Рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, способы идентификации тканезащитных соединений и их применение

009745 Настоящая заявка претендует на преимущество приоритета по совместной патентной заявке США 10/676694, поданной 30 сентября 2003 года, в которой заявлено преимущество приоритета согласно разделу 35 статье 119 (е) Кодекса Законов США по предварительной патентной заявке США 60/465891, поданной 25 апреля 2003 года, полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание в виде ссылок во всей их полноте. 1. Введение. Настоящее изобретение относится к способам целенаправленного выявления рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов, имеющих по меньшей мере один общий(с)-рецептор (известный также как CD 131) и по меньшей мере один эритропоэтиновый рецептор (ЕРО), для скрининга/выявления лекарственных средств, и способам лечения или профилактики. В частности, настоящее изобретение связано со способами идентификации и скрининга соединений, которые модулируют взаимодействие рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Способы согласно изобретению включают в себя также способы лечения или профилактики заболевания или расстройства с помощью соединений, которые модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, таких как соединения, которые идентифицированы методами скрининга согласно изобретению. Настоящее изобретение включает в себя также способы усиления функции возбудимой (чувствительной к раздражению) ткани с помощью соединений, которые модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, таких как соединения, которые идентифицированы методами скрининга согласно изобретению. 2. Основы создания изобретения. Существует целый ряд данных, свидетельствующих о том, что эритропоэтин, являясь членом суперсемейства цитокинов, выполняет важные физиологические функции, которые опосредованы взаимодействием с эритропоэтиновым рецептором (EPO-R). К таким функциям эритропоэтина относятся продуцирование красных клеток крови, митогенез, модуляция притока кальция в клетки гладкой мускулатуры и нервные клетки, а также эффекты промежуточного метаболизма.EPO-R представляет собой белок в 68 кДа и является частью семейства цитокиновых рецепторов 1 го типа. Указанное семейство включает в себя рецепторы интерлейкина (IL) - IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,IL-7, IL-9, IL-11, колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), тромбопоэтина, гормона роста и пролактина. Указанные рецепторы сгруппированы вместе по причине гомологии их внеклеточных доменов. Консервативный внеклеточный домен указанных рецепторов составляет в длину приблизительно 200 аминокислот, которые содержат четыре консервативных по положению цистеиновых остатка в их аминоконцевой области (Cys 294, Cys 283, Cys 248, Cys 238) и мотив Trp-Ser-X-Trp-Ser, расположенный проксимально по отношению к трансмембранному домену. Считается, что четыре цистеина являются критическими для поддержания структурной целостности этих рецепторов (Murray, 1996, Harpers Biochemistry 24th ed. pp. 524-526, AppilionLange, Ltd.; Caravella et al., 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24: 394-401). Считается, что, подобно многим рецепторам внутри семейства цитокиновых рецепторов 1-го типа,EPO-R активируется при взаимодействии с его эндогенным ЕРО-лигандом. Первый в димере EPO-R имеет высокую аффинность связывания с ЕРО, тогда как второй EPO-R имеет низкую аффинность связывания с этим комплексом. Такая димеризация EPO-R обусловливает тесную ассоциацию ассоциированных с EPO-R тирозинкиназ Jak2, вызывающую их трансфосфорилирование. Указанная активация приводит к фосфорилированию тирозина нескольких белков, которые в результате этого активируют несколько различных путей, таких как путь фосфатидилинозит(PI)киназы-3, путь Ras/MAP-киназы иSTAT-путь. Указанные пути осуществляют запуск физиологических функций, опосредованных эритропоэтином (Kirito et al., 2002, Blood 99: 102-110; Livnah et al., 1999, Science 283: 987-990; Naranda et al.,2002, Endocrinology 143: 2293-2302; Remy et al., 1999, Science 283: 990-993; and Yoshimura et al., 1996, TheOncol. 1: 337-339). Помимо образующихся мультимеров в состав рецепторных комплексов многих из членов семейства цитокиновых рецепторов 1-го типа входят от одного до трех различных компонентов рецепторов передачи сигнала - gp130, общий бета (c)-рецептор или гамма-субъединица рецептора IL-2 (c-рецептор). Например, рецепторный комплекс для GM-CSF состоит из рецептора GM-CSF, двух c-рецепторов и GMCSF-лиганд. Известно, что EPO-R образует комплекс с c-рецептором (см. Yutaka et al., 1995, Bioch. Biophys. Res. Com. 208: 1060-1066; Jubinsky et al., 1997, Blood 90: 1867-1873; D'Andrea et al., 1998, J. Clin,Invest. 102 : 1951-1960). Однако как было опубликовано, такие комплексы не способны были вызывать какие бы то ни было значительные физиологически эффекты (Scott et al., 2000, Blood, 96: 1588-1590). 3. Краткое содержание. Настоящее изобретение связано с целенаправленным выявлением "рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов" (которые были определены выше) для скрининга/выявления лекарственных средств и со способами достижения защиты или восстановления тканей in vivo, например для лечения или профилактики различных заболеваний, расстройств или состояний или для улучшения функции воз-1 009745 будимой ткани у человека или других млекопитающих. Настоящее изобретение отчасти основано на том открытии авторов изобретения, что комплексы c-рецептора/рецептора ЕРО участвуют в защите возбудимых тканей. Описанные здесь эксперименты показывают, что ЕРО оказывает защитный эффект, а именно снижает апоптоз, в клетках дикого типа, которые экспрессируют как рецепторы ЕРО, так и cрецепторы; однако рецепторы ЕРО не оказывали влияния на клетки, лишенные c-рецепторов. При исследованиях на животных ишемическое повреждение спинного мозга вызывали у мышей дикого типа (у которых экспрессируются оба рецептора) и у нокаут-мышей с выключенным c-рецептором (у которых не экспрессируется c-рецептор). Введение карбамилированного ЕРО (который не является эритропоэтическим и не связывается с димерами ЕРО-рецептора) приводило к улучшению процесса восстановления у мышей дикого типа. Однако ни ЕРО, ни карбамилированный ЕРО не оказывали влияния на процесс восстановления у нокаут-мышей с выключенным c-рецептором. Эти результаты свидетельствуют о том,что c-рецептор играет существенную роль в достижении тканезащитного эффекта. В одном из воплощений настоящее изобретение направлено на применение рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов, включающих в себя рецептор ЕРО и c-рецептор, в бесклеточных скрининг-анализах с целью идентификации соединений, которые связываются с рецепторными комплексами тканезащитных цитокинов. В других воплощениях настоящее изобретение направлено на применение рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов, включающих в себя рецептор ЕРО и c-рецептор, в клеточном скрининг-анализе с целью идентификации соединений, которые модулируют, т.е. усиливают или ингибируют, активность рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов или проявляют тканезащитную активность. В других воплощениях настоящее изобретение направлено на применение рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов, включающих в себя рецептор ЕРО и c-рецептор, в скрининг-анализе на животных с целью идентификации соединений, которые проявляют тканезащитную активность, в зависимости от рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов. В другом конкретном воплощении соединения, идентифицированные методами скрининга согласно изобретению, модулируют взаимодействие рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и его лигандов и проявляют тканезащитную активность. В других воплощениях настоящее изобретение направлено на способы лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, включающие в себя введение соединения,которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В другом воплощении изобретение связано со способами усиления функции возбудимых клеток, тканей или органов путем введения соединения, которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях методов скрининга согласно изобретению тест-соединение приводят в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов в присутствии и/или в отсутствие лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, таких, например, как ЕРО, но им не ограничиваясь. Такие анализы могут быть использованы для идентификации соединений, которые модулируют взаимодействие лиганда с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Бесклеточный анализ может быть использован для идентификации соединений, которыесвязываются с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. При таких воплощениях рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов или мембранные препараты таких комплексов приводят в контакт с тест-соединением и измеряют показатель связывания. Такой анализ может представлять собой анализ прямого связывания, когда соединение приводят в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В конкурентном анализе связывания два соединения (например, тест-соединение и лиганд,или же два тест-соединения) приводят в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов для определения того, которое из соединений имеет большую аффинность связывания. Анализ может представлять собой также и анализ вытеснительного связывания, когда первое соединение, когда оно приведено в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, связывается с этим комплексом, и к ним добавляют второе соединение, чтобы определить, способно ли второе соединение вытеснить связанное первое соединение. В анализе связывания [величину] связывания можно оценить путем введения метки в добавляемые соединения и/или путем введения метки в рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Анализ на основе клеток (клеточный анализ) может быть использован для идентификации соединений, которые нацелены на рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов в присутствии и/или в отсутствие лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. При таких воплощениях клетка,которая экспрессирует рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, приводится в контакт с тестсоединением. Для определения того, модулирует ли тест-соединение активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в клетке, производят считывание либо путем наблюдения, либо путем измерения параметров считывания. Считывание может представлять собой простое измерение связывания тест-соединения с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях осуществляют мечение тестсоединения и связывание тест-соединения с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов измеряют путем детектирования метки, соединившейся с указанным тест-соединением. В других воплощени-2 009745 ях считывание представляет собой фенотипическое изменение, такое как изменение размера клетки, ее формы, или же апоптотические изменения клетки. В других воплощениях считывание представляет собой экспрессию репортерного гена или изменение нагрузки клеток индикаторной краской или ее включения в культуральную среду. При указанных воплощениях клетки, которые используют в таком анализе являются генетически измененными клетками, с тем, чтобы эти клетки при активации рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов экспрессировали продукт репортерного гена. В других воплощениях, считывание определяется ферментативной реакцией клетки. При таких воплощениях анализируемые клетки после контактирования с тест-соединением лизируются. Затем клеточные лизаты изучают на предмет обнаружения индикаторов активации рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Например, клеточные лизаты могут быть приведены в контакт с антителом, которое связывает указанный комплекс, причем это антитело можно также прикрепить к подложке, чтобы укрепить заякоривание этого комплекса. Затем к полученному можно добавить также и другие антитела, с тем, чтобы выяснить,активирован ли этот рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Например, антифосфотирозиновые антитела могут связываться с фосфорилированными частями этого комплекса и/или с низлежащими компонентами общего рецепторного комплекса ЕРО/. В определенных аспектах могут быть использованы антитела, которые могут связываться с фосфорилированными частями общей -рецепторной части комплекса и/или антитела, которые могут связываться с фосфорилированными частями рецептора ЕРО. В определенных воплощениях клетки, экспрессирующие рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов, контактировали с антителами, которые могли связываться с фосфорилированными частями общего -рецептора и/или рецептора ЕРО. В определенных воплощениях выделенные рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов контактировали с антителами, которые могут связываться с фосфорилированными частями общего -рецептора и/или рецептора ЕРО. В определенных воплощениях антитела,которые могут связываться с фосфорилированными частями рецептора ЕРО, представляют собой PYJAK2-антитела. Поскольку низлежащие мишени активации цитокинов идентифицированы для рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов, считыванием путем скрининга согласно изобретению может быть детектирование фосфорилирования низлежащих клеточных компонентов. Наличие низлежащих клеточных продуктов может быть использовано для идентификации соединений, которые нацелены на рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Например, после контактирования соединения с клеткой, экспрессирующей рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов,такая клетка может быть изучена на предмет наличия других клеточных продуктов, таких как нуклеолин или нейроглобин, которые являются показателями активации рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях способов скрининга согласно изобретению клетку подвергают рекомбинантному реконструированию, с тем, чтобы она экспрессировала по меньшей мере один ЕРОрецептор или общий -рецептор. В определенных воплощениях клетку генетически модифицируют, с тем, чтобы она в повышенных количествах экспрессировала нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид общего -рецептора или полипептид рецептора ЕРО. В определенных воплощениях клетку генетически модифицируют, с тем, чтобы она в повышенных количествах экспрессировала нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид общего -рецептора и нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ЕРО-рецептора. Повышенная экспрессия может быть достигнута в результате оперативного связывания нуклеиновых кислот с промотором, генноинженерные модификации могут быть получены с помощью стандартных технологий трансформации,нацеленной гомологической рекомбинации для получения генетической активации эндогенных генов с активированным геном. В определенных воплощениях нуклеотидную последовательность получают из тех же видов, что и клетку. В определенных воплощениях клетка эндогенно экспрессирует общий рецептор и/или ЕРО-рецептор. В одном из воплощений настоящего изобретения представлен способ идентификации соединения,которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в клетках с выключенным общим -рецептором, включающий в себя введение соединения в первую клетку, непосредственно вслед за этим подвергаемую действию вредного агента, где первая клетка эндогенно экспрессирует рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, и введение соединения во вторую клетку, непосредственно вслед за этим подвергаемую действию того же самого вредного агента, что и первая клетка,причем вторая клетка является клеткой того же типа, что и первая клетка, однако является дефицитной в отношении экспрессии рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов (т.е. отсутствует экспрессия общего -рецептора), так, что если выживаемость первой клетки отличается от таковой второй клетки,следовательно, указанное соединение является таким соединением, которое направлено на рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. В одном из воплощений настоящего изобретения клетки получены из нокаут-животных с выключенным общим -рецептором. Можно провести исследования на животных моделях с целью идентификации соединений, которые направлены на рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. В одном из воплощений настоящего-3 009745 изобретения обеспечен способ идентификации соединения, которое модулирует тканезащитную активность у животного, включающий в себя введение соединения первому животному непосредственно после нанесения повреждения, при этом первое животное эндогенно экспрессирует рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, и введение соединения второму животному непосредственно после нанесения такого же типа повреждения, какое было нанесено первому животному, причем второе животное является дефицитным в отношении экспрессии рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, так,что если у первого животного восстановление после повреждения отличается от такового у второго животного, следовательно, соединение, которое модулирует тканезащитную активность, идентифицировано. Клетки, экспрессирующие рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, который может быть использован в способах скрининга согласно изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, клетки млекопитающих, клетки насекомых, эукариотические клетки, прокариотические клетки, клетки грибов или клетки бактерий. В определенных воплощениях используют клетки человека, такие, например,как пре-В-клетки, клетки 293, клетки 293 Т, клетки HeLa, клетки HepG2, клетки K562 или клетки 3 Т 3, не ограничиваясь, однако, перечисленным. В других воплощениях настоящего изобретения используют мышиные клетки, такие, например, как клетки BaF3, не ограничиваясь, однако, перечисленным. В других воплощениях используют клетки грибов, такие, например, как клетки из рода Saccharomyces,Schizosaccharomyces, Pichia и Hansenula. Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечен способ лечения или профилактики заболевания или нарушения у человека, где указанный способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества соединения, которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов человеку, в случае необходимости такого лечения или профилактики. В определенных воплощениях указанное заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, или поражение возбудимой ткани. В одном из воплощений настоящего изобретения обеспечен способ усиления функции возбудимых клеток, тканей или органов у человека, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества соединения, которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, человеку, в случае необходимости такого лечения или профилактики, где указанное усиление функции возбудимых клеток, тканей или органов приводит к усилению ассоциативного обучения или памяти. В другом воплощении изобретения обеспечен способ модуляции активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов у человека, включающий в себя введение соединения, которое модулирует активность указанного комплекса человеку, в случае необходимости такого лечения или профилактики. Еще в одном воплощении изобретения обеспечен способ лечения или профилактики заболевания или нарушения у человека, включающий в себя модулирование рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов у человека. Еще в одном воплощении изобретения обеспечен способ усиления функции возбудимых клеток,тканей или органов у человека, включающий в себя модулирование рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов у человека. В воплощениях настоящего изобретения, связанных с лечением или профилактикой заболевания или нарушения, усилением функции возбудимых клеток, тканей или органов или модуляцией активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, вводимое соединение может быть идентифицировано способом с использованием любого из описанных выше способов скрининга для идентификации соединений, которые обладают тканезащитным эффектом или модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях соединение представляет собой антитело,специфическое в отношении рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях соединение представляет собой антитело, специфическое в отношении лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях соединение представляет собой малую молекулу, пептид или член библиотеки. В связанных воплощениях соединение связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях соединение усиливает активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях соединение мешает проявлению активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях соединение вводят в сочетании с ЕРО. В определенных воплощениях вводимое соединение представляет собой ЕРО. В определенных воплощениях вводимым соединением не является ЕРО. В определенных воплощениях вводимым соединением не является модифицированный ЕРО или мутант ЕРО. Примеры соединений модифицированных ЕРО и мутантных ЕРО включают в себя, не ограничиваясь ими, те соединения, которые описаны в разделе 5.4.1.1. В определенных воплощениях настоящего изобретения, в которых вводимое соединение представляет собой ЕРО, модифицированный ЕРО или производное ЕРО,вводимое соединение не связывается с рецептором ЕРО. В связанных воплощениях настоящего изобретения, в которых вводимое соединение представляет собой ЕРО, модифицированный ЕРО или производное ЕРО, вводимое соединение не связывается с димером рецептора ЕРО. В определенных воплощениях способов согласно изобретению, предназначенных для лечения, профилактики, усиления функции воз-4 009745 будимой ткани и модуляции рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, вводимым соединением не является ЕРО, т.е. какой бы то ни было ЕРО, будь то модифицированный ЕРО, мутантный ЕРО или его производное. В определенных воплощениях способов согласно изобретению, предназначенных для лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, усиления функции возбудимой ткани или модуляции рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, вводимое соединение не связывается с рецептором ЕРО. В определенных других воплощениях способов согласно изобретению, предназначенных для лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, усиления функции возбудимой ткани или модуляции рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, вводимое соединение не связывается с димером, состоящим из двух рецепторов ЕРО. В определенных других воплощениях способов согласно изобретению, предназначенных для лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, усиления функции возбудимой ткани или модуляции рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, вводимое соединение связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В воплощениях согласно изобретению, предназначенных для лечения или профилактики заболевания или нарушения, заболевание или нарушение представляет собой нарушение настроения, состояние тревожности, депрессию, аутизм, состояние гиперактивности с дефицитом внимания, болезнь Альцгеймера, старение или когнитивную дисфункцию. В связанных воплощениях заболевание или нарушение вызвано гипоксией, припадочными заболеваниями, нейродегенеративными заболеваниями, отравлением нейротоксином, множественным склерозом, гипотонией, остановкой сердца, радиацией или гипогликемией. В связанных воплощениях заболевание или нарушение представляет собой ишемию или инсульт. В связанных воплощениях, заболевание или нарушение представляет собой нейродегенеративное состояние. В связанных воплощениях нейродегенеративное состояние представляет собой инсульт, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, церебральный паралич, травму ствола головного или спинного мозга,деменцию при СПИДе, связанную с возрастом потерю когнитивной функции, потерю памяти, амиотрофический боковой склероз, припадочные заболевания, алкоголизм, ишемию сетчатки, старение, глаукому или потерю нервных клеток. В других связанных воплощениях заболевание или нарушение представляет собой нервно-мышечное или мышечное состояние. В определенных воплощениях нервномышечное или мышечное состояние относится к сердечной ткани. В определенных воплощениях способы согласно изобретению, предназначенные для лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, усиления функции возбудимой ткани или модуляции рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, заболевание, нарушение, состояние или возбудимые клетки, ткани или органы не являются церебральными. В определенных воплощениях способы согласно изобретению, предназначенные для лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, усиления функции возбудимой ткани или модуляции рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, заболевание, нарушение, состояние или возбудимые клетки, ткани или органы не являются таковыми центральной нервной системы, включая в себя, но не ограничиваясь ими, почечные ткани, ткани сердца, эндотелиальные ткани, ткани сетчатки, сосудистые ткани, легочные ткани, ткани поджелудочной железы, мозговые ткани, кожные ткани,эмбриональные ткани, зародышевые ткани, ткани почки, ткани поперечно-полосатых мышц, печеночные ткани, желудочно-кишечные ткани, ткани репродуктивного тракта или эндокринные ткани. В воплощениях согласно изобретению, предназначенных для усиления функции возбудимых клеток, тканей или органов, возбудимая ткань представляет собой ткань центральной нервной системы или ткань периферической нервной системы. В определенных воплощениях ткань периферической нервной системы представляет собой ткань плаценты, ткань сетчатки или сердечную ткань. В воплощениях согласно изобретению, предназначенных для лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, усиления функции возбудимых клеток, тканей или органов, или модуляции активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, введение является оральным, местным, внутричерепным, интралюминальным, введением путем ингаляции, назальным, парентеральным,внутривенным, периферическим, внутриартериальным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, введением под слизистую оболочку или внутрикожным введением. В связанных аспектах введение производится перед лечебной или хирургической процедурой. В определенных воплощениях хирургическая процедура представляет собой резекцию опухоли, исправление аневризмы или процедуру шунтирования коронарной артерии. В определенных воплощениях согласно изобретению лечебная процедура связана со схватками или родами. 3.1 Терминология. В настоящем описании термин "тканезащитная активность" относится к эффекту ингибирования или задержки повреждения или гибели клетки, ткани или органа. Тканезащитная активность может быть направлена против различных состояний, заболеваний, а также против клеточного, органного и/или тканевого повреждения, например, таких, которые описаны в разделе 5.5. Тканезащитная активность может быть специфична в отношении возбудимой ткани, клеток и/или органов, имеющих рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, таких, например, как ткани центральной нервной системы, однако не ограничиваясь ими. Термин "рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, используемый в настоящем описании,-5 009745 означает комплекс, содержащий по меньшей мере один эритропоэтиновый рецептор и по меньшей мере один общий бета-рецептор. Рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов может содержать множество эритропоэтиновых рецепторов и/или общие бета-рецепторы, а также другие типы рецепторов, как описано здесь в разделе 5.1.3. Термин "лиганд рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов" означает любое соединение,которое связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и активирует этот комплекс или ингибирует активацию известным активирующим лигандом. "Лиганд рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов" может быть соединением любого типа, таким, например, как протеины, пептиды, малые молекулы, органические молекулы или неорганические молекулы, не ограничиваясь, однако перечисленным. Неограничивающие примеры лигандов рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов включают в себя ЕРО, включая его мутанты, химические модификации или фрагменты, связывающие рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Другим примером лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов является антитело, специфичное в отношении указанного комплекса. Термин "профилактика заболевания, нарушения или состояния" означает отложенное начало, торможение прогрессирования, торможение возникновения, защита от неожиданного возникновения, ингибирование или исключение неожиданного возникновения или снижение частоты такого заболевания,нарушения или состояния. Использование термина "профилактика" не означает то, чтобы подразумевалось, что все пациенты среди популяции пациентов, которым проводят профилактическую терапию, никогда не будут подвержены развитию заболевания, нарушения или состояния, на которое направлена профилактика, а скорее означает, что среди такой популяции пациентов будет иметь место снижение случаев возникновения такого заболевания, нарушения или состояния. Например, многие противогриппозные вакцины не обеспечивают 100%-ую эффективность в предотвращении гриппа среди популяции,которой вводят такую вакцину. Профилактика также включает в себя защиту возбудимых тканей. Специалист в данной области может с легкостью идентифицировать тех пациентов и те ситуации, когда профилактическая терапия окажется благотворной, и к этим случаям относятся, без ограничения, пациенты, которым планируется провести оперативное вмешательство, пациенты, у которых имеется риск наследственных заболеваний, нарушений или состояний, пациенты с риском заболеваний, нарушений или состояний, обусловленных факторами окружающей среды, или те части популяции, у которых существует риск развития конкретных заболеваний, нарушений или состояний, такие как пожилые люди, дети, или же представители популяции, у которых ослаблена иммунная система, или же пациенты с генетическим или же другим фактором риска в отношении заболевания, нарушения или состояния. Термин "введение в сочетании с" в контексте способов согласно изобретению означает введение соединения до, во время и/или после начала заболевания, нарушения или состояния. 4. Краткое описание фигур. На фиг. 1 представлены результаты конкурентного анализа между ЕРО и карбамилированным ЕРО,которые свидетельствуют о том, что карбамилированный ЕРО не связывается с рецептором ЕРО (EPOR). На фиг. 2 показано присутствие c-рецептора внутри мембран головного мозга крысы. На фиг. 2 показана ткань спинного мозга крысы, окрашенная на предмет выявления рецептора. На фиг. 4 с увеличением показана ткань спинного мозга крысы, окрашенная на предмет выявления. На фиг. 5 показана совместная преципитация EPO-R и c-рецептора. На фиг. 6 показана потенциальная конфигурация рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. На фиг. 7 показан апоптоз в кардиомиоцитах, выделенных из нормальных мышей и нокаут-мышей с выключенным с-рецептором в присутствии и в отсутствие ЕРО. На фиг. 8 приведены фотографии Вестерн-блоттинга клеточных белков, разделенных в полиакриламидных гелях с помощью антител фосфотирин(PY)-Jak2. На верхней фотографии геля показано, что фосфорилированный Jak2 присутствовал в клетках, стимулированных ЕРО в концентрациях 5 и 50 нМ. На нижней фотографии геля показан контроль, предпринятый, когда мембраны были разделены и вновь подвергнуты анализу с помощью антитела против Jak2 для подтверждения одинаковой загрузки геля. На фиг. 9 приведен график (кривая) аффинности связывания лиганда BaF3-клетками, экспрессирующими ЕРО-рецептор. Концентрация лиганда в нМ (ось X) нанесена против связывания (cpm) (ось Y) экспрессирующими ЕРО-рецептор клетками BaF3, которые были приведены в контакт с лигандами ЕРО-рецептора, с ЕРО и с карбамилированным ЕРО. На фиг. 10 приведен график аффинности связывания лиганда мембранами клеток UT-7, имеющими ЕРО-рецептор. Концентрация лиганда в нМ (ось X) нанесена против связывания (cpm) (ось Y) экспрессирующими ЕРО-рецептор мембранами клеток UT-7, которые были приведены в контакт с лигандами ЕРО-рецептора, с ЕРО и с карбамилированным ЕРО. На фиг. 11 показаны гистограммы гематокрита (11 А), измеряемого в виде объемных процентов ге-6 009745 матокрита, и уровни гемоглобина (11 В), измеренные в виде его концентрации в мМ (ось Y), у мышей после введения им носителя (контроль), ЕРО, карбамилированного ЕРО и асиало-ЕРО (ось X). На фиг. 12 приведена фотография ДСН-ПААГ-геля с обведенным в кружок белком нуклеолином в 103 кДа. На фиг. 13 приведен график зависимости двигательной активности по шкале ВВВ (ось Y) от времени, измеряемого в днях, после повреждения спинного мозга (ось X) : пяти группам мышей, две из которых составляют мыши дикого типа, а три остальные - нокаут-мыши с выключенным c, вводили либоPBS, либо ЕРО, либо карбамилированный ЕРО непосредственно вслед за повреждением спинного мозга. В группе мышей дикого типа, которым вводили карбамилированный ЕРО, животные проявляли повышенную двигательную активность на всем протяжении 42-дневного послеоперационного периода наблюдения по сравнению со всеми остальными группами. На фиг. 14 представлена гистограмма клинической тяжести состояния, измеряемой в виде площади под кривой (area under curve, (AUC (ось Y) в пяти группах мышей (ось X), описанных выше на фиг. 13. Группа мышей дикого типа, которым вводили карбамилированный ЕРО (столбик 1), проявляли значительное увеличение значений клинической тяжести (т.е. менее тяжелое состояние) по сравнению со всеми остальными группами (столбики 2-5) . 5. Подробное описание изобретения. Настоящее изобретение направлено на способы применения гетеромультимерного рецепторного комплекса, которым опосредованы защищающие ткани активности тканезащитных соединений. В изобретении предложены способы скрининга для идентификации таких тканезащитных соединений и применение таких соединений в лечении или профилактике заболеваний, нарушений или состояний, или применение таких соединений в способах усиления функции возбудимых клеток, тканей и органов. В изобретении предложены также способы лечения или профилактики заболеваний, нарушений или состояний путем введения соединений, которые модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, таких как соединения, идентифицируемые скрининг-методами согласно изобретению, но не ограничиваясь этими соединениями. В изобретении предложены также способы усиления функции возбудимых клеток, тканей или органов путем введения соединений, которые модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, таких как - без ограничения соединения,идентифицируемые скрининг-методами согласно изобретению. В изобретении предложены также способы модуляции активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов путем введения соединения, которое модулирует или направлено на рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Настоящее изобретение основано на открытии авторами изобретения того, что ЕРО-рецептор образует комплекс с c-рецептором внутри возбудимых клеток и тканей, таких как головной мозг, спинной мозг и сердце. Указанный комплекс состоит по меньшей мере из одного EPO-R в комплексе по меньшей мере с одним c-рецептором. Вдобавок к c-рецептору могут быть использованы и другие рецепторы сигнальной трансдукции, включая, но не ограничиваясь ими, c-рецептор и GP130, сегменты и части других цитокиновых рецепторов первого типа (тип-1), включая, но не ограничиваясь ими, GM-CSF, IL-3, IL5 и т.д., и одиночные (сиротские) рецепторы, включая, но не ограничиваясь ими, ROR1, NR6, НМ 74 и т.д. В скрининг-методах согласно изобретению можно использовать такие рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов в анализах по идентификации соединений, которые модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Такие анализы включают в себя анализы связывания с целью идентификации соединений, которые связываются с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или его лигандом. Открытие факторов изобретения обеспечивает пути для идентификации исключительно эффективных соединений для использования при лечении и профилактике заболеваний,нарушений и состояний, а также для усиления возбудимых клеток, тканей и органов. Активация рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов может приводить к увеличению продукции защитных белков, включая, но не ограничиваясь ими, нуклеолин и глобины, такие как нейроглобины и цитоглобин (гистоглобин). В определенных воплощениях описанных здесь способов согласно изобретению при изучении тканезащитной активности стадия изучения идентифицируемого соединения на предмет его тканезащитной активности включает в себя определение наличия нуклеолина в клетке. В определенных воплощениях описанных здесь способов согласно изобретению при изучении тканезащитной активности стадия изучения идентифицируемого соединения на предмет его тканезащитной активности включает в себя измерение повышенного уровня активности нейроглобина или цитоглобина в клетке. Соответственно, в методах скрининга с целью идентификации соединений, обладающих тканезащитной активностью, можно воспользоваться определением таких белков, уровень которых повышен. Указанный рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов и низлежащие регуляторы могут быть использованы в анализах по идентификации тканезащитных соединений, включая, но не ограничиваясь ими, малые молекулы и биологические препараты. Соединения, идентифицируемые с помощью указанных анализов, могут быть использованы для лечения различных состояний центральной и периферической нервной систем, также как и состояний возбудимых клеток, тканей и органов.-7 009745 5.1 Рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Рецепторный комплекс для применения в способах согласно изобретению включает в себя по меньшей мере один ЕРО-рецептор и по меньшей мере один c-рецептор. Различные типы встречающихся в природе модифицированных и/или мутантных ЕРО-рецепторов и c-рецепторов могут быть объединены с образованием таких комплексов, содержащих различное число рецепторов. Ниже описаны неограничивающие примеры рецепторных комплексов тканезащитных цитокинов. 5.1.1 EPO-R. В настоящем изобретении может быть использован EPO-R млекопитающих. кДНК EPO-R выделена из мышиной печени, Tojo et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm. 148: 443-48, и из печени плода человека (Jones et al., 1990, Blood 76: 31-35; Winkelmann et al., 1990, Blood 76: 24-30). Такая человеческая кДНК кодирует полипептидную цепь с молекулярной массой приблизительно в 55 кДа и содержащую приблизительно 508 аминокислот. Другие геномные клоны человеческого EPO-R, которые были выделены и секвенированы, также входят в объем настоящего изобретения (Penny and Forget, 1991, Genomics 11: 974-80; Noguchi et al., 1991, Blood 78: 2548-2556). Общую структуру таких EPO-R составляют приблизительно 24 аминокислотных остатка в сигнальном пептиде, приблизительно 226 аминокислотных остатков во внеклеточном домене, приблизительно 23 аминокислотных остатка в мембраносвязанном домене и приблизительно 235 аминокислотных остатков в цитоплазматическом домене (D'Andrea andZon, 1990, J. Clin. Invest., 86: 681-687; Jones et al., 1990, Blood, 76: 31-35; Penny and Forget, 1991,Genomics, 11:974-80). Зрелый человеческий белок EPO-R содержит приблизительно 484 аминокислотных остатка. EPO-R является коммерчески доступным из BD Biosciences Clonetech (Palo Alto, CA) и имеет в банке генов номер доступа M60459, а в SwissProt -номер доступа Р 19235. Формы EPO-R, применимые при реализации настоящего изобретения, охватывают встречающиеся в природе, синтетические и рекомбинантные формы родственных EPO-R молекул человека и других млекопитающих. Кроме того, формы EPO-R, используемые на практике при реализации настоящего изобретения, включают в себя белки, которые представляют собой функционально эквивалентные продукты генов. Такие функционально эквивалентные продукты генов включают в себя мутантный EPO-R и химически модифицированный EPO-R. Мутантный EPO-R может содержать делеции, включая внутренние делеции, добавления, включая добавления, приводящие к образованию слитых белков, или консервативные замены аминокислотных остатков внутри аминокислотной последовательности и/или аминокислотных остатков, примыкающих к аминокислотной последовательности, но при этом таких, которые приводят к образованию "молчащего" изменения, при котором измененные продукты функционально эквивалентны EPO-R. Такие аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства в полярности,заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или алифатической природе включенных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные(основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают в себя аспарагиновую и глутаминовую кислоты. Другие известные мутации EPO-R, такие как мутации, описанные в патенте США 5292654, также включены в объем настоящего изобретения. Кроме того, растворимые (укороченные) формы ЕРО-рецептора, содержащие только внеклеточный домен, также входят в объем настоящего изобретения, такие, например, как описанные у Harris et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 15205; YangJones, 1993, Blood 82: 1713 и в публикации патентной заявки США 20020031806. 5.1 c-Рецептор.c-рецептор обычно идентифицируют как передающую сигнал субъединицу рецептора, ассоциированную с человеческим GM-CSF, IL-3 и IL-5. Помимо указанных цитокинов, этот рецептор (например,под швейцарским идентификационным номером Р 32927 или под идентификационным номером М 59941 в банке генов), как было показано, в определенных случаях связывается с EPO-R. Консервативная область c-рецептора составляет полностью или частично внеклеточную лигандсвязывающую область. Настоящее изобретение частично основано на том, что, как показали авторы изобретения, EPO-R и cрецептор сосуществуют внутри некоторых возбудимых клеток, таких как клетки головного мозга (см. фиг. 2) и спинного мозга (см. фиг. 3 и 4). Авторы изобретения обнаружили также, что комплексы EPO-R и c-рецептора играют роль в механизме, который приводит к физиологическому процессу защиты и восстановления тканей, которые экспрессируют такие комплексы (см. фиг. 13 и 14). Формы c-рецептора, применимые на практике настоящего изобретения, охватывают природно образующиеся, синтетические и рекомбинантные формы молекул, родственных c-рецептору человека и других млекопитающих. Кроме того, формы c-рецептора, применимые на практике настоящего изобретения, включают в себя белки, которые представляют собой функционально эквивалентные продукты генов. Такие функционально эквивалентные продукты генов включают в себя мутантный c-рецептор и химически модифицированный c-рецептор. Мутантные c-рецепторы могут содержать делеции, вклю-8 009745 чая внутренние делеции, добавления, включая добавления, в результате которых образуются слитые белки, или консервативные замены аминокислотных остатков внутри аминокислотной последовательности и/или среди примыкающих к аминокислотной последовательности, но такие, в результате которых образуется "молчащее" изменение, приводящие к образованию функционально эквивалентного c-рецептора. Мутировавшие c-рецепторы включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, точковые мутации 1374N, FIA, AGA, H544R, V449, A459D, L445Q, CRD4 (I374N, L356P, W358N, Q375P, Y376N,W383R и L399P) и укорочение внеклеточного фрагмента (1GH7). (См. R. J. D'Andrea and Т. J. Gonda,2000, Experimental Hematology 28: 231-243; D'Andrea et al., 1998, J. Clin. Invest. 102: 1951-1960; Jenkins etal., 1999, J. Biol. Chem. 274: 8669-8677). Подразумевается также, что в настоящем изобретении могут быть использованы также и субъединицы других известных сигнальных рецепторов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, cрецептор и GP-130-рецептор, а также одиночные (сиротские) рецепторы. 5.1.3 Структура гетеромультимерного рецепторного комплекса.c-рецептор образует мультимер со множеством рецепторов, которые, как было известно ранее,способны с ним связываться, а именно GM-CSF, IL-3 и IL-5. Например, рецепторный комплекс для GMCSF состоит из рецептора GM-CSF, двух c-рецепторов и GM-CSF-лиганда. Рецептор EPO-R, как уже было известно, образует комплекс с c-рецептором. (См. Yutaka et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Com. 208: 1060-1066; Jubinsky et al., 1997, Blood, 90: 1867-1873; D'Andrea et al., 1998, J. Clin, Invest. 102: 19511960). Сходным образом, согласно настоящему изобретению, c-рецептор образует гетеромультимерный комплекс с EPO-R, с образованием тканезащитного рецепторного комплекса. Такие данные основаны на исследованиях иммунопреципитации, показавших, что c-рецептор и ЕРО-рецептор образуют копреципитаты (см. фиг. 5). Указанный тканезащитный рецепторный комплекс включает в себя по меньшей мере один EPO-R и по меньшей мере один c-рецептор. Предпочтительно, чтобы, как изображено на фиг. 6, тканезащитный рецепторный комплекс включал в себя более чем один c-рецептор. В настоящем изобретении подразумевается также, что конфигурации тканезащитного рецепторного комплекса включают в себя более чем один EPO-R. Примеры тканезащитных рецепторных комплексов, как подразумевается в настоящем изобретении, включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, ЕРО-R2/c-рецептор 2, ЕРО-R/cрецептор 2 и ЕРО-R/c-рецептор 3. Предполагается, что наилучшей конфигурацией тканезащитного рецепторного комплекса является EPO-R/c-рецептор 2, как изображено на фиг. 6. Как там показано - если не ограничивать при этом себя какой-либо конкретной теорией возможный механизм, посредством которого тканезащитное соединение связывается с тканезащитным рецепторным комплексом, включает в себя сначала связывание тканезащитного соединения с EPO-R, а затем связывание двух c-рецепторов с этим комплексом. Такое изображение является не более чем иллюстрацией одного из способов, посредством которых лиганд может связываться с тканезащитным рецепторным комплексом, и любой рядовой специалист в данной области вполне может усмотреть иные механизмы, посредством которых может происходить связывание -рецепторный комплекс (EPO-R и два c-рецептора) может сформироваться до связывания лиганда и т.д. Рецепторные полипептиды согласно изобретению, включая полноразмерные рецепторы, рецепторные фрагменты (например, лиганд-связывающие фрагменты) и слитые полипептиды, могут быть получены в соответствии со стандартными технологиями генетической инженерии хозяйских клеток. Например, идентифицированы эритропоэтин-связывающие фрагменты ЕРО-рецептора (Barone et al., J. Biol.Chem. 272: 4985-4992). Такие фрагменты, которые образуют также комплекс и с c-рецептором, используются в скрининг-методах согласно изобретению. 5.2 Скрининг-анализы. Рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов, такие как те, которые были описаны выше, однако ими не ограничиваясь, могут быть использованы в скрининг-анализах для идентификации соединений, обладающих тканезащитной активностью. Соединения, идентифицируемые при проведении таких анализов, могут модулировать активность комплекса, например, связываться с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или модулировать взаимодействие между лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и самим комплексом. Кроме того, идентифицируемые соединения могут сами по себе обладать тканезащитной активностью. Настоящее изобретение можно, в частности, использовать для скрининга соединений, используя комплекс ЕРО-рецептор-c-рецептор в любой из многочисленных технологий скрининга лекарственных средств. Используемый в таком тесте рецепторный комплекс может быть либо в свободном виде в растворе, либо в связанном с твердой подложкой виде, либо в виде комплекса, образуемого на поверхности клетки или локализованного внутриклеточно. В одном из способов скрининга лекарственных средств используются эукариотические клетки, которые стабильно трансформированы рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, экспрессируя полипептид или фрагмент. Лекарственные средства подвергают скринингу против таких трансформированных клеток, проводя конкурентные анализы связывания. Такие клетки, будь то жизнеспособные клетки или клетки в фиксированной форме, могут быть использованы в-9 009745 стандартных анализах связывания. Можно измерить, например, уровень образования комплексов между рецепторами и подвергаемым тестированию агентом или изучать снижение образования комплексов между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и соответствующей хорошо изученной и известной в данной области линией клеток. См., например, далее примеры в разделах 6 и 7. Описанные выше в разделе 5.1 рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов могут сходным образом быть использованы в анализах по определению биологической активности, будучи включенными в панель многочисленных рецепторов для широкомасштабного скрининга, в качестве реагента (включая меченый реагент) в способах анализа, предназначенных для количественного определения уровней тканезащитного соединения в биологических жидкостях, в качестве маркеров для тканей, в которых преимущественно экспрессируется соответствующее тканезащитное соединение (либо конститутивно, либо на конкретной стадии дифференцировки или развития ткани, или же на стадии заболевания), а также,конечно же, для выделения коррелятивных лигандов. Способы проведения анализов, указанных выше, хорошо известны специалистам в данной области. Ссылки, в которых описаны указанные способы, без ограничения перечисленными, включают в себя следующие: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, и "Methods in Enzymology: Guide to Molecular CloningTechniques", Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987. В определенных воплощениях описанные здесь анализы согласно изобретению могут быть использованы для идентификации соединения, которое взаимодействует с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Такие анализы могут проводиться в отсутствие лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Взаимодействием может быть, например, связывание тест-соединения с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В таких воплощениях тест-соединение приводят в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Идентифицируемым соединением может быть одно из тех соединений, которые продуцируют показатели для считывания, такие, например, как, без ограничения, активация рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, транскрипция репортерного гена, клеточная пролиферация или тканезащитная активность. Такие анализы обычно предпринимаются в присутствии контроля, в котором соединение не приводят в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В тех случаях, когда обнаруживается различие в считываемых показателях в присутствии и в отсутствие соединения, идентифицируют соединение, которое взаимодействует с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Альтернативно, стандартные уровни считываемых показателей, таких как, без ограничения, активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, могут быть измерены до контактирования рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с тест-соединением, и различие в показателях, считываемых до и после добавления соединения, может быть использовано для идентификации соединений. В определенных иных воплощениях анализы согласно изобретению могут быть использованы для идентификации соединений, которые модулируют, т.е. усиливают или гасят, взаимодействие между лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Такие анализы могут быть проведены в присутствии лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, такого как ЕРО или антитело, специфичное в отношении рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В таких воплощениях может быть зарегистрировано различие в уровне считываемых показателей в присутствии и в отсутствие тест-соединения. Затем уровень показателей считывания может быть сопоставлен с таковым в отсутствие ЕРО. Когда различие в уровнях показателей считывания, зарегистрированных в присутствии и в отсутствие тест-соединения, зависит от присутствия ЕРО, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует взаимодействие рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с его лигандом. Например, когда различие в уровнях считываемых показателей связано с повышением считываемых показателей в присутствии соединения, причем указанное увеличение зависит от присутствия ЕРО, идентифицируют агонист взаимодействия между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и его лигандом. Альтернативно, когда различие в уровнях считываемых показателей связано со снижением считываемых показателей в присутствии соединения, причем указанное снижение зависит от присутствия ЕРО,идентифицируют антагонист взаимодействия между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и его лигандом. Ситуация меняется на обратную в тех воплощениях, когда считывание связано с отрицательным считыванием. Например, считывание может происходить, когда соединение не оказывает воздействия на рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, и не происходить, когда соединение с таким эффектом включено в анализ, и в этом случае отрицательное считывание будет показателем того,что идентифицировано соединение с требуемым эффектом. Для проведения любого из указанных анализов или же для всех анализов, в которых используется рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, можно создать систему реагентов или же наборы в целях коммерциализации для научных исследований и/или в качестве клинических продуктов. 5.2.1 Бесклеточные анализы. Описанные здесь рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов могут быть использованы в- 10009745 бесклеточных анализах в целях идентификации соединений, обладающих тканезащитной активностью. В определенных воплощениях бесклеточных анализов рецепторные комплексы тканезащитных цитокинов могут быть использованы в виде свободных комплексов в растворе или прикрепленных к твердой подложке. Активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов можно измерить различными способами. Например, активностью может являться способность соединения связываться с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или аффинность связывания рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и соединения. В определенных воплощениях, рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов добавляется при анализе связывания в виде изолированных мембран, содержащих рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. В одном из воплощений в настоящем изобретении предлагается способ идентификации соединения,которое модулирует тканезащитную активность, включающую в себя контактирование тест-соединения с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, путем измерения уровня активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, идентификации тест-соединения, которое увеличивает или уменьшает уровень активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов по сравнению с уровнем активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, измеренным в отсутствие тестсоединения, и изучения идентифицированного тест-соединения на предмет тканезащитной активности. В прямом анализе связывания либо лиганд и/или рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов приводят в контакт с тест-соединением в условиях, которые позволяют тест-соединению связываться с лигандом или рецептором. Связывание может происходить в растворе или на твердой поверхности. Предпочтительно, чтобы тест-соединение было предварительно мечено с целью его детектирования. Для мечения может быть использовано любое детектируемое соединение, такое как, без ограничения, люминесцентный, флуоресцентный или радиоактивный изотоп или группа, его содержащая, или же неизотопная метка, такая как фермент или краситель. После периода инкубации, достаточного для того, чтобы произошло связывание, реакционную смесь выдерживают при определенных условиях, производя соответствующие манипуляции по удалению избытка специфически не связанного тест-соединения. Обычно это подразумевает промывание соответствующим буфером. В конце концов, обнаруживают присутствие лиганда, связанного с тест-соединением (например, ЕРО-тест-соединение), или рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, связанного с тест-соединением. В конкурентном анализе связывания тест-соединения изучают на предмет их способности нарушать или усиливать связывание лиганда (например, ЕРО) с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Меченый лиганд (например, ЕРО или карбамилированный ЕРО) может быть смешан с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или его фрагментом и помещен в условия, при которых взаимодействие между ними обычно происходит в присутствии или в отсутствие добавки в виде тестсоединения. Количество меченого лиганда (например, ЕРО), который связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, можно сравнить с его количеством, связанным в присутствии или в отсутствие тест-соединения. В предпочтительном воплощении, для облегчения комплексообразования и детектирования, анализ связывания проводят с одним или более компонентами, иммобилизованными на твердой поверхности. В различных воплощениях, твердой подложкой может служить, без ограничения, поликарбонат, полистирол, полипропилен, полиэтилен, стекло, нитроцеллюлоза, декстран, нейлон, полиакриламид и агароза. Поддерживающая конфигурация может включать в себя шарики, мембраны, микрочастицы, внутреннюю поверхность реакционного сосуда, такого как микротитровальный планшет, пробирку для анализа или какой-нибудь другой реакционный сосуд. Иммобилизация рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов или другого компонента может быть произведена путем ковалентного или нековалентного прикрепления. В одном из воплощений, прикрепление может быть непрямым, т.е. опосредованным прикрепленным антителом. В другом воплощении, рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов и отрицательные контроли метят эпитопом, таким как глутатион-S-трансфераза (GST), так, чтобы прикрепление к твердой подложке могло быть опосредовано коммерчески доступным антителом, таким как анти-GST(Santa Cruz Biotechnology). Например, такой анализ связывания может быть предпринят с помощью рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, который иммобилизован на твердой подложке. Обычно для детектирования метят не иммобилизованный компонент реакции связывания, в данном случае либо лиганд (например,ЕРО или карбамилированный ЕРО), либо тест-соединение. Доступны и могут быть использованы различные способы мечения, такие как люминесцентный, флуоресцентный или радиоизотопный, или группа, их содержащая, или же неизотопные метки, такие как ферменты или красители. В предпочтительном воплощении тест-соединение метят флуорофором, таким как флуоресцеин-изотиоцианат (FITC, доступный на фирме Sigma Chemicals, St. Louis). Затем меченые тест-соединения или лиганд (например, ЕРО или карбамилированный ЕРО) плюс тест-соединение приводят в контакт с твердой подложкой в условиях, которые способствуют специфическому связыванию. После того как произойдет реакция связывания, несвязанные и неспецифически связанные тест-соединения отделяют путем промывания поверхности. Прикрепление партнеров связывания к твердой фазе может быть произведено различными известными специалистам в данной области спосо- 11009745 бами, которые включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, химическое поперечное связывание(такому как биотин), и лигандсвязывающим белком (таким как авидин или стрептавидин), прикрепленным к твердой фазе, и т.д. Предпочтительно, чтобы рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов был введен в реакцию связывания в виде интактных клеток, которые экспрессируют рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов (см. испытания, описанные в разделах 5.2.2), или выделенных мембран, содержащих рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Таким образом, непосредственное связывание с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или способность тест-соединения модулировать лигандрецепторный комплекс тканезащитных цитокинов (например, ЕРО-рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов) можно анализировать в интактных клетках в культуре или на модельных животных в присутствии и в отсутствие. Меченый лиганд (например, ЕРО или карбамилированный ЕРО) можно смешать с грубыми экстрактами, полученными из таких клеток, и можно добавить тест-соединение. Выделенные мембраны могут быть использованы для идентификации соединений, которые взаимодействуют с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Например, обычно в эксперименте, в котором используются выделенные мембраны, клетки могут быть модифицированы генно-инженерными способами, с тем, чтобы они экспрессировали рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Мембраны могут быть собраны с помощью стандартных технологий и использованы в анализе связывания in vitro. Меченый лиганд (например, 125I-меченый ЕРО) связывают с мембранами и анализируют на предмет специфической активности; специфическое связывание определяют путем сравнения с результатами анализа связывания, предпринятого в присутствии избытка немеченого (холодного) лиганда. Растворимый лиганд тканезащитных цитокинов может также быть рекомбинантно экспрессирован и использован в бесклеточных анализах для идентификации соединений, которые связываются с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Альтернативно, лигандсвязывающий домен рекомбинантно экспрессируемого рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов или фрагмента рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов может быть использован в бесклеточных скрининганализах. В других альтернативных воплощениях пептиды, соответствующие одному или более связывающим доменам рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, или слитые белки, содержащие один или более связывающих доменов тканезащитных цитокинов, могут быть использованы в бесклеточных системах анализа для идентификации соединений, которые связываются с цитоплазматической частью рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов; такие соединения могут быть использованы для модуляции пути передачи сигнала рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В бесклеточных системах анализа рекомбинантно экспрессируемый рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов прикреплен к твердому субстрату, такому как пробирка, микротитрационный планшет или колонка,способами, хорошо известными в данной области (см. Ausubel et al., 1998, Current Protocols in MolecularBiology, John WileySons, NY). Затем тест-соединения изучают на предмет их способности связываться рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Альтернативно, реакция связывания может быть произведена в растворе. При таких исследованиях меченый компонент вводят во взаимодействие с его партнером (партнерами) связывания в растворе. Если различие в размерах между меченым компонентом и его партнером (партнерами) связывания позволяет произвести такое разделение, то разделение может быть произведено путем пропускания продуктов реакции связывания через ультрафильтр, поры которого пропускают несвязанный меченый компонент,но не пропускают его партнера (партнеров) связывания или же меченый компонент, связанный с его партнером (партнерами) связывания. Разделение может быть достигнуто также с помощью любого реагента, способного захватывать партнера связывания меченого компонента из раствора, такого, например,как антитело против партнера связывания, лигандсвязывающий белок, который может взаимодействовать с лигандом, предварительно прикрепленным к партнеру связывания, и т.д. В одном из воплощений, например, можно подвергнуть скринингу библиотеку фагов, пропуская фаг из библиотеки непрерывного фагового дисплея через колонку, содержащую очищенный рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов или его фрагмент или домен, связанный с твердой фазой, такой как пластиковые шарики. Изменяя жесткость буфера для промывки, можно добиться повышения содержания фага, который экспрессирует пептиды с высокой аффинностью в отношении рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Фаг, выделенный с колонки, может быть подвергнут клонированию, и можно напрямую измерить показатели аффинности коротких пептидов. Последовательности более чем одного олигонуклеотида могут быть скомбинированы с целью испытания на предмет выявления еще большей аффинности связывания с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или же с комплексом, образованным рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов с его лигандом. Зная, какая аминокислотная последовательность придает свойство наиболее прочного связывания с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, можно использовать компьютерные модели для идентификации молекулярных контактов между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и тестсоединением.- 12009745 Это позволит создавать небелковые соединения, которые смогут имитировать указанные контакты. Такое соединение может иметь такую же активность, что и пептид, и может быть использовано в терапевтических целях, имея при этом то преимущество, что оно будет более эффективным, и производство его будет менее дорогостоящим. В другом специфическом воплощении указанного аспекта настоящего изобретения, твердая подложка представляет собой мембраны, содержащие рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов,прикрепленный к микротитровальной чашке. Тест-соединения, например клетки, которые экспрессируют члены библиотеки, культивируют в условиях, способствующих экспрессии членов библиотеки в микротитровальной чашке. Члены библиотеки, которые связываются с белком (или нуклеиновой кислотой или производным), собирают. Такие методы описаны, например, у Parmley and Smith, 1988, Gene 73: 305-318;Fowlkes et all., 1992, BioTechniques 13: 422-427; в публикации РСТ No. WO94/18318 и в цитируемых выше публикациях. Наконец, остаточная метка на поверхности твердой фазы может быть определена способом, известным в данной области. Например, если тест-соединение мечено флуорофором, для обнаружения комплексов можно использовать флуориметр. Различные анализы in vitro можно использовать для идентификации и выверения способности соединения связываться с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, для модуляции взаимодействия рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, или для модуляции активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В другом воплощении настоящего изобретения, взаимодействия между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или лигандом (например, ЕРО или карбамилированный ЕРО) и тестсоединением могут быть изучены in vitro. Известные или неизвестные молекулы изучают на предмет выявления их специфического связывания с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов в условиях, способствующих связыванию, и затем молекулы, которые специфически связываются с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, идентифицируют. Оба этих компонента могут быть измерены различными путями. Одним из подходов является мечение одного из этих компонентов легко детектируемой меткой,помещением его, вместе с тест-соединением (тест-соединениями), в условия, которые способствуют связыванию, проведение стадии разделения, при которой меченый компонент отделяют от не связавшегося меченого компонента, а затем определяют количество связанного компонента. В одном из воплощений,рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов можно пометить и добавить к тестируемому агенту, в условиях, способствующих связыванию. Связывание тестируемого агента может быть определено с помощью полиакриламидного геля для сравнения комплексообразования в присутствии и в отсутствие тестируемого агента. Многочисленные анализы in vitro могут быть предприняты, одновременно или последовательно,для установления эффекта, оказываемого соединением на процессы, опосредованные рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Установление таких эффектов может быть предпринято путем измерения активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, например связывания тестсоединения с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, клеточной пролиферации, клеточной дифференцировки и повышения регуляции защитного белка, например глобина. В предпочтительном воплощении, описанные здесь анализы in vitro производят в широкомасшатабном формате (например, в микротитровальных планшетах). 5.2.2 Анализы на основе клеток. Рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов может быть экспрессирован в культивируемых клетках, а затем клетки могут быть использованы для скрининга лигандов для рецепторного комплекса,включая природный лиганд, а также агонисты и антагонисты природного лиганда. Вкратце, подход на основе клеточного анализа сводится к тому, что кДНК или ген, кодирующий рецептор, комбинируют с другими генетическими элементами, необходимыми для их экспрессии (например, транскрипционный промотор), и полученный в результате экспрессирующий вектор встраивают в хозяйскую клетку. Вектор, кодирующий ЕРО-рецептор или общий -рецептор, может быть синтезирован или использован для трансформации или трансфекции хозяйской клетки представляющим интерес вектором для применения в способах согласно изобретению. Использование стабильных трансформантов является предпочтительным. Клетки, которые экспрессируют ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и используют в одной или нескольких из возможных систем скрининга, как будет описано далее. Пример способа, основанного на клеточном анализе идентификации соединения, которое модулирует взаимодействие рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с его лигандом, включает в себя следующие стадии: (а) приведение тест-соединения в контакт с лигандом и с клеткой, экспрессирующей рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов; и (b) измерение уровня активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в клетке, при этом если уровень активности, измеренный в (b), отличается от уровня активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в отсутствие тестсоединения, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует взаимодействие рецепторного ком- 13009745 плекса тканезащитных цитокинов с его лигандом. Другой пример способа идентификации соединения, которое модулирует тканезащитную активность, включает в себя приведение тест-соединения в контакт с клеткой, которая сконструирована с помощью рекомбинантных технологий генной инженерии таким образом, чтобы в ней экспрессировался рецептор ЕРО или общий (-рецептор, при этом указанная клетка трансформирована нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая (i) оперативно связана с промотором и(ii) кодирует полипептид общего -рецептора или ЕРО-рецептора, измерение уровня активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в клетке, идентификацию тест-соединения, которое способствует увеличению или уменьшению активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в клетке, по сравнению с уровнем активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, измеренным в контрольной клетке, где контрольная клетка представляет собой клетку такого же типа, что и клетка, контактировавшая с тест-соединением, и эта клетка не трансформирована нуклеиновой кислотой,содержащей нуклеотидную последовательность, которая (i) оперативно связана с промотором и (ii) кодирует полипептид общего -рецептора или ЕРО-рецептора, и изучение идентифицированного тестсоединения на предмет наличия у него тканезащитной активности. Альтернативно, анализы на основе клеток могут быть использованы для идентификации соединений, которые взаимодействуют с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Например, тестсоединение может быть приведено в контакт с клеткой, экспрессирующей рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, и затем могут быть определены активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, определяемая путем измерения аффинности связывания, клеточной пролиферации или наличия транскрипта репортерного гена. Если активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов отличается, например она повышена или понижена по сравнению с активностью рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в отсутствие тест-соединения, тогда идентифицируют соединение,которое взаимодействует с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях способов согласно изобретению, описанных выше, при измерении активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов ее определяют по клеточной пролиферации или клеточной дифференцировке. В определенных воплощениях способов согласно изобретению, описанных выше, при измерении активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов ее определяют по способности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов взаимодействовать с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Скрининг-анализы на основе клеток используют для детектирования как агониста, так и антагониста лигандов. Агонисты (включая природный лиганд) и антагонисты имеют огромный потенциал в отношении их применения как in vitro, так и in vivo. Соединения, идентифицируемые как агонисты рецептора, используются для стимуляции пролиферации и развития клеток-мишеней in vitro и in vivo. Например, соединения-агонисты используются в качестве компонентов для определенных сред для культивирования клеток и могут быть использованы как отдельно, так и в сочетании с другими цитокинами и гормонами в качестве заменителя сыворотки, которая повсеместно используется при культивировании клеток. Агонисты могут быть использованы при специфической промоции роста и/или развития ЕРОзависимых клеток (включая, но не ограничиваясь ими, нервные клетки, сердечные клетки и клетки, полученные из сетчатки глаза) в культуре. Антагонисты используются в качестве реагентов для исследований при определении свойств сайтов лиганд-рецепторного взаимодействия. In vivo агонисты или антагонисты рецептора могут найти применение при лечении нервных заболеваний, сердечных заболеваний и/или заболеваний сетчатки глаза. Целый ряд сходных анализов известен в данной области. Эти анализы могут быть основаны на детектировании биологического ответа в клетках-мишенях. В одном из воплощений, связывание лиганда (например, ЕРО или карбамилированного ЕРО) с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов может быть изучено в интактных клетках на животных моделях. Меченый лиганд (например, ЕРО или карбамилированный ЕРО) может непосредственно быть введен в организм животного, отдельно или в сочетании с тест-соединением. Последствия эффекта связывания лиганда (например, ЕРО или ЕРО) с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов,наприме, защита ткани или клеточная пролиферация, могут быть измерены в присутствии или в отсутствие тест-соединения. Для проведения этих анализов хозяйские клетки, к которым добавляют тестсоединение, могут быть генетически модифицированы с помощью генно-инженерных технологий, с тем,чтобы в них экспрессировался рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов и/или лиганд (например, ЕРО или карбамилированный ЕРО), который может быть либо транзитным, либо индуцированным,либо конститутивным, либо стабильным. Для целей реализации методов скрининга согласно изобретению можно использовать большое разнообразие хозяйских клеток, включая, но этим не ограничиваясь,клетки тканевых культур, клетки млекопитающих и дрожжевые клетки. Клетки млекопитающих, такие как клетки мозга или же другие клетки, которые экспрессируют рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, могут быть предпочтительным типом клеток, в которых производят анализы согласно изо- 14009745 бретению. 5.2.2.1 Клетки. В предпочтительном воплощении клетками, используемыми в способах согласно изобретению, являются клетки млекопитающего. В более предпочтительном воплощении клетками клеткой-хозяином является клетка человека. В другом воплощении хозяйскими клетками являются прежде всего клетки,выделенные из ткани или другого представляющего интерес биологического образца. Специалисту в данной области должно быть понятно, что в способах согласно изобретению для скрининга или идентификации соединений могут быть использованы различные типы клеток. Используемые типы клеток могут эндогенно экспрессировать рецептор ЕРО, общий -рецептор, совместно рецептор ЕРО и общий, или же не экспрессировать ни ЕРО-рецептор, ни -рецептор. В предпочтительном воплощении хозяйские клетки получают из возбудимой ткани. В предпочтительном воплощении хозяйскую клетку получают из возбудимой нервной ткани. В качестве неограничивающих примеров чувствительными или возбудимыми клетками могут быть клетки или ткани нейронов, сетчатки, мышц, сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового слоя надпочечников, эндотелия капилляров, яичек, яичника, поджелудочной железы, мозга, кожи или эндометрия. Кроме того, неограничивающие примеры чувствительных или возбудимых клеток включают в себя клетки фоторецептора (палочки и колбочки), ганглия, биполярные клетки, горизонтальные клетки, amacrine, клетки Мюллера, клетки Пуркинье, клетки миокарда, искусственного водителя ритма, клетки синусно-атриального узла, клетки синусного узла, соединительной ткани, атриовентрикулярного узла, клетки пучка Гиса, гепатоциты, звездчатые клетки, купферовы клетки,мезангиальные клетки, клетки почечного эпителия, интерстициальные клетки канальцев, бокаловидные клетки, железистые клетки кишечника (крипты), кишечные эндокринные клетки, клетки клубочной зоны надпочечников, клетки пучков, кетикулярные клетки, хромаффинные клетки, перициты, клетки Лейдига,клетки Сертоли, сперматозоиды, клетки граафова пузырька, клетки первичного фолликула, клетки островков Лангерганса, -клетки, -клетки, -клетки, F-клетки, клетки-предшественники костной ткани,остеокласты, остеобласты, клетки стромы эндометрия, клетки эндометрия, стволовые и эндотелиальные клетки. Клетки млекопитающих, пригодные для применения с целью экспрессирования рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и трансдукции опосредованного рецептором сигнала, включают в себя клетки, которые экспрессируют по меньшей мере одну из субъединиц рецептора, которые участвуют в образовании функционального тканезащитного рецепторного комплекса. Указанные субъединицы могут включать в себя субъединицы класса I цитокиновых рецепторов. В определенных воплощениях настоящего изобретения предпочтительно использование клетки, полученной из того же вида, которому принадлежит и экспрессируемый рецептор. В рамках предпочтительного воплощения пролиферация клетки зависит от экзогенно прикладываемого гемопоэтического фактора роста. В определенных предпочтительных воплощениях линиями клеток такого типа являются человеческая линия клеток TF-1 (АТСС-номер CRL-2003) и линия клеток AML-193 (АТСС-номер CRL-9589),которые представляют собой GM-CSF-зависимые линии лейкемических клеток человека. В альтернативном воплощении подходящие хозяйские клетки могут быть созданы с помощью методов генной инженерии, с тем, чтобы они продуцировали необходимую субъединицу рецептора или же иной клеточный компонент, который необходим для требуемого ответа клеток. Например, мышиная клеточная линияBaF3 (Palacios and Steinmetz, 1985, Cell 41: 727-734; Mathey-Prevot et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 41334135) или линия клеток почки новорожденного хомяка (ВНК) могут быть трансфицированы, с тем, чтобы они экспрессировали нужный EPO-R и c-рецептор. Последний подход предпочтительнее, поскольку линии клеток можно модифицировать с помощью генно-инженерных технологий таким образом, чтобы они экспрессировали рецепторные субъединицы из любых видов, и, таким образом, снимаются потенциальные ограничения, связанные с видоспецифичностью. В альтернативном варианте, ортологичные виды кДНК рецептора человека могут быть клонированы и использованы среди клеточных линий, полученных из того же самого вида, такие как кДНК линии клеток BaF3. Линии клеток, которые зависят от гематопоэтического фактора роста, такого как GM-CSF, могут, таким образом, быть изменены с помощью генноинженерных технологий так, чтобы они стали зависимыми от лиганда тканезащитного рецепторного комплекса. Сходным образом специалисту в данной области должно быть ясно, что описанный выше анализ может быть предпринят и на других клеточных линиях, которые могут быть трансформированы подобным же образом. Кроме того, анализ клеточной пролиферации может быть предпринят на клетках, которые, как известно, несут на своей поверхности как ЕРО-рецептор, так и c-рецептор. Было бы предпочтительнее, если бы такие клетки включали в себя линии нервных клеток, включая, но не ограничиваясь ими, клетки Р-19, РС-12 и астроциты или другие линии клеток, о которых известно, что они являются ЕРО-зависимыми, включая, но не ограничиваясь ими, клетки сетчатки глаза и сердечные клетки. Присутствие в этих клеточных линиях обоих рецепторов, ЕРО- и c-рецепторов, может быть подтверждено с помощью методов иммунопреципитации, хорошо известных специалистам в данной области.- 15009745 Другие клетки-хозяева, которые могут быть использованы для рекомбинантного продуцирования рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов или могут быть использованы в методах скрининга согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, гибридомы, пре-Вклетки, клетки 293, клетки 293 Т, клетки HeLa, клетки HepG2, клетки K562, 3 Т 3-клетки. В предпочтительном воплощении хозяйские клетки представляют собой иммортализованные клеточные линии, полученные, например, из источника ткани. Другие хозяйские клетки, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими, клетки дрожжевые, клетки, инфицированные вирусом клетки, бактериальные клетки, клетки насекомых или клетки растений. Предпочтительные хозяйские клетки млекопитающих включают в себя, не ограничиваясь ими,клетки, полученные у человека, обезьян и грызунов (см., например, Kriegler M. In "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual", New York, FreemanCo. 1990), такие как клеточная линия обезьяньей почки, трансформированная вирусом SV40 (COS-7, с номером доступа в АТСС - CRL 1651); линии клеток эмбриональной почки человека (293, 293-EBNA или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., 1977, J Gen. Virol., 36: 59; клетки почки новорожденного хомяка(ВНК, с номером доступа в АТСС -CCL 10); клетки яичника китайского хомячка-DHFR (СНО, Urlauband Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci.77; 4216); мышиные клетки Сертоли (Mather, 1980, Biol. Reprod. 23: 243-251); мышиные фибробласты (NIH-3T3), клетки почек обезьяны (с номером доступа в CVI АТССCCL 70); клетки почек африканской зеленой обезьяны (VERO-76, с номером доступа в АТССCRL1587); клетки цервикальной карциномы человека (HELA, с номером доступа в АТССCCL 2); клетки почек собаки (MDCK, с номером доступа в АТССCCL34); клетки печени буйволиной крысы (BRL ЗА, с номером доступа в АТССCRL 1442); клетки легкого человека (W138, с номером доступа в АТССCCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); и клетки опухоли молочной железы мыши(ММТ 060562, с номером доступа в АТССCCL51). Подходящие для культивирования клетки млекопитающих включают в себя линии клеток COS-1 (АТССCRL 1650), ВНК (АТССCRL 1632) и ВНК 570 (АТССCRL10314), 293 (АТССCRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72,1977). Дополнительные подходящие линии клеток известны в данной области и являются доступными в публичных депозитариях, таких как Американская Коллекция Типовых Культур, Manassas, Va. Другая используемая система эукариотический хозяин-вектор может включать в себя систему клеток дрожжей и насекомых. У дрожжей ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, можно использовать в клетках Saccharoynyces cerevisiae (пекарные дрожжи), Schizosacclaaromyces pombe (делящиеся дрожжи), Pichia pastoris и Hansenula polymorpha (метилотропные дрожжи). В качестве обзорных публикаций см. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel etand The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Stratheni et al., Cold Spring Harbor Press,Vols. I and II. Грибные клетки, включая клетки дрожжей, и в особенности клетки рода Saccharomyces, также могут быть использованы в данном изобретении, например, для продуцирования рецепторных полипептидов, рецепторных фрагментов, полипептидных слияний или комплексов, а также для анализов на основе клеток для идентификации соединений, которые модулируют активность тканезащитных цитокинов. Способы трансформации дрожжевых клеток экзогенными ДНК и продуцирования этими клетками рекомбинантных полипептидов описаны, например, Kawasaki, патент США 4599311; Kawasaki et al.,патент США 4931373; Brake, патент США 4870008; Welch et al., патент США 5037743; и Murrayet al., патент США 484 5075. Трансформированные клетки отбирали по фенотипу, определяемому селективным маркером, обычно по лекарственной резистентности или по способности расти в отсутствие конкретного питательного элемента (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в дрожжевых клетках является векторная система POT1, описанная Kawasaki et al. (патент США 4931373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по их росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжевых клетках включают в себя промоторы и терминаторы из генов ферментов гликолиза (см., например, Kawasaki, патент СШАNo. 4,599,311; Kingsman et al., патент США No. 4,615,974; и Bitter, патент США Patent No. 4,977,092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США 4 99044 6, 5063154, 5139936 и 4661454. Трансформирующие системы для других дрожжей, включая Hanseraula polymorpha, Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago rnaydis, Pichia pastoris, Pichiamethanolica,Pichia guillermondii и Candida maltosa также доступны для применения в настоящем изобретении (см.,например, Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, и Cregg, патент США 4882279). Клетки Aspergillus могут быть использованы в соответствии со способами McKnight et al., патент США 4 93534 9. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны Sumino et al., патент США 5162228. Способы трансформации Neurospora описаны Lambowitz, патент США 4486533. Могут быть использованы стандартные способы введения представляющей интерес последователь- 16009745 ности нуклеиновых кислот в клетки-хозяева. Трансформация может быть осуществлена любым известным способом введения полинуклеотидов в хозяйскую клетку, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус и трансдукцию хозяйской клетки этим вирусом, а также прямое поглощение полинуклеотида. Используемая процедура трансформации зависит от хозяина, который подлежит трансформированию. Трансформации клеток млекопитающих (т.е. трансфекции) путем прямого поглощения могут быть произведены с использованием метода кальций-фосфатного осаждения, описанного GrahamVander Eb, 1978, Virol. 52: 546, или известных различных модификаций этого метода. Другие способы введения рекомбинантных полинуклеотидов в клетки, в частности в клетки млекопитающих, включают в себя декстран-опосредованную трансфекцию, кальций-фосфат-опосредованную трансфекцию, полибренопосредованную трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(полинуклеотидов) в липосомы и прямую микроинъекцию полинуклеотидов в ядра. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Подходящими хозяйскими клетками являются такие типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК, выращенной в культуре, и включают в себя клетки грибов и культивируемые клетки высших эукариот. Эукариотические клетки, в частности культивируемые клетки многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Технологии манипуляций молекулами клонированной ДНК и введения экзогенной ДНК в различные хозяйские клетки описаны Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, и Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY,1987. Трансформированные или трансфицированные хозяйские клетки культивируют, в соответствии с общепринятыми методиками, в культуральной среде, содержащей питательные элементы и другие компоненты, необходимые для роста выбранных в качестве хозяев клеток. Различные подходящие среды,включая конкретные среды и комплексные среды, хорошо известны в данной области и обычно включают в себя источник углерода, источник азота, основные аминокислоты, витамины и минералы. Среды могут содержать также при необходимости такие компоненты, как факторы роста или сыворотку. Культивируемые клетки млекопитающих являются в рамках настоящего изобретения предпочтительными хозяевами. Способы введения экзогенной ДНК в хозяйские клетки включают в себя кальцийфосфат-опосредованную трансфекцию (Wigler et al., 1978, Cell 14: 725; Corsaro and Person, 1981, SomaticProtocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15: 73; Ciccarone et al., 1993, Focus 15: 80). Продуцирование рекомбинантных полипептидов, включая полипептиды, которые являются компонентами рецепторного комплекса согласно изобретению, в культивируемых клетках млекопитающих описаны, например,Levinson et al., патент США 4713339; Hagen et al., патент США 4784950; Palmiter et al., патент США 4579821; и Ringold, патент США 4656134. Обычно предпочтительными являются сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловирус. (См., например, патент США 4956288). Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из металлотионеиновых генов(патенты США 4579821 и 4601978) и главный поздний промотор аденовирусов. Обычно для клеток,содержащих экзогенно добавленную ДНК, отбирают селективную ростовую среду, например избирательную в отношении лекарства или дефицитную в отношении какого-нибудь основного питательного элемента, которая дополнена селектируемым маркером, который переносится с экспрессирующим вектором или который котрансфицирован в хозяйскую клетку. В предпочтительном воплощении стабильные клеточные линии, содержащие представляющие интерес конструкции, представляют собой линии клеток, полученные для широкомасштабного скрининга. Такие стабильные клеточные линии могут быть получены путем введения конструкции, содержащей селектируемый маркер, предоставления клеткам возможности расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, а затем выращивания клеток на селективной среде. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает резистентность к селекции и дает возможность клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти до образования центров, которые, в свою очередь, могут быть клонированы и размножены в клеточных линиях. Лекарственная селекция обычно используется для отбора культивируемых клеток млекопитающих,в которые встроена чужеродная ДНК. В целом такие клетки называются "трансфектантами". Клетки, которые культивированы в присутствии селективного агента и которые способны передавать представляющий интерес ген своему потомству, называются "стабильными трансфектантами". Можно использовать целый ряд селективных систем, включая, но не ограничиваясь ими, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансферазы (SzybalskaSzybalski,1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowyet al., 1980 Cell 22: 817), соответственно, в tk-клетках, hgprt-клетках или aprt-клетках. Также антиметаболическая резистентность может быть использована как основа селекции для dhfr, которым сообщают ген резистентности к метотрексату (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981,- 17009745Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); для gpt, которым сообщают ген резистентности к микофеноловой(MulliganBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, которым сообщают ген резистентности к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); и hygro, которым сообщают ген резистентности к гидромицину (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий резистентность к антибиотику неомицину. Селекция может быть произведена в присутствии неомициноподобного лекарственного средства, такого как G-418 или сходного с ним. Системы селекции могут также быть использованы для повышения уровней экспрессии представляющего интерес гена - процесс, который называется "амплификацией". Амплификацию производят путем культивирования трансфектантов в присутствии малых количеств селективного агента, а затем увеличивают количество селективного агента, чтобы осуществить селекцию клеток, которые в больших количествах производят продукты встроенных генов. Предпочтительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает резистентность к метотрексату. Другие гены лекарственной резистентности (например, множественной лекарственной резистентности,пуромицинацетилтрансфераза) могут быть использованы также. В определенных воплощениях, BaF3, интерлейкин-3-зависимая пре-В-клеточная линия клеток, которая имеет c-рецептор, может быть трансфицирована рекомбинантным EPO-R. Присутствие EPO-R может затем быть определено по резистентности к соединениям, таким как зеоцин (при 2 мг/мл) и пуромицин (при 2 г/мл). 5.2.2.2 Анализ клеток BaF3. Анализ клеток BaF3 также может быть использован для идентификации соединений, которые модулируют активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Например, анализ на пролиферацию клеток BaF3 посредством передачи сигнала через рецепторный комплекс может быть предпринят следующим образом. В 96-луночный планшет вносили восемь серийных разведений 1:2 ростовой среды как таковой (RPMI-1640, 10% эмбриональная бычья сыворотка, 1 мМ пируват натрия, 2 мМ L-глутамин) и представляющие интерес малую молекулу, биологические или химические соединения. Конечный объем каждого разведения должен составлять приблизительно 100 мкл. Родительская линия клеток BaF3 и клетки BaF3, трансфицированные EPO-R, три раза промывали ростовой средой (см. выше), осадки ресуспендировали в ростовой среде, и клетки подсчитывали и разбавляли ростовой средой до 5000 клеток/100 мкл. Сто микролитров разбавленных клеток добавляли затем к каждому из разведений образцов. Затем аналитический планшет инкубировали в инкубаторе при 37 С в течение трех-четырех дней. Аликвоты по 20 мкл красителя Alomar blue добавляли к каждой лунке, и планшет инкубировали в течение ночи при 37 С. Планшеты считывали на флуоресцентном считывающем устройстве для планшетов при длине волны возбуждения 544 и длине волны испускания 590. Если соединение проявляет тканезащитную активность, клетки BaF3 должны пролиферировать при контакте с представляющими интерес малой молекулой, биологическими или химическими соединениями. Природный лиганд для тканезащитного рецепторного комплекса может быть идентифицирован путем искусственного мутагенеза клеточной линии, экспрессирующей рецепторный комплекс, и культивирования ее в условиях отбора аутокринного роста. (См. публикацию WIPO, WO 95/21930). В рамках обычно используемой технологии, BaF3-клетки, экспрессирующие тканезащитный рецепторный комплекс и необходимые дополнительные субъединицы, подвергают мутагенезу, например под действием 2 этилметансульфоната (EMS). Затем клетки проходят этап восстановления в присутствии IL-3, а затем их переносят в культуральную среду, в которой отсутствует IL-3 и IL-4. Выжившие клетки подвергают скринингу на предмет наличия продукции лиганда тканезащитного рецепторного комплекса, например,путем добавления к культуральной среде растворимого рецептора или путем анализа кондиционированной среды на предмет обнаружения BaF3-клеток дикого типа и BaF3-клеток, экспрессирующих рецептор. 5.2.2.3 Анализ репортерного гена. В определенных воплощениях настоящего изобретения, клетки, которые дополнительно подвергают искусственной модификации, с тем, чтобы они экспрессировали репортерный ген, используют в анализах по идентификации соединений с тканезащитной активностью. Репортерный ген связан с элементом промотора, который ответственен за связанный с рецептором каскад реакций, и при анализе определяют активацию транскрипции репортерного гена. Например, анализ репортерного гена, в соответствии со способами согласно изобретению, может включать в себя тестирование соединения в отношении модуляции им активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, где активированный комплекс запускает продукцию фактора транскрипции в хозяйских клетках. Хозяйская клетка включает в себя также промоторный элемент SRE, оперативно связанный с репортерным геном люциферазы, экспрессия которого регулируется активатором транскрипции, причем таким образом, что продукт люциферазного гена либо запускается, либо отключается (т.е. присутствует или отсутствует, или присутствует в различных количествах) в клетке в ответ на присутствие соединения, которое активирует рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Кроме того, настоящее изобретение дополнительно связано со способом идентификации соедине- 18009745 ния, которое модулирует тканезащитную активность, включающим в себя приведение тест-соединения в контакт с клеткой, экспрессирующей рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, где указанная клетка трансформирована нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует репортерный ген, оперативно связанный с регуляторным элементом, ассоциированным с активностью рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, идентификацию тест-соединения, которое повышает или понижает уровень экспрессии репортерного гена по сравнению с уровнем экспрессии репортерного гена, измеряемым в отсутствие тест-соединения, и анализ идентифицированного тестсоединения на предмет возможной тканезащитной активности. В определенных воплощениях способов согласно изобретению регуляторным элементом является элемент, чувствительный к сыворотке. Настоящее изобретение дополнительно связано со способом идентификации соединения, которое модулирует тканезащитную активность, приведение тест-соединения в контакт с клеткой, содержащей (i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую репортерный ген, оперативно связанный с сайтом связывания, специфичным в отношении ДНК-связывающего домена активатора транскрипции, (ii) первый слитый белок, содержащий (А) ДНК-связывающий домен активатора транскрипции и (В) первый полипептид рецептора тканезащитного цитокина или его фрагмент, и (iii) второй слитый белок, содержащий (А) активационный домен активатора транскрипции и (В) второй рецептор тканезащитного цитокина, детектирующий экспрессию репортерного гена, причем так, что если экспрессия репортерного гена детектированная в присутствии тест-соединения, отличается от экспрессии репортерного гена, детектированной в отсутствие тест-соединения, идентифицируют соединение, которое модулирует тканезащитную активность. Любой репортерный ген, хорошо известный специалисту в данной области, может быть использован в конструкциях репортерного гена для получения эффекта, оказываемого соединением на процессы,опосредованные тканезащитным цитокином, или повышения уровня защитных глобулинов. Предпочтительным промоторным элементом в этом отношении является элемент, чувствительный к сыворотке, илиSRE (см., например, Shaw et al., 1989, Cell 56: 563-572). Предпочтительной формой такого репортерного гена является ген люциферазы (например, люциферазы светляка, люциферазы renifla и люциферазы жука-щелкуна) (de Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 725). Экспрессия гена люциферазы определяется по люминесценции с помощью методов, известных в данной области (например, Baumgartner et al., 1994, J.Biol. Chem. 269: 29094-29101; Schenborn and Goiffin, 1993, Promega Notes 41: 11). Наборы для определения активности люциферазы, например, производства Promega Corp., Madison, Wis являются коммерчески доступными. Линии клеток-мишеней такого типа могут быть использованы для скрининга библиотек химических соединений, кондиционированных сред для культивирования клеток, бульонов грибных клеток, образцов почвы, образцов воды и т.п. Например, образцы кондиционированных сред для культивирования клеток могут быть испробованы на клетках-мишенях для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Затем положительные в отношении указанного анализа клетки используют для получения библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе млекопитающего, которую разделяют на порции,трансфицируют в хозяйские клетки и экспрессируют. Затем анализируют образцы среды из трансфицированных клеток, с последующим делением на порции, повторным трансфицированием, субкультивированием и повторным анализом положительных клеток для выделения клона кДНК, кодирующего лиганд. Примеры репортерных генов включают в себя, не ограничиваясь ими, флуоресцирующий белок(например, зеленый флуоресцирующий белок ("GFP"), желтый флуоресцирующий белок, красный флуоресцирующий белок, флуоресцирующий белок-циан и синий флуоресцирующий белок), бетагалактозидазу ("beta-gal"), бета-глюкуронидазу, бета-лактамазу, хлорамфениколацетилтрансферазу("CAT"), секретируемую щелочную фосфатазу ("SEAP"), пероксидазу хрена ("HRP") и щелочную фосфатазу ("АР"). Альтернативно, репортерный ген может представлять собой также и белковую метку, такую,например, как без ограничения - myc, His, FLAG или GST, так что в результате нонсенс-супрессии будет продуцироваться пептид и белок, мониторинг которого методами ELISA, вестерн-блоттинга или любого другого иммуноанализа позволит обнаружить белковую метку. Такие методики хорошо известны специалистам в данной области. Методы скрининга согласно изобретению охватывают также и возможность применения других репортерных генов. Репортерные гены могут быть получены, а нуклеотидные последовательности могут быть определены любым из способов, хорошо известных специалистам в данной области. Нуклеотидная последовательность может быть получена, например, из литературных источников или из баз данных,таких как банк генов. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий репортерный ген, может быть получен из нуклеиновой кислоты из соответствующего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретный репортерный ген, не доступен, но при этом последовательность репортерного гена известна, нуклеиновую кислоту, кодирующую репортерный ген, синтезировать химически или получить из соответствующего источника (например, из библиотеки кДНК или же из библиотеки кДНК, полученной из (нуклеиновой кислоты, предпочтительно полиА+ РНК, выделенной из) любой ткани или клеток, экспрессирующих репортерный ген) путем ПЦК-амплификации. Если нуклеотидная последовательность репортерного гена определена, нуклеотидная последовательность репортерного гена может быть подвергнута манипуляциям с помощью технологий манипулирования нуклеотидными по- 19009745 следовательностями, хорошо известных в данной области, например технологий рекомбинантных ДНК,сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.д. (см., например, технологии, описанные у Sambrook et al.,1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, NY - оба этих источника во всей их полноте включены в настоящее описание в виде ссылки), для получения репортерных генов, имеющих различные аминокислотные последовательности, например, для создания аминокислотных замен, делеций и/или вставок. В определенных воплощениях анализы репортерного гена, описанные выше, могут быть выполнены в отсутствие лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В таких воплощениях идентифицированным тест-соединением является такое тест-соединение, которое взаимодействует с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В определенных иных воплощениях описанные выше анализы репортерного гена могут быть выполнены в присутствии лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, такого как ЕРО. В таких воплощениях различие в уровнях транскрипции репортерного гена может быть определено в присутствии и в отсутствие тест-соединения. Затем уровень транскрипта может быть сравнен с уровнем транскрипта в отсутствие ЕРО. Если различие в уровне транскрипта, определяемом в присутствии и в отсутствие соединения, зависит от присутствия ЕРО, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует взаимодействие рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и ЕРО. Например, если различие в уровне транскрипта связано с его повышением в присутствии соединения, где указанное повышение зависит от присутствия ЕРО, тогда идентифицируют агонист взаимодействия между ЕРО и рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. 5.2.2.4 Двухгибридная система анализа в дрожжах."Двухгибридная" система может быть использована для детектирования белок-белковых взаимодействий в дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Fields and Song, 1989, Nature 340: 245-246; патент США 5283173, выданный на имя Fields and Song). Поскольку указанные взаимодействия подвергали скринингу в дрожжевой системе, межмолекулярные белковые взаимодействия, определяемые в этой системе, имели место в физиологических условиях, которые имитируют условия в клетках млекопитающих (Chien et al.,1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9578-9581). В этом анализе используется восстановление активатора транскрипции наподобие GAL4 (Johnston, 1987, Microbiol. Rev. 51: 458-476) в процессе взаимодействия двух белковых доменов, которые слиты с двумя функциональными единицами активатора транскрипции, ДНК-связывающего домена и активационного домена. Это оказывается возможным благодаря двусторонней природе определенных факторов транскрипции наподобие GAL4. Под двусторонней природой подразумевается то, что функции связывания и активации ДНК находятся в отдельных доменах и могут функционировать в транс-конфигурации (Keegan et al., 1986, Science 231: 699-704). Мониторинг восстановления активатора транскрипции проводят путем активации репортерного гена, такого как генlacZ, который находится под контролем промотора, который содержит ДНК-связывающий сайт (выше активирующей последовательности, или UAS) ДНК-связывающего домена активатора транскрипции. Этот способ наиболее часто используется либо для детектирования взаимодействия между двумя известными белками (Fields and Song, 1989, Nature 340: 245-24 6), либо для идентификации взаимодействующих белков из популяции белков, которые могли бы образовать связи с известным белком (Durfee et al.,1993, GenesDev. 7: 555-569; Gyuris et al., 1993, Cell 75: 791-803; Harper et al., 1993, Cell 75: 805-816; Vojteket al., 1993, Cell 74: 205-214). Разновидности описанных здесь способов двухгибридного анализа в дрожжах и других способов двухгибридного анализа в дрожжах хорошо известны специалистам в данной области и могут быть использованы в методах скрининга согласно изобретению. Идентификация взаимодействующих белков с помощью усовершенствованной двухгибридной дрожжевой системы основана на детектировании экспрессии репортерного гена, транскрипция которого зависит от восстановления регулятора транскрипции путем взаимодействия двух белков, каждый из которых слит с одной половиной регулятора транскрипции. Белки "bait" (т.е. рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов согласно изобретению или его производные или аналоги) и "prey" (белки, которые подлежат тестированию на предмет их способности взаимодействовать с "bait") экспрессированы в виде белков, слитых с ДНК-связывающим доменом и с доменом регулятора транскрипции, соответственно, и наоборот. В особом воплощении рекомбинантные биологические библиотеки, экспрессирующие случайные пептиды, могут быть использованы в качестве источника нуклеиновых кислот, соответствующих "prey". Обычно белки популяций "bait" и "prey" предусмотрены в виде слитых (химерных) белков (предпочтительно в результате рекомбинантной экспрессии химерной кодирующей последовательности), содержащей каждый белок, соприкасающийся с преселективной последовательностью. Для одной популяции преселективная последовательность представляет собой ДНК-связывающий домен. ДНКсвязывающий домен может быть любым ДНК-связывающим доменом, а также его специфически распознающей ДНК последовательностью внутри промотора. Например, ДНК-связывающий домен является активатором транскрипции или ингибитором. Для другой популяции преселективная последовательность представляет собой активаторный или ингибиторный домен активатора или ингибитора транскрипции соответственно. Предпочтительно, чтобы не обнаруживалось взаимодействия между регуляторным до- 20009745 меном как таковым (не в виде слияния с белковой последовательностью) и ДНК-связывающим доменом как таковым (не в виде слияния с белковой последовательностью) (чтобы избежать ложнопозитивных результатов в этом анализе). Эта система анализа дополнительно включает в себя репортерный ген, оперативно связанный с промотором, который содержит сайт связывания с ДНК-связывающим доменом активатора (или ингибитора) транскрипции. Соответственно, в способе согласно изобретению связывание белка, слитого с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, с белком, слитым с белком "prey", приводит к восстановлению активатора (или ингибитора) транскрипции, который активирует (или ингибирует) экспрессию репортерного гена. Активация (или ингибирование) транскрипции репортерного гена происходит внутриклеточно, например в прокариотических или эукариотических клетках, предпочтительно в клеточной культуре. Промотор, который оперативно связан с нуклеотидной последовательностью репортерного гена,может быть нативным или ненативным промотором нуклеотидной последовательности, и ДНКсвязывающий сайт (сайты), который распознается частью слитого белка, являющейся ДНКсвязывающим доменом, может быть нативным по отношению к промотору (если промотор обычно содержит такой сайт (сайты) связывания) или ненативным по отношению к промотору. Альтернативно,сайт связывания активации транскрипции желаемого гена (генов) может быть удален и заменен сайтами связывания GAL4 (Bartel et al., 1993, BioTechniques 14: 920-924, Chasman et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 4746-4749). Активационный домен и ДНК-связывающий домен, используемые в данном анализе, могут быть выбраны из обширного разнообразия белков-активаторов транскрипции, если эти активаторы транскрипции имеют отделимые связывающий домен и домен активации транскрипции. Например, GAL4 белок S. cerevisiae (Ma et al., 1987, Cell 48:847-853), GCN4-белок S. cerevisiae (HopeStruhl, 1986, Cell 46: 885-894), ARD1-белок S. cerevisiae (Thukral et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 2360-2369) и человеческий рецептор эстрогена (Kumar et al., 1987, Cell 51: 941-951) имеют отделимые ДНК-связывающий домен и домен активации транскрипции. Не обязательно, чтобы ДНК-связывающий домен и домен активации транскрипции, которые используются в слитых белках, были из одного и того же активатора транскрипции. В особом воплощении используют ДНК-связывающий домен GAL4 или LEXA. В другом особом воплощении используют активационный домен GAL4 или VP16 простого вируса герпеса (Triezenberg etal., 1988, Genes Dev. 2: 730-742). В особом воплощении аминокислоты 1-147 GAL4 (Ma et al., 1987, Cell 48: 847-853; Ptashne et al.,1990, Nature 346: 329-331) представляют собой ДНК-связывающий домен, а аминокислоты 411-455 VP16 (Triezenberg et al., 1988, Genes Dev. 2: 730-742; Cress et al., 1991, Science 251:87-90) содержат активационный домен. В особом воплощении плазмиды, кодирующие различные популяции слитых белков, могут быть одновременно введены в отдельную хозяйскую клетку (например, гаплоидную дрожжевую клетку), содержащую один или более репортерных генов, путем котрансформации, для проведения анализа белокбелковых взаимодействий. Или предпочтительно, если две популяции слитых белков вводят в отдельную клетку либо путем спаривания (например, для клеток дрожжей), либо путем слияния клеток (например,для клеток млекопитающих). При анализе типов спаривания конъюгация гаплоидных дрожжевых клеток противоположных типов спаривания, которые трансформированы, соответственно, экспрессирующей конструкцией (предпочтительно плазмидой) слияния связывающего домена и экспрессирующей конструкцией (предпочтительно плазмидой) слияния активационного (или ингибиторного) домена, будет приводить к тому, что обе конструкции будут попадать в одну и ту же диплоидную клетку. Тип спаривания дрожжевого штамма может быть подогнан путем трансформации НО-геном (Herskowitz and Jensen, 1991,Meth. Enzymol. 194: 132-146). В предпочтительном воплощении анализ взаимодействия при спаривании клеток дрожжей проводят с использованием двух различных типов клеток-хозяев, штаммов типа а и альфа дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Хозяйская клетка предпочтительно содержит по меньшей мере два репортерных гена,каждый с одним или несколькими сайтами связывания с ДНК-связывающим доменом (например, активатора транскрипции). Домен активатора и ДНК-связывающий домен представляют собой части химерных белков, образованных из двух соответствующих популяций белков. Один штамм клеток-хозяев, например штамм а, содержит слияния библиотеки нуклеотидных последовательностей с ДНК-связывающим доменом активатора транскрипции, таким как GAL4 . Гибридные белки, экспрессируемые в этой группе хозяйских клеток, способны к распознаванию ДНК-связывающего сайта в промоторной или энхансерной области в конструкции репортерного гена. Вторая группа дрожжевых хозяйских клеток, например,штамм альфа, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слияния библиотеки ДНКпоследовательностей с активационным доменом активатора транскрипции. В особом воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ детектирования одного или более белок-белковых взаимодействий, включающих в себя (а) рекомбинантную экспрессию в первой популяции дрожжевых клеток, являющихся первым типом спаривания, первого слитого белка, содержащего последовательность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов или его фрагмента и ДНКсвязывающий домен, где указанная первая популяция дрожжевых клеток содержит первую нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с промотором, регулируемым одним или более ДНК- 21009745 связывающими сайтами, распознаваемыми указанным ДНК-связывающим доменом, так что взаимодействие указанного первого слитого белка со вторым слитым белком, где второй слитый белок содержит домен активации транскрипции, приводит к повышению транскрипции указанной первой нуклеотидной последовательности; (b) отрицательную селекцию с целью удаления тех дрожжевых клеток в указанной первой популяции, в которых указанная повышенная транскрипция указанной первой нуклеотидной последовательности происходит в отсутствие указанного второго слитого белка; (с) рекомбинантную экспрессию во второй популяции дрожжевых клеток второго типа спаривания, отличного от указанного первого типа спаривания, множества указанных вторых слитых белков, где каждый второй слитый белок содержит последовательность фрагмента, производного или аналога белка и активационный домен активатора транскрипции, в котором активационный домен один и тот же в каждом указанном втором слитом белке; (d) спаривание указанной первой популяции дрожжевых клеток с указанной второй популяцией дрожжевых клеток, с получением третьей популяции диплоидных дрожжевых клеток, где указанная третья популяция диплоидных дрожжевых клеток содержит вторую нуклеотидную последовательность,оперативно связанную с промотором, регулируемым ДНК-связывающим сайтом, распознаваемым указанным ДНК-связывающим доменом, так что взаимодействие указанного первого слитого белка со вторым слитым белком приводит к повышению транскрипции указанной второй нуклеотидной последовательности, в которой первая и вторая нуклеотидные последовательности могут быть одними и теми же или различными; и (е) детектирование указанного повышения указанной первой и/или указанной второй нуклеотидной последовательности, определяя таким образом взаимодействие между указанным первым слитым белком и указанным вторым слитым белком. В одном из воплощений настоящего изобретения предусмотрен способ идентификации соединения,которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, где в указанном способе предусмотрено приведение тест-соединения в контакт с клеткой модифицированного штамма дрожжей, содержащего (i) нуклеотидную последовательность, кодирующую репортерный ген, который оперативно связан с промотором, чувствительным к рецепторному комплексу тканезащитных цитокинов, и (ii) экспрессирование рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и определение уровня активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов путем измерения уровня экспрессии репортерного гена, так что если уровень активности репортерного гена в присутствии соединения повышается или снижается по сравнению с уровнем активности репортерного гена в отсутствие соединения, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Рецепторные комплексы могут быть использованы при анализах ловушки взаимодействий (таких,например, как описанные у Gyuris et al., 1993, Cell 75: 791-803) для идентификации белков, которые связываются с известным белком для идентификации ингибиторов связывания. Такая система является модифицированной двухгибридной системой, как описано выше, в которой используется репортерный генLEU2 в качестве первой нуклеотидной последовательности, а репортерный ген lacZ - в качестве второй нуклеотидной последовательности, так что белок-белковые взаимодействия, которые приводят к восстановлению системы активатора транскрипции, могут быть отобраны в клетках, лишенных лейцина, и для экспрессии -галактозидазы. ДНК-связывающий домен может представлять собой ДНК-связывающий домен LexA, тогда как активаторная последовательность может быть получена из домена В 42 активации транскрипции (Ma and Ptashne, 1987, Cell 51: 113-119). Промоторы репортерных генов содержат связывающие последовательности LexA и активируются путем восстановления функционального активатора транскрипции. Другим признаком этой системы является то, что ген, кодирующий слитый белок ДНКсвязывающего домена, находится под влиянием индуцибельного промотора, такого как GAL-промотор,так что проверочные тесты могут быть предприняты в индуцирующих и неиндуцирующих условиях. В особом воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ детектирования соединения,которое модулирует взаимодействие ЕРО с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Первая популяция дрожжевых клеток, содержащая первый слитый белок, содержит последовательность первого рецептора тканезащитных цитокинов, такого как ЕРО-рецептор, и ДНК-связывающий домен LexA. Вторая популяция дрожжевых клеток содержит второй слитый белок, содержащий домен В 42 активации транскрипции, слитый с последовательностью второго рецептора тканезащитных цитокинов, такого как общий -рецептор. Репортерный ген LEU2 и репортерный ген lacZ оперативно связаны с промоторами,содержащими связывающие последовательности LexA, так что взаимодействие указанного первого слитого белка со вторым слитым белком приводит к повышенной транскрипции указанных репортерных генов. Популяции клеток, содержащих слитые белки, для селекции выращивают в средах, не содержащих лейцин. Среды содержат ЕРО, и анализ предпринимают в присутствии и в отсутствие тестсоединения. Если уровень транскрипции в присутствии тест-соединения меняется, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует взаимодействие ЕРО и рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Существуют еще и другие версии двухгибридного подхода, например был опубликован "Контин- 22009745 гентный анализ репликации" ("Contingent Replication Assay") (Nallur et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3867-3873; Vasavada et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10686-10690). В этом случае восстановление фактора транскрипции в клетках млекопитающих в результате взаимодействия двух слитых белков приводит к активации транскрипции Т-антигена SV40. Этот антиген способствует репликации слитых плазмид активационного домена. Другой модификацией двухгибридного подхода с использованием клеток млекопитающих является "Стратегия селекции кариоплазматического взаимодействия" ("Karyoplasmic Interaction Selection Strategy"), в которой также используется восстановление активатора транскрипции (Fearon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7958-7962). Используемые в этом случае репортерные гены включали в себя ген, кодирующий бактериальную хлорамфениколацетилтрансферазу, ген антигена CD4 клеточной поверхности и ген, кодирующий резистентность к гидромицину В. В обеих системах млекопитающих фактор транскрипции, который восстановлен, является гибридным активатором транскрипции, в котором ДНК-связывающий домен из GAL4, а активационный домен - из VP 16. Система активации транскрипции описана для выделения и каталогизации возможных белок-белковых взаимодействий в пределах популяции и дает возможность проводить сравнение таких взаимодействий между двумя популяциями (см. публикацию РСТ WO 97/47163, опубликованную 18 декабря 1997 года). 5.2.3 Анализ лиганд/рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В бесклеточном и основанном на клетках скрининг-методах, описанных в настоящем изобретении,лиганды рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов могут быть использованы в анализах на идентификацию соединений, которые модулируют взаимодействие рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с его лигандами. В одном из воплощений в настоящем изобретении предусмотрен способ идентификации соединения, которое связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, включающий в себя приведение рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в контакт (i) с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, связанного с первой меткой, и (ii) с эквивалентным количеством тест-соединения, связанного со второй меткой, в условиях, подходящих для связывания, удаление несвязанного материала из рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и детектирование уровня первой и второй меток, причем если вторая метка присутствует, соединение связывается с комплексом, а если уровень первой метки снижается по сравнению с уровнем первой метки, когда меченый лиганд контактирует с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов в условиях, подходящих для связывания в отсутствие тест-соединения после удаления несвязанного материала, тогда идентифицируют соединение, которое связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Еще в одном из воплощений в настоящем изобретении предусмотрен способ идентификации соединения, которое модулирует связывание лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, включающий в себя приведение лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в контакт с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов в присутствии одного или более тест-соединений в условиях, подходящих для связывания, и измерение количества лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, связанного с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, так что если количество связанного лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, измеренное в присутствии одного или более тест-соединений,отличается от количества связанного лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, измеренного в отсутствие одного или более тест-соединений, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует связывание лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях описанных здесь способов согласно изобретению, когда измеряют связывание рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, приведенного в контакт с лигандами рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, количество связанных лигандов рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов измеряли с помощью лигандспецифического антитела. В определенных воплощениях описанных здесь способов согласно изобретению, когда измеряют связывание рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, приведенного в контакт с лигандами рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, лиганд рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов метят и связывание лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов измеряют путем определения метки, связанной с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях описанных здесь способов согласно изобретению, когда измеряют связывание рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, приведенного в контакт с лигандами рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, лиганды рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов метят и связывание меченого лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов измеряют путем определения метки, связанной с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В связанных воплощениях, метка представляет собой флуоресцентную метку. В одном из воплощений настоящего изобретения предусмотрен способ идентификации соединения,которое модулирует взаимодействие между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и ли- 23009745 гандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, включающий в себя приведение рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с одним или более тест-соединениями и измерение активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, так что если активность, измеренная в присутствии одного или более тест-соединений, отличается от активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов в отсутствие одного или более тест-соединений, тогда идентифицируют соединение, которое модулирует взаимодействие между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях описанных здесь способов согласно изобретению соединение связывается с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях способов согласно изобретению, описанных выше, соединение связывается с лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. Описанные выше бесклеточный анализ и анализ на основе клеток могут быть использованы в высокопроизводительных масштабах для скрининга соединений с целью идентификации тех изних, которые способны модулировать активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов или модулировать взаимодействие между лигандом рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов и рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. Примеры библиотек соединений, которые могут быть использованы в высокопроизводительных скрининг-анализах, описаны ниже в разделе 5.4. Высокопроизводительный скрининг с использованием меченых проб может быть использован для идентификации соединений, которые воздействуют на образование специфических функциональных сайтов. Можно сравнить друг с другом профили функциональных сайтов в клетках, обработанных лекарственным средством, и в необработанных, или контрольных, клетках для идентификации лекарственных средств и лекарственных средств-кандидатов. Более того, если специфический функциональный сайт ассоциирован с тканезащитной активностью, пробы, специфичные в отношении такого сайта, могут быть использованы для определения статуса сайта до и после обработки лекарственным средством для идентификации лекарственного средства, которое изменяет статус функционального сайта и, следовательно,могло бы быть использовано в защитной терапии клетки, ткани или органа. В определенных воплощениях обработка лекарственным средством восстанавливает статус функционального сайта до статуса, наблюдаемого в контрольном образце. Скрининг-анализы, описанные в настоящем изобретении, включают в себя также высокопроизводительный скрининг и анализы по идентификации модуляторов активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов. В соответствии с таким воплощением системы, описанные ниже, могут быть составлены в наборы. Для этого клетки, экспрессирующие рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, или лизаты таких клеток могут быть упакованы в различные контейнеры, например ампулы, тюбики, микротитровальные луночные планшеты, бутыли и т.п. Другие реагенты могут быть включены в отдельные контейнеры и представлены в наборе; например, положительные контрольные образцы, отрицательные контрольные образцы, буферы, среды для культивирования клеток и т.д. Анализы согласно изобретению могут быть сначала оптимизированы в малом масштабе (т.е. в пробирке), а затем использованы в масштабе высокопроизводительных анализов. 5.3 Анализы по идентификации соединений или тестирование соединений, идентифицированных в скрининг-анализе. 5.3.1 Биологический скрининг или анализы. Соединения, идентифицированные как оказывающие воздействие на активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов или как соединения, способные модулировать взаимодействие между рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов и лигандом, могут быть испытаны на предмет тканезащитной активности, например, защищающей клетки, ткани или органы. Защитная активность может,кроме того, быть опробована с использованием анализов in vitro и in vivo. Тесты in vitro, которые являются показательными в отношении тканезащитной активности, включают в себя, например, анализы клеточной пролиферации, анализы клеточной дифференцировки или определение наличия белков или нуклеиновых кислот, стимулируемых под действием активности рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, например нуклеолина, нейроглобина и цитоглобина. Нейроглобин, например, может участвовать в облегчении транспорта или кратковременном депонировании кислорода. Следовательно,анализ транспорта или депонирования кислорода может быть использован в качестве анализа идентификации или скрининга соединений, которые модулируют активность тканезащитных цитокинов. Нейроглобин экспрессируется в клетках и тканях центральной нервной системы в ответ на гипоксию или ишемию и может обеспечивать защиту от повреждения (Sun et al. 2001, PNAS 98: 15306-15311;Schmid et al., 2003, J. Biol. Chem. 276: 1932-1935). Цитоглобин может играть сходную роль в защите, но он экспрессируется во множестве различных тканей на разных уровнях (Pesce et al., 2002, EMBO 3: 11461151). В одном из воплощений настоящего изобретения уровни повышенной регуляции белка в клетке могут быть измерены перед и после контактирования идентифицированного тест-соединения с клеткой. В определенных воплощениях наличие повышенной регуляции белка в клетке, ассоциированное с тканезащитной активностью, может быть использовано для подтверждения тканезащитных активностей соединения.- 24009745 Нуклеолин может защищать клетки от повреждения. Он осуществляет целый ряд функций в клетке,включая модуляцию процессов транскрипции, связывание белков со специфическими последовательностями РНК, цитокинез, нуклеогенез, сигнальную трансдукцию, апоптоз, индуцируемый Т-клетками, ремоделирование хроматина или репликацию. Он может функционировать также в качестве рецептора ДНК/РНК-геликазы клеточной поверхности, ДНК-зависимой АТФазы, челночного белка, компонента фактора транскрипции или репрессора транскрипции (Srivastava and Pollard, 1999, FASEB J. , 13: 19111922; and Ginisty et al., 1999, J. Cell Sci., 112: 761-772). Экспрессия повышенной регуляции белка в клетке может быть определена по детектированию уровней мРНК, соответствующих этому белку. мРНК может быть гибридизована с зондом, который специфически связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, регуляция которого повышена. Гибридизация может включать в себя, например, назерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, гибридизацию с наборами ДНК, аффинную хроматографию или гибридизацию in situ. В другом воплощении изобретения могут быть использованы системы быстрых и количественных анализов для скрининга тест-соединений на предмет их способности активировать рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Такие анализы, как описано, например, в патенте США 5,763,198,позволяют определить модуляцию активностей тирозинкиназы или фосфатазы, участвующих в сигнальной трансдукции, путем определения статуса фосфорилирования тирозина в белковом субстрате с помощью антифосфотирозинового антитела и антитела, специфичного в отношении белкового субстрата. Такие анализы могут быть воспроизведены в системе цельных клеток или в бесклеточной системе. В другом воплощении изобретения предусмотрен способ контактирования клетки, экспрессирующей рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, и лизирования клетки с целью выяснения того,фосфорилирован ли рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. В близких воплощениях рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов осаждают с помощью антитела против ЕРО-рецептора и осажденный комплекс метят антифосфотирозиновым антителом для c-рецептора. Системы животных моделей могут быть использованы для демонстрации тканезащитной активности соединения или для демонстрации безопасности и эффективности соединений, идентифицируемых описанными выше методами скрининга согласно изобретению. Соединения, идентифицируемые в результате таких анализов, можно затем тестировать с помощью животных моделей на предмет определения их биологической активности в отношении представляющего интерес типа повреждения ткани, заболевания, состояния или синдрома. Сюда входят животные, модифицированные генно-инженерными способами, такие как трансгенная мышь, с тем, чтобы у них экспрессировался рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов, связанный с системой считывания. Животные модели, которые могут быть использованы для тестирования эффективности идентифицированных соединений в отношении защиты клеток или тканей, включают в себя, например, защиту против запуска острого экспериментального энцефаломиелита (ЕАЕ) у крыс Льюис, восстановление или защиту от снижения когнитивной функции у мышей после мозговой травмы (Brines et al., 2000, PNAS,97: 10295-10672) и защиту от индуцированной ишемии сетчатки глаза (Rosenbaum et al., 1997, Vis. Res. 37: 3443-51). Такие анализы более подробно описаны в публикации РСТWO02/053580, которая во всей ее полноте включена в настоящее описание в виде ссылки. Описанные здесь тесты in vivo связаны с введением ЕРО, однако тест-соединение, которое идентифицировано как оказывающее влияние на активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, может быть введено вместо ЕРО для проверки его тканезащитной активности. Другие анализы по определению тканезащитной активности соединения хорошо известны специалистам в данной области. Анализы, построенные таким образом, чтобы определить тканезащитную активность идентифицированного соединения, могут быть предприняты в присутствии или в отсутствие лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, в зависимости от того, является ли идентифицированное соединение таким соединением, которое взаимодействует с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов или модулирует взаимодействие лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В определенных воплощениях в анализируемую систему добавляли дополнительный лиганд рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов для дальнейшего подтверждения модуляции активности соединения в отношении взаимодействия лиганда рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. 5.3.2 Анализы на связывание с клеткой. Альтернативно, могут быть использованы также анализы на связывание с клеткой, в которых используются клетки, описанные в разделе 5.2.2.1. Например, можно трансфицировать BaF3-клетки ЕРОрецептором и с-рецептором, как описано выше. Кроме того, представляющие интерес малая молекула,биологическое или химическое соединение должны быть связаны с биологическим маркером, таким как флуоресцентный или радиоактивно меченный маркер. В 96-луночный планшет вносили восемь серийных разведений 1:2 ростовой среды как таковой(RPMI-1640, 10% эмбриональная бычья сыворотка, 1 мМ пируват натрия, 2 мМ L-глутамин) и представ- 25009745 ляющие интерес малую молекулу, биологические или химические соединения. Конечный объем каждого разведения должен составлять приблизительно 100 мкл. Родительская линия клеток BaF3 и клетки BaF3, трансфицированные EPO-R, три раза промывали ростовой средой (см. выше), осадки ресуспендировали в ростовой среде и клетки подсчитывали и разбавляли ростовой средой до 5,000 клеток/100 мкл. Сто микролитров разбавленных клеток добавляли затем к каждому из разведений образцов. Затем аналитический планшет инкубировали в инкубиторе при 37 С в течение трех-четырех дней. Аликвоты по 20 мкл красителя Alomar blue добавляли к каждой лунке и планшет инкубировали в течение ночи при 37 С. Затем клетки промывали и после этого планшеты считывали на флуоресцентном считывающем устройстве для планшетов или другим подходящим способом для детектирования биомаркера, прикрепленного к представляющему интерес соединению. Сходным образом можно использовать конкурентный анализ для определения того, обладает ли соединение тканезащитным свойством. В конкурентном анализе соединения с известными тканезащитными свойствами, включая, но не ограничиваясь ими, тканезащитные цитокины, которые описаны в патентных заявках США No. 10/188,905 и 10/185,841, могут быть присоединены к соответствующему биомаркеру. В 96-луночный планшет вносили восемь серийных разведений 1:2 ростовой среды как таковой(RPMI-1640, 10% эмбриональная бычья сыворотка, 1 мМ пируват натрия, 2 мМ L-глутамин), а оставшиеся лунки содержали тканезащитное соединение/биомаркер, тканезащитное соединение/биомаркер и добавленные к ним в избытке представляющие интерес малая молекула, биологическое или химическое соединение. Конечный объем каждого разведения должен составлять приблизительно 100 мкл. Еще раз клетки BaF3 высевали в планшеты, как описано выше, и инкубировали. Через соответствующее количество времени клетки промывали и затем планшеты можно было считывать на флуоресцентном считывающем устройстве для планшетов или другим подходящим способом для детектирования биомаркера. Если параметры считывания планшетов, содержащих тканезащитное соединение/биомаркер и представляющее интерес соединение, ниже таковых, полученных при считывании планшетов, содержащих только тканезащитное соединение/биомаркер, в этом случае представляющее интерес соединение является тканезащитным соединением. 5.3.3 Активность цитокина и клеточной пролиферации/дифференцировки. Рецепторный комплекс согласно изобретению может быть полезен при идентификации тканезащитных соединений (малой молекулы, белка, химических агентов) в анализах на цитокины, клеточную пролиферацию (либо индуцирование, либо ингибирование) или клеточную дифференцировку (либо индуцирование, либо ингибирование). Многие изученные на сегодняшний день белковые факторы, включая все известные цитокины, проявляли активность при анализе клеточной пролиферации, зависимой от одного или более факторов, и, следовательно, эти анализы служат подходящим подтверждением активности цитокинов. Активность соединения может быть доказана с помощью любого из целого ряда рутинных фактор-зависимых анализов клеточной пролиферации, на линиях клеток, включая, без ограничения, клетки 32D, DA2, DA1G, Т 10, В 9, В 9/11, BaF3, MC9/G, М+(преВ М+), 2 Е 8, RB5, DA1, 123, Т 1165,НТ 2, CTLL2, TF-1, Мо 7 е и СМК. Эти клетки культивируют в присутствии и в отсутствие тестсоединения и клеточную пролиферацию определяют, например, путем измерения включения меченного тритием тимидина или колориметрическим анализом на основе метаболического распада 3-(4,5 диметилтриазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (Mosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65: 5563). Активность рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов может, помимо других способов,быть измерена по связыванию соединения или лиганда с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов, клеточной пролиферации, клеточной дифференцировке, повышенной регуляции белков, которые оказывают тканезащитный эффект, или по тканезащитной активности. 5.3.4 Слитые белки. Внеклеточный рецепторный домен может быть экспрессирован в виде слияния с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно Fc-фрагментом, который содержит два домена константной области и шарнирную область, но лишен вариабельной области. Такие слияния обычно секретируются в виде мультимерных молекул, в которых Fc-части связаны друг с другом дисульфидными мостиками, и два рецепторных полипептида расположены в непосредственной близости друг от друга. В соответствии с настоящим изобретением рецепторные полипептиды при слиянии должны включать в себя по меньшей мере один внеклеточный домен EPO-R и один внеклеточный домен c-рецептора. Слияния такого типа могут быть использованы для получения и очистки родственного лиганда из раствора, в качестве аналитического приема in vitro, для блокирования сигналов in vitro путем специфического оттитровывания лиганда, а также в качестве антагонистов in vivo путем их парентерального введения для связывания циркулирующих лигандов и их выведения из циркуляции. Для очистки лиганда к образцу, содержащему лиганд (например, кондиционированная среда для культивирования клеток или тканевые экстракты), добавляют химерный тканезащитный рецепторный комплекс в условиях, которые облегчают связывание рецептора с лигандом (обычно это близкие к физиологическим значениям температура, рН и ионная сила). Затем комплекс химера-лиганд отделяют путем смешивания, с использованием протеина А, который иммобилизован на твердой подложке (например, нерастворимых бусинках из- 26009745 смолы). Затем лиганд элюируют с использованием общеизвестных химических технологий, таких как создание градиента соли или рН. В альтернативном варианте с твердой подложкой может быть связан химерный комплекс, с последующим проведением связывания и элюции, как описано выше. Высокоаффинные химерные комплексы вводят парентерально (например, путем внутримышечной, подкожной или внутривенной инъекции). Циркулирующие молекулы связываются с лигандом и выводятся из циркуляции в результате нормальных физиологических процессов. Для применения в таких анализах химеры могут быть связаны с подложкой через Fc-область и использованы в методе ELISA. В предпочтительной системе анализа с использованием слитого белка лиганд-связывающего рецепторного комплекса или фрагмента лигандсвязывающего рецепторного комплекса используют коммерчески доступный биосенсорный инструментарий (BlAcore,Pharmacia Biosensor, Piscataway, N. J. ), где слитый белок иммобилизован на поверхности рецепторного чипа. Применение этого инструментария описано Karlsson, 1991, J. Immunol. Methods 145: 229-240, and Cunningham and Wells, 1993, J. Mol. Biol. 234: 554-563. Слитый белок ковалентно связан с помощью химии аминов или сульфгидрильной химии с декстрановыми волокнами, которые прикреплены к золотой пленке в клеточном потоке. Тестируемый образец проходит через клетку. Если лиганд присутствует в образце, он свяжется с иммобилизованным слитым белком, вызывая изменения в показателе преломления среды, которые обнаруживают по изменению поверхностностного резонанса плазмона золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости входа и выхода, на основании которых можно вычислить аффинность связывания и установить стохиометрию связывания. Лигандсвязывающие слитые белки могут быть использованы также и в других системах анализа,известных в данной области. Таким системы включают в себя метод Скатчарда для определения аффинности связывания (см., Scatchard, 1949, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672) калориметрические анализы(Cunningham et al., 1991, Science 253: 545-548; Cunningham et al, 1991, Science 254:821-825). Рецептор-лигандсвязывающий слитый белок может быть использован также для очистки лиганда. Слитый белок иммобилизован на твердой подложке, такой как агарозные бусинки, поперечно сшитая агароза, стекло, целлюлозные смолы, смолы на основе кремния, полистирол, поперечно сшитый полиакриламид или другие материалы, которые являются стабилыми в используемых условиях. Способы связывания полипептидов с твердыми подложками известны в данной области и включают в себя химию аминов, активацию цианогенбромида, активацию N-гидроксисукцинимида, активацию эпоксида, активацию сульфгидрила и активацию гидразида. Результирующая среда обычно наносится на колонку, и жидкости, содержащие лиганд, пропускают один или несколько раз через эту колонку, что позволяет лиганду связаться с рецепторным полипептидом. Затем лиганд элюируют с колонки, используя разницу в солевой концентрации или рН для разрушения лиганд-рецепторной связи. 5.3.5 Другие анализы. Рядовому специалисту в данной области известно, что рецепторный комплекс согласно изобретению найдет применение в целом ряде хорошо известных анализов, включая, но не ограничиваясь ими,лиганд-рецепторные анализы, описанные в Current Protocols In Immunology, vol. 4, Chapter 18,2001, JohnE. Coligan Ed. John Wiley and Sons. Если соединение проявляет тканезащитную активность, специалистам в данной области очевидно,что этот результат предпочтительно проверить в анализах по нейропротекции и защите ткани, известных в данной области, таких как, без ограничения, анализ клеток Р-19, РС-12, TF-1 и UT-7. Кроме того, различные модели in vivo, такие как животные модели, связанные с повреждением спинного мозга, ишемическим инсультом, повреждением периферической нервной системы и сердца и глаз, могут оказаться полезны для дальнейшей характеристике выделенного тканезащитного соединения. Подходящие анализы in vitro и in vivo описаны в патентных заявках США 10/188,905 и 10/185,841. 5.3.5.1 Анализы с использованием животных с нокаутом c(-/-). Настоящее изобретение связано также с применением хозяйских клеток и животных, генетически видоизмененных таким образом, что у них ингибируется экспрессия эндогенного c-рецептора животного и/или экспрессия c-рецептора человека (нокаут-животные с выключенным c-рецептором) (или их мутанты). Такие трансгенные животные могут быть использованы в способах идентификации биохимических путей нейропротекции и соединений, которые активируют биохимические пути защиты нервной ткани. Экспрессия эндогенных генов-мишеней также может быть снижена путем инактивации или "нокаута" генов-мишеней или их промотора с помощью нацеленной гомологической рекомбинации (см., например, публикации Smithies et al., 1985, Nature 317, 230-234; ThomasCapecchi, 1987, Cell 51, 503-512;Thompson et al., 1989, Cell 5, 313-321; каждая из которых во всей своей полноте включена в настоящее описание в виде ссылки). Например, может быть использован мутант, нефункциональный ген-мишень(или полностью неродственная последовательность ДНК), который фланкирован ДНК, гомологичной эндогенному гену-мишени (либо кодирующей области, либо регуляторным областям гена-мишени), в присутствии или в отсутствие селектируемого маркера и/или отрицательного селектируемого маркера,для трансфекции клеток, которые экспрессируют ген-мишень in vivo. Встраивание конструкции ДНК с- 27009745 помощью нацеленной гомологической рекомбинации приводит к инактивации гена-мишени. Такие подходы, особенно подходящие для модификаций клеток ES (эмбриональные стволовые клетки), могут быть использованы для получения потомства животных с неактивным геном-мишенью (см., например, ThomasCapecchi, 1987 and Thompson, 1989, выше). Такой подход, однако, может быть адаптирован для применения к человеку, обеспечивая конструкции ДНК, которые вводят напрямую или нацеленно в нужную часть организма in vivo с помощью соответствующих вирусных векторов. Сразу после получения животных с нокаутом рецептора c(-/-) можно исследовать экспрессию рекомбинантного гена c-рецептора, используя стандартные технологии. Сначала скрининг может быть произведен путем саузерн-блоттинга или технологии ПЦР для обследования тканей животного на предмет того, обнаруживается ли эндогенный ген. Уровень экспрессии мРНК трансгена в тканях трансгенных животных может быть установлен с помощью технологий, которые включают в себя, не ограничиваясь ими, назерн-блоттинг-анализы образов тканей, полученных у этих животных, анализ гибридизации in situRT-PCR (ПЦР с обратной транскриптазой). Образцы тканей, экспрессирующих ген c-рецептора, могут быть оценены также и иммуноцитохимически с помощью антител, специфичных в отношении трансгенного продукта c-рецептора. В одном из воплощений настоящего изобретения животных с нокаутом рецептора c (-/-) используют в анализах по идентификации биохимических путей и/или соединений, которые участвуют в тканезащитной активности. Например, нормальным животным и животным с нокаутом рецептора c(-/-) можно ввести агент или физически вызвать повреждение ткани, например ишемию. Обоим животным можно затем ввести соединение и определить тканезащитное действие этого соединения. Способы определения тканезащитной активности хорошо известны специалистам в данной области, и примеры таких способов описаны в публикации РСТ WO 02/053580, которая во всей своей полноте включена в настоящее описание в виде ссылки. Если тканезащитная активность наблюдается у нормальных животных, но не наблюдается у животных с нокаутом рецептора c (-/-), которым ввводили то же самое соединение, тогда идентифицируют соединение с тканезащитной активностью, зависимой от c-рецептора. Дальнейшее внедрение в изучение идентифицированного биохимического пути защиты ткани, зависимого от c-рецептора, может состоять из определения того, связывается ли соединение с cрецептором или его комплексами, или идентификации белков или мРНК-транскриптов, присутствующих только в организме животных, проявляющих тканезащитную активность. Авторы изобретения высказывают гипотезу относительно того, что могут существовать вторичные или еще дополнительные пути защиты тканей и что животных с нокаутом рецептора c (-/-) могут быть использованы для изучения таких путей. 5.4 Соединения. Способы согласно изобретению, предназначенные для скрининга и идентификации соединений, позволяют использовать множество типов соединений, включая, без ограничения, малые молекулы, органические молекулы, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, белковые аналоги, включая пептиды, содержащие неприродно образующиеся аминокислоты, например D-аминокислоты, фосфорные аналоги аминокислот, такие как фосфорные D- аминокислоты или аминокислоты, имеющие непептидные связи, аналоги нуклеиновых кислот, такие как фосфоротиоаты и PNA. Соединения, которые могут быть тестированы и идентифицированы описанными здесь способами,могут включать в себя, не ограничиваясь ими, соединения, полученные из любого коммерческого источника, включая Aldrich (Milwaukee, WI 53233), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Fluka Chemie AG (Buchs,Switzerland) Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY), Eastman Chemical Company, Fine Chemicals (Kingsport,TN), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany), Takasago (Rockleigh, NJ), SST CorporationInc., Fine Chemicals (Pittsburgh, PA 15272). В дальнейшем любой природный продукт можно будет подвергнуть скринингу в соответствии со способами согласно изобретению, включая микробные, грибные,растительные или животные экстракты. Библиотеки полипептидов или белков также могут быть использованы в анализах согласно изобретению. Например, тест-соединение может представлять собой малую молекулу, органическую молекулу,неорганическую молекулу или пептид. Примеры библиотек таких соединений, которые могут быть подвергнуты скринингу в соответствии со способами согласно изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, пептоиды; случайные биоолигомеры; диверсомеры, такие как гидантоины, бензодиазепины и дипептиды; винилогизированные полипептиды; непептидные пептидомиметики; олигокарбанаты; пептидилфосфонаты; пептидные библиотеки нуклеиновых кислот; библиотеки антител; библиотеки углеводов; и библиотеки малых молекул (библиотеки малых органических или неорганических молекул). Примеры таких библиотек включают в себя, не ограничиваясь ими, библиотеки случайных пептидов; (см.,например, Lam et al., 1991, Nature 354: 82-84; Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86) и комбинаторную,полученную химическим путем молекулярную библиотеку, составленную из аминокислот D-и/или Lконфигураций, фосфопептидов (включающих в себя, но не ограничивающихся ими, членов случайного или частичного вырождения, библиотеки направленных фосфопептидов; см., например, Songyang et al.,- 28009745 1993, Cell 72:767-778), антитела (включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, поликлональные,моноклональные, гуманизированные, антиидиотипические, химерные или одноцепочечные антитела, и экспрессируемая библиотека Fab-, F(ab')2- и Fab-фрагментов и их эпитоп-связывающих фрагментов) и малые органические или неорганические молекулы. В одном из воплощений согласно изобретению пептидные библиотеки могут быть использованы в качестве источника тест-соединений, которые можно использовать для скрининга модуляторов взаимодействий рецепторного комплекса тканезащитных цитокинов, таких как ЕРО-рецепторный комплекс тканезащитных цитокинов. Разнообразные библиотеки, такие как случайные или библиотеки комбинаторных пептидов или непептидов, могут быть подвергнуты скринингу на предмет обнаружения молекул,которые специфически связываются с рецепторным комплексом тканезащитных цитокинов. В данной области известно множество библиотек, которые могут быть использованы, например химически синтезированные библиотеки, рекомбинантные (например, библиотеки фагового дисплея) и библиотеки на основе трансляции in vitro. Примеры химически синтезированных библиотек описаны у Fodor et al., 1991, Science 251: 767-773;Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86; Lam et al., 1991, Nature 354: 82-84; Medynski, 1994,Bio/Technology 12: 709-710; Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37 (9): 1233-1251; Ohlmeyeret al.,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1142211426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712; публикация РСТ No. WO 93/20242; и Brenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383. Примеры библиотек фагового дисплея описаны у ScottSmith, 1990, Science 249: 386-390; Devlinet al., 1990, Science, 249: 404-406; Christian et al.,1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718; Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149-157; Kay et al., 1993, Gene 128: 59-65; и в публикации РСТ No. WO 94/18318, датированной 18 августа 1994. В качестве примеров непептидных библиотек бензодиазепиновая библиотека (см., например, Buninet al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712) может быть адаптирована для применения в настоящем изобретении. Библиотека пептоидов (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 9367-9371) также может быть использована. Другим примером библиотеки, которая может быть использована и в которой функциональность амидов в пептидах перметилирована с целью получения химически трансформированной комбинаторной библиотеки, описана у Ostresh et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11138-11142). Скрининг библиотек может проводиться с помощью любого из многочисленных общеизвестных способов. См., например, следующие ссылки, в которых описан скрининг пептидных библиотек: ParmleySmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; ScottSmith, 1990, Science 249: 386-390; Fowlkes et al.,1992; BioTechniques 13: 422-427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397; Yu et al.,1994, Cell 76: 933-945; Staudt et al., 1988, Science 241:577-580; Bock et al., 1992, Nature 355: 564-566; Tuerket al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 : 6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850-852; Патент США 5,096,815, Патент США No. 5,223,409 и Патент США 5,198,34 6, каждый из которых выдан на имя Ladner et al.; RebarPabo, 1993, Science 263: 671-673; и публикация РСТ WO 94/18318. В предпочтительном воплощении, комбинаторные библиотеки представляют собой библиотеки малых органических молекул, таких как, без ограничения, бензодиазепины, изопреноиды, тиазолиндиноны,метатиазаноны, пирролидины, соединения морфолино и бензодиазепины. В другом воплощении комбинаторные библиотеки включают в себя пептоиды; случайные био-олигомеры; бензодиазепины; диверсомеры, такие как гидантоины, бензодиазепины и дипептиды; винилированные полипептиды; непептидные пептидомиметики; олигокарбаматы; пептидилфосфонаты; библиотеки пептидных нуклеиновых кислот; библиотеки антител или библиотеки углеводов. Комбинаторные библиотеки как таковые являются коммерчески доступными (см., например, ComGenex, Princeton, New Jersey; Asinex, Moscow, Ru, Tripos,Inc.,St. Louis, Missouri; ChemStar, Ltd, Moscow, Russia; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pennsylvania; Martek Biosciences, Columbia, Maryland; и т.д.). В предпочтительном воплощении библиотека должна быть подвергнута предварительному отбору,так, чтобы соединения библиотеки были более подходящими для поглощения клеткой. Например, соединения отбирают на основе специфических параметров, таких как - но не ограничиваясь ими - размер,липофильность, гидрофильность и связывание водорода, которые повышают вероятность проникновения соединений внутрь клетки. В другом воплощении соединения анализируют с помощью трехмерных или четырехмерных счетно-вычислительных компьютерных программ. В одном из воплощений, библиотека комбинаторных соединений, предназначенная для способов согласно изобретению, может быть синтезирована. Существует большой интерес к способам синтеза,направленным на создание больших коллекций малых органических соединений, или библиотек, которые можно было бы подвергнуть скринингу с целью обнаружения фармакологической, биологической или иной активности. Способы синтеза, применимые для создания обширных комбинаторных библиотек,предприняты в растворе или в твердой фазе, т. е. на твердой подложке. Твердофазный синтез облегчает проведение многоступенчатых реакций и доведение реакций до их завершения, с высоким выходом, по- 29009745 скольку избыток реагентов может быть с легкостью добавлен, а затем отмыт после каждой из стадий реакции. Твердофазный комбинаторный синтез также направлен на улучшение выделения, очистки и скрининга. Однако более традиционная жидкофазная химия поддерживает более широкий спектр органических реакций, чем твердофазная химия. Библиотеки комбинаторных соединений согласно изобретению могут быть синтезированы с помощью аппаратуры, описанной в патенте США 6,190,619, выданном на имя Kilcoin et al., который во всей его полноте включен в настоящее описание в виде ссылки. В патенте США 6,190,619 описана аппаратура для синтеза, позволяющая одновременно производить дискретную библиотеку комбинаторных соединений, поддерживая синтез целого ряда соединений во множестве реакционных сосудов. В одном из воплощений библиотеки комбинаторных соединений можно синтезировать в растворе. Способ, описанный в патенте США 6,194,612, выданном на имя Boger et al., который во всей его полноте включен в настоящее описание в виде ссылки, связан с использованием признаков соединений в качестве матриц для жидкофазного синтеза комбинаторных библиотек. Матрица сконструирована таким образом, что позволяет продуктам реакции легко освобождаться от непрореагировавших реактантов в результате жидкофазной/жидкофазной или твердофазной/жидкофазной экстракций. Соединения, продуцируемые в результате комбинаторного синтеза с помощью матрицы, предпочтительно представляют собой малые молекулы. Некоторые соединения в библиотеке могут имитировать эффекты не пептидов или пептидов. В отличие от твердофазного синтеза комбинаторных библиотек, жидкофазный синтез не требует использования специализированных протоколов для мониторинга индивидуальных стадий многоступенчатого твердофазного синтеза (Egner et al., 1995, J. Org. Chem. 60: 2652; Anderson et al., 1995, J.et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3: 431). Библиотеки комбинаторных соединений, используемые в способах согласно изобретению, можно синтезировать на твердых подложках. В одном из воплощений для синтеза библиотеки соединений на твердых подложках используется способ расщепленного синтеза, протокол разделения и смешивания твердых подложек в процессе синтеза (см., например, Lam et al., 1997, Chem. Rev. 97: 41-448; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926 и цитируемые в этих публикациях ссылки). Каждая твердая твердая подложка в конечной библиотеке связывает на своей поверхности по существу одного типа соединения. Другие способы синтезирования комбинаторных библиотек на твердых подложках, где к каждой подложке прикреплен один продукт, должны быть знакомы специалистам в данной области (см., например, Nefzi et al., 1997,Chem. Rev. 97: 449-472). Здесь термин "твердая подложка" не является ограниченным специальным типом твердой подложки. Скорее наоборот, большое количество подложек является доступным и известно специалистам в данной области. Твердые подложки включают в себя силикагели, смолы, дериватизированные пластиковые пленки, стеклянные шарики, хлопок, пластиковые шарики, полистирольные шарики, алюминагели и полисахариды. Подходящая твердая подложка может быть отобрана в соответствии с конечной задачей и в соответствии с различными протоколами синтеза. Например, для пептидного синтеза твердой подложкой может быть смола, такая как смола р-метилбензгидриламина (pMBHA) (Peptides International, Louisville,KY), полистиролы (например, смола РАМ, доступная в Bachem Inc., Peninsula Laboratories, и т.д.), включая хлорметилполистирол, гидрокиметилполистирол и аминометилполистирол, сополимер поли(диметилакриламид) привитого стирола с дивинилбензолом (например, смола POLYHIPE, полученная на фирме Aminotech, Canada), полиамидная смола (полученная из Peninsula Laboratories), полистирольная смола, привитая к полиэтиленгликолю (например, TENTAGEL или ARGOGEL, Bayer, Tubingen, Germany),полидиметилакриламидная смола (полученная из Milligen/Biosearch, California) или сефароза (Pharmacia,Sweden). В некоторых воплощениях согласно изобретению, соединения могут быть прикреплены к твердым подложкам с помощью линкера. Линкеры могут быть как интегральными, так и частью твердой подложки, или же они могут быть неинтегральными линкерами, которые либо синтезированы на твердой подложке, либо прикреплены к ней после окончания синтеза. Линкеры используются не только в качестве центров прикрепления соединений к твердой подложке, но и для того, чтобы дать возможность различным группам молекул отделяться от твердой подложки в тех или иных условиях, в зависимости от природы линкера. Например, линкеры могут быть, помимо прочего, электрофильно отщепляемыми, нуклеоофильно отщепляемыми, фотоотщепляемыми, отщепляемыми ферментативным путем, отщепляемыми с помощью металлов, отщепляемыми в восстановительных условиях или отщепляемыми в оксидативных условиях. В предпочтительном воплощении соединения отщепляют от твердой подложки до начала высокопроизводительного скрининга соединений. В определенных воплощениях соединениями согласно изобретению являются цитокины. Примеры цитокинов, которые могут быть использованы в способах скрининга и способах лечения или профилак- 30