крови раскрыт также в нашей заявке на патент Соединенных Штатов, имеющей регистрационный номер 08/902,727 от 30 июля 1997 г. Далее этот метод развивается и улучшается. Раскрытие сущности изобретения В соответствии со сказанным выше, целью настоящего изобретения является разработка метода удаления бета-2 микроглобулина из крови, представляющего собой усовершенствование существующих методов. В соответствии с этими и другими целями,которые будут изложены здесь ниже, один из признаков настоящего изобретения, в сжатом виде, состоит в методе удаления бета-2 микроглобулина, в соответствии с которым кровь пропускается через адсорбирующий материал,имеющий размер пор и структуру такие, чтобы удалить бета-2 микроглобулин из крови, а 2 кровь, из которой удален бета-2 микроглобулин,снова вводится пациенту. В соответствии с предпочтительной реализацией настоящего изобретения, пропускание крови через адсорбирующий материал может иметь место одновременно или последовательно с проведением обычной процедуры гемодиализа, в которой кровь пропускается через гильзу с мембраной, используемую для гемодиализа. В соответствии с признаком настоящего изобретения, раскрываемым ниже, адсорбирующий материал представляет собой пористый полимер с увеличенной долей мезопор, например полидивинилбензол или полистирол с полидивинилбензолом. В соответствии с признаком настоящего изобретения, раскрываемым ниже, прохождение включает в себя прохождение через адсорбирующий материал, представляющий собой пористый полидивинилбензольный или полистирол сополидивинилбензольный полимер с увеличенной долей мезопор, с поверхностью из гранул и макропор, модифицированной таким образом, чтобы не допустить абсорбцию больших протеинов и тромбоцитов и минимизировать активацию дополнтельной системы подачи крови без заметного воздействия на доступность внутреннего абсорбирующего пространства гранул для бета-2 микроглобулина и для среднего размера молекул ядовитых веществ. Новые качества, которые являются характерными признаками настоящего изобретения,изложены детально в прилагаемой формуле изобретения, Однако сущность изобретения, как в части его конструкции, так и способа его работы, вместе с дополнительно достигаемыми целями и преимуществами наилучшим образом будет понятной из следующего ниже описания конкретной его реализации при чтении его вместе с поясняющими чертежами. Наилучший способ реализации изобретения В соответствии с настоящим изобретением предлагается метод удаления бета-2 микроглобулина из крови. Кровь пациента отбирается в точке доступа к артериальной системе кровообращения и пропускается через адсорбирующий полимерный материал. В соответствии с настоящим изобретением, прохождение крови через адсорбирующий материал может иметь место одновременно (последовательно) с обычной процедурой гемодиализа, когда кровь пропускается через гильзу с мембраной, используемую для гемодиализа. Адсорбирующий материал, через который проходит кровь, может быть пористым полидивинилбензольным или полистирол сополидивинилбензольным полимером с увеличенной долей мезопор. Кроме того, адсорбирующим материалом может быть пористый полидивинилбензольный или полистирол сополидивинилбензольный полимер с увеличенной долей мезопор, имеющие 3 поверхность, состоящую из гранул и макропор,модифицированную таким образом, чтобы не допустить адсорбцию больших протеинов и тромбоцитов, а также минимизировать активацию дополнительной системы кровообращения без заметного воздействия на доступность внутреннего адсорбирующего пространства гранул для мета-2 микроглобулина и для среднего размера молекул токсических веществ. Модификация может быть получена с помощью химической модификации поверхности. В соответствии с настоящим изобретением сорбенты, подготовленные в соответствии с настоящим изобретением, вводятся в колонну или гильзу для дальнейшего использования. Предпочтительно, чтобы колонна имела входное и выходное отверстие, разработанные таким образом, чтобы они позволяли осуществить легкое соединение с системой кровообращения, а также двумя пористыми фильтрами, устанавливаемыми между входом и сорбентным слоем и между сорбентным слоем и выходом. Колонна может быть сделана из биологически совместимого материала, стекла, полиэтилена, полипропилена, поликарбоната, полистирола. Из этих материалов полипропилен и поликарбонат являются предпочтительными, потому что в этом случае колонна перед загрузкой сорбентом может быть стерилизована (например, с помощью стерилизации в автоклаве или стерилизации гамма- лучами). Колонна или гильза затем заполняются 1% раствором сыворотки альбумина человека в нормальном физиологическом растворе и хранится при температуре 4C. Для подготовки к использованию колонна промывается с помощью 0,9% раствора NaCl, к которому добавляется соответствующий коагулянт, такой, например, как ACD-A, содержащий гепарин в эффективном количестве. Для гильзы емкостью 250 мл это раствор хлорида натрия примерно 1:1, к которому добавляется 150 мл ACD-A, содержащих 6000 единиц гепарина. Обычно можно в этом случае применить 2 следующие типичные экстракорпоральные системы циркуляции крови:(i) Кровь, взятая из кровеносного сосуда пациента, принудительно подается на проход через колонну, загруженную сорбентом по настоящему изобретению, причем очищенная кровь возвращается в кровеносный сосуд пациента.(ii) Кровь, взятая у пациента, сначала разделяется на сепарационной мембране с помощью центрифугирования на гемоциты и плазму,причем отделенная таким образом плазма принудительно подается для прохождения через колонну, загруженную сорбентом по этому изобретению, для устранения токсичных веществ из плазмы; далее очищенная плазма, поступающая из колонны, смешивается с гемодитами,отделенными так, как это было описано выше, 002896 4 после чего смесь возвращается в кровеносные сосуды пациента. Из этих двух методов последний является более практичным из-за меньшей потери гемоцитов, например при адгезии тромбоцитов и эритроцитов. С модифицированными сорбентами по данному изобретению можно использовать любые другие методы выполнения гемоперфузии или перфузии плазмы. Особенно многообещающим является названное выше предложение Боддена (патент США 5,069,662, декабрь 1993),при котором высокие концентрации антираковых агентов пропускаются через печень или другой содержащий опухоль орган тела, после чего вытекающая кровь подвергается экстракорпоральной гемоперфузии для удаления избыточных количеств препаратов перед возвращением крови в систему кровообращения пациента. Другой перспективной системой является система Шеттигера и др. (патент США 5,211,850,1993), в которой предлагается добиваться как конвекционного, так и диффузионного перемещения плазмы через полые волокна мембраны по направлению к закрытой камере с сорбентом, а затем подавать ее обратно в волоконный канал. Камера может быть загружена сорбентом по настоящему изобретению. Подготовка адсорбирующего материала может быть выполнена следующим образом: Пример 1. Раствор, состоящий из 130 г рэтилстирола, 130 г дивинилбензола (смесь параи мета-изомеров в отношении 1:1) и 2,62 г перекиси бензоила в растворе 600 мл толуола и 100 мл изоамил алкоголя был взвешен в 4 л чистой воды, содержащей 1% целлюлозный стабилизатор. После 39 мин перемешивания при комнатной температуре смесь в течение 1 ч нагревалась при температуре 40C, 2 ч при температуре 60C, 5 ч при температуре 80C и 2 ч при температуре 96C. После охлаждения смеси до комнатной температуры полученные гранулы были отфильтрованы и промыты горячей водой, метанолом и снова водой. Полимер осушался в течение 7 ч при температуре 80C. Пример 2. В колбу с круглым дном и 4 горлышками,имеющую объем 7 л, которая была оборудована перемешивающим устройством, термометром и обратным охладителем, поместили раствор 8,4 г полидивинилового алкогольного типа технического сорта эмульсионного стабилизатора GM14 в 4 л деионизированной воды (водная фаза). После этого при размешивании при комнатной температуре к водной фазе добавлялись раствор 260 мл дивинилбензола, 140 мл этилвинилбензола, 250 мл толуола, 250 мл n-октана и 2,94 г перекиси бензола (органическая фаза). Через 20 мин температура повышается до 80C. Реакция проводится при температуре 80C в течение 8 ч и при температуре 90-92C дополнительно еще 2 ч. По завершении сополимеризации стабилизатор тщательно промывается горячей водой(при температуре от 60 до 80C), и указанные выше растворители удаляются с помощью дистилляции паром. Полученные после этого гранулы фильтруются, промываются диоксаном 1:1 и деионизированной водой. В заключение, гранулы просушиваются в печи при температуре 60C в течение всей ночи. Полимер, полученный в примере 1, имел внутреннюю поверхность 1200 кв. м/г и полный объем пор 0,8 мл/г, увеличивал свой объем в этаноле в 1,3 раза, адсорбировал цитохром С из буферного раствора фосфата в количестве 32-34 мг на 1 г полимера, эффективно выводил бета-2 микроглобулин из крови пациентов, находящихся на постоянном лечении с помощью диализа, успешно прошел испытание на гемосовместимость (повторное обызвествление плазмы в течение разрешенного промежутка 126 -144 секунды) без какой-либо химической модификации или дополнительной обработки поверхности полимерных гранул. Отдельные сферические гранулы полимера величиной 0,4 - 0,63 мм в диаметре разрушались механически при приложении нагрузки 450 + 50 г, что значительно лучше тех результатов, которые показывают обычные макропористые гранулы (120 - 150 г),однако они не столь хороши по сравнению с результатами, которые показывают обычные гиперструктурированные гранулы (до 600 г),имеющие примерно такие же диаметр и полный объем пор. Пример 3. То же, что в примере 1, но при этом в качестве органической фазы берется 220 мл дивинилбензола, 180 мл этилвинилбензола, 150 мл толуола, 150 мл n-октана и 3 г перекиси бензола. Площадь внутренней поверхности полученного продукта составляет величину до 1 000 кв. м/г. Объем вздутий при заполнении этанолом составляет 1,25. Пример 4. То же, что в примере 1, но при этом в качестве органической фазы берется 320 мл дивинилбензола, 80 мл этилвинилбензола, 600 мл толуола, 600 мл n-октана и 2,94 г бисазоизобутыринового нитрила. Площадь внутренней поверхности полученного продукта составляет величину до 1150 кв. м/г. Объем вздутий при заполнении этанолом составляет 1,5. Пример 5. То же, что в примере 1, но при этом для подготовки органической фазы в качестве порообразователя вместо толуола и n-октана берется 250 мл дивинилбензола и 250 мл этилвинилбензола. Площадь внутренней поверхности полученного продукта составляет величину до 800 кв. м/г. Объем вздутий при заполнении этанолом составляет 1,25. 6 Пример 6. То же, что в примере 1, но при этом берется 200 мл этилендихлорида и 120 мл n-гексана в качестве порообразователя. Площадь внутренней поверхности полученного продукта составляет величину до 1000 кв. м/г. Объем вздутий при заполнении этанолом составляет 1,3. Пример 7. То же, что в примере 1, но при этом в качестве порообразователя берется смесь, состоящая из 400 мл циклогексана, 100 мл метанола. Площадь внутренней поверхности полученного продукта составляет величину до 800 кв. м/г. Объем вздутий при заполнении этанолом составляет 1,2. В соответствии с настоящим изобретением, как это было объяснено выше, поверхность гранул полимера может быть модифицирована. Модифицирование сополимера может быть выполнено в соответствии со следующими 3 основными методами: пришивкой гидрофильных полимерных целей с помощью радиальной полимеризации 2-гидроксиэтил метакрилата, Nвинилпирролидона, N-винилкапролактама или других растворимых в воде мономеров; окислением виниловых групп до эпоксидных групп с помощью воды с последующей реакцией эпоксидных групп с водой, этиленгликолем, аминами и 2-аминоэтаноловыми молекулами; и помещением гемосовместимых полимеров с большим молекулярным весом, в частности,поли(трифлюоретиоксид)фосфазена, на поверхности полимерных гранул. Это было раскрыто ранее в нашей заявке на патент США под регистрационным номером 09/019,583 и включено сюда в качестве ссылки. Ниже представлено несколько примеров процедур модификации. Пример 1. Водоорганическая среда. 5,4 г промытого в воде полимера (сухой вес составляет 2,1 г), подготовленные при полимеризации технического сорта 50% дивинилбензола, описанного в примере 1, были взвешены в смеси 3 мл этанола и 2 мл воды, после чего к ним был добавлен раствор 0,05 г персульфата аммония в 2 мл воды, раствор 0,035 мл тетраметил этилендиамина в 1 мл этанола и, наконец, с раствор 0,03 мл N-винилпирролидона в 1 мл этанола. Смесь перемешивалась при 37C в течение 4 ч. Использование метода спектрофотометрии при 234 нм показало, что в описанной выше смеси вода/этанол, в которой объемы составляющих находятся в отношении 7:5,99% всего исходного количества винилпирролидона оказалось привитым к полимеру. Полученный в результате полимер был промыт этанолом и высушен до постоянного веса. Сухой полимер может смочен водой, что доказывает наличие гидрофильного пришитого полимерного слоя на поверхности в основном гидрофобного материала. Пример 2. Органическая среда 68 г сухого полимера, полученного при полимеризации технического сорта 50%-ного дивинилбензола в соответствии с протоколом,описанным в приведенном выше примере 1,были взвешены в 350 мл этанола, поданы с раствором 1,4 г азо-бис-изобутыронитрила в 60 мл этанола и нагреты до 60C. При этой температуре в жидкость был подан раствор 1 мл Nвинилпирролидона в 10 мл этанола. После встряхивания смеси при 60C в течение 3,5 ч было определено, что конверсия винилпирролидона достигает 99%. Полученный таким образом полимер содержал 1,5% полидивинилпирролидона. Пример 3. Органическая среда К 1,5 г сухого полимера, полученного в соответствии с примером 1, и взвешенных в 5 мл этанола при температуре 40C, были добавлены 0,04 г лайроксил пероксида в 2 мл метанола и 0,01 мл тетраметил этилендиамина в 1 мл этанола. Смесь подогревалась при температуре 50C в течение 1 ч, затем в нее подавался раствор 0,01 мл N-винилпирролидона в 1 мл этанола, и нагрев производился далее до 60C в течение 3 ч. Далее полимер промывался метанолом и высушивался. Пример 4. Органическая среда К 2 г сухого полимера, полученным в соответствии с примером 1 и взвешенным в 10 мл диоксана, были добавлены 0,08 г лауроил пероксид в 4 мл этанола. Температура смеси увеличивалась до 60C в течение 10 мин, после чего подавались дополнительно 2 мл диоксана,которые содержали 0,02 мл N-винилпирролидона. Смесь, в которой происходила реакция, перемешивалась в течение 3 ч при температуре 60C, после чего полимер промывался этанолом и просушивался. Пример 5. Органическая среда К 2 г сухого полимера, полученных в соответствии с примером 1 и взвешенных в 10 мл этанола, были добавлены 0,08 г лауроил пероксида в 4 мл этанола при температуре 40C. Через 5 мин к ним были добавлены к 0,02 мл тетраметилэтилендиамина в 2 мл этанола, и еще через 5 мин были добавлены 0,02 мл Nвинилпирролидона в 2 мл этанола. После встряхивания смеси при 40C в течение 2,5 ч было определено, что с поверхностью полимера срослось 80% исходного винилпирролидона. Среда, которая применяется для модификации полимера, может быть чисто органической, однако она может быть также водоорганической с содержанием, по меньшей мере, 20% объема органических веществ. 8 Было обнаружено, что если процедура модификации проводится в неорганической, например чисто водной среде, полимер заражается эндотоксином, и у животных, кровь которых очищалась через таким образом полученный материал, повышалась температура, что косвенным образом может свидетельствовать о наличии эндотоксикана в полимере. В противоположность этому, многочисленные эксперименты, проведенные для очищения физиологических жидкостей организма с помощью материалов, модифицированных при использовании среды, полученной в соответствии с настоящим изобретением, показали, что полимеры в этом случае не загрязняются эндотоксикантами. Выделение фосфазена Пример 6. Раствор, содержащий 0,0009 г поли(трифлуоэтокси) фосфазен (с молекулярным весом 107) в 8 мл этилацетата, быстро добавлялся к 3 г сухого пористого полимера и взбалтывался до тех пор, пока весь растворитель не поглощался полностью полимерными гранулами. Материал затем просушивался при уменьшенном давлении и промывался этанолом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ. 1. Способ удаления бетта-2 микроглобулина из крови, включающий этапы отвода крови от пациента, пропускания крови через адсорбирующий материал, имеющий размер и структуру, позволяющие удалять бетта-2 микроглобулин из крови,и последующую подачу крови, из которой удален бетта-2 микроглобулин, в пациента, отличающийся тем, что указанный выше материал является пористым полидивинилбензольным или полистирол сополидивинилбензольным полимером, причем в полимере выходящие на поверхность винильные группы химически модифицированы таким образом, что образуют функциональные группы с большей гидрофильностью и биосовместимостью, чем исходные винильные группы. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что прохождение крови через адсорбирующий материал осуществляется одновременно с обычной процедурой гемодиализа, при котором кровь пропукают через гильзу с мембраной,предназначенную для гемодиализа. 3. Способ по 1, отличающийся тем, что процесс прохождения крови через адсорбирующий материал осуществляют последовательно с обычной процедурой гемодиализа, при котором кровь пропускают через гильзу с мембраной,предназначенную для гемодиализа.