Способ получения селективного активатора ca2+-зависимой no-синтазы

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО АКТИВАТОРА CA2+-ЗАВИСИМОЙ NOСИНТАЗЫ Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, в частности к способу получения селективного активатора Са 2+-зависимой NO-синтазы (далее NOS), которая является одним из ключевых ферментов антиоксидантной защиты организма, а также эффективным регулятором Са-зависимых процессов в стволовых клетках, что особенно важно для управления функциональными механизмами стволовой клетки in vivo. Техническим результатом, на получение которого направлено изобретение, является разработка селективного активатора Са 2+-зависимой NOS, характеризующегося высокой степенью активации, а также простого способа его изготовления, отличающегося простотой изготовления и доступностью необходимого для этого сырья. Технический результат достигается в селективном активаторе Са 2+-зависимой NOS, полученном следующим образом: дрожжи Saccharomyces cerevisiae(пекарские дрожжи), выращенные на синтетической среде с глюкозой, суспендируют в водопроводной воде, нагретой до 60-75 С, до концентрации 50 г сухой биомассы на 1 л,нагревают до 75-90 С и выдерживают в течение 15-25 мин при этой температуре, затем охлаждают до 35-60 С и инкубируют при этой температуре в течение 1,5-2,5 ч. Затем рН суспензии доводят до 1,0-1,5, повторно нагревают до 75-80 С и выдерживают в течение 30-60 мин. Затем суспензию разводят водой в соотношении от 1:1 до 1:10, доводят рН до 5,0-6,0 и выдерживают при помешивании 30-60 мин. Далее надосадочную жидкость центрифугированием отделяют от клеточной биомассы дрожжей и затем высушивают.(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец: применения комплексного нуклеотидного ОРЛОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА; препарата из дрожжей Saccharomyces ОРЛОВА ВАЛЕНТИНА СЕРГЕЕВНА;cerevisiae. Диссертация на соискание КЛУБКОВ ВЛАДИМИР ученой степени доктора биологических КОНСТАНТИНОВИЧ (RU) наук. - М., 2007, с. 45-47, 77-84, 94-95 Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, фармакологии, в частности к производству селективного активатора Са 2+-зависимой NO-синтазы (далее NOS), которая является одним из ключевых ферментов антиоксидантной защиты организма, а также эффективным регулятором Сазависимых процессов в стволовых клетках, что особенно важно для управления функциональными механизмами стволовой клетки in vivo. Известно действие динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) в качестве активатора Са 2+зависимой NOS [Vanin А.Р., Stukan R.A., Manukhina Е.В. Physical properties of dinitrosyl iron complexes inrelation with their vasodilator activity, Biochim Biophys Acta, 1996, 1295: 5-12]. Известно также действие иономицина как активатора Са 2+-зависимой NOS [Orlova E.V., UvarovV.W., Astashkin E.I. Effect of ionomycin on catalitic activity of nitric oxide synthase (NOS) from from rat thymocytes// In: Materials of the XIth International symposium of microsoms and drug oxidations. Los-Angeles,USA, 1996, p. 186; Орлова Е.В. Са 2+-зависимая NOS из тимоцитов и гепатоцитов крыс Wistar в онтогенезе.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2005, т. 4, с. 21-25]. Известно действие Т-активина как активатора Са 2+-зависимой NOS [Орлова Е.В. Влияние Са 2+антагониста верапамила и двух иммуномодуляторов: Т-активина и циклофосфамида на Са-зависимуюNOS из тимоцитов и гепатоцитов крыс Wistar// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2005, т. 4, с. 26-29]. Недостатком этих препаратов является низкая степень активации Са 2+-зависимой NOS, а также сложная методика получения препаратов и высокие требования, предъявляемые к качеству исходного сырья. Техническим результатом, на получение которого направлено изобретение, является разработка селективного активатора Са 2+-зависимой NOS, характеризующегося высокой степенью активации, а также простого способа его изготовления, отличающегося простотой изготовления и доступностью необходимого для этого сырья. Технический результат достигается в селективном активаторе Са 2+-зависимой NOS, полученном следующим образом: дрожжи Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи), выращенные на синтетической среде с глюкозой, суспендируют в водопроводной воде, нагретой до 60-75 С, до концентрации 50 г сухой биомассы на 1 л, нагревают до 75-90 С и выдерживают в течение 15-25 мин при этой температуре,затем охлаждают до 35-60 С и инкубируют при этой температуре в течение 1,5-2,5 ч. Затем рН суспензии доводят до 1,0-1,5, снова нагревают до 75-80 С и выдерживают в течение 30-60 мин. Затем суспензию разводят водой с температурой от 2 до 25 С в соотношении от 1:1 до 1:10 и после разведения доводят рН до 5.0-6.0 и выдерживают при помешивании 30-60 мин. Далее надосадочную жидкость центрифугированием отделяют от клеточной биомассы дрожжей и затем высушивают. На фиг. 1 показан всплеск Са в клетках с 2 с 12 в ответ на добавление ДНКЖ (1.8 мкМ) - А и селективного активатора (0.005 мг/мл), по оси х отложено время t в минутах, а по оси у - относительные единицы флюоресценции. На фиг. 2 показана флуоресценция (0.005% Pluronic) в клетках с 2 с 12 в ответ на добавление ДНКЖ(1.8 мкМ) - А и селективного активатора (0.005 мг/мл) - В на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Пример 1. Получение селективного активатора Са 2+-зависимой NOS. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, выращенные на синтетической среде с глюкозой, суспендируют в водопроводной воде, нагретой до 75 С до концентрации 50 г сухой биомассы на 1 л, нагревают до 75 С и выдерживают 20 мин, затем охлаждают до 35 С и инкубируют при этой температуре в течение 2 ч. Затем рН суспензии доводят до 1.0 концентрированной H2SO4 и снова нагревают до 80 С в течение 60 мин. Затем разводят суспензию водой температурой 15 С в соотношении 1:5 и повышают рН среды до 5.8 концентрированной KOH. После разведения суспензию выдерживают 30-60 мин при помешивании и далее надосадочную жидкость центрифугированием отделяют от клеточной биомассы дрожжей и затем высушивают. Таблица 1 Влияние показателя разведения в способе перед отделением центрифугированием на активность Са 2+-зависимой NOS Пример 2. В табл. 2 приведены результаты исследований влияния селективного активатора Са 2+-зависимойNOS, полученного из дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14, способом, описанным в примере 1, иономицина и Т-активина при 3-кратном в/б введении крысам Wistar на кинетические параметры Са 2+зависимой NOS. Таблица 2 По выраженности активирующего действия (уменьшение Km и увеличение удельной скорости реакции (Vуд селективный активатор Са 2+-зависимой NOS в использованной дозе 10 мг/кг является более сильным активатором Са 2+-зависимой NOS по сравнению с коммерческим пептидным препартом Тактивином и иономицином. Пример 3. Для изучения потенциальной способности селективного активатора Са 2+-зависимой NOS оказывать влияние на функциональные особенности стволовых клеток были проведены нижеследующие эксперименты. Культуру мышиных миобластов (как ближайшую к человеку по геномным характеристикамNOS в недифференцированных с 2 с 12 методом ЭПР-спектроскопии было проведено по методу Lancaster и Hibbs (Lancaster J.R., Hibbs J.B. EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 87, p. 1223-1227, 1999). Результаты приведены в табл. 3. Таблица 3 Изучение Са-сигнализации в присутствии флюоресцентного красителя 0.005% Pluronic проводили по методу, описанному в работе Gutierrez-Martin Y. и Martin-Romero F.J. (Gutierrez-Martin Y., MartinRomero F.J., Henao F. Store-operated calcium entry in differentiated C2C12 skeletal muscle cells// Biochim. etbiophys. acta., 2005, v. 1711, p. 33-40). Подсчет клеток проводили в камере Горяева. На фиг. 1 и 2 видно,что селективный активатор Са 2+-зависимой NOS (0.005 мг/мл) сильнее активирует Са-каналы, чем ДНКЖ в концентрации 1.8 мкМ. Таким образом, можно заключить, что селективный активатор Са 2+зависимой NOS активирует NO-синтазу в недифференцированных с 2 с 12 в гораздо большей степени, чем динитрозийный комплекс железа и иономицин. При этом, как следует из экспериментов по Сасигнализации, в недифференцированных с 2 с 12 активируется именно Са 2+-зависимая NOS, а также эффективно увеличивает выход Са из клеточных депо в цитоплазму. Функцию "депо" NO в клетке, наряду с нитрозотиолами, как известно, выполняют нитрозильные негемовые [Fe-S] белки. Синтетические аналоги динитрозильных комплексов железа с природными тиолами (цистеином, глютатионом и др.) (ДНКЖ) представляют собой малостабильные водные растворы и идентифицируются по ЭПР сигналу с гиромагнитным отношением g=2.03 (Vanin A.F., Stukan R.A., Manukhina E.B. Physical properties of dinitrosyl iron complexes in relation with their vasodilator activity//Biochim. Biophys. Acta, 1996, v. 1295, p. 5-12). Таким образом, достигается технический результат. Кроме того, селективный активатор Са 2+зависимой NOS отличается пониженным содержанием нуклеиновых кислот, что снижает вероятность возникновения мочекаменной болезни при его применении. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения селективного активатора Са 2+-зависимой NO-синтазы, характеризующийся тем,что дрожжи Saccharomyces cerevisiae, выращенные на синтетической среде с глюкозой, суспендируют в водопроводной воде, нагретой до 60-75 С, до концентрации 50 г сухой биомассы на 1 л, нагревают до 7590 С и выдерживают в течение 15-25 мин при этой температуре, затем охлаждают до 35-60 С, инкубируют при этой температуре в течение 1,5-2,5 ч, после чего рН суспензии доводят до 1,0-1,5, повторно нагревают до 75-85 С и выдерживают в течение 30-60 мин, затем суспензию разводят водой в соотношении от 1:1 до 1:10 и доводят рН суспензии до 5.0-6.0, выдерживают при помешивании 30-60 мин, после чего надосадочную жидкость центрифугированием отделяют от клеточной биомассы дрожжей и затем высушивают.