Способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивале­риановой кислот

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОПОЛИМЕРА 3-ГИДРОКСИМАСЛЯНОЙ И 3 ГИДРОКСИВАЛЕРИАНОВОЙ КИСЛОТ Заявленный способ относится к области микробиологической промышленности и предназначен для получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот. Заявленный способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот включает культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде с водород- и углеродсодержащим ростовым субстратом,представляющим собой газовую смесь H2, CO2, CO и O2, и отличается тем, что культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 осуществляют в две стадии: на первой стадии - при непрерывной подаче источника азота и на второй - без азота и при подаче в культуру валерата калия. Техническим результатом изобретения является расширение сырьевой базы и снижение затрат на производство сополимера 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом,обеспечение высокого общего выхода сополимера (не ниже 80%) за счет оптимизации режима дозирования в культуру солей валериановой кислоты. Волова Татьяна Григорьевна (RU) Черепанова Л.И. (RU)Biotechnology Letters, 2000, v. 22, p. 1067-1069 ЩИПКО М.Л. и др. Газификация бурого угля с получением синтез-газа для биосинтеза полиоксиалканоатов. Химия твердого топлива,2003,5, с. 58-67 ВОЛОВА Т.Г. и др. Синтез сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата [поли(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" (RU) Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения сополимера - 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот. Сополимер 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (П 3 ГБ/3 ГВ) является одним из наиболее перспективных представителей семейства термопластичных и биоразрушаемых полимеров микробиологического происхождения - полигидроксиалканоатов (ПГА) и предназначен для применения в различных областях (медицина, фармакология, сельское и коммунальное хозяйство, пищевая промышленность) [Sudesh K., Abe H., Doi Y.Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters // Prog. Polym. Sci. - 2000. V. 25. - P. 1503-1555]. Известен способ получения сополимера 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом на основе штамма Azotobacter chroococcum 12A на среде с сахарами (20 г/л) в качестве основного ростового субстрата и добавками валерата (1 или 2 г/л), который является предшественником для синтеза мономеров 3-гидроксибутиората [патент РФ 2307159, МПК C12N 1/20, опубл. 27.09.2007 г.]. Недостаток способа - низкий общий выход сополимера (62-70%) и низкое содержание в нем фракции 3-гидроксивалерата (10-18 мол.%) Известен также способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот при культивировании микроорганизмов на среде с валериановой кислотой или смеси масляной и валериановой кислот в качестве основного ростового субстрата [ЕР 00052459, МПК А 61K 9/22, опубл. 18.11.1980 г.]. Способ позволяет получать сополимер с содержанием в нем фракции 3-гидроксивалериата до 50 мол.%. Недостатком способов является использование дорогостоящего и дефицитного сырья -органических кислот (стоимость которого в несколько раз превосходит стоимость сахаров) и ограниченный уровень содержания 3-гидроксивалерата в сополимере. Известен способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот с использованием в качестве продуцента мутантных штаммов Alcallgenes eutrophus NCIB 11599, Н-16 АТСС 17699 в двухстадийной периодической культуре при лимите азота в среде, содержащей в качестве основного ростового субстрата глюкозу (20 г/л) или валериановую кислоту, или их смеси. В зависимости от скорости подачи основного ростового субстрата (глюкозы или валерата) соотношение мономеров в сополимеров варьирует от 10 до 100 мол.% для 3-гидроксибутирата и от 90 до 0 мол.% для 3-гидроксивалерата при общих затратах времени на ферментацию 72 ч [ЕР 00052459, МПК А 61K 9/22,опубл. 18.11.1980 г.]. Недостаток способа - использование дорогостоящего сырья, в том числе пищевого назначения, а также длительность ферментации. Известен способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот на основе природного штамма Alcallgenes eutrophus B-5786 (таксон Alcallgenes переименован в Ralstonia) на среде, содержащей в качестве основного ростового субстрата - непищевое сырье - смеси водорода и углекислого газа или ацетат и добавки валериановой (или пропионовой) кислоты [патент РФ 2051968,МПК С 123 7/62, опубл. 10.01.1996 г. (прототип)]. Культивирование проводят в периодическом режиме в одну стадию при лимите азота в среде (концентрация NH4Cl в питательной среде 0,03 г/л). В зависимости от дозы и количества добавок валериановой (или пропионовой) кислоты способ позволяет при использовании непищевого сырья получать сополимер с содержанием 3-гидроксивалерата в сополимере от 50 до 92 мол.% при затратах времени на культивирование штамма-продуцента от 32 до 58 ч. Недостатки прототипа: 1) использование в качестве основного ростового субстрата электролизного водорода (или ацетата),стоимость которых достаточно высока (см. табл. 1); 2) выбранный одностадийный режим культивирования бактерий без смены среды или организации подпитки субстратом (указанное в прототипе одностадийное культивирование штамма-продуцента на питательной среде с содержанием источника азота в среде (0,3 г/л) не может обеспечить высокие общие выходы биомассы и полимера); 3) дробный режим дозирования в культуру валериановой (или пропионовой) кислоты, которые, вопервых, подкисляют среду, поэтому возникает необходимость корректировки рН и, во-вторых, токсичны для культуры, в результате чего необходим постоянный контроль текущей концентрации этого субстрата в культуре. Техническим результатом изобретения является расширение сырьевой базы и снижение затрат на производство сополимера 3-гидроксибутрата с 3-гидроксивалератом, обеспечение высокого общего выхода сополимера (не ниже 80%) за счет оптимизации режима дозирования в культуру солей валериановой кислоты. Технический результат достигается тем, что в способе получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, включающий культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей водород- и углеродосодержащий ростовой субстрат с добавлением соли валериановой кислоты, новым является то,что культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 осуществляют в две стадии,при непрерывной подаче источника азота на первой стадии и без азота - на второй, а в качестве ростово-1 020482 го субстрата используют газовую смесь H2, CO2, CO и O2, при непрерывном режиме подачи в культуру валерата калия. Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данных и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критериям "новизна" и "изобретательский уровень". Масштабы производства и применения этих полимеров зависят от их стоимости, которая в значительной мере определяется стоимостью исходного ростового субстрата для штамма-продуцента (см. таблицу). Затраты и стоимость сырья для синтеза 1 т полимерах Как видно из представленной таблицы, затраты на ростовой субстрат и его количество, необходимое для синтеза единицы продукта, существенно варьируют. Снижение затрат на производство полимеров этого класса в целом и расширение спектра ПГА, характеризующихся различными свойствами, - актуальное направление исследований. Использование в качестве ростового субстрата водородсодерожащих газовых ресурсов, например синтез-газа, который может быть получен газификацией природного углеродсодержащего сырья (углей,природного газа, отходов растительного сырья) и трехступенчатой парокислородной конверсии синтезгаза позволяет получать газовые смеси с различным соотношением водорода и окислов углерода, при этом, чем ниже содержание окислов углерода в смеси, тем длительнее процесс конверсии и дороже получаемый газовый субстрат. Для выращивания штамма-продуцента привлекается газовый субстрат с содержанием монооксида углерода не ниже 25 об.%. Сущность изобретения заключается в следующем: культуру штамма - продуцента Ralstonia eutrophaB-5786 засевают в жидкую солевую среду, содержащую в качестве основного ростового газовый субстрат, содержащий водород-источник энергии, кислород и источник углерода (моно- и диоксид углерода), а в качестве предшественника для синтеза мономеров 3-гидроксивалерата - добавки валерата калия. Валерат калия подается в культуру бактерий не пробно (как в прототипе), а непрерывно с помощью перистальтического насоса-дозатора, что не вызывает изменения рН, обеспечивает постоянный и заданный уровень текущей концентрации валерата в культуре и исключает ингибирование культуры. Данный штамм-продуцент, обладающий СО-резистентностью, позволяет использовать газовый субстрат, содержащий в своем составе монооксид углерода. Культивирование бактерий проводят в стерильном режиме с использованием ферментационного комплекса BioFlo 110 ("New Brunswick Scientific", США) объемом 7 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (рН, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде Шлегеля [Шлегель, Г.Г. Общая микробиология /М.: Наука, 1984]. Коэффициент заполнения ферментера составляет 0,5-0,7. Культивирование проводят в периодической культуре с подпиткой азотного субстрата при 30C и рН 7,0 в два этапа. На первом этапе в культуру непрерывно насосом-дозатором подают раствор восстановленного источника азота (CO(NH2)2 или NH4Cl); на втором этапе подача азота не предусмотрена. Для синтеза мономеров 3-гидроксивалерата в культуру подается отдельным потоком субстратпредшественник - валерат калия. В зависимости от дозы подаваемого валерата калия и времени культивирования штамма-продуцента соотношение мономеров 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата в со-2 020482 полимере варьирует в широких пределах. Концентрацию сополимера в клеточной биомассе и состав мономеров в нем определяют после предварительного метанолиза проб на хроматомасс-спектрометре а также 5 мл раствора железа лимоннокислого (5 г/л) и 3 мл стандартного раствора микроэлементов, содержащего, г/л: Культивирование штамма проводят в двустадийном периодическом режиме, в качестве ростового субстрата используют водородсодержашую газовую смесь следующего состава (в об.%): водород - 64; оксид углерода - 26; диоксид углерода - 10, которая подается в культуру из газгольдера с помощью компрессора со скоростью 6 л/мин. Отдельным потоком в культуру подается кислород для обеспечения его текущей концентрации в культуре 3-5 мг/л. Через 28 ч после отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают еще 30 ч при подаче в культуру валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре - 2 г/л). Общее время культивирования штаммапродуцента составляет 58 ч при общем выходе полимера 84,5%. Состав полимера (мол.%): 3-гидроксибутират - 32,3; 3-гидроксивалерат - 66,7. Пример 2. Культивирование штамма проводят аналогично примеру 1, в качестве ростового субстрата используют водородсодержашую газовую смесь следующего состава (в об.%): водород - 60, оксид углерода - 30; диоксид углерода - 10, которуя из газгольдера подают в культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Отдельным потоком в культуру подается кислород для обеспечения его текущей концентрации в культуре 3-5 мг/л. Через 24 ч после отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают еще 32 ч при подаче в культуру валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре - 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 56 ч при общем выходе полимера 81,3%. Состав полимера (мол.%): 3-гидроксибутират - 14,0; 3-гидроксивалерат - 84,6. Пример 3. Культивирование штамма проводят аналогично примеру 1, в качестве ростового субстрата используют водородсодержашую газовую смесь следующего состава (в об.%): водород - 65; оксид углерода - 28; диоксид углерода - 7, которую из газгольдера подают в культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Отдельным потоком в культуру подается кислород для обеспечения его текущей концентрации в культуре 3-5 мг/л. Через 36 ч после отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают еще 24 ч при подаче в культуру валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре - 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 80,8%. Состав полимера (мол.%): 3-гидроксибутират - 14,0; 3-гидроксивалерат - 86,0. Использование CO-резистентного штамма позволяет привлекать для выращивания бактерий и синтеза сополимера более дешевый по сравнению с электролизным водородом водородсодержащий газовый субстрат, получаемый из природного сырья (бурый уголь, природный газ, отходы растительного сырья). Непрерывный режим подачи в культуру валерата калия, необходимого для синтеза 3-гидроксивалерата,позволяет исключить возникновение эффекта ингибирования культуры этим субстратом и не вызывает изменения рН культуры. Двустадийный режим культивирования штамма-продуцента с непрерывной подачей источника азота на первой стадии позволяет получить высокие общие выходы (80-84,6%) сополимера 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом с содержанием 3-гидроксивалерата от 51 до 86 мол.%. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, включающий культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде с водород- и углеродсодержащим ростовым субстратом с добавлением соли валериановой кислоты, отличающийся тем, что культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 осуществляют в две стадии: на первой стадии - при непрерывной подаче источника азота и на второй - без азота и при подаче в культуру валерата калия, а в качестве ростового субстрата используют газовую смесь H2, CO2, CO и O2.