Способ количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов и состав для его осуществления

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 7-ОКСА-6-ОКСОБРАССИНОСТЕРОИДОВ И СОСТАВ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Изобретение относится к области иммунохимического анализа, а именно количественному определению регуляторов роста растений, 7-окса-6-оксобрассиностероидов - брассинолида, 24 эпибрассинолида, 28-гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др., и предназначено для оценки содержания указанных брассиностероидов в растительных объектах, контроля выпуска действующего вещества и измерения его концентрации в агропрепаратах на их основе, а также может быть использовано для оценки качества сельскохозяйственной продукции, полученной с их применением, определения остаточных количеств в почве, сточных водах и т.п. Задачей настоящего изобретения является способ количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов и состав для его осуществления, которые отличаются специфичностью, высокой чувствительностью, экологической безопасностью, простотой, надежностью и технологичностью. Поставленная цель достигается, во-первых, предлагаемым способом, заключающимся в смешивании анализируемых образцов брассиностероида (или калибровочных проб) с конъюгатом 28 норбрассинолидпероксидаза хрена в полимерных лунках с иммобилизованными на внутренней поверхности поликлональными антителами к 28-норбрассинолиду, последующей инкубации,разделении свободной и связанной антителами форм брассиностероидов, добавлении к связанной форме хромоген-субстратной смеси для определения активности пероксидазы, по которой рассчитывают количество определяемого 7-окса-6-оксобрассиностероида; во-вторых, составом для его осуществления, включающиим антитела к 28-норбрассинолиду, иммобилизованные на полимерных лунках; конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена; буферный раствор для разведения конъюгата; промывочный буферный раствор; хромоген-субстратную смесь - раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в субстратном буфере с перекисью водорода; стоп-реагент - 5%ный раствор H2SO4.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 015274 Изобретение относится к области иммунохимического анализа, а именно количественному определению регуляторов роста растений, 7-окса-6-оксобрассиностероидов-брассинолида, 24-эпибрассинолида,28-гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др., и предназначено для оценки содержания указанных брассиностероидов в растительных объектах, контроля выпуска действующего вещества и измерения его концентрации в агропрепаратах на их основе, а также может быть использовано для оценки качества сельскохозяйственной продукции, полученной с их применением, определения остаточных количеств в почве, сточных водах и т.п. Традиционным методом определения брассиностероидов (эпикастастерона и эпибрассинолида в том числе) является хроматография с масс-спектрометрической детекцией (ГЖХ-МС и ВЭЖХ-МС) [1-3]. Однако проведение анализа в данном случае требует сложной многоступенчатой процедуры выделения,очистки и химической модификации, что делает практически невозможным оперативный мониторинг брассиностероидов. Применение иммунохимического анализа для количественного определения брассиностероидов с использованием антител описано в ряде работ. Так, для радиоиммунного анализа были получены антитела к кастастерону, на базе которых удалось создать систему для анализа брассинолида и кастастерона [4],однако из-за сложности работы с радиоактивными изотопами и необходимости комбинирования с инструментальными методами разработка не получила развития. Кроме того, полученная система имела низкую специфичность: показатели перекрестных реакций с другими брассиностероидами (и даже стероидами других классов) составляли 20-50%. В литературе описан подход, в котором моноклональные антитела, полученные к 24-эпибрассинолиду, были использованы для распознавания различных стероидов, включая антиген [5]. Для проведения анализа брассиностероид растворяли в смеси метанол-хлороформ и наносили на стенки полистирольной аналитической кюветы путем испарения растворителя. Дальнейший анализ проводили с использованием вторичных поликлональных антител кролика к моноклональным мышиным антителам, вступившим во взаимодействие со стероидом, и конъюгата протеин A - пероксидаза хрена, позволяющего осуществить анализ фермента, вступившего во взаимодействие с кроличьими антителами. Оказалось, что описанный способ не обеспечивает селективного определения брассиностероида (24-эпибрассинолида) даже в сопоставлении со стероидами отдаленных структурных типов. В частности, экдизон и ситостерин обнаружили 50%-ную перекрестную реакцию. Аналогом заявляемого способа по назначению является метод иммуноферментного определения 24R-метилбрассиностероидов [6,7]. Метод является высокочувствительным и высокоспецифичным в ряду брассиностероидов. Однако он не позволяет делать различие между 7-окса-6-оксо-, 6-оксо- и 6 дезоксобрассиностероидами. Следует отметить, что наибольшую биологическую активность проявляют брассиностероиды, имеющие в своей структуре 7-окса-6-оксогруппировку (так называемые брассиностероидные лактоны), которые вызывают наибольший интерес исследователей [8, 9]. Целью настоящего изобретения является способ количественного иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов. Поставленная цель достигается предлагаемым способом, заключающимся в смешивании анализируемых образцов брассиностероида (или калибровочных проб) с конъюгатом 28-норбрассинолидпероксидаза хрена в полимерных (например, полистирольных) лунках с иммобилизованными на внутренней поверхности антителами к 28-норкастастерону, последующей инкубации, разделении свободной и связанной антителами форм брассиностероидов, добавлении к связанной форме хромоген-субстратной смеси для определения активности пероксидазы, по которой рассчитывают количество определяемого 7 окса-6-оксобрассиностероида. Заявляемый способ является экологически безопасным, простым, надежным и технологичным. Применение заявляемого способа обеспечивает быстрое и прямое (без многоступенчатых стадий выделения, подготовки образца и/или его модификации) определение 7-окса-6-оксобрассиностероидов брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28-гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др. Кроме того, способ отличается высокой надежностью и чувствительностью, достаточной для обнаружения 7-окса-6 оксобрассиностероидов (в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л). Сущность изобретения подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 1. В полистирольные лунки вносят по 0,05 мл калибровочных проб и анализируемых образцов в дубликатах. Вносят во все лунки по 0,1 мл раствора конъюгата 28-норбрассинолид-пероксидаза. Инкубируют лунки 2 ч при 37C. Промывают лунки 4 раза промывочным раствором, добавляя во все лунки по 0,15 мл. Во все промытые лунки добавляют по 0,15 мл хромоген-субстратного буфера и инкубируют при 37C в течение 15 мин. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по 0,05 мл раствора стоп-реагента (5%-ной-1 015274 Измеряют на спектрофотометре оптическую плотность раствора во всех лунках при 450 нм. Результаты анализа рассчитывали методом интерполяции по калибровочной кривой [10]. В координатах "logit-log" строят для калибровочных проб график зависимости B/B0100% от концентрации 28 норбрассинолида в калибровочных пробах (нмоль/л). По калибровочному графику определяют содержание брассиностероида в исследуемых образцах. Другой задачей изобретения является состав для осуществления заявляемого способа (количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов). Аналогом заявляемому составу является состав для определения 24R-метилбрассиностероидов [6,7]. Система содержала антитела к 24-эпикастастерону, в качестве меченого антигена выступал конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена, а стоп реагентом служил 4,8%-ный раствор серной кислоты. Данный способ является высокочувствительным и высокоспецифичным в отношении 24R-метил-ряда. Однако он не позволяет делать различие между 7-окса-6-оксо-, 6-оксо- и 6-дезоксобрассиностероидами. Заявляемая тест-система включает: антитела к 28-норбрассинолиду, иммобилизованные на полимерном носителе; конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена; буферный раствор для разведения конъюгата; промывочный буферный раствор; хромоген-субстратную смесь - раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в субстратном буфере с перекисью водорода; стоп-реагент - 5%-ный раствор H2SO4. Возможность осуществления количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов с помощью заявляемого состава по описанному выше способу подтверждается примерами конкретного исполнения. Пример 2. Стадия 1. Получение конъюгата 28-норбрассинолид-БСА Растворяют 30 мг (55,7 ммоль) (22R,23R)2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-B-гомо-7-окса-5-холестан-6-она в 6 мл абс. диоксана,добавляют 8 мг сухого N-оксисукцинимида (69,6 ммоль) и прикапывают при t = 8-10C 13 мг (63,1 ммоль) дициклогексил карбодиимида в 4 мл абс. диоксана. Перемешивают 0,5 ч при t = 10C и 6 ч при комнатной температуре. Контролируют ход реакции методом ТСХ в системе этилацетат:метанол=9:1 (Rt(1)=0,05; Rf - (конъюгат)=0,67). Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают и раствор диоксана добавляют к раствору БСА в 0,1 М NaHCO3, pH=8,35, содержащему 60 мг белка в 10 мл буфера. Выдерживают 20 ч при комнатной температуре, и избыток активированного эфира и диоксан удаляют диализом против 0,005 М раствора NaCl. Полученный конъюгат (1-БСА) лиофилизуют и хранят в замороженном виде при -18C. Стадия 2. Получение конъюгата 28-норбрассинолид-пероксидаза хрена Растворяют 30 мг (55,7 ммоль) (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-B-гомо-7-окса-5-холестан-6-она в 6 мл абс. диоксана, добавляют 8 мг сухого N-оксисукцинимида (69,6 ммоль) и прикапывают при t = 8-10C 13 мг (63,1 ммоль) дициклогексил карбодиимида в 4 мл абс. диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5C и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4, упаривают. Образовавшийся эфир используют без дополнительной очитки. К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл дист. воды в присутствии 2-3 капель 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия (pH 8,35) добавляют раствор 2 мг (0,003 ммоль) N-сукцинимидного эфира, перемешивают 30 мин при 10C и при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент - дист. вода. Собирают окрашенную фракцию (желто-коричневая), затем разбавляют глицерином (1:2) и хранят в морозильнике (при -18C). Стадия 3. Получение антисыворотки к 28-норбрассинолиду. Группу из шести кроликов иммунизируют конъюгатом 28-норбрассинолид-БСА с плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного раствора поваренной соли (pH 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляли 4 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении 28-норбрассинолида и определяли их титры и значения констант ассоциации (Ka). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5 - 0,2 OE.-2 015274 Таблица 1. Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом 28-норбрассинолида с БСА Таким образом, определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,что ее разбавление в 1000000 (A1) или 1200000 (A2) раз позволяет обеспечить хорошие условия определения 28-норбрассинолида. Аналитические характеристики заявляемого состава для количественного иммунохимического определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов. 1. Специфичность. Перекрестная реакция антител, полученных к 28-нобрассинолиду, с другими брассиностероидами и стероидами различных классов приведена на схеме 1 (в скобках - связывание по отношению к 28-норбрассинолиду, %) Из схемы 1 видно, что заявляемый состав позволяет определять 7 окса-6-оксобрассиностероиды (5-11) с высокой степенью специфичности. 2. Коэффициент вариации результатов 10 определений брассиностероидов в одном и том же образце с использованием заявляемого способа и состава для его осуществления не превышает 10%. 3. Тест на "линейность". Зависимость концентрации 7-окса-6-оксобрассиностероидов в исследуемых образцах: при разведении их раствором, не содержащем 28-норбрассинолида, имеет линейный характер. 4. Тест на "открытие". При постановке теста процент открытия составил 100-150%. 5. Чувствительность. Состав позволяет обнаружить 7-окса-6-оксо-брассиностероиды в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 7 пкг в 50 мкл образца. Схема 1. Кросс-реактивность антисыворотки A2 с различными стероидами-3 015274 Важным является тот факт, что брассиностероиды широко распространены в природе, они свойственны всем или абсолютному большинству растительных видов - содержание в растении менее 10-5% [8,9]. Брассиностероиды регулируют рост и развитие растений. Обработка растений брассиностероидами на соответствующей стадии развития приводит к увеличению урожая и, в ряде случаев, к улучшению его качества. Замечательно, что эффект достигается при обработке растений в концентрации 5-20 мг на гектар посевов, что намного меньше, чем в случае традиционно применяемых средств повышения урожайности растений. На основе одного из брассиностероидов - 28-эпибрассинолида создан препарат ЭПИН,применяемый как регулятор роста и средство повышения урожайности сельскохозяйственных культур[11]. Ведется разработка препаратов на основе других БС. Все это требует разработки эффективных и высокочувствительных методов определения брассиностероидов. Применение заявляемого способа и состава для его осуществления позволит осуществлять иммуноферментное определение самых активных и перспективных с практической и научной точки зрения брассиностероидов 7-окса-6-оксобрассиностероидов в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 7 пкг в 50 мкл образца. Литература 1. Takatsuto S. Brassinosteroids - distribution in plants, bioassays and microanalysis by gaschromatography mass-spectrometry// J. Chromatogr. A. - 1994. -Vol. 658,1.-P. 3-15. 2. Croizier A., Moritz T. Physico-chemical methods of plant hormone analysis // Ed. Bernardi G. Newregulator. // Can. J. Biochem. Cell Biol.- 1984. -Vol. 62. - P. 715-721 (прототип). 6. Заявка на патент РБа 20050844 от 20.08.2005 г. Способ количественного определения 24Rметилбрассиностероидов (24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида) и состав для ею осуществления // Хрипач В.А., Свиридов О.В, Литвиновская Р.П., Прядко А.Г., Драч С.В., Михайлопуло К.И., Матвеенцев В.Д Жабинский В.Н., Завадская М.И., Новик Т.В Оф.Бюл. изобрет. НЦИС, 2007. N2. С. 12. 7. В.А. Хрипач, О.В. Свиридов, А.Г. Прядко, Р.П. Литвиновская, С.В. Драч, В.Д. Матвеенцев, Т.В. Новик, К.И. Михайлопуло, В.Н. Жабинский, М.И. Завадская, М.А. Аверькова, О.А. Драченова, Н.М. Чащина. Иммуноферментный анализ (24R)-брассиностероидов // Биоорг. Химия. - 2007 - Т.33, 3. - С.371378. 8. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Навука i тэхнiка, 1993. 288 с. 9. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., de Groot Ae. Brassinosteroids - A New Class of Plant Hormones. SanDiego: Acad. Press. 1999, 456 p. 10. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. 11. Средства защиты и регуляторы роста растений. Справочник, Минск, 1995, с.75. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов формулы 1 где R = H (28-норбрассинолид),24R-метил (24-эпибрассинолид),24S-метил (брассинолид),24S-этил (28-гомобрассинолид),путем иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что анализируемый образец смешивают с конъюгатом 28-норбрассинолид-пероксидаза хрена в полимерной лунке с иммобилизованными поликлональными антителами к 28-норбрассинолид, инкубируют, разделяют свободную и связанную антителами форму брассиностероидов, добавляют к связанной форме хромоген-субстратную смесь для определения активности пероксидазы, по которой рассчитывают количество определяемого 7-окса-6-оксобрассиностероида.-4 015274 2. Состав для количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов, включающий антитела к 28-норбрассинолиду, иммобилизованные на полимерной лунке; конъюгат 28-норбрассинолидпероксидаза хрена; буферный раствор для разведения конъюгата; промывочный буферный раствор; хромоген-субстратную смесь - раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в субстратном буфере с перекисью водорода; стоп-реагент - 5%-ный раствор H2SO4.