Иммунотерапевтические комбинации для лечения опухолей, которые сверхэкспрессируют ганглиозиды

006936 Область техники Данное изобретение относится к медицине человека и, в частности, к терапевтическим вакцинам,которые индуцируют иммунную реакцию на опухоли, сверхэкспрессирующие ганглиозиды. Предпосылки изобретения Ганглиозиды являются компонентами плазматических мембран большинства клеток млекопитающих. Даже при экспрессии этих гликосфинголипидов в нормальных тканях они являются очень привлекательными мишенями для иммунотерапии вследствие характера экспрессии во время злокачественной трансформации клеток (Hakomori, S. Ann. Rev. Biochem. 50; 1981:733-764; Hakomori, Cancer Res. 45; 1985:2405-2414; Irie, R.F., et al., In: Therapeutic monoclonal antibodies. Borrebaeck, C.A.K., and Larrick, J.W.(Eds.). M Stockton Press, 1990, pp. 75-94). Сахаридная природа ганглиозидов, вместе с фактом, что они являются аутоантигенами, делает их очень слабыми иммуногенными молекулами. Были использованы некоторые стратегии для увеличения иммуногенности этих антигенов. Они основаны на представлении ганглиозидов иммунной системе в отличающейся молекулярной среде. Одной из подобных стратегий представления было применение конъюгированных вакцин, в которых этот сахаридный антиген ковалентно связан с белком-носителем,где этот носитель является очень иммуногенным для Т-клеток. Это позволяет получить сильную и продолжительно сохраняющуюся иммунную реакцию в виде антител. С использованием этой процедуры удалось индуцировать IgG-антитела против таких ганглиозидов, хотя титры после повторной иммунизации были более низкими в сравнении с титрами, получаемыми в классической иммунной реакции против тимус-независимых антигенов (Helling, F. et al. Cancer Res. 54; 1994:197-203; Helling, F. et al. Cancer Res. 55; 1995:2783-2788; Livingston PO et al. Cancer Immunol Immunother 45; 1997:10-19). Сообщалось, что новые вакцинные композиции индуцируют иммунную реакцию против N-ацетилированных и N-гликолилированных ганглиозидов. Эти вакцины основаны на гидрофобной конъюгации между ганглиозидами и являются протеолипосомами очень малого размера (VSSP), полученными из связывания белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) из Neisseria meningitidis, грамотрицательной бактерии, с ганглиозидами (ганглиозиды/VSSP) (Estevez F. et al. Vaccine 18; 1999: 190-197;Patents US 5788985 и US 6149921). Вакцины, состоящие из ганглиозида GM3/VSSP или ганглиозида(NeuGcGM3)/VSSP, индуцировали высокие титры антител IgM и IgG, специфических против GM3 иNeuGcGM3. В других отношениях, вакцинация GM3/VSSP увеличивала выживание мышей, несущих меланому В 16, она уменьшала также объемы опухолей и увеличивала скорость отторжения подкожных трансплантатов этой опухоли (Alonso et al. Int. J Oncology 15; 1999: 59-66; Car, A. et al., Melanoma Research, в печати). Теория идиотипической сети, предложенная Jerne (Jerne, N.K. Ann. Immunol. 125C; 1974:373-389),привлекла внимание к иммунной системе как сети антител со сложным распределением взаимодействий между ними и несколькими природными антигенами, причем эти взаимодействия происходят через вариабельные области, или идиотип (Id), и иммунная система регулируется посредством области контакта идиотип-антиидиотип. Теория Jerne поддержала новые стратегии для активной иммунотерапии рака (AI) на основе использования антиидиотипических вакцин. Вакцинацию проводят антителом (Аb1), которое узнает опухолеспецифический антиген, что индуцирует антиидиотипические антитела (Аb2). Эти антиидиотипические антитела имитируют номинальный антиген и, в свою очередь, они генерируют антиантиидиотипические антитела (Аb3) против опухолеспецифического антитела (Schmolling J, et al. Hybridoma 14; 1995:183-186). С другой стороны, сообщалась индукция иммунной реакции против опухолеспецифических антигенов после вакцинации aнти-Id-антителами (Аb2) (Raychauhuri, S. et al. J. Immunol. 137; 1986:1743-1749; Raychauhuri, S. et al. J. Immunol. 139; 1987:3902-3910; Bhattacharya-Chatterjee, M. et al., J.al. Clin. Cancer Res. 1; 1995:1285-1294; Herlyn, D. et al. Hybridoma 14; 1995:159-166; Sclebush, H. et al. Hybridoma 14; 1995:167-174; Herlin, D. et al. Cancer Immunol. Immunother. 43; 1996:65-76). Альтернативой, касающейся применения антител Аb2 и увеличения иммуногенности сахаридных остатков, является возможность того, что такие сахаридные эпитопы могут быть представлены белковым эпитопом на молекуле антитела. В самом деле, были получены многие из этих анти-Id-антител; они имитируют ганглиозиды, в высокой степени экспрессирующиеся в опухолевых клетках, такие как GM3, GD3 и GD2 (Yamamoto, S et al. J. Natl. Cancer Inst. 82; 1990:1757-1760; Chapman, P.B. et al. J. Clin. Invest 88; 1991:186-192; Cheung N-K V, et al. Int J Cancer 54; 1993:499-505; Saleh MN. et al. J Immunol 151; 1993:3390-3398; Sen G. et al. J Immunotherapy 21; 1998: 75-83). Многообещающие результаты были получены из клинических испытаний на пациентах со злокачественными опухолями использованием антител Аb2, вводимых одновременно с BCG или QS21 в ка-1 006936 честве адъюванта (McCaffery M. et al. Clin Cancer Res 2; 1996: 679-686; Foon KA. et al. Clin Cancer Res. 4; 1998:1117-1124). Из предшествующего уровня знаний известно моноклональное антитело Р 3 (депозитный номер ЕСАСС 94113026), которое специфически узнает сиаловую кислоту в N-гликолил-содержащих моносиало- и дисиалоганглиозидах. Это антитело MAb Ab1 узнает антигены на опухолях молочной железы человека и меланомах (патент США US 5788985; Vazquez AM. et al. Hybridoma 14; 1995:551-556; Moreno E. etal. Glycobiology 8; 1998: 695-705; Marquina G. et al. Cancer Res 56; 1996:5166-5175; Carr, A. Et al. Hybridoma 19(3); 2000:241-247). Антиидиотипическое антитело 1 Е 10 (Ab2 MAb 1E10) (депозитный номер ЕСАСС 97112901), полученное путем иммунизации MAb Р 3, является антителом гамма-типа (не внутреннее изображение). Аb2MAb 1E10 показало противоопухолевое действие на рост опухолей молочной железы и меланом (патент США US 6063379; Vazquez et al. Hybridoma 14; 1995:183-186; Vazquez et al. Oncology Reports 7; 2000:751756). В предыдущем уровне знаний нет данных о применении комбинации между вакцинами, содержащими ганглиозиды, и фармацевтическими композициями, содержащими антитела против ганглиозидов(Ab1) , или антиидиотипические антитела (Аb2), называемыми идиотипическими вакцинами; нет данных также о применении комбинаций идиотипической вакцины Ab1 с идиотипической вакциной Аb2. Данное изобретение относится к применению всех возможных описанных вакцинных комбинаций для потенцирования действия, которое каждая из них оказывает отдельно. Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к фармацевтической композиции или комбинации фармацевтических композиций, применимых для иммунотерапии злокачественной опухоли, в частности, для опухолей, которые сверхэкспрессируют ганглиозиды, и она содержит по меньшей мере два из следующих соединений:(A) Идиотипическую вакцину, содержащую антиганглиозидное антитело (Ab1);(B) Идиотипическую вакцину, содержащую антиидиотипическое антитело (Аb2) против антиганглиозидного антитела; и(C) Вакцину, содержащую ганглиозид. Эта фармацевтическая композиция или комбинация фармацевтических композиций может иметь А плюс В или А плюс С или В плюс С. Предпочтительной является фармацевтическая композиция или комбинация фармацевтических композиций, где А может быть идиотипической вакциной, содержащей мышиное MAb P3 с депозитным номером ЕСАСС 94113026; и где В может быть идиотипической вакциной, содержащей мышиное антиидиотипическое антитело 1 Е 10 с депозитным номером ЕСАСС 97112901, и где С может быть вакциной,содержащей N-гликолил- GM3- (NeuGcGM3) или N-ацетил-GM3 (NeuAcGM3)-ганглиозиды. В данном изобретении А плюс В или А плюс С или В плюс С могут вводиться одновременно или попеременно. Композиции данного изобретения могут быть применимы в лечении злокачественной опухоли, в частности, такой, при которой характерна сверхэкспрессия ганглиозидов, а также злокачественной опухоли легкого, молочной железы, пищеварительной системы, мочеполовой системы, меланом, сарком, и таких ее форм, которые происходят из нейроэктодермальной ткани. В данном изобретении описана также схема введения этих фармацевтических композиций или комбинации фармацевтических композиций для лечения млекопитающих. В данном изобретении описан также способ, который предусматривает введение млекопитающим фармацевтической композиции или комбинации фармацевтических композиций, описанных ранее, для предупреждения или лечения рака молочной железы, легкого, пищеварительной системы, мочеполовой системы, меланом, сарком и рака нейроэктодермального происхождения. 1. Получение вакцины, содержащей ганглиозиды. Вакцины, содержащие ганглиозиды, получают в соответствии с описанием Estevez et al. Vaccine 18,1999; 190-197 и в патентах США 5788985 и US 6149921. Они включают в себя протеолипосомы очень малого размера (VSSP), полученные из связывания белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) из грамотрицательного бактериального штамма, Neisseria meningitidis, с синтетическими или природными ганглиозидами (VSSP-G). Ганглиозидами могут быть (NeuGcGM3), GD3 или (NeuAcGM3). 2. Получение идиотипических вакцин. Эти фармацевтические композиции получают в соответствии с описаниями патентов США 5817513 и 6063379. Эта вакцина содержит мышиные антиганглиозидные моноклональные антитела, такие какMAb P3, или мышиные антиидиотипические моноклональные антитела, такие как MAb 1E10, которые узнают антиганглиозидные моноклональные антитела. 3. Иммунотерапевтические комбинации, которые потенцируют иммунную реакцию и противоопухолевое действие ганглиозидных вакцин и идиотипических вакцин в моделях животных. Указанные процедуры могут быть использованы на мышах или любых других видах млекопитающих. Компонентами комбинации являются ганглиозидная вакцина и идиотипическая вакцина; они могут-2 006936 быть объединены различными способами. В одной комбинации животные могут быть иммунизированы 3-10 дозами в диапазоне 25 мкг-1 мг мышиного антиганглиозидного моноклонального антитела; интервал между дозами может составлять 7 и 14 дней. Во время этого периода животные получают 3-10 доз в диапазоне 60-1000 мкг ганглиозидной вакцины, с интервалом между дозами 7-14 дней. В другой комбинации животные могут быть иммунизированы 3-10 дозами в диапазоне 25 мкг-1 мг мышиного антиидиотипического антитела, специфического против антиганглиозидного антитела; интервал между дозами может быть 7-14 дней. Во время этого периода животные получают 3-10 доз в диапазоне 60-1000 мкг ганглиозидной вакцины, с интервалом между дозами 7-14 дней. Оба типа вакцин можно вводить одновременно или попеременно. Эти вакцины могут быть приготовлены в виде отдельных продуктов или в виде вакцинной композиции при их одновременном введении. При попеременном введении вакцин интервалы между разными типами вакцин могут составлять 37 дней. Вакцины вводят в адъюванте, которым может быть гидроксид алюминия (62,5 мкг-2,5 мг), Montanide ISA 51 (0,1-1,2 мл на дозу) или любой другой подходящий адъювант. Общий объем для каждой дозы может быть 10 мкл-2 мл. Вакцины, содержащие ганглиозиды, могут быть введены интрадермально, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, через слизистую оболочку или комбинациями этих способов. Такие же способы введения могут быть использованы для введения вакцин, содержащих антитела. Иммунотерапевтические комбинации увеличивают иммунную реакцию в виде антител, а также клеточную иммунную реакцию у обработанных животных. Время появления локальных опухолей, объем опухоли и выживание обработанных субъектов сравнивают с теми же самыми параметрами в контрольной группе для оценки эффективности иммунотерапевтических комбинаций. При сравнении этих параметров между обработанной и контрольной группами можно наблюдать более короткое время появления локальных опухолей, уменьшение объема опухоли и увеличение выживания в группе, обработанной терапевтическими комбинациями согласно изобретению. Контрольными группами являются не только животные, обработанные адъювантом, но также группы, обработанные только одной вакциной вместо их комбинаций. 4. Иммунотерапевтические комбинации, которые потенцируют иммунную реакцию и противоопухолевое действие ганглиозидных вакцин и идиотипических вакцин у человека. Описанная ранее процедура может быть применена к пациентам со злокачественными опухолями в различных клинических стадиях и, конкретно, с опухолями, которые сверхэкспрессируют ганглиозиды, а также опухолями легкого, молочной железы, пищеварительной системы, мочеполовой системы, меланомам, саркомам и опухолями нейроэктодермального происхождения. В одной комбинации пациенты могут быть иммунизированы 3-10 дозами в диапазоне 0,1-5 мг мышиного антиганглиозидного моноклонального антитела; интервал между дозами может составлять 7 и 14 дней. Во время этого периода пациенты получают 3-10 доз в диапазоне 60-1000 мкг ганглиозидной вакцины, интервал между дозами может составлять 7-14 дней. Во второй комбинации пациенты могут быть иммунизированы 3-10 дозами в диапазоне 0,1-5 мг мышиного антиидиотипического антитела, специфичного в отношении антиганглиозидного антитела; интервал между дозами может составлять 7-14 дней. Во время этого периода пациенты получают 4-6 доз в диапазоне 60-1000 мкг ганглиозидной вакцины, интервал между дозами может быть 7-14 дней. В третьей комбинации пациенты могут быть иммунизированы мышиным антиганглиозидным моноклональным антителом; дозы, частота и интервалы могут быть такими же, какие описаны ранее. Во время этого периода пациенты получают 3-10 доз в диапазоне 0,1-2 мг мышиного антиидиотипического антитела, специфичного в отношении антиганглиозидного антитела. Введение обоих типов вакцин может быть одновременным или попеременным. Эти вакцины могут быть приготовлены в виде отдельных продуктов или в виде вакцинной композиции при их одновременном введении. При попеременном введении вакцин интервалы между разными типами вакцин могут составлять 3-7 дней. Вакцины вводят в адъюванте, которым может быть гидроксид алюминия (1-5 мг на дозу), Montanide ISA 51 (0,6-1,2 мл на дозу) или любой другой подходящий адъювант. Общий объем для каждой дозы может составлять 10 мкл-2 мл. Вакцины, содержащие ганглиозиды, могут быть введены интрадермально, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, через слизистую оболочку или путем комбинирования этих способов. Такие же способы введения могут быть использованы для введения вакцин, содержащих антитела. Во время вакцинации некоторые биохимические параметры и титры антител подвергают мониторингу посредством измерений в крови. Частота может составлять 1 неделю - 3 месяца. Клеточный иммунитет исследуют с использованием лимфоцитов пациентов. Экстракции проводят с частотой, колеблющейся от одной недели до трех месяцев. Наконец, пациенты могут быть повторно иммунизированы обеими вакцинами в указанных выше концентрациях; интервалы между дозами могут составлять 1-6 месяцев. Они могут вводиться одновременно или не одновременно и в течение 1-2 лет. Приведенная схема вакцинации индуцирует у пациентов усиленную иммунную реакцию в виде ан-3 006936 тител и клеточную иммунную реакцию и, следовательно, уменьшает опухолевую нагрузку. Примеры Пример 1. Активация антиидиотипических Т 2- и антиантиидиотипических Т 3-клеток в сингенной модели, индуцированная иммунизацией мышиным МАb Р 3. Самок мышей Balb/c и голых мышей с одной и той же генетической основой в возрасте 6-8 недель иммунизировали подкожно 100 мкг мышиного МАb Р 3 (антитело против N-гликолилированного ганглиозида, депозитный номер ЕСАСС 94113026; Vazquez et al., Hybridoma 14; 1995: 551-558; Moreno et al.Glycobiology 8; 1998: 695-705) в полном адъюванте Фрейнда (CFA). Спустя 7 дней мышей повторно иммунизировали 50 мкг этого антитела в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). В день 10 лимфатические узлы дренажа собирали, и лимфоциты получали продавливанием через шприц. Суспензии клеток использовали в экспериментах по клеточной пролиферации, которую измеряли по включению 3 Нтимидина. Пролиферацию лимфоцитов in vitro измеряли при культивировании суспензии лимфоцитов в присутствии увеличивающихся концентраций (25-150 мкг/мл) мышиного МАb Р 3 и его Аb2 МАb 1 Е 10(депозитный номер ЕСАСС 97112901). Мышиные МАb того же изотипа использовали в качестве контролей. Индексы стимуляции, равные 3 или выше, считали положительными. Лимфоциты, полученные после иммунизации мышей Balb/c МАb Р 3, специфически пролиферировали в присутствии этих МАb, и эту пролиферацию не наблюдали при культивировании этих клеток в присутствии мышиного контрольного МАb A3 (IgM) (Alfonso M. et al. Hybridoma 14; 1995: 209-216). Эта пролиферация зависела от присутствия Т-клеток, поскольку ее не получали с клетками лимфатических узлов из иммунизированных Р 3 бестимусных мышей nu/nu. Иммунизация мышиным МАb Р 3 не только индуцировала пролиферацию Тклеток против идиотипа этого Ab1 МАb (Т 2), но также индуцировала пролиферацию антиантиидиотипических Т-клеток (Т 3) , специфичных в отношении мышиного Аb2 МАb 1 Е 10 (IgG1), но не МАb С 5 того же самого идиотипа (IgG1) (фиг. 1). Пример 2. Активация антиидиотипических (Т 2) и антиантиидиотипических (Т 3) Т-клеток, индуцированная иммунизацией химерным антителом Р 3. Химерное антитело Р 3, аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей которого показаны, соответственно, на фиг. 8 и 9, использовали для иммунизации самок мышей Balb/c в возрасте 6-8 недель. Для первой подкожной дозы использовали 100 мкг антитела,эмульгированного в ACF. Спустя 7 дней животных повторно иммунизировали 50 мкг антитела, эмульгированного в AIF. В день 10 дренированные лимфатические узлы (LN) собирали, и лимфопролиферативную способность клеток LN анализировали, инкубируя их в присутствии мышиных и химерных вариантов антител Р 3 и Аb2 1 Е 10, последовательности вариабельных областей которых показаны на фиг. 13(тяжелая цепь) и 14 (легкая цепь). Мышиное MAb C5 и его химерный вариант использовали в качестве контролей того же изотипа (Патентная заявка WO 97/33916 А 1). Лимфоциты мышей, иммунизированных химерным антителом Р 3, специфически пролиферировали при культивировании в присутствии этого антитела или химерного антитела MAb 1E10, а также при культивировании в присутствии мышиных вариантов этих антител. Специфичность пролиферации демонстрировали с использованием контрольныхMAb того же самого изотипа. Таким образом, химерное MAb Р 3 сохраняет способность мышиного варианта индуцировать специфическую пролиферацию антиидиотипических (Т 2) и антиантиидиотипических(Т 3) Т-клеток (фиг. 2). Пример 3: Усиление противоопухолевого действия вакцины GM3-VSSP/Montanide ISA 51 ее комбинированием с вакциной, состоящей из мышиного MAb 1E10, адсорбированного в гидроксиде алюминия. Группу 6-8-недельных самок мышей C57BL/6 иммунизировали подкожно в дни 0, 14, 28 и 42 50 мкг мышиного MAb 1E10, адсорбированного в гидроксиде алюминия. В дни 7, 21, 35 и 49 мыши получали внутримышечные дозы 120 мкг GM3-VSSP/Montanide ISA 51. Другую группу мышей иммунизировали подобным образом, но иммунизации начинали с вакцинного препарата, содержащего ганглиозид GM3. Контрольные группы, отдельно иммунизированные при тех же самых временных интервалах и тем же самым числом доз каждой вакцины или только забуференным фосфатом солевым раствором, использовали в этих экспериментах. В день 63 мышей во всех группах подкожно инокулировали 10000 клеток мышиной опухоли В 16. Рост опухолей оценивали во всех группах. Статистический анализ данных Mixed Lineal Pattern использовали для сравнения опухолевого роста между всеми группами и группой контроля, которая получала только ЗФР. Вакцинация только MAb 1E10 не защищала мышей против контрольного заражения 10000 клеток меланомы В 16. Вакцина GM3-VSSP вызывала замедление роста опухоли (р 0,05). Комбинация вакцинGM3-VSSP и MAb 1E10 приводила к увеличению защитного действия, наблюдаемого только с одной вакциной GM3-VSSP (р 0,05) (фиг. 3). Пример 4. Схема иммунизации раковых пациентов ганглиозидной вакциной NeuGc-GM3/VSSP с использованием Montanide ISA 51 в качестве адъюванта. С целью демонстрации безопасности и иммуногенности иммунизации вакциной NeuGc-GM3/VSSP с использованием Montanide ISA 51 в качестве адъюванта (патент США 5788985 и патент США 6149921) проводили клиническое испытание, в котором 20 пациентов с запущенной злокачественной меланомой,-4 006936 которые не поддавались никакой другой опухолеспецифической обработке, иммунизировали этой вакциной. Эти пациенты получали 9 доз вакцинного препарата, содержащего 200 мкг ганглиозида GM3. Дозы вводили в дни 0, 14, 28, 42, 56, 84, 112, 140 и 168. В соответствии с назначениями лечащего врача, пациенты получали дополнительные дозы каждые 28 дней после шестого месяца до достижения одного года лечения. Брали пробы крови для рутинных биохимических определений и для оценки сывороточных титров анти-NeuGcM3-ганглиозидных антител в дни 0, 14, 28, 56, 112, 168, 224, 280 и 332. Титры антител измеряли при помощи ELISA. Разведения сыворотки считали положительными, когда величины OD были равными или большими, чем 0,1 (относительно OD антиметанола). Токсичность вакцины NeuGcGM3-VSSP/Montanide ISA 51 выражалась в эритеме, локальной боли,уплотнении (индурации) в месте инъекции и лихорадке, и это позволило характеризовать токсичность как легкую, степени I/II, согласно критериям OMS. У пациентов развивались титры специфических антител против NeuGcGM3 (между 1:80 и 1:2560). Детектированный изотип антител включает в себя IgG и IgM (все пациенты) и IgG (75% пациентов; табл.I). У пациента 01, который вступил в это испытание с диагнозом запущенной злокачественной меланомы (эволюционное метастатическое заболевание, EMD), наблюдали регресс и стабилизацию некоторых кожных повреждений после двух месяцев лечения с неокрашенными ореолами вокруг этих повреждений, в которых были показаны воспалительный инфильтрат и некроз посредством патологоанатомических исследований в биопсиях (фиг. 4) . У пациента 02, имеющего диагноз запущенной злокачественной меланомы, наблюдали стабилизацию метастатического повреждения легкого в правой верхней части 18-20 мм, в течение по меньшей мере 4 месяцев (фиг. 5). Таблица I. Титры антител против NeuGcGM3 у пациентов с запущенной злокачественной меланомой,иммунизированных вакциной NeuGcGM3/VSSP/Montanide ISA 51 Пример 5. Схема иммунизации у раковых пациентов идиотипической вакциной, содержащей осажденное гидроксидом алюминия Аb2 MAb 1E10. С целью демонстрации безопасности и иммуногенности идиотипической вакцины, содержащей мышиное антиидиотипическое антитело MAb 1E10 (патент США 5817513 и патент США 6063379) и гидроксид алюминия в качестве адъюванта, проводили клиническое испытание с 20 пациентами с запущенной злокачественной меланомой, которые не поддавались никакой другой опухолеспецифической обработке. Пациенты получали 4 дозы вакцины, состоящей из 2 мг MAb 1 Е 10. Пробы крови брали до обработки и спустя 14 дней после каждой иммунизации для рутинных биохимических определений и для оценки сывороточных титров антител против идиотипа MAb 1E10 и ганглиозида NeuGc-GM3. Титры антител измеряли при помощи анализа ELISA, причем положительными величинами считали величины, равные или большие 0,15. Введение вакцины пациентам давало слабую токсичность, классифицируемую как степень I и II, в соответствии с OMS.-5 006936 У 16 из 17 оцениваемых пациентов индуцировались сильные реакции в виде антитела IgG Аb3, детектируемые после получения 2 или 3 доз этой вакцины. Анализ специфичности этого Аb3 показал преимущественное узнавание сыворотками пациентов антитела MAb 1E10 в сравнении с контрольнымиMAb других изотипов, что предполагало индукцию идиотип-специфического компонента в реакции в виде антител на MAb 1E10. Это подтверждалось сильной реактивностью сывороток против F(ab')2 фрагментов этих MAb, с медианой титра 1:15000 (титры от 1:10000 до более, чем 1:100000), с малым узнаванием F(ab' )2-фрагментов контрольных MAb, используемых в качестве контролей (фиг. 6). Антитела, генерированные против NeuGcGM3, были в большинстве случаев как IgM, так и IgG, с титрами 1:4000 и 1:800, соответственно (фиг. 7). Пациент с диагнозом злокачественной меланомы и метастазами в легких был включен в клиническое испытание; после обработки была показана стабилизация заболевания в течение 8 месяцев, и выживание этого пациента составило 15 месяцев. Пример 6. Комбинированная иммунизация антиидиотипической вакциной, содержащей Аb2 MAb 1E10, и NeuGcGM3-VSSP-ганглиозидной вакциной. Пациент с меланомой, имеющий метастазы, которого подвергали хирургии один раз в месяц после диагноза, получал 6 доз идиотипической вакцины, содержащей Аb2 MAb 1E10 и гель гидроксида алюминия (2 мг MAb на дозу), в дни 0, 14, 28, 42, 56. Во время этого периода пациенту вводили также ганглиозидную вакцину, содержащую 200 мкг NeuGcGM3-VSSP-ганглиозида и Montanide ISA 51 в качестве адъюванта, в дни 7, 21, 35, 49, 63. После получения пациентом этой схемы иммунизации его повторно иммунизировали один раз в месяц одновременно обеими вакцинами в течение двух месяцев. В течение этого периода вакцинации не появлялись новые повреждения, и состояние пациента было хорошим. Пример 7. Узнавание опухолевых тканей MAb 14F7. Ганглиозид NeuGcGM3 узнается MAb 14F7 (патентная заявка WO 99/40119). Показано узнавание опухолевых тканей этим антителом. Фиксированную формалином ткань заливали в парафин. Гистологию оценивали в окрашенных гематоксилином-эозином срезах. Эти срезы окрашивали иммунологически комплексом биотин-стрептавидин-пероксидаза (Hsu, S.M.and Raine, L. 1981, J. Histochem Cytochem., 29:1349-1353). Вкратце, парафин удаляли и влажные срезы обрабатывали 3% Н 2 О 2 (в метанольном растворе) в течение 30 мин для уменьшения эндогенной пероксидазной активности. После инкубации с MAb 14F7 (чистым) в течение 1 ч при комнатной температуре добавляли биотинилированные антимышиные иммуноглобулины и комплекс стрептавидин-пероксидаза(Dakopatts) при комнатной температуре; между временными точками инкубации срезы промывали раствором Трис-НСl-буфера. Реакцию (POD) проявляли с использованием 5 мл Трис-НСl, 0,005 мл буферного раствора, содержащего Н 2 О 2, до 30% и 3 мг 3-3-диаминобензидина. После промывания контрастированной гематоксилином водой (Mayer) срезы покрывали бальзамом и накрывали покровным стеклом. Ферментативная реакция придает коричневую окраску. Свежие биопсии из патологических тканей получали через один час после хирургии. Все ткани промывали солевым раствором и сразу же замораживали в жидком азоте и сохраняли в замороженном виде при -80 С. Срезы замороженных фрагментов получали в криостате Leica при -25 С. Получали серийные срезы 5 мкм, сушили их на воздухе и использовали сразу же или сохраняли при -20 С завернутыми в алюминиевую фольгу; после этого срезы фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 мин. В табл. II показано иммунное окрашивание (окрашивание с использованием иммунной метки) с использованием MAb 14F7 в нескольких опухолях человека. Краситель был очень интенсивным в карциномах ободочной кишки, матки, яичника, саркомах, лимфатических узлах и метастазах рака молочной железы, а также в метастазах меланомы. Таблица II. Иммунное окрашивание с использованием MAb 14F7 Более 50% клеток показали интенсивное иммунное окрашивание мембран и цитоплазмы-6 006936 Краткое описание фигур Фиг. 1. Мышей Balb/c (эутимических и бестимусных) иммунизировали подкожно 100 мкг мышиного MAb P3 в CFA с последующей повторной иммунизацией 50 мкг MAb, эмульгированного в IFA. Спустя три дня собирали клетки лимфатических узлов, и проводили анализ пролиферации с различными концентрациями MAb Р 3, A3, 1 Е 10 и С 5. Фиг. 2. Мышей Balb/c иммунизировали подкожно 100 мкг химерного антитела Р 3 в CFA с последующей повторной иммунизацией 50 мкг МАb, эмульгированного в IFA. Спустя три дня собирали клетки лимфатических узлов и проводили анализ пролиферации с различными концентрациями с использованием мышиных и химерных антител в качестве контроля. Фиг. 3. Кинетики роста мышиной опухоли В 16 у мышей, иммунизированных иммунотерапевтическими комбинациями, в частности, идиотипической вакциной, содержащей Аb2 МАb 1 Е 10, и GМ 3VSSP-ганглиозидной вакциной, как подробно описано в примере 3. Фиг. 4. Развитие кожных метастазов у пациента с меланомой. Снимки были сделаны до иммунизации вакциной NeuGcGM3/VSSP/ISA 51 и спустя 2 и 4 месяца после обработки. Наблюдаются неокрашенные ореолы вокруг некоторых повреждений, стабилизированные повреждения, в одном повреждении наблюдали уменьшенный размер и в одном повреждении обнаружили увеличение размера. Фиг. 5. Развитие метастазов в легких у пациента с меланомой. Левая верхняя часть легкого наблюдалась при помощи аксиальной томографии с использованием компьютера, размер повреждения был 18x20 мм перед иммунизацией вакциной NeuGcGM3/VSSP/ISA 51, и спустя 4 месяца после иммунизации наблюдали стабилизацию этого повреждения. Фиг. 6. Узнавание F (ab')2-фрагментов из Аb2 МАb1 Е 10 и из других МАb одного и того же изотипа сывороткой пациентов, иммунизированных идиотипической вакциной, содержащей Аb2 МАb1 Е 10 и гель гидроксида алюминия в качестве адъюванта. Фиг. 7. Узнавание ганглиозидов GM3(NeuGc) и GM3(NeuAc) сывороткой пациентов, иммунизированных идиотипической вакциной, содержащей Аb2 МАb1 Е 10 и гель гидроксида алюминия в качестве адъюванта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммунотерапевтическая комбинация, используемая для лечения злокачественных опухолей, которые экспрессируют ганглиозиды, содержащая два компонента, выбранные из группы, содержащей(A) вакцину, содержащую мышиное антиганглиозидное моноклональное антитело (Ab1);(B) вакцину, содержащую специфическое мышиное антиидиотипическое моноклональное антитело(Аb2) против антиганглиозидного моноклонального антитела;(C) ганглиозидную вакцину. 2. Иммунотерапевтическая комбинация по п.1, содержащая компоненты А и С или В и С. 3. Иммунотерапевтическая комбинация по любому из пп.1-2, где указанная вакцина А содержит мышиное антиганглиозидное антитело MAb ECACC 94113026. 4. Иммунотерапевтическая комбинация по любому из пп.1-2, где указанная вакцина В содержит Аb2 МАb1 Е 10 ЕСАСС 97112901. 5. Иммунотерапевтическая комбинация по любому из пп.1-4, где указанная вакцина С содержит ганглиозид NeuGcGM3. 6. Иммунотерапевтическая комбинация по любому из пп.1-4, где указанная вакцина С содержит ганглиозид NeuAcGM3. 7. Способ, используемый при лечении злокачественных опухолей, предусматривающий одновременное или попеременное введение компонентов А и С или В и С. 8. Применение иммунотерапевтической комбинации по любому из пп.1-7 для лечения опухолей,экспрессирующих ганглиозиды. 9. Применение по п.8 для лечения опухоли молочной железы, легкого, предстательной железы, пищеварительной системы, мочеполовой системы, меланом, сарком и опухолей из нейроэктодермальных тканей. 10. Способ контроля роста и/или пролиферации клеток опухолей, предусматривающий введение млекопитающему, имеющему одну из таких опухолей, иммунотерапевтической комбинации по любому из пп.1-7. 11. Способ по п.10, где указанным млекопитающим является человек.