Полипептид r1, обеспечивающий устойчивость растений к патогенам, кодирующая его нуклеотидная последовательность и способы их применения

008599 Данное изобретение относится к гену устойчивости R1 из картофеля. Оно также относится к способам и материалам, использующим этот ген, и способам идентификации или выработки других родственных генов. Оно также относится, в целом, к способам идентификации соединений для защиты растений,способных индуцировать ген R1 или активность кодируемого им протеина. Кроме того, данное изобретение относится к трансгенным растениям, которые становятся устойчивыми к фитофторозу картофеля в результате экспрессии трансгена R1. Некоторые документы упомянуты в тексте данного описания в виде названий. Полные библиографические ссылки можно найти в конце описания перед формулой изобретения. Каждый из документов,упоминаемых здесь (включая описания производителей, инструкции и т.д.), включен в данную заявку в виде ссылки; однако, это не является признанием того, что какой-либо из упомянутых документов является прототипом данного изобретения. Фитофтороз картофеля представляет собой наиболее опасное заболевание выращиваемого картофеля во всем мире, приносящим миллиардные убытки каждый год (Kamoun et al. 1999). Патогеном, вызывающим это заболевание, является Phytophthora infestans, оомицетный гриб, поражающий также томаты(Judelson 1997). Полное уничтожение урожая картофеля фитофторозом вызвало "ирландский картофельный голод" в середине XIX века (Salaman 1985) и активизировало поиск устойчивых растений. Одиночные гены устойчивости к фитофторозу (R-гены) были открыты почти 100 лет назад в S. derrnssum, диком сорте картофеля, произрастающем в Мексике. Интрогрессия R-генов в культурные сорта картофеля принесла расоспецифическую устойчивость, однако, лишь временную устойчивость к фитофторозу, поскольку новые расы быстро преодолевали устойчивость, опосредованную R-геном (Wastie 1991, Fry andGoodwin 1997). Количественная или полевая устойчивость к фитофторозу также была идентифицирована в диких сортах картофеля (Ross 1986). Эта устойчивость более длительная, чем опосредованная Rгенами, но трудно переносится в культурные сорта путем скрещивания и фенотипической селекции. Борьба с фитофторозом все еще осуществляется, главным образом, путем частого нанесения фунгицидов, которые теряют эффективность в результате выведения фунгицид-устойчивых изолятов. Некоторыеet al. 1992, El-Kharbotly et al. 1994, 1996, Li et al. 1998, Ewing et al. 2000, Naess et al. 2000). R1 расположен в хромосоме V (Leonards-Schippers et. al. 1992) в области, где также были картированы гены устойчивости к Potato virus X (картофельному вирусу X) (Ritter et al. 1991, De Jong 1997). Одна и та же область содержит основные локусы количественных признаков (QTL) устойчивости к паразитической корневой нематоде Globodera pallida (Kreike et al. 1994, Rouppe van der Voort et al. 1997, 2000) и фитофторозу(Leonards-Schippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999, Collins 1999). Присутствие "горячей точки" генов устойчивости предполагает их эволюцию из общего предшественника путем локальной генной дупликации с последующей функциональной диверсификацией (Leonards-Schippers et al. 1994, Leister et al. 1996, Oberhagemanh et al. 1999, Gebhardt and Valkonen 2001). Если это так, молекулярное клонирование гена R1 должно открыть возможности изучения на молекулярном уровне нескольких факторов картирования этой области и регулирования качественной и количественной устойчивости к различным патогенам. Таким образом, техническая задача данного изобретения состояла в удовлетворении потребности в растительных генах устойчивости к патогенам и их регуляторных последовательностях. Решение этой технической задачи достигается путем создания вариантов осуществления, определенных в формуле изобретения и подробно описанных ниже. По данному изобретению был клонирован и описан на молекулярном уровне R1, первый ген устойчивости к фитофторозу. Этот ген был идентифицирован путем специального комбинированного позиционного клонирования и с использованием подхода на основе генов-кандидатов. Молекулярная структура гена позволяет отнести R1 к растительным генам устойчивости, содержащим законсервированный NBSLRR и лейцин-зипперный мотивы (Ellis et al. 2000, Dangl and Jones 2001).R1 был клонирован с использованием стратегии позиционного клонирования в сочетании с поиском генов-кандидатов, имеющих сходство ДНК-последовательности с известными растительными генами устойчивости (Hammond-Kosack and Jones 1997, Ellis et al. 2000). Подобный подход оказался успешным для клонирования картофельных генов устойчивости к Potato Virus X (Rx1, Bendahmane et al. 1999) и корневой нематоде Globodera pallida (Gpa2, Van der Vossen et al. 2000). "Прогулка по хромосоме" к R1 была инициирована от двух маркерных локусов SPUD237 и AFLP1, фланкирующих R1 на коротких генетических расстояниях 0,1 сМ. Однако прогулка от маркера AFLP1 оказалась непродуктивной из-за дефицита клонов ВАС и YAC (Leister et al. 1997), содержащих маркер AFLP1. Идентификацию картофельных геномных клонов с перекрывающимися инсерциями облегчили при помощи ВАС-технологии в сочетании с использованием макромассивов клонов ВАС. Применение этого подхода было успешным для риса (Nakamura et al. 1997, Yang et al. 1997, Yang et al. 1998) и томатов (Folkertsma et al. 1998). Физическая карта (фиг. 1) охватывает по меньшей мере 250 kb генома картофеля. Около 200 kb представляли собой кандидатную область на содержание гена R1, исходя из связи без рекомбинации с концевыми маркерами ВАС. Эта кандидатная область была открытой на концах по отношению к локусу AFLP1, поскольку единственное рекомбинационное событие, отделяющее R1 и AFLP1, не было включено в физическую карту. Частичная информация последовательности из кандидатной области идентифицировалаRGL-фрагмент гена, "подобный" гену устойчивости, что позволило выявить семейство генов, члены которого присутствуют в обеих хромосомах, несущих аллель восприимчивости r1 или аллель устойчивостиR1. Фактически, RGL-зонд, используемый для идентификации кДНК и ВАС-клонов R1, был частью аллели восприимчивости r1. Анализом на основе аллельспецифической ПЦР выведенной из кДНК-клона кодирующей части R1 было выявлено, что функциональный член семейства генов-кандидатов присутствует в растениях, содержащих аллель устойчивости R1, и отсутствует в восприимчивых растениях. Этот ген-кандидат субклонировали из ВАС BA87d17 и стабильно трансформировали в восприимчивый культурный сорт Desire. Комплементация фенотипа R1 в нескольких трансгенных растениях показала, что ген-кандидат, в самом деле, представлял собой ген R1. Таким образом, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид,который способен придавать устойчивость к патогену растению, в котором упомянутый полипептид экспрессируется, при этом указанная нуклеиновая кислота содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей:(R1), который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;(b) нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере одну или более кодирующих областей последовательности ДНК SEQ ID NO: 1;(c) нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, определенной в (а) или (b) в жестких условиях гибридизации;(d) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, полученный из полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (b), путем замещения, делеции и/или присоединения одной или нескольких аминокислот;(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидными последовательностями (а) или (b);(f) нуклеотидную последовательность, кодирующую один, или любые два, или три домена, выбранных из домена "лейциновой молнии" (LZ), соответствующего аминокислотным положениям 308-329SEQ ID NO: 2, домена сайта нуклеинового связывания (NBS), соответствующего аминокислотным положениям 572-682 SEQ ID NO: 2, и домена, богатого лейциновыми повторами (LRR), соответствующего аминокислотным положениям 780-1280 SEQ ID NO: 2;(g) нуклеотидную последовательность, кодирующую эпитопнесущую часть полипептида R1, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (b);(h) нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности любого из пп.(а)-(g);(i) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий один или более мотивов, приведенных в SEQ ID NO: 10 и 12, приведенных на фиг. 4, или аминокислотную последовательность LHD;(j) последовательность ДНК, полученную путем скрининга соответствующей библиотеки в жестких условиях при помощи зонда, включающего по меньшей мере 17 последовательно расположенных нуклеотидов любой нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или 5-8;(k) нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент по меньшей мере из 6 последовательных аминокислот протеина, кодируемого нуклеотидной последовательностью (а) или (b); и(l) нуклеотидную последовательность, полученную из любой нуклеотидной последовательности(а)-(i), на основе принципа вырожденности генетического кода. В первом аспекте данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, способный придавать устойчивость к патогену, например к грибкам в растении, в котором упомянутый полипептид экспрессируется. Молекулы нуклеиновой кислоты по данному изобретению могут иметь рекомбинантную форму или форму, свободную или, в основном, свободную от нуклеиновых кислот или генов представляющего интерес вида или источника, отличающихся от последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией. Молекулы нуклеиновой кислоты и кодируемые ими полипептидные продукты также могут быть (i) изолированы и/или очищены из их природной среды (не обязательно в чистой форме), или (ii) в чистой (в основном) форме или гомогенной форме. Нуклеиновая кислота по изобретению может включать кДНК, РНК, геномную ДНК, предпочтительно целый ген, и может быть полностью или частично синтетической (конструктов). Если последовательность ДНК определена, например имеет ссылку на некоторую aигуру или последовательность (SEQID NO), то, если контекст не требует иного, она включает РНК-эквивалент с замещениями U на Т там,где они есть. Также включается комплемент различных описанных последовательностей, который может быть использован в опытах с зондированием или в даунрегуляции последовательности. Отдельным аспектом данного изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, имеющая последовательность, которая является полностью или частично последовательностью, показанной в SEQ ID-2 008599 явно присутствует большая открытая рамка считывания (ORF). Дальнейшее сравнение последовательности геномной ДНК с последовательностью кДНК показало, что ген содержит три экзона и три интрона; см. пример 5 и фиг. 4. Предполагаемая полипептидная последовательность R1 показана на фиг. 4 и обозначена SEQ ID NO: 2. Предположительно, R1 содержит 1293 аминокислотных остатка и имеет молекулярную массу 149,4 кДа. Отдельные молекулы нуклеиновй кислоты по данному аспекту изобретения включают такие молекулы, которые кодируют протеиновый продукт R1 и кДНК, предположительно основания 2223-6321, исключая интроны, обозначенные, как показано на схеме (4878-4970 и 6130-6229 включительно). Неожиданно первичная структура R1 оказалась сходной со структурой R-протеинов класса L. Zipl NBS-LRR (Hammond-Kosack and Jones 1997). Исходя из дедуцированной протеиновой последовательности, R1 принадлежит к классу L.Zip/NBS/LRR растительных генов устойчивости(Hammond-Kosack and Jones 1997). Лейциновый зипперный мотив (L.Zip) в аминоконцевой области предположительно является признаком димеризации или взаимодействия с другими протеинами. Находящийся ниже предполагаемый домен сайта нуклеотидного связывания (NBS) может быть задействован в пути трансдукции сигнала, что приводит к выработке реакции устойчивости. C-концевой повторяющийся домен, богатый лейцином (LRR), совпадает с консенсусной последовательностью цитоплазматического домена LRR, описанного Jones and Jones (1997), и может функционировать в протеин-протеиновых взаимодействиях и связывании лигандов. Доказано, что домены LRR аллелей гена устойчивости L к ржавчине льна определяют узнавание специфических рас патогена (Ellis et al. 1999). Предсказание insilico четырех сайтов миристилирования и 43 сайтов фосфорилирования в последовательности R1 предполагает возможное прикрепление протеина R1 к плазматической мембране и участие этапов фосфорилирования/дефосфорилирования, соответственно, в трансдукции сигнала (Dangi and Jones 2001).R1 расположен на короткой ветви хромосомы V (Leonards-Schippers et al. 1992, Dong et al. 2000) и представляет собой последовательность, родственную гену устойчивости Prf томата к Pseudomonas syringae,который расположен в хромосоме 5 томата внутри кластера генов устойчивости Pto/Fen (Salmeron et al. 1996). Хромосомы 5 картофеля и томата являются колинеарными друг другу, за исключением парацентрической инверсии короткой ветви (Tanksley et al. 1992). Локус картофеля StPto, соответствующий картам Pto/Fen, более чем на 10 сМ ближе к R1 (Leister et al. 1996), поэтому исключается возможность того,что R1 и Prf расположены в колинеарной геномной области. Однако именно так обстоит дело при рассмотрении гена Bs4 томата, придающего устойчивость к бактериальному патогену Xanthomonas campestris. Предположение о местонахождении локуса катофеля, соответствующего Bs4, может быть сделано исходя из тесной связи (1 сМ) между Bs4 и маркером TG432 (Ballvora et al. 2001), который расположен на 3,8 сМ от GP21 в молекулярной карте томата (Tanksley et al. 1992). Эта область хромосомы томата 5, которая расположена дальше от маркера GP21, должна быть колинеарна с интервалом картофеля GP21-GP179,включающим R1, с учетом парацентрической инверсии между этими двумя геномами. Два гена устойчивости картофеля к Potato Virus X, Rx2 и Nb, также находятся в положениях, подобных R1 (Ritter et al. 1991, Leonards-Schippers et al. 1992, De Jong et al. 1997). Ген Rx2 был клонирован и, как и R1, принадлежит к классу L.Zip/NBS/LRR генов устойчивости (Bendahmane et al. 2000). Этих два гена устойчивости имеют лишь 32% идентичности последовательности и поэтому являются весьма различными членами одного суперсемейства генов. Nb расположен в интервале GP21-SPUD237 (De Jong etal. 1997), не содержащем R1, и поэтому является генетически отделенным от R1. В следующем аспекте изобретение относится к активным гомологичным вариантам последовательностей R1, которые могут быть, например, мутантами или другими производными или же природными гомологами R1, такими как аллельные варианты, паралоги (из того же вида, но на другом участке, например псевдоаллели в сцепленных локусах), или ортологи (родственные гены из разных видов). Их примеры приведены ниже. В каждом случае вариант кодирует продукт, гомологичный (подобный) R1, который может быть изолирован или выработан на основе этой последовательности и способен придавать устойчивость к одному или более патогенам. Активность гена устойчивости может быть испытана обычными способами, известными в науке, в соответствии с природой исследуемой устойчивости. Примеры испытательных методик можно найти в следующих публикациях: бактериальная устойчивость (Grant, (1995) Science 269, 843-846); устойчивость к грибам (Dixon, (1996) Cell 84, 451-459; Jones, (1994) Science 266, 789-793; Thomas, (1997) The Plant Cell 9, 2209-2224); к нематодам и вирусам (Whitham, (1994) Cell 78, 1101-1115). Как правило, активность испытывают путем комплементации признака в растении; см. пример 4. Это можно осуществить путем использования изолированного гена или, например, путем сцепления предполагаемого активного варианта с промотором и терминатором для экспрессии в растениях и трансформации его в восприимчивое растение, не имеющее признака данной устойчивости. Затем активность варианта R1 подтверждают путем проверки соответствующим патогеном. В альтернативе, для испытания активности варианта R1 может быть использован анализ временной экспрессии, аналогичный анализу, используемому Mindrinos,(1994) Cell 78, 1089-1099. В кратком изложении, предполагаемый активный вариант R1 коэкспрессируют с плазмидой, содержащей патогенпроизводный ген, который является элиситором устойчивости, определяемой исследуемым гомологом R1, и ген-репортер (например, GUS). Если при непрерывной экспрессии патогенпроизводного гена вариант R1 активируется, то произойдет HR (гомологичная рекомбинация), и-3 008599 активность гена-репортера будет уничтожена. Если активность не инициируется, то ген-репортер будет обнаружим. Подобие или гомология между вариантом и R1 может быть определена по Altschul, (1990) J. Mol.Biol. 215, 403-10, при помощи программы TBLASTN, которая в настоящее время широко используется в биотехнологии, или, и это может быть предпочтительнее, при помощи стандартной программы BestFit,являющейся частью Wisconsin Package, Version 10, January 1999 (Genetics Computer Group, 575 ScienceDrive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711), которая использовалась для расчета гомологичности последовательностей в данной заявке. Также может быть использовано программное обеспечениеDNASTAR, использующее методику CLUSTAL с таблицей масс остатков РАМ 250 (штраф за пропуск 10,длина пропуска 10). Гомология (или подобие, или идентичность) может быть на уровне нуклеотидной последовательности и/или на уровне экспрессируемой аминокислотной последовательности. Предпочтительно нуклеиновокислотная и/или аминокислотная последовательность имеет гомологию с кодирующей последовательностью или последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQID NO: 1 или другими последовательностями, описанными здесь, предпочтительно по меньшей мере на 50, или 60, или 70, или 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Гомология может быть по всей длине соответствующей последовательности, представленной здесь, или, более предпочтительно, может быть вдоль непрерывной последовательности, длиной, например, 20, 100, 200, 300, 500, 600 или более аминокислот или кодонов, в сравнении с соответствующей аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, в зависимости от обстоятельств. Предположительно существует более двух гомологов R1 в геноме картофеля. Вполне вероятно, что один или более из этих гомологов являются R-генами против вирусов, грибов, бактерий или нематод. Природные варианты R1 могут быть изолированы, в свете данного описания, без дополнительной нагрузки из любого подходящего растения. Природные варианты R1 могут быть изолированы, например,из геномной или кДНК. Предполагаемые гены устойчивости могут быть получены с использованием необходимых материалов (например, праймеров или зондов) на основе областей, специфических для R1,например, показанных на фиг. 4. Как описано в прилагаемых примерах, ген R1, идентифицированный по данному изобретению в картофеле, должен определить новый класс растительных генов устойчивости. Поэтому соответствующие гены, кодирующие протеины, которые доказывают подобные свойства,должны присутствовать также и в других растениях. Молекулы нуклеиновй кислоты по изобретению могут быть получены, например, путем гибридизации вышеописанных нуклеиново-кислотных молекул с нуклеиново-кислотными молекулами (образцами) любого происхождения. Молекулы нуклеиновй кислоты, гибридизирующиеся с вышеописанными молекулами нуклеиновой кислоты, в целом, могут быть получены из любого растения, содержащего такие молекулы, предпочтительно из двудольных растений, в частности из любого растения, представляющего интерес в сельском хозяйстве, садоводстве или лесоводстве, например из посевных культур, в частности из семейства Solanaceae, таких как картофель и томаты, но также и из таких растений, как маниока, бобовых растений, масличных растений, таких как масличный рапс, лен, и т.д., растений, накапливающих полипептиды, таких как соя, растений, накапливающих сахарозу, таких как сахарная свекла или сахарный тростник, деревьев, декоративных растений, а также растений, которые могут использоваться для производства биомассы, рекуперативной энергии или строительных материалов, например газонной травы и т.д. Таким образом, в следующем аспекте данное изобретение относится к способу идентификации и/или клонирования гомологичных генов R1 из растения, при этом упомянутый способ включает все или часть нуклеотидных последовательностей, описанных выше. Так, в одном из вариантов осуществления информация о нуклеотидных последовательностях, предоставленная здесь, может быть использована в базе данных (например, ESTs, или STSs, или информация о других геномных последовательностях) для поиска гомологичных последовательностей продукты экспрессии которых могут быть испытаны на активность устойчивости к патогену, например, с использованием методик на основе временной экспрессии по данному изобретению или обычных фенотипических анализов в трансгенных растениях. В альтернативе, могут быть использованы зонды на основе последовательностей, например, в саузерн-блоте. В частности, ДНК может быть экстрагирована из клеток, взятых у растений, показывающих соответствующий признак устойчивости, и расщеплена различными рестрикционными ферментами. Рестрикционные фрагменты могут быть затем отделены (например, путем электрофореза на геле агарозы) перед денатурацией и перенесены на нитроцеллюлозный фильтр. На фильтре с фрагментами ДНК может быть гибридизирован меченый зонд, и затем может быть определено связывание. Предварительные эксперименты могут выполняться путем гибридизации в нежестких условиях. Предпочтительными условиями для зондирования являются такие, которые будут достаточно жесткими для создания простого шаблона с малым числом гибридизаций, идентифицированных как положительные, которые могут быть подвергнуты дальнейшему исследованию. Например, гибридизации могут выполняться с использованием гибридизационного раствора, содержащего 5 Х SSC (где SSC=0,15 М хлорид натрия; 0,15 М цитрат натрия; рН 7), 5 Х реагента Денхардта, 0,5-1,0% SDS, 100 мкг/мл денатурирован-4 008599 ной, фрагментированной ДНК спермы лосося, 0,05% пирофосфата натрия и до50% формамида. Гибридизацию проводят при 37-42 С в течение, минимум, 6 ч. После гибридизации фильтры промывают следующим образом: (1) 5 мин при комнатной температуре в 2 Х SSC и 1% SDS; (2) 15 мин при комнатной температуре в 2 Х SSC и 0,1% SDS; (3) 30 мин-1 ч при 37 С в 1X SSC и 1% SDS; (4) 2 ч при 42-65 С в 1XSSC и 1% SDS, со сменой раствора каждые 30 мин. Одна из общепринятых формул расчета жесткости условий, требуемых для обеспечения гибридизации между нуклеиново-кислотными молекулами с заданной гомологичностью последовательности такова (Sambrook et al. 1989): Tm=81,5C+16,6Log [Na+]+0,41 (% G+C)-0,63 (% формамида)-600/bр (число пар оснований) в дуплексе. Например, в соответствии с формулой при использовании [Na+]=[0,368] и 50% формамида, с содержанием GC 42% и средним размером зонда 200 оснований, Тm составляет 57 С. Тm дуплексной ДНК снижается на 1-1,5 С с каждым 1% снижением гомологичности. Так, при использовании температуры гибридизации 42 С будут получены целевые последовательности с 75% идентичности. Такая последовательность будет рассматриваться как, по существу, гомологичная нуклеиново-кислотной последовательности по данному изобретению. В биотехнологии хорошо известно постепенное повышение жесткости гибридизации, пока не останется лишь несколько положительных клонов. Другие подходящие условия включают, например, для обнаружения последовательностей, идентичных примерно на 80-90%, гибридизацию в течение ночи при 42 С в 0,25 М Na2HPO4, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% сульфата декстрана и конечную промывку при 55 С в 0,1 Х SSC, 0,1% SDS. Для обнаружения последовательностей, идентичных более чем на 90%, применимые условия включают гибридизацию в течение ночи при 65 С в 0,25 М Na2HPO4, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% сульфата декстрана и конечную промывку при 60 С в 0,1 Х SSC, 0,1% SDS. Связывание зонда с целевой нуклеиновой кислотой (например, ДНК) может быть измерено с использованием любой из множества существующих методик. Например, зонды могут быть меченными радиоактивными, флуоресцентными или ферментными метками. Другие методики, не использующие меток зондов, включают амплификацию с использованием ПЦР (в том числе там, где это возможно, ПЦРRACE), РНазную защиту и аллельспецифическое олигонуклеотидное зондирование. После идентификации успешной гибридизации проводят изолирование гибридизированной нуклеиновой кислоты, которое может включать один или более этапов ПЦР или амплификации путем клонирования в вектор, реплицирующийся в подходящем хозяине. В случае необходимости, клоны (например, лямбда, космида, плазмида, BACs, biBACS) или фрагменты, идентифицированные во время поиска, могут быть удлинены или дополнены. Например, если есть подозрение, что они неполные, можно вернуться к исходному источнику ДНК (например, библиотеке клонов, препарату мРНК и т.д.) для изолирования отсутствующих частей, например, с использованием последовательностей, зондов или праймеров на основе той части, которая уже была получена, для идентификации других клонов, содержащих перекрывающуюся последовательность (см., например, "Principlesof Genome Analysis" by S.В. Primrose (1995) Pub. Blackwell Science Ltd., Oxford, UK). Молекулы нуклеиновй кислоты или соответствующие гены могут быть затем испытаны на функциональность, например, как описано в примерах. Одна из схем изолирования гомологов R1 включает следующие этапы:I) получение популяции, в которой признак устойчивости является сегрегирующим;II) ПЦР-амплификация ДНК из отдельных членов популяции с использованием праймеров на основе последовательности R1 (но не из законсервированных мотивов гена R);III) испытание продуктов ПЦР (прямым анализом последовательности или рестрикционным ферментным расщеплением) на полиморфизм последовательности, который косегрегирует с признаком R. Идентификация соответствующей полиморфной маркерной последовательности;IV) изолирование полной кодирующей последовательности полиморфного гена. Она может быть изолирована из соответствующей клонированной библиотеки или путем амплификации с использованием праймеров из 5'- и 3'-экстремумов R1. В каждом случае идентифицированный продукт ПЦР или информация о последовательности, предоставляемая им, используется для идентификации гена. Кодирующая активность гена устойчивости может быть затем испытана, как описано выше или как описано в примерах. Более специфический подход основан на понимании того, что гомологичные гены R1 могут быть сцеплены в кластеры. Существование кластеров R-генов в картофеле уже было описано (Leister et al. 1996; De Jong et al. 1997). Один из больших кластеров R-генов находится в короткой ветви хромосомы V картофеля."Горячая точка" устойчивости в хромосоме V картофеля, которая включает R1, также содержит основные QTL (количественные локусы признака) устойчивости к Phytophthora infestans (LeonardsSchippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999, Collins et al. 1999) и корневой нематоде Globodera pallida(Kreike et al. 1994, Rouppe van der Voort et al. 1997, 2000). Картирование неравновесия сцеплений показало сильную связь между маркерами в 0,8 сМ интервале SPUD237-GP179, содержащем R1, и устойчивостью листьев и клубней к фитофторозу, что подтверждает тесную связь между R1 и факторами, регулирующими количественную устойчивость к фитофторозу. На основе наблюдаемой генетической связи-5 008599 было сделано предположение, что R1 и факторы, регулирующие количественную устойчивость к фитофторозу, могут быть аллелями одного и того же гена или членами семейства кластеризованных генов(Leonards-Schippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999). Первый молекулярный анализ локуса R1 показал, что последний вариант более предпочтителен, так как R1 является членом семейства генов и присутствует в виде дополнительной копии в ДНК-инсерции в хромосоме, несущей R1. Подобные сведения описаны для локуса Rpm1 в Arabidopsis (Stahl et al. 1999). Ген R1 нужно было интрогрессировать в геномS. tuberosum из дикого вида S. demissum путем гетерогенетического хромосомного кроссинговера. В кроссах между дикими и культурными видами Solarium часто обнаруживается гетерогенетическое хромосомное спаривание (Singh et al. 1989). Второй высокогомологичный член семейства генов R1, имеющий две аллели r1.1 и r1.2, расположен физически близко к R1. Необходимы дальнейшие исследования функциональности этого гена. При известной последовательности R1 теперь могут быть идентифицированы другие члены семейства R1, которые могут присутствовать в тех частях интервала GP21-GP179,которые еще не известны в физической карте, и/или в других частях генома картофеля. Могут быть изолированы аллельные варианты S. tuberosum и гомологи в других видах Solanaceae, которые задействованы в количественной устойчивости к P. infestans. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения упомянутый патоген, против которого является устойчивым растение, экспрессирующее молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, представляет собой Phythophthora infestans. Взаимодействие между R1 и патогеном фитофтороза картофеля согласуется с концепцией "ген за ген" (Person et al. 1962, Flor 1971). Перенос одного гена был достаточным для придания восприимчивому растению-хозяину гиперчувствительной реакции устойчивости к инфицированию расой Р. infestans, несущей ген авирулентности Avr1 (все расы, за исключением расы со специфичностью расы 1). Avr1 сергегируется как одиночный доминантный фактор в потомственных штаммах P. Infestans, гетерозиготных кAvr1, и был картирован в группу связей IV молекулярной карты P. infestans (Van der Lee et al. 2001). До сих пор ни один фактор авирулентности P. infestans не был клонирован. Дальнейшее описание R1 на молекулярном уровне и клонирование гена Avr1 должно прояснить, как протеин устойчивости узнает эффекторную молекулу авирулентности. Клонирование генов устойчивости к фитофторозу, которые узнают факторы авирулентности, отличные от Avr1, должно облегчить идентификацию молекулярных мотивов, которые определяют специфичность узнавания эффектора и могут оказать помощь в конструировании R-протеинов с более широкой и более длительной устойчивостью к фитофторозу. Другие, сцепленные, варианты R1 (предоставляющие другие R-признаки) могут быть изолированы, в основном, так, как описано выше, но с использованием для этапа первоначальной амплификации ДНК, взятой из членов популяции, в которой требуемый признак R косегрегирует с самим R1 (или вариантом R1). Авторами данного изобретения было сделано наблюдение, что последовательность R1 подобна последовательности неродственного гена Prf, который придает устойчивость томатам к бактериальному патогену, т.е. Р. syringae (Salmeron et al. 1996). В свете этой информации, становится ясно, что последовательность R1 может быть модифицирована, например, путем сайт-направленной или случайной мутации, для получения мутантов R1 или других производных, которые могут придавать устойчивость к патогенам (т.е. инициируются ими), совершенно отличным от P. infestans. Это может осуществляться, как описано ниже, с тестированием мутантов R1 при помощи методов анализа временной экспрессии, описанных выше. Предпочтительно молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся мутантом или другим производным, получают прямым или косвенным путем (например, при помощи одного или нескольких этапов амплификации или репликации) из исходной нуклеиновой кислоты, соответствующей всей или части последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 или других последовательностях, описанных здесь. Таким образом, следующим аспектом данного изобретения является способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей R1-производное, который включает этап модификации молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующей R1. Производное может включать такие изменения в молекуле нуклеиновой кислоты, которые не оказывают влияния на кодируемую аминокислотную последовательность (т.е. дегенеративно эквивалентные). Изменения в последовательности для получения мутанта или производного могут быть реализованы путем одного или более присоединений, инсерций, делеций или замещений одного или более нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, что приводит к присоединению, инсерции, делеции или замещению одной или более аминокислот в кодируемом полипептиде. В дополнение к одному или более изменениям внутри последовательности R1, вариантная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, включающую дополнительные аминокислотные последовательности у Сокончания и/или N-окончания. Данное изобретение также относится к частям или фрагментам (синтезированным), которые соответствуют участкам описанных здесь последовательностей и кодируют полипептиды, обладающие биологической активностью, например устойчивостью к патогенам или способностью вырабатывать или связывать R1-связывающие антитела. Вообще говоря, изменения могут быть желательны по ряду причин, включая введение или удаление следующих функций: последовательностей рестрикционной эндонуклеазы; использования кодонов; дру-6 008599 гих сайтов, необходимых для посттрансляционной модификации; сайтов расщепления в кодируемом пептиде; мотивов гликозилации, липоилации в кодируемом пептиде и т.д. К экспрессируемому протеину могут присоединяться лидерные или другие таргетинг-последовательности для определения его локализации после экспрессии. Все это может помочь в эффективном клонировании и экспрессировании активного полипептида в рекомбинантной форме (как описано ниже). Предпочтительные модификации включают такие модификации, которые снижают результирующий отрицательный заряд области, расположенной внутри или вокруг мотивов QLPL, CFLY или LHD. Средства и способы модификации устойчивых генов известны специалистам и описаны, например, в WO 01/29239 для гена Rx Solarium tuberosum. Другие желательные мутации могут быть результатом случайного или сайт-направленного мутагенеза для видоизменения активности (например, специфичности) или стабильности кодируемого полипептида. Понятно, что гомология на аминокислотном уровне определяется на основе подобия или идентичности аминокислот. Подобие дает возможность консервативных вариаций, т.е. замещения гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой или замещения одного полярного остатка на другой, такой как аргинин вместо лизина, глутаминовая кислота вместо аспарагиновой или глутамин вместо аспарагина. Специалистам хорошо известно, что видоизменение первичной структуры полипептида путем консервативного замещения может не оказывать существенного влияния на активность этого пептида, поскольку боковая цепь аминокислоты, которая вставляется в последовательность,может быть способна образовывать такие же связи и контакты, как и боковая цепь аминокислоты, которая была замещена. Это справедливо, даже когда замещение происходит в области, которая является критической в определении конформации пептидов. Изобретение также относится к гомологам, содержащим неконсервативные замещения. Специалистам хорошо известно, что замещения в тех областях пептида, которые не являются критическими в определении их конформации, могут не оказывать большого влияния на их активность, так как они не изменяют существенным образом трехмерную структуру пептида. В областях, которые являются критическими в определении конформации или активности пептидов, такие изменения могут изменить свойства полипептида. В самом деле, изменения, подобные описанным здесь, могут придавать пептиду достаточно благоприятные свойства, например измененную стабильность или специфичность, в частности более широкую специфичность. Мутанты, имеющие эти свойства, могут быть затем селектированы, как описано выше. Другие способы могут включать смешивание или встраивание последовательностей из родственных генов устойчивости в последовательность R1. Например, рестрикционные фрагменты R1 могут быть дотированы с фрагментами гомолога R1 или даже неродственного гена с образованием рекомбинантных версий R1. Альтернативная концепция модификации R1 использует ПЦР, как описано выше (Но et al. 1989 Gene 77, 51-59) или ДНК-шаффлинг (Crameri et al. 1998 Nature 391). Таким образом, способы по изобретению, описанные выше, могут включать гибридизацию одного или более (например, двух) зондов или праймеров на основе последовательности R1 либо для скринингаR1-гомологов, либо для выработки R1-производных. Таким образом, олигонуклеотиды, зонды или праймеры образуют следующую часть данного изобретения. Олигонуклеотид для использования в зондировании или ПЦР может иметь длину 30 или менее нуклеотидов (например, 18, 21 или 24). Обычно специфические праймеры имеют длину 14 или 15 нуклеотидов. Для оптимальной специфичности и эффективности затрат могут быть предпочтительны праймеры из 16-24 нуклеотидов. Специалистам хорошо известны принципы конструирования праймеров для использования в таких технологиях, как ПЦР. Если необходимо, зондирование может быть проведено с целыми рестрикционными фрагментами генов, описанными здесь, которые могут состоять из сотен или даже тысяч нуклеотидов. По одному из аспектов данного изобретения молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, имеет форму рекомбинантного и предпочтительно реплицирующегося вектора. Понятие "вектор" включает,среди прочего, любой бинарный вектор - плазмиду, космиду, фаг или агробактерию в дву- или однонитевой линейной или кольцевой форме, - который может быть или может не быть самопередающимся или мобилизуемым и который может трансформировать прокариотические или эукариотические хозяева путем встраивания в геном клетки или существует во внехромосомной форме (например, автономная реплицирующаяся плазмида с источником репликации). В частности, изобретение включает челночные векторы, под которыми следует понимать ДНК-носитель, способный, от природы или путем конструирования, к репликации в двух различных организмах-хозяевах, которые могут быть выбраны из актиномицет и родственных им видов, бактерий и эукариотических клеток (например, клеток высших растений, млекопитающих, дрожжей или грибов). Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по изобретению, не обязательно содержит промотор или другую регуляторную последовательность, особенно если вектор должен использоваться для введения этой нуклеиновой кислоты в клетки для рекомбинации в геном. Предпочтительно нуклеиновая кислота в векторе находится под контролем соответствующего промотора и оперативно связана с ним или с другими регуляторными элементами для транскрипции в клетку-хозяина, такую как микробная клетка, например бактериальная или растительная. Вектор может представлять собой бифункциональный вектор экспрессии, который функционирует во множестве хозяев. В случае геномной ДНК он содержит свой собственный промотор или другие регуляторные элементы, а в случае кДНК он может находиться под контролем соответствующего промотора или других регулятор-7 008599 ных элементов для экспрессии в клетке-хозяине. Под "промотором" следует понимать последовательность нуклеотидов, с которой может быть начата транскрипция оперативно связанной ДНК в 3'-направлении смысловой нити двунитевой ДНК."Оперативно-связанная" означает присоединенная в виде части той же молекулы нуклеиновой кислоты, удобно расположенная и ориентированная для транскрипции, начинаемой с промотора. ДНК,оперативно связанная с промотором, и "находится под действием регуляции инициирования транскрипции" данного промотора. Таким образом, в этом аспекте изобретение относится к генной конструкции, предпочтительно реплицирующемуся вектору, включающему промотор, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью по данному изобретению, такой как кодирующая область гена R1 или ее вариант (мутант,производное или аллель). В целом, специалисты в биотехнологии знакомы с конструированием векторов и протоколами конструирования для экспрессии рекомбинантных генов. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности,включая промоторные последовательности, терминирующие фрагменты, полиаденилационные последовательности, энхансерные последовательности, гены-маркеры и другие подходящие последовательности. Подробности см., например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al. 1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные технологии и протоколы обработки нуклеиновых кислот, например получения нуклеиново-кислотных конструкций, мутагенеза (см. выше), секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов, а также анализ протеинов, подробно описаны в CurrentSambrook et. al. и Ausubel et al. включены в данную заявку в виде ссылки. Один из вариантов осуществления данного изобретения относится к генной конструкции, предпочтительно реплицирующемуся вектору, включающему индуцируемый промотор, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью по данному изобретению. Выражение "индуцируемый" в отношении к промотору хорошо знакомо специалистам. По существу, выражение "под контролем индуцируемого промотора" означает "включение" или усиление реакции на применение стимула. Природа стимула различна для различных промоторов. Некоторые индуцируемые промоторы вызывают лишь небольшие или необнаружимые уровни экспрессии (или отсутствие экспрессии) в отсутствие соответствующего стимула. Другие индуцируемые промоторы вызывают обнаружимую конститутивную экспрессию в отсутствие стимула. Каким бы ни был уровень экспрессии в отсутствие стимула, в присутствии надлежащего стимула экспрессия от любого индуцируемого промотора увеличивается. Предпочтительной является ситуация, когда уровень экспрессии при применении нужного стимула увеличивается в степени, эффективной для изменения фенотипических характеристик. Таким образом, может быть использован индуцируемый(или "включаемый") промотор, который в отсутствие стимула вызывает базовый уровень экспрессии,слишком низкий для получения желаемого фенотипа (и, фактически, может быть нулевым). После применения стимула экспрессия увеличивается (или включается) до уровня, обеспечивающего желаемый фенотип. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие возможность экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, промоторы PL, lac, trp или tac в Е. coli, а примеры регуляторных элементов, обеспечивающих возможность экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, включают промотор АОХ 1 или GAL1 в дрожжах или CMV-, SV40-, RSV-промотор (вирус саркомы Роуза), CMVэнхансер, SV40-энхансер или глобиновый интрон в клетках млекопитающих и других животных. Пригодные в этом контексте векторы экспрессии известны в биотехнологии, например вектор экспрессии кДНК pcDV1 Окаяма-Берга (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL). В частности, для данного изобретения интерес представляют растительные векторы. Специфические методики и векторы, широко и с успехом используемые ранее для растений, описаны у Bevan (Nucl.In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed.) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp. 121-148). Подходящие промоторы, функционирующие в растениях, включают промотор гена мозаичного вируса цветной капусты 35S (CaMV 35S, который экспрессируется с высоким уровнем практически во всех растительных тканях (Benfey et al. 1990a and 1990b); промотор цветной капусты meri 5, который экспрессируется в вегетативной верхушечной меристеме, а также в нескольких хорошо локализованных положениях растительного организма, например внутренней флоэме, зачатках цветков, точках разветвления корней и побегов (Medford 1992; Medford et al. 1991), и промотор LEAFY Arabidopsis thaliana, который экспрессируется на самой ранней стадии развития цветка (Weigel et al. 1992). Другие промоторы включают промотор актина риса. Промотор может включать один или более мотивов или элементов последовательности, обеспечивающих контроль развития и/или тканеспецифический регуляторный контроль экспрессии. Таким образом, векторы по данному изобретению могут включать ген R1 или его вариант, в дополнение к различным последовательностям, необходимым для придания векторам улучшенных функций репликации, интеграции и/или экспрессии. Эти векторы могут быть использованы, например, для прида-8 008599 ния растениям, в которые они введены, устойчивости к P. infestans или другим грибам. Если желательно индуцировать устойчивость более широкого спектра, в свете данного описания,применимы следующие дополнительные возможности:(a) модифицировать последовательность R1 с получением мутантов или других производных, описанных выше, так, чтобы ее эффект мог быть инициирован элиситорами или патогенами, отличными отP. infestans или от других природных элиситоров, описанных здесь;(c) коэкспрессировать R1 и ген элиситора, транскрипция или трансляция которого подавляется в результате активации R1. Это должно обеспечить сцепление R1 с его элиситором и улучшить имитацию природной реакции на инфекцию P. infestans, что приведет к сайленсингу широкой специфичности;(d) коэкспрессировать R1 с геном элиситора, трансляция которого включается только в присутствии патогена (патогенов);(e) коэкспрессировать R1 с геном элиситора, в результате чего один из них или оба станут инактивированными, и реактивировать ген (гены) разнообразными способами, так чтобы HR ограничивалась лишь некоторыми участками растения (например, соматически определенными участками), но защитная реакция распространялась за пределы этих участков. Это может быть достигнуто, например, по аналогии с методиками, описанными в WO 95/31564, в соответствии с которыми после беккросса между растением,несущим транспозон-меченый ген устойчивости (в том случае cf-9) и целый элиситор (Avr-9), и растением, несущим активаторную транспозазу, потомство показывает соматическую реактивацию cf-9, ведущую к локализованной некротической реакции, но при этом к широко распространенной устойчивости. Кроме векторов и конструкций, описанных выше, данное изобретение также относится к способам,включающим введение конструкций R1, описанных выше (таких, как векторы) в клетку-хозяин и/или индуцирование экспрессии конструкции в растительной клетке, путем применения подходящего стимула, эффективного экзогенного индуктора. Векторы, описанные выше, могут быть введены в хозяева любым подходящим способом, например конъюгацией, мобилизацией, трансформацией, трансфекцией,трансдукцией или электропорацией, как описано ниже более подробно. В следующем аспекте данное изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор по данному изобретению, особенно растительной или микробной клетке. Клеткойхозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка, например бактериальная,грибковая, клетки насекомых, растений или животных. Предпочтительными грибковыми клетками являются, например, клетки рода Saccharomyces, в частности вида S. cerevisiae. Для экспрессии нуклеиново-кислотных молекул по изобретению в смысловой или антисмысловой ориентации в растительных клетках молекулы вводят под контроль регуляторных элементов, которые обеспечивают экспрессию в растительных клетках. Эти регуляторные элементы могут быть гетерологичными или гомологичными по отношению к экспрессируемой молекуле нуклеиновой кислоты, а также по отношению к трансформируемому виду растения. Обычно такой регуляторный элемент представляет собой промотор, активный в растительных клетках. Для получения экспрессии во всех тканях трансгенного растения предпочтительно используют конститутивные промоторы, такие как промотор 35 S CaMV (Odell, Nature 313 (1985),810-812) или промоторы генов полиубиквитина кукурузы (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675689). Для получения экспрессии в специфических тканях трансгенного растения можно использовать тканеспецифические промоторы (см., например, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Известны также промоторы, которые являются специфически активными в клубнях картофеля или в семенах различных видов растений, например кукурузы, Vicia, пшеницы, ячменя и т.д. Могут быть использованы индуцируемые промоторы для возможности точного контроля экспрессии. Примеры индуцируемых промоторов включают промоторы генов, кодирующих протеины теплового удара. Также описаны микроспораспецифические регуляторные элементы и их использование (WO 96/16182). Кроме того, может быть использована химически индуцируемая Tet-система (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229-237). Другие подходящие промоторы известны специалистам и описаны, например, у Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993),361-366). Регуляторные элементы могут также включать транскрипционные и/или трансляционные энхансеры, функциональные в растительных клетках. Кроме того, регуляторные элементы могут включать сигналы терминирования транскрипции, такие как сигнал поли-А, который приводит к присоединению хвоста поли-А к транскрипту, который может улучшить их стабильность; литературу см. выше. В случае, если молекула нуклеиновой кислоты по изобретению экспрессируется в смысловой ориентации, то, в принципе, возможна модификация кодирующей последовательности таким образом, чтобы протеин был расположен в желаемом отделе растительной клетки. Такие отделы включают эндоплазматический ретикулюм, вакуоль, митохондрии, пластиды, апопласт, цитоплазму и т.д. Способы осуществления этих модификаций и сигнальные последовательности, обеспечивающие локализацию в желаемом отделе, хорошо известны специалистам. Способы введения чужеродной ДНК в растения также хорошо известны в биотехнологии. Эти способы включают, например, трансформацию растительных клеток или тканей Т-ДНК с использованием(см., например, ЕР-А 164575), инъекцию, электропорацию, биолистические способы, такие как бомбардировка частицами, и другие способы, известные в биотехнологии. Векторы, используемые в способе по изобретению, могут содержать дополнительные функциональные элементы, например "левые граничные" и "правые граничные" последовательности Т-ДНК Agrobacterium, которые дают возможность стабильной интеграции в геном растения. Кроме того, специалистам известны способы и векторы, которые дают возможность получения трансгенных растений без маркеров, т.е. селектируемый или измеряемый маркерный ген теряется на определенной стадии развития растения или селекции растения. Это может быть достигнуто, например, путем котрансформации (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151-161; Peng,Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91-104) и/или путем применения систем, которые используют ферменты, способные промотировать гомологичную рекомбинацию в растениях (см., например, WO 97/08331; Bayley,Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353-361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170-176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373-6378). Способы получения соответствующих векторов описаны, например, в Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Подходящие штаммы Agrobacterium tumefaciens и векторы, а также трансформация Agrobacteria и соответствующие среды роста и селекции хорошо известны специалистам и описаны в литературеand expression studies. In: Plant Molecular Biology Manual Vol. 2, Gelvin and Schilperoort (Eds.), Dordrecht,The Netherlands: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120516; Hoekema: The Binary Plant Vector System,Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287). Хотя использование Agrobacterium tumefaciens является предпочтительным в способе по изобретению, могут быть использованы и другие штаммы Agrobacterium, такие как Agrobacteriumrhizogenes, например, если желателен фенотип, который дает этот штамм. Способы трансформации с использованием биолистических методик хорошо известны специалистам, см., например, Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558 andPotrykus and Spangenberg (eds.), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995). С использованием способов, описанных выше, возможна трансформация большинства двудольных растений. Но разработано также несколько методик успешной трансформации однодольных растений. Эти методики включают трансформацию с использованием биолистических способов, как, например,описано выше, а также трансформацию протопластов, электропорацию клеток с частично нарушенной проницаемостью мембраны, введение ДНК с использованием стекловолокна и т.д. Полученная трансформированная растительная клетка может быть затем использована для регенерации трансформированного растения способами, известными специалистам. См., например, Hood, Molecular Breeding 3 (1997),291-306; Coleman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 7094-7097; Shilito, Biotechnology 7 (1989), 581-587. В целом, растения, которые могут быть модифицированы по изобретению и которые показывают чрезмерную экспрессию протеина по изобретению или снижение синтеза такого протеина, могут быть получены из любого желаемого растительного вида. Это могут быть однодольные растения или двудольные растения, предпочтительно относящиеся к виду, представляющему интерес в сельском хозяйстве, лесоводстве или садоводстве, такие как злаки (например, кукуруза, рис, ячмень, пшеница, рожь, овес и т.д.), картофель, масличные растения (например, масличный рапс, подсолнечник, арахис, соя и т.д.),хлопок, сахарная свекла, сахарный тростник, бобовые растения (например, бобы, горох и т.д.), растения для производства древесины, предпочтительно деревья, и т.д. Конкретный выбор технологии трансформации будет определяться ее эффективностью в отношении трансформации определенных видов растений, а также опытом и предпочтениями человека, который будет осуществлять на практике данное изобретение при помощи выбранной методики. Специалистам будет понятно, что частный выбор системы трансформации для введения нуклеиновой кислоты в растительные клетки не является существенным или ограничивающим фактором для изобретения, так же, как и выбор технологии регенерации растения. Если это желательно, могут быть использованы селектируемые генетические маркеры, состоящие из химерных генов, которые сообщают селектируемые фенотипы,например устойчивость к антибиотикам, таким как канамицин, гидромицин, фосфинотрицин, хлорсульфурон, метотрексат, гентамицин, спектиномицин, имидазолиноны и глифосат. Таким образом, в следующем аспекте данное изобретение относится к способу трансформации растительной клетки, включающему введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту по данному изобретению (например, R1 или вариант R1), в растительную клетку и инициирование или предоставление возможности рекомбинации между вектором и геномом растительной клетки для введения последовательности нуклеотидов в геном. Изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной нуклеиново-кислотной молекулой или вектором по изобретению, в частности растительной или микробной клетке. В трансгенных- 10008599 растительных клетках (т.е. с введенной нуклеиновой кислотой, рассматриваемой здесь) трансген может содержаться во внегеномном векторе или быть встроенным, предпочтительно стабильно, в геном. В гаплоидном геноме может быть более одной гетерологичной нуклеотидной последовательности. Выражение "гетерологичный" широко используется в данном аспекте и означает, что ген/последовательность нуклеотидов, рассматриваемая здесь, была введена в упомянутые клетки растения или его предка с использованием генной инженерии, т.е. путем вмешательства человека. Гетерологичный ген может быть дополнительным к имеющемуся эндогенному гену. Нуклеиновая кислота, гетерологичная,или экзогенная, или чужеродная, к растительной клетке, может быть неприродной для клеток данного типа, сорта или вида. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота может включать кодирующую последовательность растительной клетки определенного типа, или вида, или сорта растения или выведенную из нее последовательность, помещенную в среду растительной клетки другого типа, или вида, или сорта растения. После трансформации растение может быть регенерировано, например, из отдельных клеток, ткани каллуса или дисков листьев по обычной технологии. Почти любое растение может быть полностью регенерировано из клеток, тканей и органов растения. Имеющиеся технологии описаны в Vasil et al., CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications,Academic Press, 1984, и Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press,1989. Производство фертильных трансгенных растений было достигнуто в таких злаках, как рис, кукуруза,пшеница, овес и ячмень (обзор в Shimamoto, К. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5,158-162; Vasil etal. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil,1996, Nature Biotechnology 14, page 702). Изобретение также относится к растениям, которые содержат растительную клетку по изобретению, включая все его части или побеги, семена, собственное или гибридное потомство. Растение по изобретению может быть таким, которое не дает чистосортного потомства по одному или нескольким свойствам. Сорта растений могут быть исключены, в частности сорта растений, регистрируемые в соответствии с Plant Breeders' Rights (Права селекционеров растений). Следует отметить, что нет необходимости рассматривать растение как "сорт" только потому, что оно стабильно содержит в своем геноме трансген,введенный в клетку растения или его потомка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансгенное растение по изобретению в присутствии гена R1 по изобретению приобретает устойчивость или повышает устойчивость к патогену по сравнению с соответствующим исходным растением, восприимчивым к этому патогену. Выражение "устойчивость" включает целый диапазон защитной реакции, от замедления до полного ингибирования развития заболевания. Примеры наиболее важных патогенов включают Phyfophthora infestans,возбудитель фитофтороза картофеля, Phytophthora sojae, патоген корневой гнили сои, Peronospora parasitica(ложная мучнистая роса), Magnaporthe grisea, возбудитель пирикуляриоза риса, Erysiphe spp (настоящая мучнистая роса), Pseudomonas syringae (фактор бактериальной гнили), Erwima amylovora (бактериальный ожог плодовых деревьев), Erwima carotovora (мягкая гниль), Botryfis cinerea (ложная мучнистая роса винограда), Rhizoctonia solani и Pythium debaryanum (факторы заболевания всходов или болезни высыхания). Предпочтительно трансгенное растение по изобретению приобретает устойчивость к P. infestans. Кроме регенерированного растения, данное изобретение относится к клону такого растения, к семенам, к собственному или гибридному потомству (например, потомству F1 и F2) и любой их части, например черенкам, семенам. Изобретение также относится к побегам такого растения, т.е. любой части,которая может быть использована для воспроизводства или распространения, полового или вегетативного, включая черенки, семена и т.д. В отличие от молекулярно-биологических способов введения R1 (или его вариантов) в растения,последовательности, описанные здесь, могут быть использованы для облегчения селекции растений, для которых желательно введение признака устойчивости традиционными способами селекции растений. Потомство от скрещиваний, которое несет нужный ген, может быть легко идентифицировано путем скрининга на основе последовательности R1, в частности сигнатурной последовательности R1. Способы, описанные здесь для идентификации ближних маркеров локуса R1, как правило, могут быть применимы к другим кластеризованным генам, (например, растительным генам устойчивости). Такие способы отличаются тем, что они включают этап ПЦР в условиях низкой жесткости с использованием недегенеративных праймеров без мотивов законсервированных последовательностей. Общий подход может быть изложен следующим образом: (а) получение популяции, в которой ген, представляющий интерес, является сегрегирующим; (b) идентификация гомолога (гомологов) гена устойчивости, связанного с локусом, представляющим интерес, на основе высокозаконсервированных (ген устойчивости) мотивов и высокодегенеративных праймеров (Leister et al. 1996) Nature Genet. 14,421-428; (с) идентификация дополнительных маркеров, соответствующих гомологичным генам, которые находятся внутри локуса (устойчивости) и которые являются ближними к гену, с использованием ПЦР в условиях низкой жесткости с использованием недегенеративных праймеров без мотивов законсервированных последовательностей; (d) использование упомянутых дополнительных маркеров для идентификации клона, несущего- 11008599 геномную библиотеку гена (устойчивости), представляющего интерес, из устойчивого растения, возможно,в сочетании с анализами переходной активности (Mindrinos et al. (1994) или как описано здесь); (е) возможно, подтверждение идентичности клонированного гена на основе фенотипа трансгенных растений. Данное изобретение также относится к продукту экспрессии R1 или вариантных нуклеиновокислотных последовательностей, описанных здесь, и к способам получения продукта экспрессии путем экспрессии кодирующих нуклеиново-кислотных молекул в подходящих условиях, например в подходящих клетках-хозяевах in vitro, или путем химического синтеза, в частности, если требуются антигены для выработки антител. Антитела могут быть выработаны с получением очищенного R1/вариантного полипептида или пептида любым способом, известным в биотехнологии (обзор способов см., например, в "Immunology-5thEdition" by Roitt, Brostoff, Male: Pub. 1998-Mosby Press, London). Такие антитела или их фрагменты или производные могут быть использованы для связывания R1 или для идентификации и/или изолирования протеинов, гомологичных R1 (т.е. имеющих с ним общие эпитопы), которые, в свою очередь, могут стать основой способа изолирования кодирующих их генов, альтернативного описанным выше способам. Подобно этому, могут быть использованы аптамеры, которые связываются с полипептидом R1 по изобретению. Получение аптамеров известно специалистам; см., например, Thomas and Dinshaw (2000)Adaptive recognition by nucleic aptamers. Science 287:820-825. Изобретение также относится к способу воздействия на признак устойчивости в растении, включающему этап инициирования или предоставления возможности экспрессии гетерологичной нуклеиново-кислотной последовательности, описанной выше (например, R1 или варианта R1, возможно, с элиситором в обоих случаях) в клетках растения. В качестве альтернативы, может быть желательно даунрегулировать активность R1. Это может быть выполнено, например, путем использования антисмысловой технологии (описанной в Bourque(1995), Plant Science 105,125-149, и Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496). Альтернативой этой технологии является использование копии всего или части целевого гена, инсертированной в смысловой, т.е. в той же ориентации, что и целевой ген, для снижения экспрессии целевого гена путем косупрессии; см.,например, van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli et al, (1990) The Plant Cell 2, 279-289;Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4,1575-1588, и патент США US-A-5,231,020. Таким образом, изобретение также относится к трансгенной растительной клетке - и к трансгенным растениям, содержащим такие растительные клетки, - которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или ее часть, предпочтительно стабильно встроенную в геном, при этом транскрипция и/или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты или ее части приводит к снижению синтеза протеинаR1. В предпочтительном варианте осуществления снижение достигается путем антисмыслового, смыслового, рибозимного, косупрессивного, доминантного мутантного эффекта или нокаут-мутанта в гене R1. Однако предпочтительно изобретение относится к способу, который включает экспрессированиеSEQ ID NO: 1 или ее варианта в клетках растения (продуцирующих в результате этого кодируемый ею полипептид) после предшествующего этапа введения нуклеиновой кислоты в клетку растения или его предка. Как правило, такой способ может быть использован для введения в растение устойчивости к грибам, посредством чего R1-опосредованная устойчивость включается при контакте с соответствующим грибковым элиситором или другим инициатором или индуктором. Вообще говоря, элиситор или другой инициатор может быть закодирован непосредственно инвазирующими грибами (например, вирулентным протеином P. infestans или некоторыми другими грибами). В альтернативе, она может быть экспрессирована посредством отдельной конструкции или трансгена, который сам по себе включается или апрегулируется грибковой инфекцией. Кроме того, в обоих этих случаях модификация последовательности R1(варианта) может обеспечить инициирование неприродным элиситором, если это предпочтительно. Форматы, описанные выше для приобретения функции R1 или R1-производного по отношению к предполагаемому или известному элиситору, сами по себе составляют следующий аспект изобретения. В частности, способы создания гена для генной совместимости между элиситором и геном устойчивости отличаются тем, что они включают следующие этапы: (а) инициирование или предоставление возможности коэкспрессии в клетке R1 или R1-производного и элиситора, (b) наблюдение за HR в упомянутой клетке, (с) установление корреляции результатов наблюдений, полученных в (b), со специфичностью R1 или R1-производного к элиситору. В соответствии с вышеизложенным данное изобретение также относится к таким трансгенным растениям, которые являются более чувствительными к инфицированию фитофторозом по сравнению с соответствующим растением дикого типа. Подобным образом, данное изобретение относится к частям растения, предназначенным для сбора урожая, и к материалу для размножения таких растений. Как описано в примерах, был изолирован ген R1, который после трансформации в восприимчивый сорт картофеля Desire придал ему устойчивость к P. infestans. Поскольку геномный клон, соответствующая последовательность ДНК которого показана в SEQ ID NO: 1, оказался способным вызывать этот эффект, то очевидно, что регуляторные последовательности гена R1, необходимые и достаточные для опосредования экспрессии полипептида R1 после инфицирования патогеном, содержатся в изолированной последовательности ДНК. Специалистам будет совершенно очевидно, что такие регуляторные по- 12008599 следовательности будут иметь важное применение сами по себе, например для специфической экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК после инфицирования патогеном, например для индукции гиперчувствительной реакции на данный патоген. Соответственно, данное изобретение также относится к регуляторной последовательности промотора, природным образом регулирующего экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению,описанной выше, или молекулы нуклеиновой кислоты, гомологичной молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению, при этом упомянутая регуляторная последовательность способна вызывать или модулировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК после инфицирования патогеном. В контексте данного изобретения выражение "регуляторная последовательность" относится к последовательностям, которые влияют на специфичность и/или уровень экспрессии, например, в том смысле, что они придают клеточную и/или тканевую специфичность. Такие области могут быть расположены выше сайта инициирования транскрипции, но могут быть также расположены ниже этого сайта, например в транскрибируемых, но не транслируемых лидерных последовательностях или в интронах. Выражение "промотор" в контексте данного изобретения относится к нуклеотидным последовательностям, необходимым для инициирования транскрипции, например связывания РНК-полимеразы и успешного начала образования процессивного транскрипта, и может также включать, например, ТАТАбокс. Выражение "молекула нуклеиновой кислоты, гомологичная молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению", здесь включает промоторные области и регуляторные последовательности других генов R1,например генов из других видов, таких как томат, которые являются гомологичными генам R1 картофеля и которые показывают, по существу, такую же картину экспрессии. Такие промоторы отличаются способностью вызывать, предпочтительно, только экспрессию гетерологичной последовательности ДНК в растении после инфицирования патогеном. Выражение "способный вызывать или модулировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК после инфицирования патогеном" здесь означает, что упомянутый промотор способен контролировать экспрессию гетерологичной последовательности ДНК в растениях на участках инфекции, аналогичную или близкородственную контролируемой экспрессии патогенсвязанных генов, задействованных в природной устойчивости при наиболее несовместимых взаимодействиях хозяин-патоген, таких как смерть гиперчувствительных клеток на участках инфекции какой-либо части растения. Таким образом,регуляторная последовательность по изобретению отличается способностью избирательно опосредовать локализованную активацию транскрипции в ответ на атаку патогена или в ответ на стимулы, которые имитируют атаку патогена, такие как элиситоры, полученные, например, из патогенов, таких как грибы или бактерии или их производные. Активация транскрипции регуляторной последовательностью по изобретению может происходить также в клетках, окружающих фактический участок инфекции, благодаря взаимодействиям "клетка-клетка". Регуляторная последовательность по изобретению и химерные промоторы, включающие такие последовательности, что благоприятно, могут не быть индуцируемыми или могут быть индуцируемыми лишь в малой степени при воздействии другого стимула, такого как абиотический стресс. Предпочтительно индукция со стороны химерного промотора в ответ на атаку патогена или обработку элиситором по меньшей мере в 10 раз выше, предпочтительно в 20 раз выше и наиболее предпочтительно в 30 раз выше, чем его активация абиотическим стрессом, если она вообще имеет место. Однако специфичность экспрессии, сообщаемая регуляторными последовательностями по изобретению, может не быть ограничена локальной экспрессией гена в результате воздействия патогенов, например они могут сочетаться с другими регуляторными последовательностями, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию гена. Конкретная картина экспрессии может также зависеть от используемой системы растение/вектор. Однако экспрессия гетерологичных ДНК-последовательностей, управляемая регуляторными последовательностями по изобретению, преимущественно имеет место после инфицирования патогеном или обработки соответствующим элиситором, если только некоторые элементы по изобретению не будут использованы опытным специалистом в биотехнологии для создания конструкции, обеспечивающей контроль экспрессии гетерологичной ДНК-последовательности в определенных типах клеток. Таким образом, по данному изобретению могут быть использованы регуляторные последовательности из других видов, которые являются функционально гомологичными регуляторным последовательностям промотора описанных выше R1-специфичных нуклеиново-кислотных молекул или промоторов генов, которые показывают идентичную или подобную картину экспрессии. Конкретная картина экспрессии также может зависеть от используемой системы растение/вектор. Однако экспрессия гетерологичных ДНК-последовательностей, управляемая регуляторными последовательностями по изобретению, преимущественно происходит в любой клетке, инфицированной соответствующим патогеном, если только некоторые элементы по изобретению не будут использованы опытным специалистом в биотехнологии для создания конструкции, обеспечивающей контроль экспрессии гетерологичной ДНК-последовательности в определенной ткани или контроль иного рода. По данному изобретению могут быть изолированы новые регуляторные последовательности геновR1, что проиллюстрировано на примере регуляторной последовательности гена R1 картофеля. Например,- 13008599 геномная ДНК может быть расщеплена подходящими рестрикционными ферментами, денатурирована и подвергнута отжигу с обратным праймером, полученным из последовательности кДНК по изобретению. После удлинения праймера может быть лигирован адаптер с тупыми концами и может быть проведена ПЦР с использованием вложенного обратного праймера, полученного из упомянутой кДНК, и форвардпраймера, полученного из последовательности адаптера. В другой методологии клонирования регуляторных последовательностей по изобретению может быть сконструирована физическая карта геномных последовательностей выше кодирующей области посредством геномного саузерн-анализа. С этой информацией геномная ДНК может быть расщеплена выбранными рестрикционными ферментами, геномные фрагменты, содержащие отрезок вышерасположенных последовательностей и кодирующую последовательность, могут быть подвергнуты гелевой очистке и самолигированию в большом объеме для образования кольцевых молекул, которые могут быть затем амплифицированы путем ПЦР с форвард- и обратным праймером, полученными из кодирующей последовательности гена. Внутри клонированной геномной последовательности может быть определен сайт начала транскрипции путем стандартных методик, хорошо известных специалистам, таких как 5'-RACE, удлинение праймера или SI-картирование. Для определения цис-регуляторных элементов выше сайта начала транскрипции (т.е. внутри предполагаемой промоторной области) соответствующую область сливают с маркерными генами, такими как гены, кодирующие GUS или GFP, и воспроизводят 5'-делеционные производные этой конструкции. Их трансформируют в подходящий растительный материал и определяют экспрессию маркерного гена в зависимости от оставшейся вышерасположенной последовательности (предполагаемый промотор). Эти технологии хорошо известны специалистам. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность по изобретению содержит последовательность ДНК, выбранную из группы, содержащей:(a) ДНК-последовательность, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 1 до 2222, или ее часть (части);(b) ДНК-последовательность, включающую по меньшей мере 14 последовательных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 1 до 2222;(d) ДНК-последовательность или ее фрагмент, полученные скринингом соответствующей геномной библиотеки ДНК с зондом, полученным на основе нуклеотидной последовательности, определенной в п.1; и(e) ДНК-последовательность, соответствующую последовательностям (а), (b) и (с), содержащим консервативные замены нуклеотидов. Гомологичные регуляторные последовательности отличаются в одном или более положениях от регуляторной последовательности (а) или (b), но все равно имеют ту же специфичность, а именно они включают такие же или подобные мотивы последовательностей, предпочтительно размером от 6 до 10 нуклеотидов, ответственные за вышеописанную картину экспрессии. Предпочтительно такие регуляторные последовательности гибридизируются с одной из вышеупомянутых регуляторных последовательностей, наиболее предпочтительно в жестких условиях. Особо предпочтительными являются регуляторные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90-95% и наиболее предпочтительно 96-99% идентичности последовательности с одной из вышеупомянутых регуляторных последовательностей и обладают такой же или, по существу, такой же специфичностью. Такие регуляторные последовательности также включают видоизмененные последовательности, например, путем одной или более нуклеотидных делеций, инсерций, замещений, присоединений и/или рекомбинаций и/или любых других модификаций, известных в биотехнологии, отдельных или в комбинации друг с другом,по сравнению с вышеупомянутой нуклеотидной последовательностью. Способы введения таких модификаций в нуклеотидную последовательность регуляторных последовательностей по изобретению хорошо известны специалистам. Также специалистам будет совершенно очевидно, что к регуляторным последовательностям по изобретению могут присоединяться дополнительные регуляторные элементы. Например, могут быть использованы транскрипционные энхансеры и/или последовательности, обеспечивающие индуцированную экспрессию регуляторных последовательностей по изобретению. Подходящие индуцируемые системы включают, например, тетрациклинрегулируемую экспрессию генов, описанную,например, у Gatz, выше. Существует возможность модификации регуляторных последовательностей, описанных выше, или их мотивов путем, например, нуклеотидных замен, не влияющих на общую структуру или мотив связывания регуляторной последовательности, так что она остается способной вызывать экспрессию гена после инфицирования патогеном. Регуляторная последовательность по изобретению может быть получена из генов R1 картофеля (см. примеры), хотя и другие растения могут быть приемлемыми источниками для таких регуляторных последовательностей. Кроме того, нуклеотидные последовательности по изобретению могут быть подвергнуты выравниванию при помощи соответствующих компьютерных программ,известных в биотехнологии, таких как BLAST, что означает Basic Local Alignment Search Tool (Инструмент Поиска Локального Выравнивания Последовательностей) (Altschul 1997; Altschul, J. Mol. Evol. 36(1993), 290-390; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990); 403-410), для поиска локального выравнивания последовательностей. BLAST предоставляет выравнивание нуклеотидных последовательностей для определения подобия последовательностей. Благодаря локальному характеру выравнивания пакет BLAST особенно полезен в определении или идентификации гомологов. С такими техническими средствами можно идентифицировать законсервированные нуклеотидные последовательности, которые могут играть определенную роль в патогенспецифической экспрессии. Как правило, упомянутая регуляторная последовательность является частью рекомбинантной молекулы ДНК. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения регуляторная последовательность в рекомбинантной молекуле ДНК оперативно связана с гетерологичной последовательностью ДНК. Выражение "гетерологичная" по отношению к последовательности ДНК, оперативно связанной с регуляторной последовательностью по изобретению, означает, что упомянутая последовательность ДНК в природе не является связанной с регуляторной последовательностью по изобретению. Экспрессия упомянутой гетерологичной последовательности ДНК включает транскрипцию последовательности ДНК,предпочтительно в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно растительных клетках, хорошо известны специалистам. Они обычно включают сигналы поли-А, обеспечивающие терминирование транскрипции и стабилизацию транскрипта, см. также выше. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные и трансляционные энхансеры; см. выше. В предпочтительном варианте осуществления гетерологичная последовательность ДНК вышеописанных рекомбинантных молекул ДНК кодирует пептид, протеин, антисмысловую РНК, смысловую РНК и/или рибозим. Рекомбинантная молекула ДНК по изобретению может быть использована отдельно или как часть вектора для экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК, которые, например, кодируют протеины, такие как протеины семенного накопления, токсины, антитела ("плантитела") или для диагностики экспрессии R1-родственных генов. Рекомбинантную молекулу ДНК или вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую протеин, представляющий интерес, вводят в клетки, которые, в свою очередь, продуцируют протеин, представляющий интерес. Например, регуляторные последовательности по изобретению могут быть оперативно связанными с последовательностями, кодирующими Barstar и Barnase, соответственно, для использования в выработке HR-ответа в растениях. Практическое применение регуляторных последовательностей по изобретению будет очевидно для специалистов и описано в литературе, например Strittmatter and Wegener, Zeitschrift fur Narurforschung 48c (1993),673-688; Kahl, J. Microbiol. Biotechnol. 11 (1995), 449-460 и ссылки, приведенные там. С другой стороны, упомянутый протеин может представлять собой измеряемый маркер, например люциферазу, зеленый флуоресцентный протеин или -галактозидазу. Данный вариант осуществления особенно полезен для простого и быстрого скрининга на соединения и вещества, описанные ниже, которые способны модулировать экспрессию гена R1. Например, трансгенное растение может быть культивировано в присутствии и в отсутствие исследуемого соединения, для того чтобы определить, влияет ли это соединение на экспрессию генов, контролируемых регуляторными последовательностями по изобретению, которая может быть измерена, например, путем измерения экспрессии вышеупомянутого маркера. Специалистам будет также совершенно очевидно, что могут быть использованы другие маркерные гены, кодирующие, например, селектируемый маркер, который обеспечивает прямую селекцию соединений, индуцирующих или ингибирующих экспрессию упомянутого маркера. Регуляторные последовательности по изобретению могут быть также использованы в способах на основе антисмыслового принципа. Антисмысловая РНК может представлять собой короткую (обычно по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 14 нуклеотидов и возможно до 100 или более нуклеотидов) нуклеотидную последовательность, составленную таким образом, чтобы она была комплементарна части специфической последовательности мРНК и/или ДНК гена, представляющего интерес. В литературе описаны стандартные методики, относящиеся к антисмысловой технологии; см., например,Klann, Plant Physiol. 112 (1996), 1321-1330 и выше. После транскрипции последовательности ДНК в антисмысловую РНК антисмысловая РНК связывается со своей целевой последовательностью внутри клетки,таким образом ингибируя трансляцию мРНК и даунрегулируя экспрессию протеина, кодируемого мРНК. В следующем варианте осуществления изобретение относится к нуклеиново-кислотным молекулам размером по меньшей мере 15 нуклеотидов, специфически гибридизирующимся с регуляторной последовательностью, описанной выше, или с ее комплементарной нитью. Специфическая гибридизация происходит предпочтительно в жестких условиях и не включает или почти не включает перекрестной гибридизации с нуклеотидными последовательностями, не имеющими регуляторных свойств или имеющими, по существу, другие регуляторные свойства. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться в качестве зондов и/или для контроля экспрессии генов. Технология нуклеиново-кислотных зондов хорошо известна специалистам, которые знают, что такие зонды могут иметь различную длину. Предпочтительными являются нуклеиново-кислотные зонды размером от 17 до 35 нуклеотидов. Безусловно, могут также использоваться нуклеиновые кислоты размером до 100 и более нуклеотидов. Нуклеиново-кислотные зонды по изобретению могут применяться для различных целей. С одной стороны,- 15008599 они могут использоваться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации регуляторных последовательностей по изобретению. Другое применение - в качестве гибридизационного зонда для идентификации регуляторных последовательностей, гибридизирующихся с регуляторными последовательностями по изобретению, путем гомологичного скрининга геномных библиотек ДНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновй кислоты, комплементарные регуляторной последовательности, описанной выше, могут быть также использованы для репрессии экспрессии гена, включающего такие регуляторные последовательности, например, за счет антисмыслового, косупрессивного или трехспирального эффекта, или для конструирования соответствующих рибозимов (см., например, ЕРВ 10291533, ЕР-А 10321201, ЕР-А 20360257), которые специфически расщепляют (пре)-мРНК гена, включающего регуляторную последовательность по изобретению. Выбор соответствующих целевых сайтов и соответствующих рибозимов может быть проделан, как описано, например, в Steinecke, Ribozymes,Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460. Кроме того, специалистам хорошо известно, что в такой нуклеиново-кислотный зонд можно также ввести метку в виде соответствующего маркера для специфических целей, например для обнаружения присутствия молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в образце, взятом из организма. Вышеописанные молекулы нуклеиновй кислоты могут представлять собой ДНК или РНК или их гибрид. Кроме того, упомянутая молекула нуклеиновой кислоты может содержать, например, тиоэфирные связи и/или нуклеотидные аналоги, традиционно используемые в олигонуклеотидных антисмысловых методиках; см. выше. Данное изобретение также относится к векторам, в частности плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, традиционно используемым в генной инженерии, которые включают регуляторную последовательность или соответствующую рекомбинантную молекулу ДНК по изобретению. Предпочтительно упомянутый вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор, дополнительно включающий селективный маркер растений. Например, подходящие селективные маркеры см. выше. Для конструирования рекомбинантных векторов могут быть использованы способы, хорошо известные специалистам, см., например, методики, описанные в Sambrook, Molecular Cloning: A LaboratoryPublishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). В альтернативе, рекомбинантные молекулы ДНК и векторы по изобретению могут быть реконструированы в липосомы для доставки в целевые клетки. Данное изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным регуляторной последовательностью, молекулой ДНК или вектором по изобретению. Упомянутые клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Регуляторная последовательность, вектор или рекомбинантная молекула ДНК по изобретению, присутствующая в клетке-хозяине, может быть встроена в ее геном или может поддерживаться во внехромосомной форме. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, такой как бактериальная клетка, клетка насекомого, грибковая, растительная клетка или клетка животного или человека. Предпочтительными клетками являются растительные. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу производства трансгенных растений, растительных клеток или растительных тканей, включающему введение молекулы нуклеиновой кислоты, рекомбинантной молекулы ДНК или вектора по изобретению в геном упомянутого растения, растительной клетки или растительной ткани. Для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК под контролем регуляторной последовательности по изобретению в растительных клетках могут быть использованы дополнительные регуляторные последовательности, например поли-А-хвост может быть слит, предпочтительно 3'-окончанием, с гетерологичной последовательностью ДНК, см. также выше. Дополнительные возможности включают присоединение транскрипционных или трансляционных энхансеров, которые увеличивают экспрессию генов, или последовательностей, которые увеличивают стабильность мРНК. Способы введения чужеродной ДНК в растения, растительные клетки и растительную ткань описаны выше. Таким образом, данное изобретение также относится к трансгенным растительным клеткам, которые содержат предпочтительно стабильно встроенную в геном регуляторную последовательность, рекомбинантную молекулу ДНК или вектор по изобретению. Кроме того, данное изобретение также относится к трансгенным растениям и растительной ткани, включающей вышеописанные трансгенные растительные клетки. Кроме того, данное изобретение относится к способу идентификации соединения для защиты растений, включающему следующие этапы:(а) культивирование клетки растения или ткани растения или выращивание растения, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению, в присутствии тестируемого соединения или образца, содержащего тестируемые соединения, в условиях, которые обеспечивают экспрессию указанной молекулы ДНК;(b) идентификацию или верификацию образца и соединения, соответственно, как непригодного или пригодного для защиты растения на основании их способности вызывать супрессию или активацию и/или улучшение экспрессии указанной молекулы ДНК в указанном растении, клетке растения или ткани- 16008599 растения. Выражение "считывающая система" в контексте данного изобретения означает последовательность ДНК, которая после транскрипции и/или экспрессии в клетке, ткани или организме обеспечивает измеряемый и/или селектируемый фенотип. Такие считывающие системы хорошо известны специалистам и включают, например, рекомбинантную молекулу ДНК и маркерные гены, описанные выше. Выражение "множество соединений" в способе по изобретению следует понимать как множество веществ, которые могут быть или могут не быть идентичны. Упомянутое соединение или множество соединений могут быть неорганическими или органическими, природными или искусственными соединениями и могут содержаться, например, в образцах, например клеточных экстрактах, например, из растений, животных или микроорганизмов. Кроме того, упомянутое соединение(соединения) может быть известно в науке, но до настоящего времени не в качестве соединения, способного подавлять или активировать и/или усиливать транскрипцию гена R1. Множество соединений может, например, добавляться в среду культуры или вводиться путем инъекции в растение, растительные клетки или ткани или распыляться на растение или вводиться в почву. Если образец, содержащий соединение или множество соединений, идентифицирован способом по изобретению, то можно изолировать соединение из исходного образца, идентифицированного как содержащий соединение, способное подавлять или активировать и/или усиливать транскрипцию гена R1,или можно дополнительно разделить исходный образец, например, если он включает множество различных соединений, чтобы уменьшить число различных соединений на один образец, и повторить осуществление способа с частями исходного образца. В зависимости от сложности образцов, этапы, описанные выше, могут выполняться несколько раз, предпочтительно до тех пор, пока образец, идентифицированный способом по изобретению, не будет содержать лишь ограниченное количество веществ или только одно вещество. Предпочтительно упомянутый образец содержит вещества со сходными химическими и/или физическими свойствами, и наиболее предпочтительно упомянутые вещества являются идентичными. Предпочтительно соединение, идентифицированное вышеописанным способом, смешивают с дополнительными веществами для получения формы, удобной для применения в селекции растений или обработки растительных клеткок и тканевых культур. Соединения, которые могут быть протестированы и идентифицированы способом по изобретению,могут представлять собой библиотеки экспрессии, например библиотеки экспрессии кДНК, пептиды,протеины, нуклеиновые кислоты, антитела, малые органические соединения, гормоны, пептидомиметики, ПНК и т.п. (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp. Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79(1994), 193-198 и ссылки, приведенные выше). Кроме того, гены, кодирующие предполагаемый регулятор гена R1, могут быть идентифицированы с использованием, например, инсерционного мутагенеза,использующего, например, таргетинг-векторы генов, известные в науке (см., например, Hayashi. Science 258 (1992), 1350-1353; Fritze and Walden, Gene activation by T-DNA tagging. In Methods in Molecular Biology 44 (Gartland, K.M.A. and Davey, M.R., eds). Totowa: Human Press (1995), 281-294) или маркировки транспозонами (Chandlee, Physiologia Plantarum 78 (1990), 105-115). Упомянутые соединения также могут быть функциональными производными или аналогами известных ингибиторов или активаторов. Способы получения химических производных и аналогов хорошо известны специалистам и описаны, например, вBeilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Кроме того, эффекты упомянутых производных и аналогов могут быть проанализированы способами, известными в биотехнологии. Кроме того, могут быть использованы пептидомиметики и/или компьютеризованное конструирование соответствующих производных и аналогов, например, способами, описанными выше. Определение того, способно ли соединение подавлять или активировать и/или усиливать транскрипцию гена R1, может быть произведено, например, в растениях путем наблюдения за геномрепортером. Это может быть также выполнено путем наблюдения за фенотипическими характеристиками трансгенного растения по изобретению после контакта с соединениями и сравнения их с характеристиками растений дикого типа. В дополнительном варианте осуществления упомянутые характеристики могут сравниваться с характеристиками трансгенного растения после контакта с соединением, которое известно своей способностью или неспособностью подавления или активирования и/или усиления экспрессии гена R1 или активности протеина. Соединения, идентифицированные способом по изобретению,предположительно должны быть весьма благоприятными, так как промоторы, которые были известны до сих пор, имеют лишь ограниченное использование из-за отсутствия или нестрогой специфичности их регуляторных последовательностей к патогену. Ингибитор или активатор, идентифицированный вышеописанным способом, может оказаться полезным в качестве гербицида, пестицида и/или регулятора роста растений. Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к соединению, полученному или идентифицированному способом по изобретению. Такие полезные соединения могут включать, например, действующие извне факторы, которые связываются с регуляторной последовательностью по изобретению. Идентификация действующих извне факторов может проводиться с использованием стандартных способов (см., например, Sambrook,выше, и Ausubel, выше). Для определения связывания протеина с регуляторной последовательностью по- 17008599 изобретению могут быть использованы стандартные анализы методом футпринтинга ДНК и/или нативного гель-шифта. Для идентификации действующего извне фактора, который связывается с регуляторной последовательностью по изобретению, регуляторная последовательность должна использоваться как аффинный реагент в стандартных способах очистки протеинов или как зонд для скрининга библиотеки экспрессии. Если действующий извне фактор идентифицирован, можно добиться модуляции его связывания с регуляторными последовательностями по изобретению, начиная, например, со скрининга на ингибиторы связывания действующего извне фактора с регуляторными последовательностями по изобретению. Затем может быть достигнута активация или репрессия генов R1 в растениях путем применения действующего извне фактора (или его ингибитора) или гена, кодирующего его, например, в векторе для трансгенных растений. Кроме того, если активной формой действующего извне фактора является димер,то могут быть получены доминант-негативные мутанты действующего извне фактора, для того чтобы ингибировать его активность. Кроме того, после идентификации действующего извне фактора могут быть идентифицированы другие компоненты маршрута активации (например, сигнальная трансдукция) или репрессии гена под контролем регуляторных последовательностей по данному изобретению. Затем можно добиться модуляции активностей этих компонентов, для того чтобы разработать дополнительные лекарственные средства и способы для модулирования экспрессии гена под контролем регуляторных последовательностей по данному изобретению. Предпочтительно соединение, идентифицированное вышеописанным способом, или его аналог или производное смешивают с дополнительными веществами для получения формы, удобной для применения в селекции растений или в растительных клетках и тканевых культурах. Например, оно может быть смешано с агрономически приемлемым носителем, известным в науке. Композиция для защиты растений может быть приготовлена с использованием вышеописанного способа по изобретению и синтеза соединения, идентифицированного как ингибитор или активатор, в количестве, достаточном для использования в агрономии. Таким образом, данное изобретение также относится к способу получения агрономической композиции для защиты растений, включающей вышеописанные этапы способа по изобретению и синтез соединения, идентифицированного этим способом, или его аналога или производного. В композиции для защиты растений по изобретению соединение, идентифицированное вышеописанным способом, может быть предпочтительно смешано обычными способами с веществами, традиционно используемыми, например, для производства гербицидов и пестицидов, или средствами, способными индуцировать системную приобретенную устойчивость (SAR). Например, могут быть использованы некоторые добавки, известные специалистам, включающие стабилизаторы или вещества, улучшающие поглощение растительной клеткой, растительной тканью или растением, например карборунд или 0,01% раствор SDS (натрия додецилсульфата). Следующий вариант осуществления изобретения относится к способу идентификации и получения кДНК, кодирующей фактор авирулентности или вирулентности патогена, включающему следующие этапы:(a) скрининг с помощью полипептида R1 по данному изобретению или его фрагмента из соответствующей библиотеки экспрессии кДНК, кодирующей возможный фактор авирулентности или вирулентности патогена;(b) идентификация кДНК патогена как кодирующей фактор авирулентности или вирулентности по способности ее продукта супрессировать или активировать транскрипцию гена полипептида R1. Кроме вышеописанных возможностей использования нуклеиново-кислотных молекул по изобретению для генетического конструирования растений с модифицированными характеристиками и для идентификации гомологичных молекул описанные молекулы нуклеиновй кислоты могут быть также использованы для некоторых других целей, например для идентификации нуклеиново-кислотных молекул, кодирующих протеины, которые взаимодействуют с протеинами R1, описанными выше. Это осуществимо при помощи аналитических методик, хорошо известных в науке, например, описанных в Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065), путем использования так называемой дрожжевой "двугибридной системы". В этой системе протеин, кодируемый нуклеиново-кислотными молекулами по изобретению, или его часть связаны с ДНК-связывающим доменом фактора транскрипции GAL4. Дрожжевой штамм, экспрессирующий этот слитый протеин и содержащий ген-репортер lacZ, управляемый соответствующим промотором, который узнается фактором транскрипции GAL4, трансформируют библиотекой кДНК, которая будет экспрессировать растительные протеины или их пептиды, слитые с доменом активации. Таким образом, если пептид, кодируемый одной из кДНК, способен взаимодействовать со слитым пептидом,представляющим собой пептид протеина по изобретению, то комплекс способен к прямой экспрессии гена-репортера. Таким образом, молекулы нуклеиновй кислоты по изобретению и кодируемые ими пептиды могут быть использованы для идентификации пептидов и протеинов, взаимодействующих с протеинами R1. Этот способ также может быть использован для идентификации ингибиторов и активаторов,описанных выше. Другие способы идентификации соединений, взаимодействующих с протеинами по изобретению или нуклеиново-кислотными молекулами, кодирующими такие молекулы, представляют собой, например, in vitro скрининг с системой фагового дисплея, а также аналитические методики связывания на фильтре или измерение взаимодействия "в реальном времени" с использованием, например, аппаратаBIAcore (Pharmacia); см. ссылки, приведенные выше. Подобные задачи решает так называемая трехгибридная система. Дрожжевая двугибридная система впервые была описана Fields and Song (Nature 340 (1989), 245-246; см. также обзор Vidal, M., in Bartel,P.L and Fields, S. (eds.), The yeast two-hybrid system. Oxford University Press, New York, NY, (1997), 109147). Модифицированная версия дрожжевой двугибридной системы была описана Gyuris, Cell 75 (1993),223-232; Zervos, Cell 72 (1993), 223-232. В кратком изложении, используют домен полипептида в качестве затравки для связывания соединений. Положительные опыты затем селектируют по их способности расти на пластинах в условиях дефицита лейцина, а затем испытывают на способность к голубому окрашиванию на пластинах с X-gal, как описано в вышеуказанной публикации более подробно; см. также WO 95/31544. Модифицированной версией является "обратная дрожжевая двугибридная система", обеспечивающая возможность отбора дефектных аллелей на способность к взаимодействию, с использованием методики отрицательного отбора, как описано, например, в Vidal, Proc. Natl Acad Sci. USA 93 (1996),10321-10326; Vidal, Proc. Natl Acad Sci. USA 93 (1996), 10315-10320. Эта система использует контрселектируемый ген-репортер URA3. Дрожжевые клетки, экспрессирующие Ura3p, превращают соединение 5 фтороротовую кислоту (FOA) в токсичное производное 5-фторурацил. Таким образом, двугибидное взаимодействие, которое приводит к активации гена-репортера URA3, может быть контрселектировано в присутствии FOA и потеря функциональных мутантов может быть специфически селектирована из большого пула аллелей дикого типа. Другим удобным способом может быть, например, дрожжевая трехгибридная система, описаннаяSenGupta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 8496-8501. Дрожжевая трехгибридная система селекции была разработана для изолирования генов из протеинов, которые взаимодействуют с РНК, и для изучения взаимодействий РНК-протеин. Эта система, основанная на дрожжевой двугибридной системе, состоит из ДНК-связывающего домена, слитого с известным РНК-связывающим протеином, домена активации, слитого с предполагаемым РНК-связывающим протеином, и гибридной РНК. Транскрипция геноврепортеров происходит только в том случае, если оба гибридных протеина взаимодействуют с гибридной РНК. В обратной трехгибридной системе взаимодействие протеинов с гибридной РНК приводит к экспрессии гена-репортера, продукт которого токсичен для дрожжевых клеток. Все эти методики могут быть использованы в вышеописанном способе по данному изобретению с использованием протеина R1 или его пептидных фрагментов в качестве затравки для идентификации и получения фактора авирулентности или вирулентности и кодирующих их кДНК или их частей. Способы получения последовательности ДНК клонов, оказавшихся положительными по результатам скрининга, известны специалистам и описаны в приведенных выше публикациях. Данное изобретение также относится к кДНК и кодируемому ею продукту, полученному или идентифицированному вышеописанным способом. Изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну из вышеупомянутых нуклеиново-кислотных молекул и/или содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную такой молекуле нуклеиновой кислоты, вектор по изобретению, протеин R1 по изобретению или его иммунологически или биологически активный фрагмент или антитело или аптамер, специфически узнающий такой протеин или фрагмент; регуляторную последовательность, или рекомбинантную ДНК,или соответствующий вектор по изобретению, соединение, сконструированное ориентированным в соответствии с протеином по изобретению и/или идентифицированное способом, описанным выше, и/или антитело, специфически узнающее такое соединение или регуляторную последовательность по изобретению, и, возможно, приемлемые средства для обнаружения или приемлемые средства для культивирования растительной клетки и ткани. Диагностические композиции могут использоваться в способах обнаружения экспрессии гена R1 путем обнаружения присутствия соответствующей мРНК, которые включают изолирование мРНК из клетки и контактирование полученной мРНК с зондом, представляющим собой нуклеиново-кислотный зонд, описанный выше, в гибридизирующих условиях, обнаружение присутствия мРНК, гибридизировавшейся с зондом, и, следовательно, обнаружение экспрессии гена клеткой. Другие способы обнаружения протеина по изобретению включают иммунотехнологии, хорошо известные специалистам, например ферментосвязанный иммуносорбентный анализ. Кроме того, данное изобретение относится к комплекту, содержащему по меньшей мере один из вышеупомянутых элементов, т.е. нуклеиново-кислотных молекул, векторов, протеинов, соединений, антител или аптамеров по изобретению. Комплект по изобретению может содержать дополнительные ингредиенты, такие как селективные маркеры и компоненты для селективных сред, пригодных для выработки трансгенных растительных клеток, растительной ткани или растений. Кроме того, комплект может включать буферы и субстраты для генов-репортеров, которые могут присутствовать в рекомбинантном гене или векторе по изобретению. Комплект по изобретению может быть успешно использован для осуществления способа по изобретению и, среди прочего, может быть использован для различных целей,описанных здесь, например для диагностических или исследовательских целей. Компоненты комплекта по изобретению могут быть упакованы отдельно в ампулах или совместно в контейнерах или мультиконтейнерах. Производство комплекта предпочтительно осуществляется по стандартным методикам, из- 19008599 вестным специалистам. Комплект или его ингредиенты по изобретению могут быть использованы в культурах растительных клеток и растительных тканей, например, в любом из вышеописанных способов для обнаружения ингибиторов и активаторов генов R1. Комплект по изобретению и его ингредиенты предположительно будут весьма полезными для селекционирования новых сортов, например растений,показывающих улучшенные свойства, такие как питательная ценность или устойчивость к болезням. Специалистам будет также совершенно очевидно, что регуляторные последовательности, рекомбинантные молекулы ДНК, векторы и соединения по данному изобретению могут быть использованы для получения трансгенных растений с желаемым признаком; см. обзор в ТIРТЕС Plant ProductCropBiotechnology 13 (1995), 312-397. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно использовать в качестве молекулярных маркеров в селекции растений. Сверх того, чрезмерная экспрессия нуклеиново-кислотных молекул по изобретению может быть полезна для видоизменения или модификации взаимодействия растение/патоген. Выражение "патоген" включает, например, бактерии, вирусы и грибки, а также протозоа. Предпочтительно упомянутый патоген представляет собой P. infestans. Кроме того, данное изобретение относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, протеина, регуляторной последовательности, рекомбинантной ДНК-молекулы аптамера, вектора, соединения аптамера и/или антитела по изобретению для использования в способах скрининга для идентификации вирулентных или авирулентных генов патогенов, для скрининга соединений для защиты растений, для индуцирования устойчивости к патогену в растениях, в качестве маркера в способе селекции растений при помощи маркеров. Регуляторную последовательность или рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению предпочтительно используют для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК. Эти и другие варианты осуществления представлены в описании и примерах данного изобретения. Дополнительная литература, касающаяся любого из способов, назначений и соединений, используемых по изобретению, может быть найдена в публичных библиотеках, например, с использованием электронных устройств. Например, может быть использована публичная база данных "Medline", доступная в Интернет, в частности по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Другие базы данных и адреса, такие как http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/researchtools.html,http://www.tigr.org/, известны специалистам и могут быть также найдены, например, через http://www.lycos.com. Обзор патентной информации по биотехнологии и список релевантных источников патентной информации, полезных для ретроспективного поиска и для осведомленности о текущем уровне развития, приведен в Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364. Далее изобретение описано при помощи следующих неограничивающих фигур и примеров. Описание фигур Фиг. 1. Генетическая и физическая карта области R1. GP21 и GP179 представляют собой маркеры,используемые для конструирования карты высокого разрешения области R1. SPUD237 и AFLP1 представляют собой преобразованные маркеры AFLP (Meksem et al. 1995, De Jong et al. 1997), фланкирующиеR1. Генетические расстояния приведены в сМ. CosS - это космидный клон, селектированный при помощи SPUD237. Остальные клоны в физической карте представляют собой BACs длиной от 70 до 90 kb. Сплошные черные полосы: BACs из хромосомы, несущей R1. Серые полосы: BACs из хромосомы, несущей r1. Белая полоса: происхождение ВАС не определено. Картированные концы ВАС помечены числом рекомбинантов, отделяющих этот конец ВАС от R1. Концы космиды и ВАС, используемые для прогулки по хромосоме, отмечены вертикальными стрелками. RGL: фрагмент, подобный гену устойчивости. Фиг. 2. ПЦР-амплификация 1,4 kb фрагмента гена R1 с использованием аллельспецифических праймеров 76-2sf2 и 76-2SR и матрицы ДНК (A) Desire; (В) устойчивого родителя Р 41; (С) восприимчивого родителя Р 40; (D) трансгенного растения Desire 10-25; (E) клон ВАС BA87d17, несущий аллельR1; (F), (G), (Н), (I), (J) клоны ВАС ВА 122 р 13, ВА 12101, ВА 76011, BA47F2 и ВА 27 с 1, соответственно,(K) отрицательный контрольный опыт. Фиг. 3. Тест на комплементацию R1. Симптомы заболевания показаны через 9 дней после инокуляции молодых листьев от (А) восприимчивого Desire; (В) трансгенной линии Desire10-25, трансформированной клоном g10-2, и (С) устойчивого родителя Р 41 (R1r1). Фиг. 4. Ген R1. (А) Структурная организация. Экзоны показаны в виде прямоугольников, а интроны в виде ломаный линий. (В) Дедуцированная аминокислотная последовательность. Мотив лейцинового зиппера подчеркнут дважды. Область LRR выделена курсивом. Предсказанные киназные мотивы выделены рамками, а сайты N-гликозилации выделены жирным шрифтом. Законсервированные мотивыQLPL, CFLY и LHD, специфические для растительных протеинов устойчивости, подчеркнуты. Для аминокислот использованы стандартные однобуквенные коды. Фиг. 5. Схематическое представление области хромосомы 5 вокруг локуса R1. Рамки, заштрихованные вертикальными линиями, показывают гомологичные области между хромосомами, несущими аллели R1 и r1. Функциональная аллель R1.1 и локус R1.2/r1.2 выделены незаштрихованными рамками. Ломаная линия показывает делецию, присутствующую в r1-хромосоме по сравнению с R1-хромосомой.- 20008599 Примеры Материал и способы Растительный материал. Потомство F1 кросса между гетерозиготными диплоидными клонами Н 79.1506/1 (R1r1) и Н 80.696/4(r1r1), называемыми Р 41 и Р 40, соответственно (Gebhardt et al. 1989, Leonards-Schippers et al. 1992), использовали для генетического картирования R1 высокого разрешения. Рекомбинанты в маркерном интервале GP21-GP179, произошедшие от родителя Р 41 (R1r1), селектировали, как описано у Meksem et al. 1995. Гибридный клон Р 6/210, полученный кроссом Р 41 х Р 40 (Leister et al. 1997), который несет R1 в гетерозиготном состоянии, использовали для конструирования геномных библиотек космид и ВАС. Родитель Р 41 (R1r1) использовали для конструирования библиотек кДНК. Тест на устойчивость к Phytophthora infestans. Устойчивость к изоляту P. infestans, содержащему соответствующий фактор авирулентности Avr1(раса 4) определяли, как описано у Leonards-Schippers et al. 1992, за исключением того, что для инокуляции использовали целые листья вместо дисков листьев. Присутствие или отсутствие гиперчувствительной реакции (HR) измеряли через 8-10 дней после инокуляции. Геномные библиотеки картофеля. Библиотеку ВАС приобрели в LION Bioscience AG (Heidelberg, Germany). Библиотека была сконструирована из частично расщепленной HmdIII высокомолекулярной геномной ДНК клона Р 6/210 в бинарном векторе pCLD04541 (Jones et al. 1992), как описано у Meksem et al. 2000. Библиотека ВАС состоит из 101376 клонов со средним размером инсерции 70 kb. Колонии хранили в 264-х 384-микротитровальных пластинах (Genetix, Oxford, UK) в среде 2YT (Sambrook et al. 1989) с замораживающим буфером(5,5% (вес./об.) глицина, 7 мМ (NH4)SO4, 1,5 мМ Na-цитрата, 0,3 мМ MgSO4, 13 мМ КН 2 РO4, 27 мМ К 2 НРO4). Космидную библиотеку примерно из 150000 клонов конструировали с использованием стандартной методики (Sambrook et al. 1989) из частично расщепленной Sau3 АI геномной ДНК (17-23 kb фрагменты) Р 6/210, в том же векторе (сайт клонирования ВаmH1), что и библиотека ВАС. Космиды упаковывали с использованием экстракта Gigapack II Gold Packaging extract (Stratagene, CA, USA) и трансфектировали в штамм Е. coli SURE (Stratagene, СА, USA). Плазмидную ДНК экстрагировали из пулов 1500 бактериальных колоний (Sambrook et al. 1989). Было сгенерировано 103 космидных пула, которые подвергли скринингу путем ПЦР с использованием SPUD237-специфических праймеров (De Jong et al. 1997). Положительные пулы подвергали скринингу на пластинах путем гибридизации колоний с использованием стандартных протоколов (Sambrook et al. 1989). Скрининг библиотек ВАС и конструирование контига. Фильтры колоний высокой плотности для скрининга на основе гибридизации ВАС-библиотеки приготовили с применением робота BioGRID (Oxford, UK). Клоны разместили двойными пятнами с использованием массива 5 х 5 в количестве 6 х 384 массивов на 22,5 х 22,5 см нейлоновую мембрану (PALL,Biodyne, Portsmouth, UK). Каждый массив 5x5 содержал 2x12 колоний, при этом контрольное положение в массиве занимал клон pSW1 (PE Biosystems, Foster City, CA USA). Такой шаблон размещения позволил представить 27648 колоний дважды на одном фильтре. Скрининг библиотеки проводили с использованием набора из четырех фильтров, содержащих 101376 клонов. Фильтры с колониями инкубировали в средеLB в течение 15 ч при 37 С и обработали для гибридизации колоний по стандартной методике (Sambrooket al. 1989). Гибридизацию фильтра выполняли, как описано у Gebhardt et al. 1989, за исключением того,что 300-пикограммовую контрольную вставку pSW1 маркировали и гибридизировали вместе с зондом для облегчения определения адресов положительных клонов. Плазмидную ДНК выделяли из положительных клонов, а вставки секвенировали с обоих концов с использованием в качестве праймеров секвенирования Т 3 и Т 7 олигонуклеотидов. Информацию последовательности ДНК концов ВАС-вставок использовали для конструирования специфических пар праймеров ПЦР. Продукты ПЦР амплифицировали этими праймерами, а соответствующие ВАС-матрицы использовали в качестве зондов для новой гибридизации на фильтре для идентификации перекрывающихся ВАС-клонов, для ориентации перекрывающихся ВАС-клонов по отношению друг к другу и для картирования в рекомбинантных растениях. Области перекрывания подтверждали путем секвенирования продуктов ПЦР. Направление удлинения контига проверяли путем генетического картирования с использованием рекомбинантных растений и маркерного анализа на основе RFLP (анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) или ПЦР. Для определения размера ВАС-вставок ВАС-ДНК расщепляли NotI и фрагменты отделяли путем гельэлектрофореза в импульсном поле на CHEF DRIII (BioRad, Hercules, CA, USA) в течение 12 ч при 11 С с временем исходного импульса 5 с и временем конечного импульса 10 с, при угле 120 и напряженности электрического поля 6 В/см. Изоляция ВАС-ДНК. ВАС-ДНК экстрагировали с использованием набора QIAfilter Piasmid Purification Kit 100 (Qiagen,Hilden, Germany) согласно инструкциям изготовителя с незначительными модификациями. Одиночную колонию прекультивировали в жидкой среде LB в течение 8 ч при 37 С. 75 мкл прекультуры добавили в 75 мл среды LB и дополнительно инкубировали 15 ч при 37 С. Перед пропусканием супернатанта черезQIAfilter дополнительно провели этап центрифугирования для удаления обломков бактериальных клеток.- 21008599 Получение зондов из ВАС-вставок. 1,5 мкг ВАС-ДНК расщепили до конца посредством HindIII и ЕсоRI и отделили от вектора в 0,8% низкоплавком геле агарозы (Sea Plaque GTG Agarose, Bioproducts, Rockland, Maine, USA). Инсертированную ДНК отделили от геля с использованием системы GELase (Epicentre Technologies или Biozym) в соответствии с инструкциями изготовителя. ДНК осадили этанолом, растворили в воде и маркировали 32PdCTP путем случайного примированного маркирования (Feinberg and Vogeistein 1984). Субклонирование ВАС BA87d17. 10 мкг ВАС-ДНК частично расщепили посредством 1U Tsp5091 в течение 15 мин при 65 С и отделили по размеру в 0,8% низкоплавком геле агарозы (Sea Plaque GTG Agarose, Bioproducts, Rockland,Maine, USA). Фрагменты размером 10 kb элюировали с использованием системы GELase (EpicentreTechnologies, Madison, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищенные фрагменты клонировали в бинарный вектор pCLD04541, линеаризованный посредством ЕсоRI, дефосфорилировали с использованием фосфатазы SHRIMP (Roche, Germany) и трансформировали в штамм Е. coli DH10B (LifeTechnologies, USA). Двести рекомбинантных колоний собрали в микротитровальные пластины. Конструирование и скрининг библиотек кДНК. Срезанные побеги 8-недельных растений родителя Р 41 (R1r1) и восприимчивого сорта Desire инфицировали расой 4 P. infestans и содержали под стеклянным цилиндром (для увеличения влажности) в воде в камере роста при 17 С на свету в течение 16 ч. В этих условиях листья восприимчивого контрольного растения заросли мицелием P. infestans через 8 дней. Равные количества неинфицированных листьев родителя Р 41 и инфицированных листьев собрали через 2 ч, 19 ч, 3 дня, 7 дней и 9 дней после инокуляции. Изолировали поли А+-РНК с использованием набора RNeasy Plant Mini Kit или набора OligotexmRNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. Библиотеку кДНК ZAP II (Stratagene, CA, USA) сконструировали из поли А+-РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Различные препараты кДНК собрали в пул перед лигированием в вектор ZAP. 5 х 105 pfu(бляшкообразующих единиц) поместили в пластины и подвергли скринингу путем гибридизации бляшек(Sambrook et al. 1989) с использованием в качестве зонда вставок ВАС ВА 121o1 и ВА 76 о 11. 5'-Быстрая амплификация концов кДНК (анализ RACE). Целую РНК изолировали из ткани неинфицированных листьев Р 41 (R1r1) с использованием набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. Анализ RACE выполняли с 1 мкг целой РНК с применением набора для амплификации SMARTRace cDNA Amplification Kit (Clontech, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вложенные генспецифичные праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, представляли собой сначала RT1-1: 5'-AAACCCGGTGTTCCAAATCTAACACT-3' (SEQ ID NO: 3), а затем RT2-1: 5'CATGTAGTGAGGATATGTCACGAGTG-3' (SEQ ID NO: 4). Конечные ПЦР-продукты реакции RACE клонировали в вектор pGEM-T (Promega, CA, USA). Два независимых клона секвенировали. Анализ последовательности ДНК. Обычное секвенирование ДНК проводили при помощи устройства ADIS в Мах Planck Institute forBreeding Research. Применяли секвенирование способом терминирования дидезоксицепей при помощи набора ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и автоматизированного ДНКсеквенатора АВI377 (РЕ Biosystems, Foster City, СA USA). Анализ последовательности выполняли с использованием Wisconsin Package Version 10.0, GeneticsComputer Group (GCG), Madison, Wise, USA. Поиск по базам данных последовательностей проводили при помощи BlastX и других алгоритмов, имеющихся в распоряжении National Center for Biotechnologyand Forde (1989). Три штамма Agrobacterium, LBAg10-2, LBAg10-5 и LBAg10-23, использовали для трансформации картофеля.Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация картофеля и анализ трансгенных растений. Восприимчивый сорт картофеля Desire использовали во всех опытах по трансформации. Agrobacteriumtumefaciens-опосредованную трансформацию выполняли, как описано у Rocha-Sosa et al. (1989), с тем исключением, что среда MS содержала 250 мг/л клафорана. Канамицин-устойчивые трансгенные растения испытывали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) на присутствие вставки g10 с использованием инсертспецифических праймеров 87 е (5'-ATTACAATGGGTTGAACTCAG-3' (SEQ ID NO: 5 и 87s (5'ACCTCTTTCAATTGTTCTGGTG-3' (SEQ ID NO: 6. Условия ПЦР были такие: Та при 55 С в течение 45 с и полимеризация при 72 С в течение 60 с. Трансгенные растения подвергли скринингу R1 специфическими праймерами 76-2sf2 (5'-CACTCGTGACATATCCTCACTA-3' (SEQ ID NO: 7 и 76-2SR(5'-CAACCCTGGCATGCCACG -3' (SEQ ID NO: 8, полученными из кДНК с 76-2. Условия ПЦР были такие: Та при 55 С в течение 45 с и полимеризация при 72 С в течение 90 с. Тесты на устойчивость к расе 4 P. infestans проводили с использованием трех листьев от растения в каждом тесте.- 22008599 Пример 1. Генетическое картирование локуса R1 с высоким разрешением. Для облегчения физического картирования локуса R1 селектировали из 588 растений 16 рекомбинантов между маркерами GP21 и GP179, фланкирующими R1 (Leonards-Schippers et al. 1992), и тестировали на устойчивость к расе Р. Infestans, несущей соответствующий фактор авирулентности Avr1. Вместе с 15 рекомбинантами, селектированными ранее в том же интервале (Meksem et al. 1995), в наличии имелось общее количество 31 рекомбинант GP21-GP179 из 1049 растений, что соответствует 3,0% частоты рекомбинации (3 сМ). Частота рекомбинаций между GP21 и R1 и между R1 и GP179 составила 2,2 и 0,8%, соответственно (табл. 1). Таблица 1 Число рекомбинантных экземпляров в интервалах GP21-R1, GP179-R1 и GP21-GP179,селектированных из 1049 растений сегрегирующей популяции F1et al. 1995), фланкируют локус R1. Оба маркера были отделены от R1 путем одного рекомбинационного события в 1049 растениях (0,1 сМ, фиг. 1). Пример 2. Прогулка по хромосоме к локусу R1 и идентификация гена-кандидата R1. Маркер SPUD237 использовали в качестве зонда для скрининга космидной библиотеки. Идентифицировали один положительный клон CosS (фиг. 1). Концевым секвенированием вставки CosS выработали новый маркер, отделенный одним рекомбинационным событием (0,1 сМ) от локуса R1. Путем скрининга ВАС-библиотеки этим маркером идентифицировали ВАС-клон ВА 100 е 13. Тремя рекомбинационными событиями отделили конец ВА 100 е 13, дальний от R1. Конец ВА 100 е 13, ближний к R1, идентифицировал BA47f2. Конец BA47f2, дальний от R1, перекрыли с ВА 100 е 13 и отделили от R1 одним рекомбинационным событием. Ближний конец косегрегировал с R1, как и все последующие анализируемые ВАС-концы (правая часть фиг. 1). Конец BA47f2, косегрегированный с R1, идентифицировал ВА 27 с 1. Конец ВА 27 с 1, не перекрывающийся с BA47f2, идентифицировал клоны ВА 122 р 13 и ВА 121 о 1. Конец ВА 121 о 1, не перекрывающийся с ВА 27 с 1, показал существенное подобие последовательности (37% идентичности, 56% подобия транслированной аминокислотной последовательности) с геном устойчивости томата Prf к Pseudomonas syringae (Salmeron et al. 1996). Этот подобный гену устойчивости (RGL) фрагмент использовали в качестве зонда для рескрининга ВАС-библиотеки. RGL-зонд идентифицировал,в дополнение к ВА 122 р 13, несколько новых положительных клонов, из которых два, BA87d17 и ВА 76 о 11, были подвергнуты дальнейшему анализу. Они содержали полные копии RGL-гена, который был рассмотрен как возможный R1-кандидат. Неперекрывающиеся концы ВА 76 о 11 и BA87d17 косегрегировали с R1. ВАС-концевые маркеры, используемые для конструирования физической карты, использовали также для отнесения ВАС-клонов к хромосоме Р 6/210 (R1r1), несущей аллель r1 или R1. Клоны ВА 100 е 13,BA47f2 и BA87d17 (фиг. 1) находились в цис-положении с аллелью R1, в то время как клоны ВА 121 о 1,ВА 122 р 13 и ВА 76 о 11 были получены из гомолога, содержащего r1 (фиг. 1). Клон ВА 27 с 1, на основе использовавшихся маркеров, не мог быть отнесен к r1 или R1 хромосоме. Пример 3. кДНК-клоны R1-кандидата. С использованием целых вставок ВАС хромосом BA121o1 and BA76o11 в качестве зондов, были изолированы 6 и 8 кДНК-клонов, соответственно, из библиотеки кДНК, полученной из инфицированных листьев генотипа Р 41 (R1r1). 8 из 14 кДНК-клонов были подобны известным растительным генам устойчивости. Наивысшее подобие было получено с геном устойчивости томата Prf к Pseudomonas syringae(Salmeron et al. 1996). Последовательности восьми кДНК-кандидатов имели 80-90% идентичности друг с другом. кДНК-клон с 76-2 длиной в 2292 нуклеотида был идентичен, за исключением интронов, геномной последовательности клона g10, субклона, представляющего часть BA87d17 (см. ниже). Сравнение последовательностей с известными генами устойчивости из базы данных показало, что клон с 76-2 не являлся полным геном. С использованием анализа RACE кДНК удлинили на 1943 нуклеотида в направлении 5'-окончания, получив полную последовательность кДНК из 4235 нуклеотидов, в том числе 5'-нетранслируемую область из 59 нуклеотидов и 297 нуклеотидов 3'-нетранслируемой последовательности- 23008599 между стоп-кодоном и поли-А-хвостом. кДНК включала стартовый кодон в положении 2223 геномной последовательности, соответствующий первому метионину в аминокислотной последовательности, дедуцированной из клона g10 (фиг. 4 В). Были идентифицированы два аденина в положениях -3 и +4 (где а в ATG=+1), что называют последовательностью узнавания рибосом у растений, насекомых, дрожжей и млекопитающих (Kozak 1991). ПЦР-праймеры, специфические для клона кДНК с 76-2, были сконструированы на основе выравнивания последовательностей с другими семью кандидатами кДНК. Праймерами 76-2sf2 и 76-2SR (см."Материал и способы") выработали 1,4 kb продукт ПЦР только в родительском растении Р 41 (R1r1), но не в родительском растении Р 40 (r1r1) (фиг. 2). Этот полиморфизм навел на мысль о том, что ВАСBA87d17 (полученный из хромосомы, содержащей R1) мог содержать ген R1, несмотря на то, что данные картирования все еще показывали отсутствие рекомбинации между дальним концом этого ВАС-клона иR1. Пример 4. Комплементация фенотипа R1. Геномную суббиблиотеку в бинарном векторе pCLD04541 (см. "Материал и способы") с 10 kb (в среднем) инсерциями сконструировали из BA87d17 (76 kb). Библиотеку скринировали путем гибридизации колоний с RGL-зондом из ВА 121 о 1. Положительные клоны оценивали на присутствие полной копииRGL-гена-кандидата по размеру продуктов амплификации, полученных при помощи ПЦР с форвардпраймерами из краев вектора (Т 3 и Т 7) и обратными праймерами из RGL. Клоны также тестировали с использованием с 76-2 кДНК-специфических праймеров 76-2sf2 и 76-2SR. Субклон g10-2 селектировали и трансформировали в A. tumefaciens. Три различные бактериальные колонии использовали для трансформации восприимчивого сорта Desire. Из трех опытов по трансформации регенерировали 15 независимых трансгенных линий и протестировали их в четырех независимых опытах на экспрессию устойчивости к расе 4 P. infestans (табл. 2). Таблица 2 Тест на устойчивость к расе 4 P. infestans трансгенных линий картофеля,трансформированных клоном g10 Трансгенные линии тестировали в четырех независимых опытах с тремя листьями от каждой линии на экспрессию гиперчувствительной устойчивости к расе 4 P. infestans. Девять трансгенных линий явно показали типичную реакцию HR, подобно устойчивой линии Р 41,содержащей R1 (фиг. 3); три линии показали неявные результаты, и остальные три были восприимчивыми, как нетрансформированное контрольное растение Desire. На основе этих результатов было сделано заключение, что субклон g10 содержал ген R1. Все трансгенные линии с фенотипом R1 содержали ген, соответствующий кДНК 76-2, что было продемонстрировано присутствием 1,4 kb продукта ПЦР, амплифицированного праймерами 76-2sf2 и 762SR. Этот продукт отсутствовал в нетрансформированном Desire (контрольном) и во всех ВАС-клонах,представленных на фиг. 1 в качестве членов контига вокруг R1, за исключением BA87d17 (фиг. 2). Пример 5. Структура гена R1. Субклон g10, содержащий ген R1, секвенировали; см. SEQ ID NO: 1. Последовательность содержала 10388 нуклеотидов и включала один ген с последовательностью, подобной другим растительным ге- 24008599 нам устойчивости. Никакая другая открытая рамка считывания или гомология последовательности не была идентифицирована в базе данных GenEMBL. Выравнивание последовательности с кДНК с 76-2 и 5'продуктом RACE выявило присутствие трех экзонов и трех интронов. Два интрона длиной 92 bр (положение 4878-4970) и 126 bр (положение 6103-6229) прерывают кодирующую область. Третий интрон длиной 81 bр (положение 6323-6404) расположен в 3'-нетранслируемой области сразу после стоп-кодона(фиг. 4 А). Дедуцированная аминокислотная последовательность предсказывает полипептид из 1293 аминокислот с молекулярной массой 149,4 кДа (фиг. 4 В). Дедуцированная аминокислотная последовательность гена R1 наиболее подобна (40% идентичности) гену устойчивости томата Prf к Pseudomonas syringae(Salmeron et al. 1996). Предсказанный протеин R1 имеет предполагаемый домен сайта нуклеотидного связывания (NBS), состоящий из мотивов Р-петли (аминокислоты 572-578), киназы 2 (аминокислоты 649-653) и киназы 3 а (аминокислоты 677-682) (фиг. 4 В). После киназных мотивов расположены другие последовательности, подобные доменам неизвестной функции, законсервированным среди генов устойчивости: GLPL (QLPL (SEQ ID NO: 10) в R1), CKLY (CFLY (SEQ ID NO: 12) в R1) и MHD (LHD в R1). Поиск законсервированных мотивов с использованием алгоритма ExPASY обнаружил 4 предполагаемых сайта миристилирования, 9 сайтов гликозилации, 43 сайта фосфорилирования и 1 сайт амидирования в дедуцированной аминокислотной последовательности R1. Предполагаемый повторяющийся домен, богатый лейцином (LRR), R1 содержит 15-16 дефектных повторов, расположенных в карбоксиконцевой части гена. Подобно некоторым растительным R-протеинам с цитоплазматическими LRRs, протеин R1 содержит лейциновый зиппер в аминокислотном положении 308-329 (Hammond-Kosack and Jones, 1997). Пример 6. Геномная организация локуса R1. Саузерн-блот анализ в геле показал, что R1 является членом семейства генов, R1-специфические праймеры 76-2sf2 и 76-2SR амплифицировали 1,4 kb фрагмент в BA87d17 (R1), но не в перекрывающихся клонах ВА 121 о 1, ВА 122 р 13 и ВА 76 о 11 (r1) (фиг. 2). Анализ последовательности ДНК BACs BA87d17(R1) и ВА 122 р 13 (r1) выявил, что BA87d17 содержит два высокогомологичных члена семейства геновR1: R1, соответствующий функциональному гену R1, и r1.1, ортологичный аллели r1.2 в ВА 122 р 13. Функциональный ген R1 был частью 15 kb инсерции, присутствующей в R1-несущей хромосоме в области, представленной клоном BA87d17, но отсутствующей в хромосоме, содержащей r1 (фиг. 5). Следует понимать, что изобретение может осуществляться на практике способами, отличными от приведенных в данном описании и примерах. В свете изложенных выше принципов, возможны многочисленные модификации и вариации данного изобретения, которые не выходят за пределы объема данного изобретения. Полное содержание каждого документа (включая патенты, патентные заявки, журнальные статьи,рефераты, лабораторные инструкции, монографии, последовательности или другие описания), упомянутого в предисловии изобретения, описании, примерах и списке последовательностей, включено в данную заявку в виде ссылки. Ссылки