Способ выявления бактерионосительства при бруцеллезе крупного рогатого скота

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЬСТВА ПРИ БРУЦЕЛЛЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Султанов Ахметжан Акиевич (KZ),Ласкавый Владислав Николаевич(KZ), Волков Денис Сергеевич (RU),Оспанов Ержан Калиолдинович (KZ),Морозов Сергей Михайлович (RU),Алпысбаева Сабира Егизбаевна (KZ),Галкина Ольга Александровна (RU) Гембицкая Е.И. (RU) Изобретение относится к ветеринарии, в частности - к методам диагностики инфекционных заболеваний животных. Изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота у вакцинированного и невакцинированного поголовья за счт возможности выявления скрыто больных бруцеллзом животных. Способ осуществляется следующим образом. Всем животным, в том числе и молодняку, начиная с 2-х дневного возраста, как иммунизированным против бруцеллза, так и неиммунизированным, вводят внутримышечно бруцеллин, а через 30-40 мин - раствор для инъекций в дозе 4-6 мл на голову. При этом молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову, а взрослому поголовью - в дозе 4,5-5,0 мл на голову. Раствор для инъекций представляет собой смесь водного раствора формальдегида 36,5-40%-ной концентрации и изотонического раствора натрия хлорида 0,85-0,95%-ной концентрации при соотношении весовых частей растворов 2-6:994-998, через 10-28 дней после введения препаратов проводят серологические исследования.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "САРАТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ" (RU); ТОВАРИЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ Изобретение относится к ветеринарии, в частности к методам диагностики инфекционных заболеваний животных. Известен способ выявления бактерионосительства путм постановки серологических реакций с помощью реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК) (см., например, Шубина Е.А. Бруцеллез крупного рогатого скота, диагностика, специфическая профилактика./ http://www.vetlek.ru/articles/, опуб. 14.02.2011). Однако эффективность способа невелика, поскольку он не позволяет выявлять инфицированных животных с низкой резистентностью и толерантностью в отношении возбудителя бруцеллза. Известен также способ выявления бактерионосительства путм постановки аллергических реакций,т.е. с помощью бруцеллина ВИЭВ (см. Наставление по диагностике бруцеллза животных, утв. Минсельхозом РФ 29.09.200313-5-02/0850 и введнное в действие с 1 января 2004 года), заключающийся во внутрикожном введении препарата в дозе 0,2 мл. Данный метод применяют на свиньях с четырхмесячного возраста, не вакцинированных против бруцеллза. Реакцию на бруцеллин учитывают через 24 и 48 ч. Однако данный способ применим только на невакцинированных против бруцеллза животных (в частности, свиньях). Метод аллергической диагностики не может применяться на вакцинированных животных из-за возможности получения заведомо положительных результатов. Наиболее близким к заявляемому является способ выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота (см. патент РФ 2008918 по кл. МПК 5 А 61K 9/00, опуб. 15.03.1994), заключающийся в аллергическом исследовании невакцинированных животных, при этом животных предварительно иммунизируют вакциной из штамма 82, а аллергические исследования проводят через 3-4 дня. Однако, способ может применяться только на невакцинированных против бруцеллза животных. Введение вакцины из штамма 82 приводит к усилению аллергических реакций у невакцинированных животных и не может применяться на вакцинированном поголовье. Изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота у вакцинированного и невакцинированного поголовья за счт возможности выявления скрыто больных бруцеллзом животных. Для решения поставленной задачи в способе выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота, заключающемуся в однократном внутримышечном введении животным специфического бруцеллзного препарата, проведении иммунологических исследований и оценке бактерионосительства по их результатам, согласно изобретению дополнительно через 30-40 мин после введения специфического бруцеллзного препарата вводят внутримышечно однократно раствор для инъекций в виде смеси водного раствора формальдегида 36,5-40%-ной концентрации и изотонического раствора натрия хлорида 0,85-0,95%-ной концентрации при соотношении весовых частей растворов: 2-6:994-998, а в качестве специфического бруцеллзного препарата используют бруцеллин, при этом бруцеллин вводят в дозе 2,5-5,0 мл на голову, раствор для инъекций - в дозе 4-6 мл на голову, причм препараты вводят иммунизированным и неиммунизированным против бруцеллза животным всех возрастных групп, а оценку бактерионосительства осуществляют по результатам серологических исследований. Молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову, а взрослому поголовью - в дозе 4,5-5,0 мл на голову. Серологические исследования проводят через 10-28 дней после введения препаратов. В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описан способ выявления бактерионосительства при бруцеллзе у вакцинированного и невакцинированного поголовья крупного рогатого скота, позволяющий однозначно дифференцировать больных и здоровых животных и эффективно дополнительно выявлять больных бруцеллзом животных среди всего ранее обследованного поголовья за счт усиления специфических и снижения неспецифических реакций путм внутримышечного введения бруцеллина и раствора для инъекций в виде смеси водного раствора формальдегида и изотонического раствора натрия хлорида при соотношении весовых частей растворов 2-6:994-998. Известен препарат, содержащий смесь водного раствора формальдегида с изотоническим раствором хлорида натрия. Этот препарат является холестеринорегулирующим средством и позволяет включать гипермутационный механизм организма, который приводит к повышению аффинности рецепторов, регулирующих, в свою очередь, уровень холестерина (см. патент РФ 2352331 по кл. А 61K 31/115, опуб. 20.04.2009). Известен также препарат на основе формальдегида, хлорида натрия и дистиллированной воды (см. патент РФ 2077882 по кл. А 61K 31/115, опуб. 27.04.1997), который используется в качестве модулятора естественной резистентности организма, обеспечивающего саморегуляцию основных систем макроорганизма. В заявленном изобретении выявлено неизвестное ранее свойство раствора для инъекций на основе формальдегида и изотонического раствора хлорида натрия - осуществлять диагностику бруцеллза крупного рогатого скота путм усиления специфических реакций у больных бруцеллзом животных, особенно у нереагирующих на постановку аллергической пробы на бруцеллин. Кроме этого, выявлено свойство данного раствора для инъекций - снижать неспецифические реакции за счт нормализации иммунного статуса организма животных, что позволяет дифференцировать здоровых животных от больных. Раствор для инъекций на основе малых концентраций формальдегида способствует провокации латентно протекающих форм бруцеллезной инфекции в организме иммунизированных коров. Сказанное позволяет сделать вывод о наличии "изобретательского уровня" в заявляемом изобретении. Раствор для инъекций представляет собой прозрачный бесцветный раствор без запаха. Бруцеллин представляет собой стерильный биологический препарат в виде прозрачной жидкости коричневато-жлтого цвета без опалесценции, которая содержит продукты жизнедеятельности и специфические вещества, извлечнные из бруцелл (см., например, Наставление по диагностике бруцеллза животных, утв. Минсельхозом РФ 29.09.200313-5-02/0850 по состоянию на 23 января 2008). Способ осуществляется следующим образом. Всем животным, в том числе и молодняку, начиная с 2-х дневного возраста, как иммунизированным против бруцеллза, так и неиммунизированным, вводят внутримышечно бруцеллин, а через 30-40 мин раствор для инъекций в дозе 4-6 мл на голову. При этом, молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову, а взрослому поголовью - в дозе 4,5-5,0 мл на голову. Через 10-28 дней после введения препаратов проводят серологические исследования. Пример. Исследования проводились в крестьянском хозяйстве Акмолинской области сотрудниками лаборатории бруцеллеза ТОО "КазНИВИ". Животные были сформированы в 2 группы: 1- группа состояла из 100 голов, отрицательно реагирующих на бруцеллез, взрослых животных (коров и телят прошлого года) и 2-х телят до 9 дней, родившихся от здоровых животных. Взрослым животным вводили однократно внутримышечно каждому по 5 мл бруцеллина, а через 35 мин - по 5,5 мл раствора для инъекций. Телятам препарат вводили также однократно внутримышечно по схеме: 3 мл бруцеллина, а через 35 мин - 5 мл раствора. 2 группа состояла из 58 бычков разных возрастов, которым вводили однократно внутримышечно каждому по 5 мл бруцеллина, а через 35 мин - по 5,5 мл раствора для инъекций. Серологические исследования коров проводили через 10 и 28 дней, а быков и телят через 28 дней после введения препаратов в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК), постановки пробы роз-бенгал (РБП) и путм постановки иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты проведенных работ представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, из 100 здоровых взрослых коров, исследованных на бруцеллез после введения препаратов, положительно реагировало по всем серологическим тестам при первом исследовании 28 голов (28%), а при повторном - 30 (30%). Данное стадо коров до введения препаратов числилось благополучным по бруцеллезу, т.е. при предварительном диагностическом исследовании животные отрицательно реагировали на бруцеллез. Таблица 1. Результаты серологических исследований крупного рогатого скота Появление 28 положительных показаний серологических тестов при исследовании заведомо здоровых коров после первичного и 30 положительных случаев после вторичного введения препаратов обусловлено действием специфического бруцеллезного аллергена совместно с раствором для инъекций на основе малых концентраций формальдегида, что, в конечном итоге, способствовало провокации латентно протекающих форм бруцеллезной инфекции в организме животных. Раствор готовили следующим образом. Берут 2-6 вес.ч. 36,5-40%-ного медицинского раствора формальдегида, добавляют его в 998-994 вес.ч. стерильного 0,85-0,95%-ного раствора хлорида натрия для инъекций. Раствор хранят в темном месте при температуре 15-35C. Например, берут 0,2 мл 37%-ного медицинского раствора формальдегида, добавляют его в 99,8 мл стерильного 0,9%-ного (или 0,95%-ного) изотонического раствора хлорида натрия. Смесь растворов тщательно перемешивают. Содержание весовых частей раствора для инъекций было подобрано экспериментальным путм. Для доказательства отсутствия токсического действия раствора для инъекций были проведены эксперименты на мышах. В опытах было использовано 56 аутбредных мышах ICR обоего пола массой 18-24 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при одинаковом уходе, на постоянной диете и при свободном доступе к воде и к корму. Наблюдения за животными проводили в течение 14 суток с момента введения раствора. Оценивали общее состояние животных, двигательную активность, поведение, реакцию на раздражители, рефлексы. В экспериментах, где было необходимо, периодически проводили взвешивание животных, определяли объемы потребляемой пищи и воды. Погибших в ходе исследований животных вскрывали, проводили оценку состояния внутренних органов, определяли их относительные коэффициенты (головной мозг,печень, сердце, селезенка, почки, надпочечники, яички, яичники). Выживших животных по истечении периода наблюдения умерщвляли дислокацией шейных позвонков, проводили вскрытие и оценивали выраженность макроскопических патологоанатомических изменений состояния внутренних органов. Показатели токсичности определяли методом пробитанализа по Litchield и Wilcoxon с использованием номограмм З. Рота. Препарат с содержанием 0,2 мл раствора 37%-го формальдегида и 99,8 мл 0,9% раствора хлорида натрия вводили внутримышечно однократно в дозах 5, 25 и 50 мл/кг. За период наблюдения животных взвешивали трижды (1, 7 и 14 сутки после введения). Результаты исследований показали, что после введения препарата в дозе 5,0 мл/кг не выявлено каких-либо изменений в общем состоянии животных и их поведении. Гибели животных в группе в течение всего периода наблюдения не было. Динамика нарастания массы тела у всех животных оставалась в пределах нормы. Отличий в общем состоянии и поведении в группах самцов и самок не выявлено. Близкую к вышеописанной картине наблюдали и после введения препарата в дозе 25 мл/кг. Общее состояние, поведение, потребление корма и воды, динамика нарастания массы тела оставались в пределах нормы как в группах самцов, так и самок. В группе животных, которым вводили препарат в дозе 50,0 мл/кг, отмечали кратковременное (до 1 мин) легкое возбуждение, после чего состояние животных нормализовалось и заметно не отличалось от такового в других опытных группах мышей. После завершения периода наблюдения (14 сут.) животных вывели из эксперимента дислокацией шейных позвонков, вскрыли и провели макроскопическую оценку внутренних органов, после чего органы удалили, взвесили и определили относительные индексы внутренних органов. Исследованиями установлено, что относительные массы органов во всех опытных группах статистически достоверно не различались и находились в пределах нормы. Местной реакции (наличие инфильтрата, гиперемии, выпадения волосяного покрова и т.д.) не выявлялось. Провели исследования по введению препарат в дозе, в 10 раз превышающей концентрацию готовой лекарственной формы препарата, т.е. с содержанием 2 мл раствора 37% формальдегида и 98 мл 0,9% концентрации раствора хлорида натрия. Мышам (самцам и самкам) ICR препарат вводили внутримышечно в дозах 6, 12,5 и 25 мл/кг. В течение первых 5-6 ч после введения отмечали умеренное угнетение возбудимости и реактивности животных. Постепенно нарастало учащение дыхания и сердцебиения. Однако гибели животных в течение первых суток после введения вещества не зарегистрировали. Гибель наступила от остановки дыхания на 4-е сутки у одной из мышей, которой ввели субстанцию в дозе 25 мл/кг. У всех опытных животных развивалась местная реакция в виде уплотнения мышечной ткани. К концу опыта кожный покров на месте инъекции раствора терял шерстяной покров, здесь формировался плотный инфильтрат. Исследования показали, что начальная токсическая доза препарата не оказала существенного влияния на прирост массы тела животных. Колебания этих показателей в группах самцов и самок не выходят за пределы допустимых отклонений. В конце эксперимента мыши были умерщвлены, обследованы макроскопически, их внутренние органы взвешены и вычислены относительные коэффициенты. Результаты эксперимента показали, что у мышей обоего пола, получивших данный препарат в дозе,в 10 раз превышающей терапевтическую, в конце эксперимента относительная масса мозга, сердца, печени, селезенки, почки, надпочечников, семенников (яичников) существенно не отличалась от таковой для нормальных показателей у животных. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о низкой токсичности раствора для инъекций на основе малых концентраций формальдегида. Было выявлено, что введение раствора для инъекций с другими соотношениями весовых частей не приводит к повышению эффективности диагностических мероприятий. Дозы введения препаратов также были подобраны экспериментально. Установлено, что введение раствора для инъекций в дозе менее 4 мл не приводит к решению поставленной задачи, а именно - к эффективному выявлению бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота, а более 6 мл нецелесообразно с экономической точки зрения. Аналогичным образом и из этих же соображений были подобраны дозы введения бруцеллина для молодняка (2,5-3,0 мл) и взрослого поголовья (4,5-5,0 мл). Проведение серологических исследований спустя 10-28 дней объясняется следующими соображениями. Общеизвестно, что иммунитет при бруцеллзе формируется через три недели после вакцинации(см., например, Инструкцию и ТУ 9384-016-00482915-01 по применению вакцины против бруцеллза из слабоагглютиногенного штамма Brucella abortus 82, Инструкцию и ОСТ 10-08064-41-95 по применению вакцины против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма 19 производства ФГУП "Щелковский биокомбинат"/ http://www.biocombinat.ru/index). Для доказательства эффективности достигаемого нами результата были проведены серологические исследования до формирования иммунитета (через 10 дней после обработки животных препаратами) и спустя 28 дней после. Таким образом, способ позволяет эффективно выявлять скрыто больных бруцеллзом животных,причм как вакцинированного, так и невакцинированного поголовья. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота, заключающийся в однократном внутримышечном введении животным специфического бруцеллзного препарата,проведении иммунологических исследований и оценке бактерионосительства по их результатам, отличающийся тем, что дополнительно через 30-40 мин после введения специфического бруцеллзного препарата вводят внутримышечно однократно раствор для инъекций в виде смеси водного раствора формальдегида 36,5-40%-ной концентрации и изотонического раствора натрия хлорида 0,85-0,95%-ной концентрации при соотношении весовых частей растворов: 2-6:994-998, а в качестве специфического бруцеллзного препарата используют бруцеллин, при этом бруцеллин вводят в дозе 2,5-5,0 мл на голову,раствор для инъекций - в дозе 4-6 мл на голову, причм препараты вводят иммунизированным и неиммунизированным против бруцеллза животным всех возрастных групп, а оценку бактерионосительства осуществляют по усилению специфических серологических реакций,исследования на которые проводят через 10-28 дней после введения бруцеллзного препарата и раствора для инъекций. выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота по п.1, отли 2. Способ чающийся тем, что молодняку молозивного возраста бруцеллин вводят в дозе 2,5-3,0 мл на голову. 3. Способ выявления бактерионосительства при бруцеллзе крупного рогатого скота по п.1, отличающийся тем, что взрослому поголовью бруцеллин вводят в дозе 4,5-5,0 мл на голову.