Варианты участка fc

009746 Область изобретения Настоящее изобретение относится к вариантам участка Fc и олигонуклеотидам, кодирующим варианты участка Fc. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способам идентификации полезных вариантов участка Fc, а также к способам применения вариантов участка Fc (например, для лечения заболевания). Уровень техники У человека обнаружено пять типов иммуноглобулинов. Эти группы известны как IgG, IgM, IgD,IgA и IgE и различаются изотипами гена тяжелой цепи (гамма, мю, дельта, альфа и эпсилон соответственно). Наиболее распространенным изотипом является IgG, который состоит из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи и двух идентичных полипептидов легкой цепи. Две тяжелых цепи ковалентно связаны друг с другом с помощью дисульфидных связей, а каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью с помощью дисульфидной связи. Каждая тяжелая цепь содержит приблизительно 445 аминокислотных остатков, и каждая легкая цепь содержит приблизительно 215 аминокислотных остатков. Каждая тяжелая цепь содержит четыре разных домена, которые обычно называют вариабельным доменом (VH), константным доменом 1 тяжелой цепи (СН 1), константным доменом 2 тяжелой цепи(СН 2) и константным доменом 3 тяжелой цепи (CH3). Домены СН 1 и СН 2 соединены шарнирным участком (междоменные секции), который придает иммуноглобулину гибкость. Каждая легкая цепь содержит два различных домена, которые обычно называют вариабельным доменом легкой цепи (VL) и константным доменом легкой цепи (CL). Вариабельные домены тяжелых и легких цепей непосредственно связываются с антигеном и ответственны за разнообразие и специфичность иммуноглобулинов. Каждый VL и VH содержит три участка,определяющих комплементарность (CDR, также известны, как гипервариабельные участки). Если VL иVH сходятся в результате взаимодействия тяжелой и легкой цепи, то участки CDR формируют поверхность связывания, которая вступает в контакт с антигеном. В то время как вариабельные домены вовлечены в связывание антигена, константные домены тяжелой цепи, в первую очередь СН 2 и CH3, выполняют другие функции, помимо связывания антигенов. Этот участок, в основном известный как участок Fc, выполняет много важных функций. Например, участок Fc связывает комплемент, который может запускать фагоцитоз или опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC). Участок Fc также связывается с рецепторами Fc, которые могут запускать фагоцитоз или опосредованную антителами клеточную цитотоксичность (ADCC). Участок Fc также способствует удержанию иммуноглобулина в циркуляции и взаимодействует с протеином А, который обычно используется для сорбции иммуноглобулина. В последнее время усилия направлены на улучшения иммуногенных качеств и антигенсвязывающих характеристик антител. Например, для иммунотерапии созданы моноклональные, химерные и гуманизированные антитела. Примеры антител, которые разрешены для иммунотерапии человека при соответствующих заболеваниях включают Ритуксан (RITUXAN, лимфома), Синагис (SYNAGIS, инфекционное заболевание), Зенепакс (ZENEPAX, пересадка почки), Ремикад (REMICADE, болезнь Крона и ревматоидный артрит), Герцептин (HERCEPTIN, карцинома молочной железы) и Эдреколомаб (EDRECOLOMAB, рак толстого кишечника). Однако существует много антител, для которых были проведены клинические испытания, но которые не были разрешены из-за недостаточной эффективности или других проблем, связанных с их применением. Для улучшения эффективности и ускорения разрешения к применению дополнительных лечебных антител необходимы композиции и способы изменения участков Fc для создания вариантов полипептидов с улучшенными свойствами. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к вариантам участка Fc полипептида и к олигонуклеотидам, кодирующим варианты участка Fc, а также их части. Конкретно настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способы идентификации полезных вариантов участка Fc и способы применения вариантов участка Fc. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, причем вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например,антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой P247L. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении-1 009746 251 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой L251F. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Т 256 М. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Н 268 Е. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой D280A. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А 330K. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой I332E. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А 339 Т. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней (например, В-клеток) в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой A378D. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,-2 009746 чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой S440Y. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты P247L), который включает последовательность SEQ ID NO:15. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующей участок СН 2 с модификацией P247L (например, SEQ ID NO:40). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией P247L, которая включает SEQ ID NO:15. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислотыL251F) с последовательностью SEQ ID NO:16. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН 2 с модификацией L251F (например, SEQ ID NO:41). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией L251F, которая включает SEQ ID NO:16. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Т 256 М), который включает последовательность SEQ ID NO:17. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующей участок СН 2 с модификацией Т 256 М (например, SEQ ID NO:42). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией Т 256 М, которая включает SEQ ID NO:17. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Н 268 Е), содержащему последовательность SEQ ID NO:20. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН 2 с модификацией Н 268 Е (например, SEQ ID NO:45). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией Н 268 Е, которая включает SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты D280A), который включает последовательность SEQ ID NO:21. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующей участок СН 2 с модификацией D280A (например, SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией D280A, которая включает SEQ ID NO:21. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты А 330K), содержащему последовательность SEQ ID NO:23. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН 2 с модификацией А 330K (например, SEQ ID NO:48). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией А 330K, которая включает SEQ ID NO:23. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты I332E), который включает последовательность SEQ ID NO:26. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующей участок СН 2 с модификацией I332E (например, SEQ ID NO:51). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией I332E, которая включает SEQ ID NO:26. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты А 339 Т), содержащему последовательность SEQ ID NO:29. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН 2 с модификацией А 339 Т (например, SEQ ID NO:54). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией А 339 Т, которая включает SEQ ID NO:29. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты A378D), который включает последовательность SEQ ID NO:30. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующей участок СН 2 с модификацией A378D (например, SEQ ID NO:55). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией S440Y, которая включает SEQ ID NO:30. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты S440Y), который включает последовательность SEQ ID NO:31. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН 2 с модификацией S440Y (например, SEQ ID NO:56). В до-3 009746 полнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН 2 с модификацией S440Y, которая включает SEQ ID NO:31. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc, выбранную из Р 247 Н, P247I и P247L. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Fc, выбранную из L251F. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc, выбранную из Т 256 М и Т 256 Р. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc, выбранную из H268D и Н 268 Е. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты,кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc,где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc,выбранную из D280A и D280K. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc, выбранную из А 330K иA330R. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc, выбранную из I332D и I332E. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc, выбранную из А 339 Т. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc, выбранную из A378D. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc, выбранную из S440Y. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, содержащую SEQ IDNO:13. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ IDNO: 38 и/или SEQ ID NO: 39, и/или SEQ ID NO: 40, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 38 и/или SEQ ID NO: 39, и/или SEQ ID NO: 40. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 13, 14, 15, 38, 39 или 40. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Р 247 Н,P247I или P247L. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:16. В определенных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 41, или ее комплементарную последовательность, или последовательность, которая связывается с SEQ ID NO: 41 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 41. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 16 или 41. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является L251F. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-5 009746 зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:17. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 42, и/или SEQ ID NO: 43,или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 43 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 42 и/или SEQ ID NO: 43. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 17, 18, 42 или 43. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Т 256 М или Т 256 Р. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью,четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:19. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 44, и/или SEQ ID NO: 45,или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам CHO) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 44 и/или SEQ ID NO: 45. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 19, 20, 44 или 45. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления по меньшей-6 009746 мере одна модификация аминокислоты представляет собой I332K или I332R. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная модификация представляет собойH268D или Н 268 Е. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую,третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:21. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 46, и/или SEQ ID NO: 47,или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 46 и/или SEQ ID NO: 47. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 21, 22, 46 или 47. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является D280A или D280K. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью,четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется.-7 009746 В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:23. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 48, и/или SEQ ID NO: 49,или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 48 и/или SEQ ID NO: 49. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 23, 24, 48 или 49. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является А 330K или A330R. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью,четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В дополнительных вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:25. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 50, и/или SEQID NO: 51, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 50 и/или SEQ ID NO: 51. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 25, 26, 50 или 51. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является I332D илиI332E. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:29. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 54 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 54 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 54. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 29 или 54. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является А 339 Т. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участкаFc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:30. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 55 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 55 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 55. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует-9 009746 представление SEQ ID NO: 30 или 55. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует истощение клетокмишеней в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2,IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является A378D. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc(см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНОэкспрессированный полипептид. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН 2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQID NO:31. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 56 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 56 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 56. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 31 или 56. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является S440Y. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид. В дополнительных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты исходного полипептида, который включает по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания на участке Fc. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты Fc полипептида, который опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,чем исходный полипептид, где вариант Fc полипептида включает модификацию аминокислоты в положении аминокислоты 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания. В дополнительных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты исходного полипептида, который включает по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней в образце цельной крови более эффек- 10009746 тивно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания на участке Fc. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты Fc полипептида, который опосредует истощение клеток-мишеней в образце цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, где вариант Fc полипептида включает модификацию аминокислоты в положении аминокислоты 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания. В определенных вариантах осуществления варианты по данному изобретению и нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты, представлены по меньшей мере еще одним компонентом в наборе. Например, набор может содержать по меньшей мере один тип варианта и инструкции по применению вариантов. Набор также может содержать буферы и другие используемые реактивы. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) клеток, экспрессирующих мишеневый антиген (например, CD20), ii) композиции,включающей вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, и iii) эффекторных клеток (обогащенных РВМС от донора(ов)-человека, например), и b) контакт клеток-мишеней с композицией и эффекторных клеток при таких условиях, что вариант связывается с клетками-мишенями (например,через лиганд, экспрессированный на поверхности клетки) и с) оценку гибели клеток-мишеней (по высвобождению ЛДГ или хрома 51, например). В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) образцов цельной крови, которые содержат клетки, экспрессирующие мишеневый антиген (например, В-клеток, экспрессирующих CD20) и ii) композиции, включающей вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc и b) контакт клеток-мишеней с композицией при таких условиях, что вариант связывается с клетками-мишенями (например, через CD20 лиганд, экспрессированный на поверхности клетки) и с) измерение исчезновения клеток-мишеней (например, путем анализаFacs с другим маркером В-клетки, таким как CD19). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие i) клетокмишеней, ii) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, и где вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида более эффективно, чем исходный полипептид, и iii) эффекторных клеток второго вида, и b) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что варианткандидат связывается с клетками-мишенями, образуя, таким образом, клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, d) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариантом-кандидатом), е) определение того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает аналогичный скрининг исходного полипептида с эффекторными клетками второго вида. В дополнительных вариантах осуществления стадии b) и с) проводятся одновременно. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию f) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В других вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию f) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида приблизительно в 1,2 раза (или приблизительно в 1,5 раз,в 5 раз или приблизительно в 10 раз) более эффективно, чем исходный полипептид (например, наблюдается повышение лизиса клеток-мишеней приблизительно в 1,2 раза). В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие i) клетокмишеней, ii) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участкеFc, iii) эффекторных клеток первого вида, и iv) эффекторных клеток второго вида, и b) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клеткамимишенями, образуя, таким образом, клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток первого вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, d) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариантом-кандидатом), е) определение того, что вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида более эффективно, чем исходный полипептид, f) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом (например, полученными на стадии b), g) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариан- 11009746 том-кандидатом), h) определение того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию определения способности исходного полипептида опосредовать цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии первого вида и/или второго вида. Например, способы могут дополнительно предусматривать смешивание эффекторных клеток первого или второго вида с клетками-мишенями, связанными с исходным полипептидом, и затем измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, определение такого значения, которое является значением для сравнения вариантов). В определенных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию g) введения улучшенного варианта с двойной специфичностью подопытному животному, где подопытное животное принадлежит второму виду. В других вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает перед стадией а) стадию скрининга варианта-кандидата в пробе связывания с Fc рецептором(FcR). В определенных вариантах осуществления анализ связывания FcR представляет собой анализ связывания с неонатальным рецептором Fc (FcRn). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает перед стадией а) стадию скрининга варианта-кандидата в пробе CDC (см., например, раздел IV ниже). В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки первого вида представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС). В других вариантах осуществления эффекторные клетки первого вида представляют собой РВМС мыши или РВМС крысы. В определенных вариантах осуществления эффекторные клетки второго вида представляют собой РВМС мыши или РВМС крысы. В конкретных вариантах осуществления эффекторные клетки второго вида представляют собой РВМС человека. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие i) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, и где варианткандидат опосредует CDC более эффективно, чем исходный полипептид, и iii) источник комплемента второго вида; и b) инкубирование композиции с комплементом второго вида; и с) определение того, опосредует ли вариант-кандидат CDC более эффективно, чем исходный полипептид. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию d) идентификации вариантакандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой клетки человека (например, клетки со сверхэкспрессией одного или более следующих ассоциированных с опухолью антигенов: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, рецептор EGF, рецептор her-2, специфический для простаты мембранный антиген, углевод Y Льюиса, ганглиозиды GD2 и GD3, lamp-1, CO-029, L6 и ephA2). В определенных вариантах осуществления вариант включает антитело или его часть, специфичную для клетокмишеней. В других вариантах осуществления вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида приблизительно в 1,2 раза более эффективно,чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления стадия е) включает проведение контрольной реакции с исходным полипептидом. В дополнительных вариантах осуществления измерение включает количественное определение гибели или лизиса клеток-мишеней. В других вариантах осуществления клетки-мишени инфицированы вирусом (например, ВИЧ, CMV, вирус гепатита В или RSV) или микробными организмами (например, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas и т.д.). В определенных вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой микробные организмы (например, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas и т.д.). В некоторых вариантах осуществления клетки мишени заменены вирусами (например, ВИЧ, CMV, вирус гепатита В или RSV). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) немодифицированную каркасную область человека(например, в природном каркасе человека не было сделано изменений), и ii) вариант участка Fc. В определенных вариантах осуществления немодифицированная каркасная область человека представляет собой каркас зародышевой линии человека. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) по меньшей мере одну рандомизированную CDR последовательность и ii) вариант участка Fc. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) немодифицированную каркасную область человека (например, каркас зародышевой линии человека), ii) по меньшей мере одну рандомизированную CDR последовательность и iii) вариант участка Fc. Определения Для лучшего понимания изобретения некоторые термины определены ниже. Используемые в описании термины "субъект" и "пациент" обозначают любое животное, такое как млекопитающее, например собака, кошка, птица, домашний скот и предпочтительно человек (например,человек, страдающий заболеванием). Используемые в настоящем описании термины "молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая",- 12009746"последовательность ДНК, кодирующая" и "ДНК, кодирующая" обозначают порядок или последовательность дезоксирибонуклеотидов в цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты. Порядок этих дезоксирибонуклеотидов определяет порядок аминокислот в полипептидной (белковой) цепи. Последовательность ДНК,таким образом, кодирует аминокислотную последовательность. Говорят, что молекулы ДНК имеют "5' концы" и "3' концы", поскольку мононуклеотиды взаимодействуют с образованием олигонуклеотидов или полинуклеотидов таким образом, что 5'-фосфат одного мононуклеотидного кольца пентозы присоединен к соседнему 3'-кислороду в одном направлении посредством фосфодиэфирной связи. Следовательно, конец олигонуклеотида или полинуклеотида называют "5'-концом", если его 5'-фосфат не связан с 3'-кислородом пентозного кольца мононуклеотида, и "3'концом", если его 3'-кислород не связан с 5'-фосфатом следующего пентозного кольца мононуклеотида. В настоящем описании последовательность нуклеиновой кислоты, даже если она является внутренней по отношению к олигонуклеотиду или полинуклеотиду большего размера, также может называться последовательностью, содержащей 5'- и 3'-концы. В линейной или круговой молекуле ДНК отдельные элементы обозначают элементы, расположенные в направлении 3'-5' (или просто 5') или в направлении 5'-3' (или просто 3'). Такая терминология отображает тот факт, что транскрипция осуществляется по способу от 5' к 3' вдоль цепи ДНК. Промоторные и энхансерные элементы, которые осуществляют непосредственную транскрипцию связанного гена, в общем, расположены в направлении 5' (от) кодирующего участка. Однако энхансерные элементы могут оказывать свое влияние даже при расположении 3' от промоторного элемента и кодирующего участка. Терминация транскрипции и сигналы полиаденилирования расположены в направлении 3' (от) кодирующего участка. Используемый в настоящем описании термин "кодон" или "триплет" относится к триплету трех смежных мономеров нуклеотида, который обозначает одну из двадцати природных аминокислот, обнаруженных в ходе биосинтеза полипептидов. Термин также включает несмысловые кодоны, которые не обозначают никакой аминокислоты. Используемые в настоящем описании термины "олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид" "полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид" и "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид" обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит участок, кодирующий конкретный полипептид. Кодирующий участок присутствует в форме кДНК, геномной ДНК или РНК. Если кодирующий участок присутствует в форме ДНК, то олигонуклеотид или полинуклеотид может быть одноцепочечным (т.е. смысловая цепь) или двухцепочечным. Подходящие контролирующие элементы, такие как энхансеры/промоторы, экзон-интронное сочленение, сигналы полиаденилирования и т.д. при необходимости могут быть расположены в непосредственной близости от кодирующей области гена для осуществления надлежащей инициации транскрипции и/или правильного процессинга первичного транскрипта РНК. Альтернативно, кодирующий участок, используемый в экспрессирующих векторах по данному изобретению, может содержать эндогенные энхансеры/промотеры, экзон-интронные сочленения, прерывающие последовательности, сигналы полиаденилирования и т.д. или комбинацию эндогенных и экзогенных контролирующих элементов. В настоящем описании термины "комплементарный" или "комплементарность" используются для обозначения полинуклеотидов (т.е. последовательности нуклеотидов) в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов. Например, последовательность "A-G-T" комплементарна последовательности "Т-СА". Комплементарность может быть "частичной", когда только некоторые из оснований нуклеиновых кислот совпадают в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов. Или может присутствовать полная комплементарность между нуклеиновыми кислотами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительное влияние на эффективность и прочность гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Это особенно важно для реакций амплификации, а также для способов обнаружения, которые зависят от связывания между нуклеиновыми кислотами. В настоящем описании термин "комплемент" данной последовательности используется для обозначения последовательности, которая полностью комплементарна последовательности по всей длине. Например, последовательность A-G-T-A является "комплементом" последовательности Т-С-А-Т. Термин "гомология" (в отношении последовательностей нуклеиновых кислот) относится к степени комплементарности. Может существовать частичная гомология или полная гомология (т.е. идентичность). Частично комплементарная последовательность представляет собой последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью и обозначается функциональным термином "по существу гомологичная". Термин "ингибирование связывания" в отношении связывания нуклеиновой кислоты относится к ингибированию связывания, вызванному конкуренцией гомологичных последовательностей за связывание с последовательностью-мишенью. Ингибирование гибридизации полностью комплементарной последовательности с последовательностью-мишенью может быть исследовано с использованием гибридизационного анализа (Саузерн- или Нозерн-блоттинг, жидкофазная гибридизация и т.п.) в условиях низкой жесткости. По существу гомологичная последовательность или зонд конкурируют за связывание и ингибируют связывание (т.е. гибридизацию) полностью гомологичной последовательности с мишенью в- 13009746 условиях низкой жесткости. Это не говоря о том, что условия низкой жесткости таковы, что разрешено неспецифическое связывание; условия низкой жесткости требуют, чтобы связывание двух последовательностей друг с другом было специфичным (т.е. селективным) взаимодействием. В отсутствии неспецифического связывания можно убедиться путем использования второй мишени, где отсутствует даже частичная степень комплементарности (например, идентичность менее приблизительно 30%); в отсутствие неспецифического связывания зонд не гибридизуется со второй некомплементарной мишенью. Из уровня техники хорошо известно, что многочисленные эквивалентные условия могут использоваться для создания условий низкой жесткости; рассматриваются такие факторы, как длина и природа(ДНК, РНК, нуклеотидный состав) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, нуклеотидный состав, находится в растворе или иммобилизирован, и т.д.) и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, декстрана сульфата, полиэтиленгликоля), и раствор для гибридизации может варьироваться для создания условий гибридизации низкой жесткости, которые отличаются от приведенных выше условий, но эквивалентны им. Кроме того, из уровня техники известны условия, которые способствуют гибридизации в условиях высокой жесткости (например, повышение температуры гибридизации и/или стадии отмывки, использование формамида в гибридизационном растворе и т.д.). Последовательность нуклеиновой кислоты (например, кодирующей вариант участка Fc или его часть) может образовывать множество типов РНК, которые создаются путем альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК. кДНК, которые являются вариантами сплайсинга одного гена, содержат идентичные или полностью гомологичные участки последовательности (являющиеся следствием наличия одинаковых экзона или части экзона в обеих кДНК) и участки полной неидентичности (например,являющиеся следствием наличия экзона "А" в кДНК 1, причем кДНК 2 вместо этого содержит экзон"В"). Поскольку две кДНК содержат участки идентичности последовательности, они оба будут гибридизоваться с зондом, полученным из целого гена или частей гена, содержащих последовательности, имеющиеся в обеих кДНК; два варианта сплайсинга, таким образом, являются по существу гомологичными с таким зондом и друг с другом. Термин "по существу гомологичный" в отношении одноцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты относится к любому зонду, который может гибридизоваться (т.е. является комплементарным) с одноцепочечной последовательностью нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. В настоящем описании термин гибридизация используется для обозначения спаривания комплементарных нуклеиновых кислот. На гибридизацию и прочность гибридизации (т.е. прочность связи между нуклеиновыми кислотами) влияют такие факторы, как степень комплементарности между нуклеиновыми кислотами, жесткость используемых условий, Тпл образованного гибрида и соотношение G:C в нуклеиновых кислотах. В настоящем описании термин "Тпл" используется для обозначения "температуры плавления". Температура плавления представляет собой температуру, при которой популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты диссоциирует на одинарные цепи. Уравнение для расчета Тпл нуклеиновых кислот хорошо известно из уровня техники. Как указано в стандартных источниках, простая оценка значения Тпл может быть рассчитана по уравнению: Тпл=81,5+0,41(%G+C), если нуклеиновая кислота находится в водном растворе с 1 М NaCl (см., например, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]). В других источниках сообщается о более сложных вычислениях, которые принимают в расчет структурные характеристики и характеристики последовательности для расчета Тпл; и в некоторых случаях Тпл может быть определена эмпирически, исходя из расчетной Тпл путем повышения или понижения температуры с малым шагом и определения воздействия на популяцию молекул нуклеиновых кислот. В настоящем описании термин "жесткость" в отношении условий температуры, ионной силы и присутствия других соединений, таких как органические растворители, при которых проводится гибридизация нуклеиновых кислот. Специалистам в данной области очевидно, что "жесткость" условий может быть изменена путем варьирования описанных выше параметров по отдельности или в совокупности. При условиях "высокой жесткости" спаривание оснований нуклеиновой кислоты будет происходить только между фрагментами нуклеиновой кислоты, имеющими высокую частоту комплементарных нуклеотидных последовательностей (например, гибридизация в условиях "высокой жесткости" может возникать между гомологами с идентичностью 80-100%, предпочтительно с идентичностью приблизительно 70-100%). При условиях средней жесткости спаривание оснований нуклеиновой кислоты будет происходить между нуклеиновыми кислотами со средней частотой комплементарных нуклеотидных последовательностей (например, гибридизация в условиях "средней жесткости" будет происходить между гомологами с идентичностью приблизительно 50-70%). Таким образом, условия "слабой" или "низкой" жесткости часто необходимы при использовании нуклеиновых кислот, которые получены из генетически отличных организмов, так как частота комплементарных последовательностей в них обычно меньше. Термин "условия высокой жесткости" в отношении гибридизации нуклеиновой кислоты включает условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42 С в растворе, состоящем из 5 Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% натрия додецилсульфата, 5 Х реактив Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последую- 14009746 щей отмывкой в растворе, который включает 0,1 Х SSPE, 1,0% SDS при 42 С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов длиной. Термин "условия средней жесткости" в отношении гибридизации нуклеиновой кислоты включает условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42 С в растворе, состоящем из 5 Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% натрия додецилсульфата, 5 Х реактив Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последующей отмывкой в растворе, который включает 1,0 ХSSPE, 1,0% натрия додецилсульфата при 42 С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов."Условия низкой жесткости" включают условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42 С в растворе, состоящем из 5 Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,1% натрия додецилсульфата, 5 Х реактив Денхардта [50 Х содержит на 500 мл: 5 г Ficoll (тип 400, Pharmacia), 5 г BSA (фракция V; Sigma)] и 100 г/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последующей отмывкой в растворе, который включает 5 Х SSPE, 0,1% натрия додецилсульфата при 42 С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов. Следующие термины используются для описания соотношений последовательностей между двумя или больше полинуклеотидами: "ссылочная последовательность", "идентичность последовательностей" и"процент идентичности последовательности". "Ссылочная последовательность" представляет собой определенную последовательность, которая используется как основа для сравнения последовательностей; ссылочная последовательность может быть подмножеством последовательности большего размера, например, в качестве сегмента полноразмерной последовательности кДНК, приведенной в перечне последовательностей, или может включать полную последовательность гена. В общем, длина ссылочной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов, часто по меньшей мере 25 нуклеотидов,и часто по меньшей мере 50 нуклеотидов (например, любая из SEQ ID NO: 32-37 может использоваться как ссылочная последовательность). Поскольку каждый из двух полинуклеотидов (1) может содержать последовательность (т.е. часть полной последовательности полинуклеотида), которая является сходной для двух полинуклеотидов, и (2) может дополнительно включать последовательность, которая будет различной для двух полинуклеотидов, сравнение последовательностей между двумя (или несколькими) полинуклеотидами обычно осуществляется путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов на протяжении "окна сравнения", предназначенного для идентификации сходства и сравнения локальных участков последовательностей. "Окно сравнения" в настоящем описании относится к схематичному сегменту длиной по меньшей мере 20 смежных нуклеотидных положений, причем полинуклеотидная последовательность может сравниваться с ссылочной последовательностью длиной по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов, и причем часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать добавление или делецию (т.е. промежутки), составляющие 20 или меньше процентов от длины ссылочной последовательности (которая не включает добавление или делецию) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться по алгоритму локальной гомологии Smith и Waterman [Smithand Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)] по алгоритму гомологичного выравнивания Needleman иWunsch [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], методом поиска сходства Pearson и Lipman[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)], с помощью компьютеризованных воплощений данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) или просмотром, и выбирают наилучшее выравнивание (т.е. приводящее к наибольшему проценту гомологии на протяжении окна сравнения) из полученных с помощью различных методов. Термин "идентичность последовательностей" означает, что две последовательности полинуклеотидов являются идентичными (т.е. по каждому нуклеотиду) на протяжении окна сравнения. "Процент идентичности последовательностей" рассчитывают путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения,определения количества положений, при которых идентичные основания нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, G, U или I) встречаются в обеих последовательностях с получением количества соответствующих положений, делением количества соответствующих положений на общее количество положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Окно сравнения в данной заявке представляет собой полную длину упомянутой ссылочной последовательности (т.е. если SEQ ID NO:33 упоминается как ссылочная последовательность,процент идентичности последовательности сравнивают на протяжении полной длины SEQ ID NO:33). В настоящем описании термин "зонд" относится к олигонуклеотиду (т.е. последовательности нуклеотидов), который встречается в природе и который получают в виде рестрикционного фрагмента или получен синтетическим путем, рекомбинантным способом или путем ПЦР амплификации, который способен гибридизоваться с другим интересующим олигонуклеотидом. Зонд может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Зонды применимы для обнаружения, идентификации и выделения последовательностей конкретных генов. Считается, что любой зонд, который используется в соответствии с настоящим изобретением, может быть помечен любой "репортерной молекулой", таким образом, что он может быть обнаружен в любой системе обнаружения, включая без ограничения ферментные (например, ELISA, а- 15009746 также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентные, радиоактивные и люминесцентные системы. Настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной системой обнаружения или меткой. В настоящем описании термин "полимеразная цепная реакция" ("ПЦР") относится к способу, описанному в патентах США 4683195, 4683202 и 4965188, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, в которых раскрыт способ увеличения концентрации сегмента последовательностимишени в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Этот способ амплификации последовательности-мишени состоит из введения большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, которая содержит желаемую последовательность-мишень, с последующей точной последовательностью циклов термической обработки в присутствии ДНК-полимеразы. Два праймера комлементарны соответствующим цепям двухцепочечной последовательности-мишени. Для осуществления амплификации смесь денатурируют и праймеры затем отжигают с комплементарными последовательностями в молекуле-мишени. После отжига праймеры удлиняют с помощью полимеразы таким образом, чтобы образовать новую пару комплементарных цепей. Стадии денатурации, отжига праймера и полимеразного удлинения могут повторяться несколько раз (т.е. денатурация, отжиг и удлинение составляют один "цикл"; и может присутствовать много "циклов") для получения высокой концентрации амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени. Длину амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени определяют по относительным положениям праймеров друг относительно друга, и, таким образом, эта длина является контролируемым параметром. Из-за аспекта повторяемости процесса способ называется "полимеразной цепной реакцией" (в настоящем описании "ПЦР"). Поскольку желаемые амплифицированные сегменты последовательности-мишени становятся преобладающими в смеси последовательностями (по концентрации), их называют "ПЦР-амплифицированными". ПЦР позволяет амплифицировать единственную копию конкретной последовательности-мишени в геномной ДНК до уровня, который может быть обнаружен с помощью нескольких различных методик(например, гибридизации с меченым зондом; включения биотинилированных праймеров с последующим обнаружением с помощью авидин-ферментного конъюгата; включения меченых 32 Р дезоксинуклеотидтрифосфатов, таких как дЦТФ или дАТФ, в амплифицированный сегмент). Помимо геномной ДНК, любая олигонуклеотидная или полинуклеотидная последовательность может быть амплифицирована с помощью подходящего набора молекул праймеров. Конкретно, амплифицированные сегменты, созданные с помощью процесса ПЦР, сами по себе являются эффективными матрицами для последующей ПЦРамплификации. Термин "выделенный" в отношении нуклеиновой кислоты, как в выражениях "выделенный олигонуклеотид" или "выделенный полипептид", относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей нуклеиновой кислоты, с которой она обычно встречается в их природном источнике. Выделенная нуклеиновая кислота находится в виде или состоянии, которое отличается от того, в котором она встречается в природе. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, которая существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, причем,например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомном локусе, отличном от локуса в природных клетках. Выделенная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид может существовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если выделенная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид используются для экспрессии белка, олигонуклеотид или полинуклеотид будет содержать по меньшей мере смысловую или кодирующую цепь (т.е. олигонуклеотид или полинуклеотид может быть одноцепочечным), но могут содержать смысловую и антисмысловую цепи (т.е. олигонуклеотид или полинуклеотид может быть двухцепочечным). В настоящем описании термин "часть" в отношении нуклеотидной последовательности (как в выражениях "часть данной нуклеотидной последовательности") относится к фрагментам такой последовательности. Фрагменты могут варьировать по размеру от 10 нуклеотидов до полной нуклеотидной последовательности минус один нуклеотид (например, 10 нуклеотидов, 20, 30, 40, 50, 100, 200 и т.д.). В настоящем описании термин "часть" в отношении аминокислотной последовательности (как в выражениях "часть данной аминокислотной последовательности") относится к фрагментам такой последовательности. Фрагменты могут варьировать по размеру от 6 аминокислот до полной аминокислотной последовательности минус одна аминокислота (например, 6 аминокислот, 10, 20, 30, 40, 75, 200 и т.д.). В настоящем описании термин "очищенный" или "очищать" означает удаление загрязняющих веществ из образца. Например, антиген-специфические антитела могут быть очищены удалением загрязняющих белков, отличных от иммуноглобулинов; их также очищают удалением иммуноглобулина, который не связывается с тем же антигеном. Удаление белков, отличных от иммуноглобулинов, и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с конкретным антигеном, приводит к увеличению процентного содержания антиген-специфических иммуноглобулинов в образце. В другом примере рекомбинантные антиген-специфические полипептиды экспрессируются в бактериальных клеткаххозяевах, и полипептиды очищают удалением белков клеток-хозяев; процент рекомбинантных антиген- 16009746 специфических полипептидов в образце таким образом повышается. Термин "рекомбинантная молекула ДНК" в настоящем описании относится к молекуле ДНК, которая включает сегменты ДНК, соединенные вместе в соответствии с молекулярно-биологическими методиками. Термин "рекомбинантный белок" или "рекомбинантный полипептид" в настоящем описании относится к молекуле белка, который экспрессируется молекулой рекомбинантной ДНК. Термин "нативный белок" в настоящем описании показывает, что белок не содержит остатков аминокислот, кодируемых векторными последовательностями; т.е. нативный белок содержит только аминокислоты, присутствующие в белке, который обычно встречается в природе. Нативный белок может быть получен рекомбинатными средствами или может быть выделен из природного источника. Термин "Саузерн-блоттинг" относится к анализу ДНК на агарозных или акриламидных гелях для фракционирования ДНК в соответствии с размером с последующим переносом ДНК из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированную ДНК затем зондируют меченым зондом для обнаружения молекул ДНК, комплементарных используемому зонду. ДНК может быть расщеплена рестриктазами до проведения электрофореза. После электрофореза ДНК может быть частично депуринирована и денатурирована до или во время переноса на твердую подложку. Саузерн-блоттинг представляет собой стандартный инструмент молекулярных биологов (J. Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58 [1989]). Термин "Нозерн-блоттинг" в настоящем описании относится к анализу РНК путем электрофореза РНК на агарозных гелях для фракционирования РНК в соответствии с размером с последующим переносом РНК из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированную РНК затем зондируют меченым зондом для выявления молекул РНК, комплементарных используемому зонду. Нозерн-блоттинг представляет собой стандартный инструмент молекулярных биологов (J. Sambrook, et al., supra, pp 7.39-7.52 [1989]). Термин "Вестерн-блоттинг" относится к анализу белка(ов) (или полипептидов), иммобилизированных на подложке, такой как нитроцеллюлоза или мембрана. Белки обрабатывают на акриламидных гелях для разделения, с последующим переносом белка из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированные белки затем контактируют с антителами, реагирующими с интересующим антигеном. Связывание антител можно выявить различными способами,включая использование радиоактивно меченых антител. Термин "антигенная детерминанта" в настоящем описании относится к такой части антигена, которая контактирует с конкретным антителом (т.е. эпитопу). Если белок или фрагмент белка используют для иммунизации животного-хозяина, многочисленные участки белка могут индуцировать продукцию антител, которые специфически связываются с данным участком или трехмерной структурой белка; данные участки или структуры обозначают как антигенные детерминанты. Антигенная детерминанта может конкурировать с интактным антигеном (т.е. иммуногеном, который используется для индукции иммунного ответа) за связывание с антителом. Термин "трансген" в настоящем описании относится к чужеродному, гетерологичному или аутологичному гену, который вводят в организм путем введения гена в только что оплодотворенные яйца или эмбрионы на ранних стадиях. Термин "чужеродный ген" относится к любой нуклеиновой кислоте (например, генной последовательности), которая введена в геном животного с помощью экспериментальных манипуляций и может включать генные последовательности, имеющиеся у такого животного при условии, что введенный ген имеет локализацию, отличную от таковой природного гена. Термин "аутологичный ген" включает варианты (например, полиморфы или мутанты) природного гена. Термин трансген, таким образом, включает замещение природного гена вариантной формой гена. В настоящем описании термин "вектор" используется для обозначения молекул нуклеиновой кислоты, которые переносят сегмент(ы) ДНК от одной клетки к другой. Термин "носитель" иногда используется взаимозаменяемо с термином "вектор". Термин "экспрессирующий вектор" в настоящем описании относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей желаемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии функционально присоединенной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии в прокариотах, обычно включают промотор, оператор (необязательно) и сайт связывания рибосомы, часто вместе с другими последовательностями. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования. В настоящем описании термин "клетка-хозяин" относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, бактериальным клеткам, таким как Е. coli, клетки СНО, дрожжевые клетки,клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки амфибий, клетки растений, клетки рыб и клетки насекомых), находящейся in vitro или in vivo. Например, клетки-хозяева могут находиться в трансгенном животном. Термины "трансфекция" и "трансформация" в настоящем описании означают введение чужеродной- 17009746 ДНК в клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки). Трансфекция может достигаться с помощью разнообразных средств, известных из уровня техники, включая соосаждение фосфата кальция-ДНК, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, опосредованную полибреном трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосомы, липофекцию, слияние протопласта, ретровирусную инфекцию и биолистику. Термин "стабильная трансфекция" или "стабильно трансфицированный" относится к введению и интеграции чужеродной ДНК в геном трансфицированной клетки. Термин "стабильный трансфектант" относится к клетке, которая содержит чужеродную ДНК, стабильно встроенную в геномную ДНК. Термин "временная трансфекция" или "временно трансфицированный" относится к введению чужеродной ДНК в клетку, где чужеродная ДНК не способна встроиться в геном трансфицированной клетки. Чужеродная ДНК сохраняется в ядре трансфицированной клетки в течение нескольких дней. В течение этого времени чужеродная ДНК подвергается регуляторному контролю, который управляет экспрессией эндогенных генов в хромосомах. Термин "временный трансфектант" относится к клеткам, которые захватили чужеродную ДНК, но оказались не способны интегрировать эту ДНК. Термин "соосаждение с фосфатом кальция" относится к технике введения нуклеиновых кислот в клетку. Захват нуклеиновых кислот клетками усиливается, если нуклеиновая кислота присутствует в виде соосадка фосфат кальция-нуклеиновая кислота. Исходная методика Graham и van der Eb (Graham и vander Eb, Virol., 52:456 [1973]) была модифицирована несколькими группами для оптимизации условий для конкретных типов клеток. Эти многочисленные модификации хорошо известны из уровня техники. Термин "композиция, которая включает данную последовательность полинуклеотида" в настоящем описании относится к любой композиции, включающей данную последовательность полинуклеотида. Композиция может включать водный раствор. Композиция, включающая последовательности полинуклеотида, кодирующие, например, вариант участка Fc или его фрагмент, может применяться как зонд гибридизации. В этом случае последовательности полинуклеотида, кодирующие вариант участка Fc, обычно применяются в водном растворе, содержащем соли (например, NaCl), детергенты (например, натрия додецилсульфат) и другие компоненты (например, раствор Денхардта, сухое молоко, ДНК молоки лосося и т.д.). Термины "исследуемое соединение" или "соединение-кандидат" обозначают любое химическое вещество, фармацевтический препарат, лекарственное средство и т.п., которые могут быть применены для лечения или профилактики заболевания, недомогания, болезни или расстройства функций организма или другим образом изменяет физиологический или клеточный статус образца. Исследуемые соединения включают известные и потенциальные лекарственные соединения. Терапевтические свойства исследуемого соединения могут быть определены путем скрининга с применением способа скрининга по данному изобретению. Термин известное терапевтическое соединение" относится к соединению с доказанными лечебными свойствами (например, в результате исследований на животных или предварительного опыта введения людям) как эффективное для такого лечения или профилактики. В настоящем описании термин "ответ" в отношении анализа относится к генерации детектируемого сигнала (например, накопление репортерного белка, повышение концентрации иона, накопление детектируемого химического продукта). В настоящем описании термин "репортерный ген" относится к гену, кодирующему белок, который может быть обнаружен с помощью анализа. Примеры репортерных генов включают без ограничения люциферазу (см., например, deWet et al., Mol. Cell. Biol., 7:725 [1987] и патент США 6074859, включенные в настоящее описание посредством ссылки), зеленый флуоресцентный белок (GFP, например,GenBank Accession Number U43284; множество вариантов GFP коммерчески доступны от CLONTECHLaboratories, Palo Alto, СА), хлорамфеникол ацетилтрансферазу, -галактозидазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу хрена. В настоящем описании термины "компьютерная память" и "устройство компьютерной памяти" обозначает любые средства для хранения, которые могут быть считаны процессором компьютера. Примеры компьютерной памяти включают без ограничения ПЗУ, ОЗУ, компьютерные микросхемы, цифровые видеодиски (DVD), компакт-диски (CD), жесткие диски (HDD) и магнитную ленту. В настоящем описании термин "машиночитаемый носитель" относится к любому устройству или системе для хранения и доставки информации (например, данные и инструкции) процессору компьютера. Примеры машиночитаемых носителей включают без ограничения DVD, CD, жесткие диски, магнитную ленту и серверы для распределения носителей по компьютерным сетям. В настоящем описании фраза "машиночитаемый носитель кодирует представление" последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности относится к машиночитаемому носителю, на котором хранится информация, которая при доставке процессору позволяет показать пользователю (например, распечатать или представить на экране дисплея) последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислот. В настоящем описании термины "процессор" и "модуль центрального процессора" или "CPU" используются взаимозаменяемо и обозначают устройство, способное считывать программу из памяти компьютера (например, ПЗУ или другой вид компьютерной памяти) и выполнять набор шагов в соответст- 18009746 вии с программой. В настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина использует формат индекса ЕС, как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), специально включенной в настоящее описание посредством ссылки. Термин "формат индекса ЕС согласно Kabat" относится к нумерации остатков антитела человеческого IgG1 EC. В настоящем описании термин "исходный полипептид" представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая может быть заменена или изменена (например, осуществлены замена, добавление или делеция аминокислоты) для создания варианта. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает по меньшей мере часть природного участка Fc или участок Fc с модификациями аминокислотной последовательности (например, добавление, делеция и/или замена). В некоторых вариантах осуществления конкретно рассматриваются варианты, которые короче или длиннее, чем исходный полипептид. В особенно предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид отличается по функции (например, эффекторная функция, связывание и т.д.) в сравнении с вариантом. В настоящем описании термин "вариант исходного полипептида" относится к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой исходного полипептида по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, по меньшей мере 40, 50, 75 или 90% или участокFc). В предпочтительных вариантах осуществления вариант включает участок Fc исходного полипептида по меньшей мере с одной модификацией аминокислоты. В настоящем описании термин "участок Fc" относится к С-концевому участку тяжелой цепи иммуноглобулина. "Участок Fc" может быть участком Fc с нативной последовательностью или вариантом участка Fc. Хотя общепринятые границы участка Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать,участок Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяется промежутком от остатка аминокислоты в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления варианты включают только части участка Fc и могут включать или не включать карбоксильный конец. Участок Fc иммуноглобулина, в общем, включает два константных домена, СН 2 и CH3. В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты, содержащие один или несколько константных доменов. В других вариантах осуществления рассматриваются варианты без таких константных доменов(или только с частью таких константных доменов). В настоящем описании "СН 2 домен" (также обозначается как "С 2" домен), как правило, включает промежуток остатков, который продолжается приблизительно от аминокислоты 231 приблизительно до аминокислоты 340 на участке Fc (например, в человеческом участке Fc IgG). Домен СН 2 является уникальным в том, что он не является тесно спаренным с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи встроены между двумя доменами СН 2 интактной молекулы нативного IgG. В настоящем описании "CH3 домен" (также обозначается как "С 3" домен), как правило, включает промежуток остатков С-концевого по отношению к СН 2 домену участка Fc (например, приблизительно от остатка аминокислоты 341 приблизительно до остатка аминокислоты 447 участка Fc IgG человека). В настоящем описании участок Fc может обладать "эффекторными функциями", которые ответственны за активацию или снижение биологической активности (например, у субъекта). Примеры эффекторных функций включают без ограничения C1q: связывание; комплемент-зависимую цитотоксичность(CDC); связывание с рецептором Fc; антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточного рецептора;BCR) и т.д. Такие эффекторные функции могут требовать, чтобы участок Fc был объединен с доменом связывания (например, вариабельный домен антитела), и могут быть оценены с применением различных анализов (например, анализа связывания Fc, анализа ADCC, анализа CDC, истощение клеток-мишеней из образцов цельной или фракционированной крови и т.д.). В настоящем описании термин "натаивная последовательность участка Fc" или "участок Fc дикого типа" относится к аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотной последовательности участка Fc, обычно встречающейся в природе. Показательные нативные последовательности участкаFc человека и включают нативную последовательность участка Fc человеческого IgG1 (f и a, z аллотипы); нативную последовательность участка Fc человеческого IgG2; нативную последовательность участка Fc человеческого IgG3 и нативную последовательность участка Fc человеческого IgG4, а также их природные варианты. Другие последовательности также рассматриваются и могут быть легко получены с различных веб-сайтов (например, веб-сайт NCBI). В настоящем описании термин "вариант участка Fc" относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от таковой участка Fc с нативной последовательностью (или их части) по меньшей мере одной модификацией аминокислоты (например, заменой, вставкой или делецией), включая гетеродимерные варианты, причем последовательности субъединиц тяжелой цепи могут отличаться друг от друга. В предпочтительных вариантах осуществления вариант участка Fc включает по меньшей мере- 19009746 одну замену аминокислоты в сравнении с участком Fc с нативной последовательностью (например, заменено приблизительно от 1 приблизительно до 10 аминокислот и предпочтительно заменено приблизительно от 1 приблизительно до 5 аминокислот в нативной последовательности участка Fc). В предпочтительных вариантах осуществления варианты участка Fc будут обладать по меньшей мере приблизительно 80% гомологии с нативной последовательностью участка Fc, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологии и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологии. В настоящем описании термин "гомология" в отношении аминокислотных последовательностей относится к проценту остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые являются идентичными с нативной аминокислотной последовательностью после выравнивания последовательностей и введения при необходимости пропусков для достижения максимального процента гомологии. Термин "полипептид, содержащий участок Fc" относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин (см. определения ниже), который включает участок Fc. Термины "Fc-рецептор" и "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с участком Fc (например, участок Fc антитела или фрагмента антитела). Термин включает рецептор новорожденных, FcRn, который отвечает за перенос иммуноглобулинов IgG от матери плоду. В настоящем описании фраза "антитело-зависимая клеточная цитотоксичность" и термин "ADCC" означают клеточно-опосредованную реакцию, в которой цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют FcRs (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клеток-мишеней. Основные клетки для опосредования ADCC, клетки NK, экспрессируют FcRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcRI, FcRII и FcRIII. В настоящем описании фраза "эффекторные клетки" относится к лейкоцитам, которые экспрессируют один или больше FcRs и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по меньшей мере FcRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника (например, из крови). В настоящем описании фраза "цельная кровь" относится к образцам нефракционированной крови. В настоящем описании вариант полипептида с "измененной" FcR связывающей активностью илиADCC активностью представляет собой такой, который обладает увеличенной (т.е. повышенной) или уменьшенной (т.е. сниженной) FcR-связывающей активностью и/или активностью ADCC в сравнении с исходным полипептидом или полипептидом, включающим участок Fc с нативной последовательностью. Вариант полипептида, который "демонстрирует повышенное связывание" с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с лучшим сродством, чем исходный полипептид. Вариант полипептида, который "демонстрирует сниженное связывание" с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с худшим сродством, чем исходный полипептид. Такие варианты, которые демонстрируют сниженное связывание с FcR,могут проявлять небольшое или не проявлять совсем заметного связывания с FcR, например 0-20% связывание с FcR в сравнении с исходным полипептидом. Вариант полипептида, который связывает FcR с"лучшим сродством, чем исходный полипептид, представляет собой полипептид, который связывает любой один или несколько из идентифицированных выше FcR с более высоким сродством связывания,чем исходное антитело, когда количества варианта полипептида и исходный полипептид в пробе связывания по существу являются сходными, и все другие условия являются идентичными. Например, вариант полипептида с улучшенным сродством связывания с FcR может демонстрировать приблизительно от 1,10-кратного приблизительно до 100-кратного (чаще приблизительно от 1,2-кратного приблизительно до 50-кратного) улучшения (т.е. повышения) сродства связывания с FcR в сравнении с исходным полипептидом, где FcR связывающую активность определяют, например, в анализе ELISA. В настоящем описании "модификация аминокислоты" относится к изменению в аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности. Показательные модификации включают без ограничения замену, вставку и/или делецию аминокислоты. В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой замену (например, в участке Fc исходного полипептида). В настоящем описании "модификация аминокислоты в" указанном положении (например, в участкеFc) относится к замене или делеции обозначенного остатка или вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка, смежного с обозначенным остатком. Вставка "смежного" с указанным остатка означает вставку с одним или двумя его остатками. Вставка может быть N-концевой или С-концевой по отношению к указанному остатку. В настоящем описании "замена аминокислоты" относится к замене по меньшей мере одного существующего остатка аминокислоты в данной аминокислотной последовательности другим отличным "заменяющим" остатком аминокислоты. Заменяющий остаток или остатки могут представлять собой "природные остатки аминокислот" (т.е. кодируемые генетическим кодом) и выбранные из: аланина (Ala); аргинина (Arg); аспарагина (Asn); аспарагиновой кислоты (Asp); цистеина (Cys); глутамина (Gln); глутами- 20009746 новой кислоты (Glu); глицина (Gly); гистидина (His); изолейцина (lle); лейцина (Leu); лизина (Lys); метионина (Met); фенилаланина (Phe); пролина (Pro); серина (Ser); треонина (Thr); триптофана (Trp); тирозина (Tyr) и валина (Val). Замена одним или несколькими остатками неприродных аминокислот также охватывается определением аминокислотной замены в настоящем описании. Термин "неприродный аминокислотный остаток" относится к остатку, отличному от природных аминокислотных остатков, перечисленных выше, который способен ковалентно связываться со смежным остатком(ами) аминокислот в полипептидной цепи. Примеры неприродных аминокислотных остатков включают норлейцин, орнитин,норвалин, гомосерин и другие аналоги остатков аминокислот, такие как описаны в Ellman et al. Meth.Enzym. 202: 301-336 (1991), включенной сюда посредством ссылки. В настоящем описании термин "вставка аминокислоты" относится к включению по меньшей мере одной аминокислоты в данной аминокислотной последовательности. В предпочтительных вариантах осуществления вставка обычно представляет собой вставку одного или двух остатков аминокислот. В других вариантах осуществления вставка включает вставки большего пептида (например, вставку приблизительно от 3 приблизительно до 5 или даже приблизительно 10 аминокислотных остатков). В настоящем описании термин "делеция аминокислоты" относится к делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка из данной аминокислотной последовательности. Термин "аналитический сигнал" относится к выходу любого способа обнаружения белок-белкового взаимодействия, включая без ограничения измерение поглощения колориметрических анализов, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализов могут включать ELISA, Facs или другие способы. Изменение в "аналитическом сигнале" может отображать изменение жизнеспособности клеток и/или изменение в кинетике образования связей, кинетике диссоциации связей или обеих. Термин"более сильный аналитический сигнал" относится к измеренному значению выхода, большему, чем другое число (например, вариант может иметь более высокое (большее) измеренное значение в анализеELISA в сравнении с исходным полипептидом). Термин "более слабый аналитический" сигнал относится к измеренному значению выхода, более низкому, чем другое число (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное значение в анализе ELISA в сравнении с исходным полипептидом). Термин "связывающая активность" относится к константе равновесия диссоциации (выражается в единицах концентрации), связанной с каждым связывающим взаимодействием Fc рецептор-Fc. Сродство связывания имеет непосредственное отношение к соотношению кинетики образования связей (в общем регистрируется в единицах обратного времени, например с-1), разделенных на кинетику диссоциации связей (в общем регистрируется в единицах концентрации на единицу времени, например, мол./с). Обычно невозможно однозначно утверждать, являются ли изменения констант равновесия диссоциации следствием отличий в образовании связей,диссоциации связей или обоих параметрах, за исключением случая, когда каждый из этих параметров определен экспериментально (например, с помощью измерений BIACORE или SAPIDYNE). В настоящем описании термин "шарнирный участок" относится к промежутку аминокислот в IgG1 человека, который простирается от Glu216 до Pro230 человеческого IgG1. Шарнирные участки других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 размещением первого и последнего остатков цистеина, образующих S-S связи между тяжелыми цепями в одних и тех же положениях. В настоящем описании термин "нижний шарнирный участок" участка Fc относится к промежутку аминокислотных остатков непосредственно С-концевых по отношению к шарнирному участку (например, остатки 233-239 участка Fc IgG1)."C1q" представляет собой полипептид, который включает сайт связывания для участка Fc иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, С 1r и C1s, образует комплекс С 1, первый компонент пути комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). В настоящем описании термин "антитело" используется в самом широком смысле и, в частности,охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. В настоящем описании термин "фрагменты антител" относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают без ограничения линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; пептиды Fc или Fc', Fab и Fab фрагменты и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител предпочтительно сохраняют по меньшей мере часть шарнирного и необязательно СН 1 участка тяжелой цепи IgG. В других предпочтительных вариантах осуществления фрагменты антитела включают по меньшей мере часть участка СН 2 или полностью участок СН 2. В настоящем описании термин "функциональный фрагмент" в отношении моноклонального антитела относится к части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может быть, например, антиген-связывающей активностью или специфичностью. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают, например, отдельные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как VL, VH и Fd; моновалентные фрагменты, такие как(Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) и в Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed.,Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990), каждая из которых включена сюда посредством ссылки. Термин функциональный фрагмент включает, например, фрагменты, образованные путем расщепления протеазой или восстановления моноклонального антитела и с помощью методов рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области. В настоящем описании "гуманизированные" формы, отличные от человеческих (например, мышиных) антител, представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из отличного от человеческого иммуноглобулина, или она отсутствует. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент),в котором остатки гипервариабельного участка реципиента замещены остатками гипервариабельного участка отличных от человеческих видов (антитело-донор), таких как мышь, кролик или нечеловекообразный примат, имеющих желаемую специфичность, сродство и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека замещены соответствующими отличными от человеческих остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не содержатся в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации, как правило, осуществляют для дальнейшего улучшения функциональности антитела. Обычно гуманизированное антитело будет включать, по существу, все, по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена, где все или, по существу, все гипервариабельные петли соответствуют таковым отличного от человеческого иммуноглобулина и все или, по существу, все остатки FR являются таковыми последовательности человеческих иммуноглобулинов. Гуманизированное антитело может также включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Примеры способов,которые используются для создания гуманизированного антитела, описаны в патенте США 5225539,выданном Winter et al. (включен сюда посредством ссылки). В настоящем описании термин "гипервариабельный участок" относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок включает аминокислотные остатки из "определяющего комплементарность участка" или "CDR" (т.е. остатки 24-34(L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н 2) и 95-102 (Н 3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 и/или такие остатки из "гипервариабельной петли" (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н 2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987. "Каркасные" или "FR" остатки являются остатками вариабельного домена, другими чем остатки гипервариабельного участка, как определено в настоящем описании. В настоящем описании термин "иммуноадгезин" обозначает антитело-подобные молекулы, которые сочетают домен связывания гетерологичного "адгезина" белка (например, рецептор, лиганд или фермент) с константным доменом иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины включают гибрид аминокислотной последовательности с желаемой специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (антиген-связывающего сайта) антитела (т.е. является "гетерологичным") по отношению к последовательности константного домена иммуноглобулина. В настоящем описании термин "лиганд-связывающий домен" относится к любому нативному рецептору или любому участку или его производному, которое сохраняет по меньшей мере качественную лиганд-связывающую способность соответствующего нативного рецептора. В определенных вариантах осуществления рецептор происходит из полипептида клеточной поверхности, который содержит внеклеточный домен и является гомологичным члену надсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются членами надсемейства иммуноглобулинов, но, тем не менее, конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы цитокинов, и, конкретно, рецепторы с тирозинкиназной активностью (рецепторы тирозинкиназы), члены надсемейств рецепторов гематопоэтинов и факторов роста нервов, и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, L- и Р- селектины). В настоящем описании термин "рецептор-связывающий домен" относится к любому нативному лиганду рецептора, включая молекулы клеточной адгезии или любой участок или производное такого природного лиганда, сохраняющему по меньшей мере качественную способность к связыванию соответствующего нативного лиганда. В настоящем описании термин "антитело-иммуноадгезиновая химера" включает молекулу, которая сочетает по меньшей мере один домен связывания антитела по меньшей мере с одним иммуноадгезином. Примеры включают без ограничения биспецифические CD4-IgG химеры, описанные в Berg et al., PNAS(USA) 88:4723-4727 (1991) и Charnow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994), каждая из которых включена сюда посредством ссылки. В настоящем описании "выделенный" полипептид представляет собой полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен от компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые будут мешать диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и- 22009746 другие белковые или небелковые вещества. В определенных вариантах осуществления выделенный полипептид очищают до (1) более 95 мас.% полипептидов, как определено по методу Лоури, и предпочтительно более 99 мас.%, (2) достаточной степени для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования колпачного секвенатора или(3) до гомогенности с помощью электрофореза на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси голубого или окрашивания серебром. Выделенный полипептид включает полипептид in situ в рекомбинантных клетках,поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения полипептида будет отсутствовать. Обычно, однако, выделенный полипептид будет получен с помощью по меньшей мере одной стадии очистки. В настоящем описании термин "лечение" относится к лечебным и профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже имеется нарушение, а также тех, у кого нарушение должно быть предупреждено. В настоящем описании термин "нарушение" относится к любому состоянию, при котором пациент будет получать пользу от лечения вариантом полипептида, включая хронические и острые нарушения или заболевания (например, патологические состояния, которые предрасполагают пациента к конкретному расстройству). В определенных вариантах осуществления нарушение представляет собой злокачественную опухоль. В настоящем описании термины "злокачественная опухоль" и "злокачественный" относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественной опухоли включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов злокачественной опухоли включают чешуйчатоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, чешуйчатую карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника,рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак колоректальный, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные виды рака головы и шеи. В настоящем описании фраза "HER2-экспрессирующая злокачественную опухоль" обозначает вид злокачественной опухоли, включающий клетки, которые содержат белок HER2 рецептора (например,номер доступа Genebank X03363) на клеточной поверхности, таким образом, что антитело против HER2 способно связываться со злокачественной опухолью. В настоящем описании термин "метка" относится к детектируемым соединению или композиции,конъюгированным непосредственно или непрямым способом с полипептидом. Метка может сама по себе обнаруживаться (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое изменение детектируемых соединения-субстрата или композиции. В настоящем описании термины "контрольный элемент, контрольная последовательность" и "регуляторный элемент" относятся к генному элементу, который контролирует определенный аспект экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, промотор представляет собой регуляторный элемент, который способствует инициации транскрипции действующего присоединенного кодирующего участка. Другие регуляторные элементы включают сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, сигналы терминации и т.д. Контрольные элементы, которые являются подходящими для прокариот, например, включают промотор, необязательно оператор последовательности, и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры. В настоящем описании нуклеиновая кислота является "функционально присоединенной", если ее помещают в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если она расположена таким образом, что способствует трансляции. В предпочтительных вариантах осуществления "функционально связанный" означает, что присоединенные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторного лидера, смежными и в рамке считывания. Однако энхансеры, например, не обязательно должны быть смежными. Присоединение может достигаться, например, путем лигирования в традиционных сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, могут использоваться синтетические адапторы или линкеры олигонуклеотида в соответствии с традиционной практикой. В настоящем описании выражения "клетка", "линия клеток" и "культура клеток" используются- 23009746 взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают клетку первичного субъекта и полученные из нее культуры безотносительно к количеству переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по составу ДНК вследствие произвольных или случайных мутаций. Также предусмотрено мутантное потомство, которое обладает такими же функциями или биологической активностью, которые были показаны скринингом для первоначально трансформированной клетки. Если подразумеваются разные обозначения, это будет понятно из контекста. В настоящем описании термин "исследуемое вещество" относится к веществу, которое подлежит анализу. Предпочтительно исследуемое вещество представляет собой участок Fc, содержащий полипептид, который подлежит анализу на предмет способности связываться с рецептором Fc. В настоящем описании термин "рецептор" относится к полипептиду, способному связываться по меньшей мере с одним лигандом. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор на поверхности клетки или растворимый рецептор, содержащий внеклеточный лиганд-домен связывания и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или мембранный якорь). Рецептор, подлежащий оценке в анализах, раскрытых в настоящем описании, может быть интактным рецептором, его фрагментом или производным (например, слитый белок, который включает домен связывания рецептора, который используется с одним или больше гетерологичными полипептидами). Более того, рецептор, подлежащий оценке на предмет свойств связывания, может существовать в клетке или изолированно и необязательно быть нанесенным на аналитический планшет или какую-либо другую твердую фазу или непосредственно помечен, и который используется как зонд. В настоящем описании фраза "СНО-экспрессированный полипептид" относится к полипептиду, который был рекомбинантным способом экспрессирован в клетках яичника китайского хомяка (СНО). В настоящем описании термин "заболевание, которое отвечает на антитело" относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, которое лечится, по крайней мере, частично с помощью лечения антителами. Примеры такого заболевания и медицинских состояний включают без ограничения лимфому (лечится с помощью RITUXAN), инфекционные заболевания (лечатся с помощью SYNAGIS),почечный трансплантат (ZENAPAX обладает полезным эффектом), болезнь Крона и ревматоидный артрит (лечится с помощью REMICADE), карциному молочной железы (лечится с помощью HERCEPTIN) и рак толстого кишечника (лечится с помощью EDRECOLOMAB). В настоящем описании термин "заболевание, которое отвечает на иммуноадгезин" относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, которое лечится, по меньшей мере, частично терапией иммуноадгезином. В настоящем описании вариант полипептида, который "опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно", чем исходное антитело, представляет собой полипептид, который in vitro или in vivo значительно более эффективен в опосредовании ADCC, когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в анализе, по существу являются сходными. Например, такой вариант вызывает лизис большего количества клеток-мишеней в данном анализе ADCC, чем исходный полипептид в идентичном анализеADCC. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением анализа ADCC, но другие анализы или методы определения активности ADCC также могут использоваться (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида от приблизительно в 1,2, 1,5, 50, 100 раз, приблизительно в 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании ADCC, чем исходный полипептид. В настоящем описании вариант полипептида, который "опосредует зависящее от антител истощение В-клеток из цельной крови более эффективно", чем исходное антитело представляет собой полипептид, который in vitro или in vivo значительно более эффективен в опосредовании истощения В-клеток,когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в анализе, по существу являются сходными. Например, такой вариант вызывает более высокую степень истощения Вклеток в данном анализе, чем исходный полипептид в идентичном анализе. Кроме того, такой вариант может истощать В-клетки в такой же степени, но при более низких концентрациях, чем те, которых требует исходный полипептид в идентичном анализе. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением анализа ADCC, но также могут использоваться другие анализы или методы определения активности ADCC (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления усиление истощения относительно исходного полипептида не зависит от генотипа FcRIIIa в положении 158 (V или F) и генотип FcRIIa в положении 131 (Н или R), и полипептидный вариант приблизительно в 1,2 раза, 1,5 раза, 50 раз, 100 раз, приблизительно в 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании истощения В-клеток, чем исходный полипептид. Термин "симптомы заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин" относится к симптомам, как правило, связанным с конкретным заболеванием. Например, симптомы, которые обычно связаны с болезнью Крона, включают: боль в животе, диарею, ректальное кровотечение, снижение массы тела, лихорадку, снижение аппетита, обезвоживание, анемию, вздутие живота, фиброз, воспаление кишечника и истощение. Фраза "при таких условиях, что симптомы ослабляются" относится к любой степени качественного- 24009746 или количественного ослабления детектируемых симптомов любого заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин, включая без ограничения детектируемое влияние на скорость выздоровления от заболевания (например, скорость увеличения массы тела) или ослабление по меньшей мере одного из симптомов, которые обычно сопровождают конкретное заболевание (например, если заболевание,которое отвечает на антитело или иммуноадгезин, представляет собой болезнь Крона, ослабление по меньшей мере одного из следующих симптомов: боли в животе, диареи, ректального кровотечения, снижения массы тела, лихорадки, снижения аппетита, обезвоживания, анемии, вздутия живота, фиброза,воспаления кишечника и истощения). Подробное описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает варианты участка Fc полипептида и олигонуклеотидов, кодирующие варианты участка Fc. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способы идентификации применяемых вариантов участка Fc и способы применения вариантов участка Fc для лечения заболевания. Описание изобретения изложено ниже в следующих разделах: I) участки Fc антитела; II) варианты участка Fc; III) комбинированные варианты; IV) анализы варианта полипептида; V) показательные молекулы, содержащие вариант участка Fc;VI) нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты участка Fc; VII) терапевтическое применение и препараты; VIII) дополнительное применение вариантов участка Fc.I. Участки Fc антитела Как описано выше, антитела содержат участки, в основном участки СН 2 и CH3, которые принимают участие в других функциях, помимо связывания антигенов. Взятые вместе, такие участки собирательно известны как участок Fc и выполняют некоторые эффекторные функции, опосредованные связыванием эффекторных молекул. Эффекторные функции, опосредованные участком Fc антитела, могут быть разделены на две категории: (1) эффекторные функции, которые выполняются после связывания антитела с антигеном (такие функции включают, например, участие каскада комплемента или клеток, несущих рецептор Fc (FcR; и(2) эффекторные функции, которые выполняются независимо от связывания антигена (эти функции обеспечивают, например, удержание в циркуляции и способность проникать через клеточные барьеры путем трансцитоза). Например, связывание компонента С 1 комплемента с антителами активирует систему комплемента. После опсокизации активация комплемента играет важную роль в лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента стимулирует воспалительную реакцию и может также вовлекаться в аутоиммунные реакции гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками через участок Fc, с сайтом связывания с рецептором Fc на участке антитела Fc, который связывается с рецепторомFcR (FcR) на клетке. Существует большое количество рецепторов Fc, которые являются специфичными для антител различных классов, включая IgG (гамма рецепторы), IgE (эта рецепторы), IgA (альфа рецепторы) и IgM (мю рецепторы). Хотя настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом,связывание антитела с рецепторами Fc на поверхности клеток запускает множество важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, выведение иммунных комплексов, лизис клетками-киллерами покрытых антителами клеток-мишеней (так называемую антитело-зависимую клеточную цитотоксичность или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль выработки иммуноглобулина. Некоторые эффекторные функции антитела опосредуются рецепторами Fc (FcRs), которые связываются с участком Fc антитела. FcRs определяются их специфичностью по отношению к изотипам иммуноглобулина; Fc рецепторы антител IgG обозначают как FcR, IgE как FcR, IgA как FcR и т.д. Были идентифицированы три подкласса FcR: FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII (CD16). Поскольку каждый подкласс FcR кодируется двумя или тремя генами, и альтернативный сплайсинг РНК приводит к образованию множества транскриптов, существует широкое разнообразие изоформFcR. Три гена, кодирующие подкласс FcRI (FcRIA, FcRIB и FcRIC), собраны в кластер в области 1q21.1 длинного плеча хромосомы 1; гены, кодирующие FcRII изоформы (FcRIIA, FcRIIB и FcRIIC),и два гена, кодирующие FcRIII (FcRIIIA и FcRIIIB), собраны в кластер в области 1q22. Указанные различные подтипы FcR экспрессируются на различных типах клеток (см., например, Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991. Например, у людей, FcRIHB наблюдаются только на нейтрофилах, тогда как FcRIIIA наблюдаются на макрофагах, моноцитах, природных клетках-киллерах (NK) и субпопуляции Т-клеток. Следует отметить, что FcRIIIA присутствует на клетках NK, одном из видов клеток, вовлеченных в ADCC. Рецептор FcRIIIA (CD16) человека обладает распространенным полиморфизмом в положении 158 во внеклеточном домене, который кодирует фенилаланин или валин в этом положении. Аллель VFcRIIIA имеет более высокое сродство к IgG1 человека, чем аллель F. Аллель V158 также опосредуетADCC более эффективно. Данные клинических исследований показали корреляцию между генотипом рецептора FcRIII у пациентов, получающих лечение Ритуксаном (Rituxan), и терапевтическим ответом. Продемонстрировано, что клинический и молекулярный ответ, а также период до прогрессирования были лучше у пациентов, гомозиготных по генотипу FcRIIIA-158V (приблизительно 20% населения). И- 25009746 наоборот, пациенты, гетерозиготные или гомозиготные по гену FcRIIIA-158F, определяющим более низкое сродство (приблизительно 80% населения), отвечают хуже. Эти данные указывают на то, что мутации Fc, которые усиливают активность ADCC носителей 158F, могут усиливать клиническую эффективность лечения злокачественной опухоли с помощью антител. Генный полиморфизм также присутствует в рецепторе FcRIIA (CD32) человека в положении 131 во внеклеточном домене, который кодирует гистидин (Н) или аргинин (R) в этом положении. Обнаружено, что полиморфизм в положении 131 влияет на способность связываться с IgG человека. Недавно полученные данные также показывают корреляцию между полиморфизмом FcRIIA в положении 131 и клиническим ответом на Ритуксан (Rituxan). Пациенты, гомозиготные по аллели Н 131, давали значительно более высокую частоту ответа, чем 2 другие группы.FcRI, FcRII и FcRIII представляют собой рецепторы надсемейства иммуноглобулинов (IgSF);FcRI содержит три домена IgSF во внеклеточном домене, тогда как FcRII и FcRIII содержат только дваIgSF домена среди внеклеточных доменов. Другой тип рецептора Fc представляет собой рецептор Fc новорожденных (FcRn). FcRn является структурно сходным с главным комплексом гистосовместимости (МНС) и состоит из -цепи, нековалентно связанной с 2-микроглобулином.II. Варианты участка Fc Настоящее изобретение обеспечивает варианты полипептида, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты полипептида, и способы создания вариантов полипептида. Предпочтительно, варианты полипептида по данному изобретению отличаются от исходного полипептида по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. "Исходный", "дикого типа", "начальный" или "невариантный" полипептид предпочтительно включает по меньшей мере часть участка Fc антитела и может быть получен с применением методик, доступных из уровня техники для создания полипептидов, включающих участок Fc или его часть. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид представляет собой антитело. Исходный полипептид может, однако, быть любым другим полипептидом,который включает по меньшей мере часть участка Fc (например, иммуноадгезин). В определенных вариантах осуществления вариант участка Fc может быть создан (например, в соответствии со способами,раскрытыми в настоящем описании) и может использоваться для выбранного гетерологичного полипептида, такого как вариабельный домен антитела или домен связывания рецептора или лиганда. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc или его функциональную часть. Как правило, участок Fc исходного полипептида будет включать участок Fc с нативной последовательностью и предпочтительно нативную последовательность участка Fc человека. Однако участок Fc исходного полипептида может содержать одно или несколько предварительно существовавших изменений или модификаций аминокислотной последовательности в сравнении с нативной последовательностью участка Fc. Например, C1q-связывающая активность участка Fc может быть предварительно изменена или FcR связывающая активность участка Fc может быть изменена. В дополнительных вариантах осуществления исходный участок Fc полипептида является схематичным (например,умственное размышление или визуальное представление на компьютере или на бумаге) и, хотя он физически не существует, конструктор антител может выбрать желаемый вариант аминокислотной последовательности участка Fc и создать полипептид, включающий такую последовательность или ДНК, кодирующую желаемый вариант аминокислотной последовательности участка Fc. Однако в предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая участок Fc исходного полипептида,доступна, и данную последовательность нуклеиновой кислоты изменяют для создания варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант участка Fc. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант исходного полипептида, может быть приготовлена способами, известными из уровня техники, с использованием указаний данного описания для конкретных последовательностей. Такие способы включают без ограничения получение путем сайт-специфического(или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР-мутагекеза и кассетного мутагенеза ранее полученной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Сайт-специфический мутагенез представляет собой предпочтительный способ получения вариантов. Данная техника хорошо известна из уровня техники (см., например, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) и Kunkel et. al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82: 488 (1987), каждая из которых включена посредством ссылки). Вкратце, при осуществлении сайт-специфического мутагенеза ДНК, исходную ДНК изменяют, во-первых, одновременно гибридизацией одного или больше олигонуклеотида(ов), кодирующего желаемую мутацию(и) для одной цепи такой исходной ДНК. После гибридизации ДНК-полимераза используется для синтеза полной второй цепи,с использованием гибридизованного олигонуклеотида(ов) в качестве праймера, с использованием одиночной цепи исходной ДНК в качестве шаблона, и ДНК-лигаза используется для лигирования второй цепи с образованием кольцевой, двухцепочечной ДНК. Таким образом, олигонуклеотид, кодирующий желаемую мутацию, встраивается в полученную двухцепочечную ДНК. ПЦР-мутагенез также подходит для получения вариантов аминокислотной последовательности исходного полипептида (см., например, Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989), таким образом,- 26009746 включена как ссылка). Вкратце, если в качестве исходного материала для ПЦР используют малые количества матричной ДНК, праймеры, которые слегка отличаются по последовательности от соответствующего участка в матричной ДНК, могут быть использованы для получения относительно больших количеств специфичного фрагмента ДНК, который отличается от последовательности матрицы только в положениях, в которых праймеры отличаются от матрицы. Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на методике, описанной Wellset al., Gene 34: 315-323 (1985), которая включена сюда посредством ссылки. Исходное вещество представляет собой плазмиду (или другой вектор), который включает ДНК исходного полипептида, подлежащую мутации. Идентифицируют кодон(ы) в исходной ДНК, подлежащие мутации. С каждой стороны идентифицированного сайта(ов) мутации должен находиться уникальный сайт рестрикции. Если такие сайты рестрикции отсутствуют, они могут быть созданы с использованием описанного выше метода олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза для введения их в надлежащие места в ДНК исходного полипептида. ДНК-плазмиды разрезают в этих местах для линеаризации. Двухцепочечный олигонуклеотид,кодирующий ДНК между сайтами рестрикции и содержащий желаемую мутацию(и), синтезируют с использованием стандартных методик, где две цепи олигонуклеотида синтезированы отдельно и затем гибридизованы вместе с использованием стандартных техник. Этот двухцепочечный нуклеотид обозначается как кассета. Данная кассета сконструирована таким образом, что содержит 5'- и 3'-концы, совместимые с концами линеаризованной плазмиды, таким образом, что она может быть непосредственно лигирована в плазмиду. Данная плазмида теперь содержит мутантную последовательность ДНК. Альтернативно или дополнительно, желаемая аминокислотная последовательность, кодирующая вариант полипептида, может быть определена, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая такой вариант аминокислотной последовательности, может быть создана синтетическим путем. Аминокислотная последовательность исходного полипептида может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант участка Fc с измененной активностью связывания Fc рецептора или активностью in vitro и/или in vivo, и/или измененной активностью, зависящей от антител клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) in vitro и/или in vivo. Аминокислотная последовательность исходного полипептида также может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант участка Fc с измененными свойствами связывания комплемента и/или периодом полувыведения из циркуляции. Значительные модификации биологических свойств участка Fc могут достигаться путем выбора вариантов замены, которые значительно отличаются по действию на изменение (а) структуры скелета полипептида в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или объема боковой цепи, (d) взаимодействия с углеводом или(е) гибкости движений домена. Остатки природного происхождения делят на классы на базе общих свойств боковой цепи:(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и(6) ароматические: trp, tyr, phe. Неконсервативные варианты замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на член другого класса. Консервативные варианты замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на другого члена того же класса. Как показано в примерах ниже, можно создать вариант участка Fc с измененной активностью (эффекторная функция (b) и фармакокинетика). Можно, например, модифицировать один или больше аминокислотных остатков участка Fc с целью изменения (например, увеличение или уменьшение) активности ADCC. В предпочтительных вариантах осуществления модификация включает один или больше остатков участка Fc, идентифицированных в настоящем описании (см., например, пример 2, и WO0042072,включена как ссылка для всех целей). В общем, будет осуществлено замещение аминокислоты в одном или более остатках участков Fc, идентифицированных в настоящем описании как влияющие на активность ADCC для того, чтобы создать такой вариант участка Fc. В предпочтительных вариантах осуществления не более чем от 1 до приблизительно 10 остатков на участке Fc будут удалены или заменены. В настоящем описании участок Fcs, который включает одну или больше модификаций аминокислот (например, замен), предпочтительно будет сохранять по меньшей мере приблизительно 80%, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, исходной последовательности участка Fc или нативной последовательности участка Fc человека. Можно также приготовить варианты участка Fc с вставкой аминокислот, которые будут вариантами с измененной эффекторной функцией. Например, можно ввести по меньшей мере один аминокислотный остаток (например, один или два аминокислотных остатка и, в общем, не более 10 остатков) смежно с одним или больше положениями участка Fc, идентифицированными в настоящем описании как влияющие на связывание с FcR. "Смежно" означает в пределах одного или двух аминокислотных остатков уча- 27009746 стка Fc, идентифицированного в настоящем описании. Такие варианты участка Fc могут демонстрировать усиленное или ослабленное связывание с FcR и/или активности ADCC по отношению к исходной молекуле. С целью создания таких вариантов вставки можно оценить сокристаллическую структуру полипептида, который включает участок связывания с FcR (например, внеклеточный домен интересующегоFcR) и участок Fc, в который должен быть вставлен аминокислотный остаток(ки) (см., например, Sondermann et al. Nature 406:267 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-2370 (1981); и Burmeister et al.,Nature 342: 379-383, (1994), все из которых включены как ссылки) с целью рационализации проектирования варианта участка Fc, например, с улучшенной способностью связывания FcR. В предпочтительных вариантах осуществления такая вставка(и) осуществлена на участке Fc петли, но не во вторичной структуре (т.е. в -цепи) участка Fc. Путем введения подходящей модификации(й) последовательности в исходном участке Fc можно создать вариант участка Fc, который (а) опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность(ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более или менее эффективно, и/или (b) опосредует зависящую от комплемента цитотоксичность (CDC) в присутствии комплемента человека более или менее эффективно, и/или (с) связывает Fc гамма рецептор (FcR) или рецептор Fc новорожденных (FcRn) с желаемым сродством при других значениях рН, чем исходный полипептид. Такие варианты участка Fc будут, в общем, включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc. В предпочтительных вариантах осуществления исходный участок Fc полипептида представляет собой участок Fc человека, например природный участок Fc IgG1 человека (f и a, z аллотипы), IgG2, IgG3,IgG4 и все аллотипы, известные или обнаруженные в любых видах. Такие участки имеют последовательности SEQ ID NO:1-8, SEQ ID NO:9-12 и SEQ ID NO:32-37. В определенных вариантах осуществления с целью создания участка Fc с улучшенной ADCC активностью исходный полипептид предпочтительно имеет предварительно существовавшую ADCC активность (например, исходный полипептид включает человеческий IgG1 или участок Fc человеческогоIgG3). В некоторых вариантах осуществления вариант с улучшенным ADCC опосредует ADCC значительно более эффективно, чем антитело с нативной последовательностью IgG1 или участок Fc IgG3 (например, P247L и I332E варианты). В предпочтительных вариантах осуществления модификацию(и) аминокислоты вводят в домены СН 2 и/или CH3 участка Fc. Примененные положения аминокислот для модификации с целью создания варианта участка Fc IgG с измененной ADCC активностью включают любое одно или несколько положений аминокислот: 247, 251, 256, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294,295, 296, 298, 300 301, 303, 305, 307, 309, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 360, 373, 376,416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439 или 440 участка Fc. В предпочтительных вариантах осуществления исходный участок Fc, используемый как матрица для создания таких вариантов, включает участок Fc IgG человека. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой P247L. В других вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой P247I или Р 247 Н. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой L251F. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Т 256 М или Т 256 Р. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой H268D или Н 268 Е. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой D280A или D280K.- 28009746 В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А 330 К или A330R. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой I332D, I332E, I332K или I332R. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А 339 Т. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой A378D. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой S440Y. Описанные выше варианты полипептида могут подвергаться дальнейшим модификациям, в зависимости от желаемого или предусмотренного применения полипептида. Такие модификации могут включать, например, дальнейшее изменение аминокислотной последовательности (замена, вставка и/или делеция аминокислотных остатков), модификации углеводов, слияние с гетерологичным полипептидом(ами) и/или ковалентные модификации. Такие дополнительные модификации могут быть осуществлены до, одновременно или после модификации аминокислоты(ы), раскрытой выше, которая ведет к изменению связывания с рецептором Fc и/или активности ADCC. Альтернативно или дополнительно может быть полезно сочетать модификации аминокислот с одной или больше дополнительными модификациями аминокислот, которые изменяют связывание C1q и/или функцию зависящей от комплемента цитотоксичности участка Fc. Особенно интересный исходный полипептид в настоящем описании представляет собой такой, который связывается с C1q и который демонстрирует комплемент-зависящую цитотоксичность (CDC). Варианты замены аминокислот, раскрытые в настоящем описании, могут служить для изменения способности исходного полипептида связываться с C1q и/или модификации его функции комплемент-зависящей цитотоксичности (например,уменьшать и предпочтительно устранять такие эффекторные функции). Однако полипептиды, которые включают варианты замены в одном или более описанных положений с улучшенным связыванием C1q и/или функцию комплемент-зависящей цитотоксичности (CDC), рассматриваются в настоящем описании. Например, исходный полипептид может быть не способен связываться с C1q и/или опосредоватьCDC и может быть модифицирован в соответствии с указаниями в настоящем описании таким образом,что он приобретает эти дополнительные эффекторные функции. Более того, полипептид с предварительно существующей активностью связывания C1q, необязательно дополнительно обладающий способностью опосредовывать CDC, может быть модифицирован таким образом, что один или оба из этих видов активности усиливаются. Аминокислотные последовательности, которые изменяют C1q и/или модифицируют его функцию комплемент-зависимой цитотоксичности, описаны, например, в WO0042072, которая, таким образом, включена как ссылка. Как было описано выше, можно сконструировать участок Fc или его часть с измененной эффекторной функцией, например, путем модификации активности CDC и/или активности ADCC. Например,можно создать вариант участка Fc с улучшенной CDC активностью и улучшенной ADCC активностью(например, с улучшенной активностью ADCC и улучшенной активностью CDC). Альтернативно, если будет желательным снижение или устранение эффекторной функции, можно сконструировать вариант участка Fc со сниженной CDC активностью и/или сниженной ADCC активностью. В других вариантах осуществления можно повысить только один из этих видов активности и необязательно также снизить другой вид активности, например, для создания участка Fc с улучшенной ADCC активностью, но сниженной активностью CDC и наоборот. Кроме того, можно создать вариант участка Fc, обладающего модифицированным сродством связывания с FcRn, белком А и/или другими белками, которые связываются с Fc. Другой вид замены аминокислот служит для изменения структуры гликозилирования полипептида.- 29009746 Это может быть достигнуто, например, путем удаления одного или больше углеводных остатков, связанных с полипептидом, и/или добавлением одного или больше сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в полипептиде. Альтернативно, этого можно достигнуть непрямым способом, путем изменения аминокислот, не являющихся сайтом гликозилирования или проектированием клеток. Гликозилирование полипептидов обычно является N-связанным или О-связанным. N-Связанный относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Пептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих пептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. ОСвязанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалоктазамина,галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут быть использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление сайтов гликозилирования к полипептиду традиционно сопровождается изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит один или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменения также могут быть осуществлены путем добавления (или замещения) одного или больше остатков серина или треонина к последовательности оригинального полипептида (для О-связанных сайтов гликозилирования). Показательный вариант гликозилирования содержит замену аминокислоты остатка Asn 297 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию остатка поверхностной аминокислоты (см., например, Deisenhofer, Biochemistry,28;20(9):2361-70, April 1981, и WO0042072, каждая из которых включена сюда посредством ссылки). В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию остатка не поверхностной аминокислоты. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию поверхностной аминокислоты и по меньшей мере одну модификацию не поверхностной аминокислоты.III. Комбинированные варианты В некоторых вариантах осуществления варианты по настоящему изобретению включают две или больше модификаций аминокислот (например, замен). Такие комбинированные варианты могут быть получены, например, путем выбора двух или больше модификаций аминокислот, описанных выше. В таблице 1 ниже приведены примерные комбинации замен двух или больше аминокислот. Например, первый ряд таблице 1 показывает возможные комбинации Р 247 Н с заменой другой аминокислоты в положениях 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 и 440 (таким образом, данный ряд показывает комбинации двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти и десяти модификаций аминокислот).