Иммуноконъюгаты для лечения опухолей

007396 Область изобретения Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции и ее использованию. Предпосылки создания изобретения Противоопухолевая активность некоторых цитокинов хорошо известна и описана. Некоторые цитокины уже используются для лечения людей. Например, цитокины, такие как IL-2 и IFN-, показали хорошую противоопухолевую активность у пациентов с различными типами опухолей, такими как метастатическая карцинома почки, лейкоз ворсистых клеток, саркома Капоши, меланома, множественная миелома и похожих. Другие цитокины, подобные IFN, фактору некроза опухоли (TNF), TNF, IL-1, 4,6, 12, 15 и колониестимулирующим факторам (CSFs), показали определенную противоопухолевую активность на некоторых типах опухолей. Вообще терапевтическое использование цитокинов сильно ограничено их системной токсичностью.TNF, например, был первоначально обнаружен по его способности вызывать геморрагический некроз некоторых опухолей и по его in vitro цитотоксическому эффекту на различных опухолевых линиях, но впоследствии доказали, что он имеет сильную провоспалительную активность, которая может при определенных условиях нанести серьезный вред телу человека. Поскольку системная токсичность является основной проблемой в использовании фармакологически активных количеств цитокинов у человека, оцениваются новые производные и терапевтические стратегии, направленные на уменьшение токсических эффектов этого класса биологических действующих веществ при сохранении их терапевтической эффективности. Некоторые новые подходы направлены наa) создание слитых белков, которые могут доставлять TNF в опухоль и повышать местную концентрацию. Например, были получены слитые белки, состоящие из TNF и опухолево-специфичных антител;b) разработка мутантов TNF, которые сохраняют противоопухолевую активность и имеют пониженную системную токсичность. Таким образом, были получены мутанты, способные селективно распознавать только один рецептор;c) использование анти-TNF антител, способных понижать некоторые токсические эффекты TNF без изменения его противоопухолевой активности. Такие антитела уже описаны в литературе;d) использование производных TNF с повышенным периодом полураспада (например, TNF конъюгированный с полиэтиленгликолем). Недавно сообщалось о получении производных TNF, обеспечивающих селективное нацеливание на опухолевые сайты. Например, был описан слитый белок, полученный путем слияния гена тяжелой цепи антитрансферринового рецептора mAb и гена TNF, или слитый белок TNF и шарнирной области моноклонального антитела против опухолево-ассоциированного TAG72 антигена, или слитый белок Fv-TNF. В ЕР 251494 раскрыта система для ведения диагностического или терапевтического агента, которая содержит антитело, конъюгированное с авидином или стрептавидином, агент, способствующий комплексообразованию конъюгированного антитела, и вещество, состоящее из диагностического или терапевтического агента, конъюгированного с биотином, которые вводили последовательно и в достаточной мере медленно для того, чтобы сделать возможной локализацию терапевтического или диагностического агента через биотин-стрептавидиновое взаимодействие на клетке-мишени, распознаваемой антителом. Описанные терапевтические или диагностические агенты содержат хелаты металлов, в частности хелаты радионуклидов, и низкомолекулярные противоопухолевые агенты, такие как цисплатин, доксорубицин и т.д. В ЕР 496074 раскрыт способ, который предлагает последовательное введение биотинилированного антитела, авидина или стрептавидина и биотинилированного диагностического или терапевтического агента. Хотя, в общем, указывается цитотоксичность агентов, подобных рицину, заявка главным образом относится к радиолабильным соединениям. В WO 95/15979 раскрыт способ локализации высокотоксичных агентов на клеточных мишенях, основанный на введении первого конъюгата, содержащего специфическую молекулу-мишень, конъюгированную с лигандом или антилигандом, с последующим введением второго конъюгата, состоящего из токсичного агента, связанного с антилигандом или лигандом. В WO 99/13329 раскрыт способ направления молекулы к опухолевым ангиогенным сосудам, основанный на конъюгации указанной молекулы с лигандами NGR рецепторов. В качестве возможных кандидатов рассматривался ряд молекул, но подробно описан только доксорубицин. Не раскрыто использование лигандов NGR рецепторов в качестве носителей цитокинов для вызова иммунного ответа. В WO 01/61017 описано, что, как неожиданно найдено изобретателями, терапевтический показатель определенных цитокинов может быть значительно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть усилены путем связывания с лигандом рецептора N-аминопептидазы (CD13). CD13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, который хорошо сохраняется в различных видах. Его экспрессировали на нормальных клетках, а также в миелоидные опухолевые линии, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. CD13 рецептор обычно идентифицируется как "NGR" рецептор, так как его пептидные лиганды разделяют аминокислоты звена "NGR".-1 007396 Однако остается потребность в дальнейшем и в улучшенных фармацевтических композициях, и в способах лечения и диагностики рака. Краткое описание изобретения Доставка лекарственных средств и проникновение в неопластические клетки является решающей для эффективности опухолевой химиотерапии. Мы нашли, что неожиданно направленная доставка пикограммовых доз цитокинов усиливает пенетрацию химиотерапевтических лекарственных средств. Более подробно, мы нашли, что доставка очень низких доз цитокинов в опухоли и опухолеассоциированную окружающую среду, включая опухолевую сосудистую систему, представляет новый подход для того,чтобы избежать механизмы негативных ответных реакций и сохранить его способность видоизменять лекарственно-пенетрационные барьеры. Настоящее изобретение, таким образом, представляет новую и неожиданную стратегию для повышения терапевтического индекса химиотерапевтических лекарственных средств. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, мы нашли, используя сосудистое нацеливание, достигаемое путем связывания TNF с CNGRC, пептидом, который определяет опухолевую неоваскуляторность, что эта обработка в 8-10 раз увеличивает терапевтическую эффективность доксорубицина без заметного увеличения токсичности. Аналогично, сосудистое нацеливание увеличивает эффективность мелфалана, различных химиотерапевтических лекарственных средств. Синергия с химиотерапией наблюдалась с 3-5 нг/кг нацеленного TNF (i.p.), 106 раз ниже, чем LD50, и 105 раз ниже, чем доза, требуемая для ненацеленного TNF. Кроме того, мы также нашли, что нацеленная доставка низких доз TNF в опухолевые сосуды не вызывает высвобождения растворимых TNF рецепторов в циркуляцию. Также найдено, что RGD-TNF и IFN-NGR активны в пикограммовом интервале. Также показано, чтоNGR-TNF увеличивает эффект цисплатина. Эти результаты показывают, что доставка ультрамалых количеств цитокинов в опухолевые сосуды представляет новый подход для того, чтобы избежать механизмов негативных ответных реакций и сохранить его способность видоизменять лекарственнопенетрационные барьеры. Сосудистое нацеливание на этом пути представляет новую стратегию для усиления терапевтического индекса химиотерапевтических лекарственных средств. Изложение изобретения Согласно одному аспекту настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат цитокина и опухоленацеливающего модуля (ТТМ) и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, в которой цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает механизма негативных ответных реакций. Соответственно цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает выпадение растворимого цитокинового рецептора. Предпочтительно конъюгат присутствует в количестве, обеспечивающем дозиравание в интервале от 0,5 до 500 нг/кг, более предпочтительно 1-50 нг/кг, еще более предпочтительно 5-15 нг/кг. В одном варианте осуществления изобретения цитокин является воспалительным цитокином. В другом варианте осуществления изобретения цитокин является химиотерапевтическим цитокином. Предпочтительно цитокины выбирают из TNF, таких как TNF, TNF, IFN, IFN, IFN, IL-1, 2, 4,6, 12, 15, EMAP II, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), PDGF, PD-ECGF и хемокина. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения цитокин представляет собойTNF, TNF или IFN, наиболее предпочтительно TNF или TNF. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой связывающий партнер, такой как лиганд или антитело к поверхностной молекуле опухолевой клетки, такой как рецептор, маркер или другой внеклеточный компонент. В другом варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой опухолево-сосудистый нацеливающий модулем (TVTM) и может быть связывающим партнером, таким как лиганд, или антителом к поверхностной молекуле опухолевой сосудистой клетки, такой как рецептор, маркер или другой внеклеточный компонент. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой антитело или его фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой лиганд или его фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой пептид, содержащий NGR или RGD звено, или представляет собой HIV-tat, аннексин V, остеопонтин, фибронектин,коллаген типа I или IV, гиалуронат или эфрин, или представляет собой связывающий партнер, такой как антитело к онкофетальному фибронектину, или представляет собой фрагмент любого из вышеуказанных. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит NGR звено. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой CNGRCVSGCAGRC,NGRAHA, GNGRG, циклоCVLNGRMEC, линейный или циклический CNGRC. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой пептид,содержащий RGD звено. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ нацелен на VEGFR, ICAM 1, 2 или 3, РЕСАМ 1, CD13, VCAM-1, селектин, ActRII, ActRIIB, ActRI, ActRIB, CD44, аминопептидазу А, аминопептидазуN (CD13), v3 интегрин, v5 интегрин, FGF-1,2,3, или 4, IL-1R, EPHR, MMP, NG2, тенасцин, онкофе-2 007396 тальный фибронектин, PD-ECGFR, TNFR, PDGFR или PSMA. Комбинации предпочтительных нацеливающих модулей и цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, приведены в нижеследующей таблице.