N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, взаимодействующая с каспазой-8, и способы ее применения

005853 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится в основном к области цистеин-протеаз. Конкретнее, изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8 (МАСН) и/или модулирующим ее функции на пути гибели клеток (или при апоптозе), опосредованном CD95 (Fas/Apo-1) или CD120a (рецептор дляTNF р 55). В частности, настоящее изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8/МАСН прямо или косвенно. Изобретение также относится к получению и применению белков, взаимодействующих с каспазой-8/МАСН. Предпосылки создания изобретения Фактор некроза опухоли (TNF-альфа) и лимфотоксин (TNF-бета) (далее обозначение TNF относится как к TNF-альфа, так и к TNF-бета) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, образованными главным образом мононуклеарными фагоцитами, и оказывают ряд воздействий на клетки (Wallach, D, (1986) в Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; и Beutlerand Cerarai (1987). Как TNF-альфа, так и TNF-бета начинают свое воздействие через связывание со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Некоторые такие воздействия, вероятно, благоприятны для организма: они разрушают, например, опухолевые клетки или клетки, зараженные вирусом, и повышают антибактериальную активность гранулоцитов. В этом отношении TNF вносит вклад в защиту организма от опухолей и инфекционных агентов и вносит вклад в восстановление после повреждений. Таким образом, TNF можно использовать в качестве противоопухолевого средства, которое при применении связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и посредством этого инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. TNF также можно использовать в качестве противоинфекционного средства. Однако как TNF-альфа, так и TNF-бета обладают также разрушительным действием. Очевидно, что сверхпродуцирование TNF-альфа может играть роль главного патогена при некоторых заболеваниях. Например, известно, что воздействие TNF-альфа, в первую очередь, на сосудистую сеть является основной причиной симптомов септического шока (Tracey et al., 1986). При некоторых заболеваниях TNF может вызвать чрезмерную потерю веса (кахексия), подавляя активность адипоцитов и вызывая анорексию,и поэтому TNF-альфа назван кахектином. Он также описан как медиатор повреждения тканей при ревматоидных заболеваниях (Beutler and Cerami, 1987) и как главный медиатор повреждения, наблюдаемого при реакциях "трансплантат против хозяина" (Piquet et al., 1987). Кроме того, известно, что TNF вовлекается в процесс воспаления и во многие другие болезненные состояния. Два разных, экспрессируемых независимо, рецептора TNF-R р 55 (CD120 а) и р 75 (CD120b), которые специфически связываются как с TNF-альфа, так и с TNF-бета, инициируют и/или опосредуют указанное выше биологическое действие TNF. Эти два рецептора имеют различные по структуре внутриклеточные домены, причем предполагается, что они передают сигнал по-разному (см. Hohmann et al., 1989;Smith et al 1990 и Holler et al., 1990). Однако клеточные механизмы, например различные белки и другие факторы, вовлекаемые во внутриклеточную передачу сигналов CD120a и CD120b, еще не выяснены. Речь идет о внутриклеточной передаче сигнала, которая происходит, как правило, после связывания лиганда, т.е. TNF (альфа или бета), с рецептором, что является ответственным за начало каскада реакций,конечным результатом которого является наблюдаемая реакция клетки на TNF. Что касается вышеуказанного действия TNF, вызывающего гибель клетки, в большинстве клеток,изученных до настоящего времени, то это действие инициируется, главным образом, CD120a. Антитела против внеклеточного домена (домена связывания лиганда) CD120a сами могут инициировать действие,вызывающее гибель клеток (см. ЕР 412486), коррелирующее с эффективностью поперечного сшивания рецепторов антителами, что предположительно является первой стадией при генерации процесса внутриклеточной передачи сигнала. Далее, исследования мутаций (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al.,1993) показали, что биологическая функция CD120a зависит от целостности его внутриклеточного домена и, соответственно, предполагается, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, приводящего к вызывающему гибель клетки действию TNF, происходит в результате ассоциации двух или большего числа внутриклеточных доменов CD120a. Кроме того, TNF (альфа и бета) встречается в виде гомотримера, и как таковой, предположительно, индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через CD120a за счет своей способности связываться с молекулами рецептора и образовывать поперечные сшивки, т.е. вызывать агрегацию рецепторов. Еще одним членом суперсемейства рецепторов TNF/NGF является рецептор FAS/APO1 (CD95) , который также называют FAS-антигеном, белок поверхности клетки, экспрессируемый в различных тканях и гомологичный ряду рецепторов клеточной поверхности, включая TNF-R и NGF-R. CD95 опосредует гибель клетки в форме апоптоза (Itoh et al., 1991) и представляется служащим в качестве отрицательного селектора аутореактивных Т-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток CD95 опосредует гибель Т-клеток вследствие апоптоза, распознающих аутоантигены. Также обнаружено, что мутации в гене CD95 (lpr) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, что имеет сходство с аутоиммунной болезнью человека системной красной волчанкой (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Оказывается, что лигандCD95 представляет собой молекулу, связанную с поверхностью клетки, содержащейся среди прочих в киллерных Т-клетках (или цитотоксичных Т-лимфоцитах CTL), и, следовательно, когда такие CTL контактируют с клетками, содержащими CD95, они способны индуцировать апоптозную гибель клеток, содержащих CD95. Далее получены моноклональные антитела, специфичные для CD95, причем такие моноклональные антитела способны индуцировать апоптозную гибель клеток, содержащих CD95, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей CD95 человека (Itoh et al., 1991). Несмотря на то, что цитотоксическое действие лимфоцитов опосредуется через взаимодействие продуцированного лимфоцитами лиганда с встречающимся повсеместно рецептором поверхности клеткиCD95, обладающим способностью инициировать гибель клетки, также обнаружено, что различные другие здоровые клетки, кроме Т-лимфоцитов, экспрессируют CD95 на своей поверхности и могут быть убиты через инициирование этого рецептора. Предполагается, что неуправляемая индукция такого киллинга вносит вклад в повреждение тканей при некоторых заболеваниях, например разрушение клеток печени при остром гепатите. Соответственно, поиск способов сдерживания цитотоксической активностиCD95 может иметь лечебное значение. С другой стороны, так как также обнаружено, что некоторые злокачественные клетки и ВИЧинфицированные клетки содержат CD95 на своей поверхности, антитела против CD95 или лиганд дляCD95 можно использовать для инициации опосредуемого CD95 цитотоксического действия в этих клетках и посредством этого создать способ борьбы со злокачественными клетками или ВИЧинфицированными клетками (см. Itoh et al., 1991). Поиск еще и других способов усиления цитотоксической активности поэтому также может иметь лечебный потенциал. Уже длительное время существует потребность в способе модуляции клеточной реакции на TNF(альфа или бета) и лиганд CD95. Например, в случаях указанной выше патологии, когда TNF или лигандCD95 экспрессируются в избытке, желательно подавлять вызываемое TNF или CD95 действие, убивающее клетки, в то время как в других случаях, например при применениях для заживления ран, желательно усиливать действие TNF, или, в случае CD95, усиливать опосредуемое CD95 действие в опухолевых клетках или в ВИЧ-инфицированных клетках. Заявители предприняли попытки (см. заявки на европейский патентЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) регулировать губительное действие TNF посредством ингибирования связыванияTNF с его рецепторами с использованием антител против TNF или с использованием растворимых рецепторов для TNF (являющихся, по существу, растворимыми внеклеточными доменами рецепторов), для того, чтобы создать конкуренцию связыванию TNF с TNF-R, связанным с поверхностью клетки. Кроме того, на том основании, что связывание TNF с его рецепторами необходимо для индуцируемого TNF действия в клетке, заявители предприняли попытки (см. например ЕР 568925) модулировать действиеTNF посредством модуляции активности TNF-R. Например, в ЕР 568925 описывается способ модуляции сигнальной трансдукции и/или расщепления в TNF-R, в результате чего пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать или с самим рецептором или с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, причем таким образом модулируется нормальная функция TNF-R. В ЕР 568925 описывается конструирование и характеризация различных мутантных форм CD120a, имеющих мутации в его внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах. При таком способе области в пределах вышеуказанных доменов CD120a идентифицированы как существенные для функционирования рецептора, т.е. для связывания лиганда (TNF) и последующей трансдукции сигнала и внутриклеточной передачи сигнала, конечным итогом которых становится наблюдаемое действие TNF на клетки. Далее также описывается ряд подходов для выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, способных связываться с различными участками в указанных выше доменах CD120a, и эти белки, пептиды и другие факторы могут вовлекаться в процессы регуляции или модуляции активности TNF-R. Ряд подходов к выделению и клонированию последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; к конструированию экспрессирующих векторов для продуцирования таких белков и пептидов; и к получению антител или их фрагментов, взаимодействующих с CD120a или вышеуказанными белками и пептидами, связывающимися с различными участками CD120a, также указаны в ЕРО 368925. Однако в ЕР 568925 не описываются ни реальные белки и пептиды, связывающиеся с внутриклеточными доменами TNF-R (например, CD95), ни двухгибридный способ с дрожжами для выделения и идентификации таких белков или пептидов, связывающихся с внутриклеточными доменами TNF-R. Подобным образом в ЕР 568925 не описываются белки или пептиды, способные связываться с внутриклеточным доменом CD95. Таким образом, когда требуется ингибировать действие TNF или лиганда CD95, следует снизить количественно активность TNF-R или CD95 на поверхности клетки, хотя количественное повышение активности TNF-R или CD95 может потребоваться, когда добиваются усиленного действия TNF илиCD95. С этой целью секвенированы и проанализированы промоторы как для CD120a, так и для CD120b,и найден ряд ключевых мотивов последовательностей, специфичных для различных факторов регуляции транскрипции, и, по существу, экспрессию этих TNF-R можно регулировать на уровне их промоторов,т.е. ингибировать транскрипцию от промоторов для снижения числа рецепторов и усиливать транскрипцию от промоторов для увеличения числа рецепторов (ЕР 606869 и WO 9531206).-2 005853 Несмотря на то, что известно, что рецепторы для фактора некроза опухоли (TNF) и структурно родственный рецептор CD95 инициируют в клетках, после стимуляции лигандами, продуцированными лейкоцитами, деструктивную активность, приводящую к их собственной гибели, механизмы такого инициирования пока мало понятны. Исследования с мутациями показывают, что в передаче цитотоксиче-ского сигнала в CD95 и CD120a участвуют разные участки в пределах их внутриклеточных доменов (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Эти области ("домены гибели") имеют схожие последовательности. "Домены гибели" как CD95, так и CD120a имеют тенденцию к самоагрегации. Их самоагрегация, по-видимому, промотирует агрегацию рецепторов, необходимую для инициации передачи сигнала (см. Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), и при высоком уровне экспрессии рецепторов может привести к инициации лиганднезависимой передаче сигнала (Boldin et al.,1995). Некоторые из цитотоксических действий лимфоцитов опосредуются через взаимодействие продуцированного лимфоцитами лиганда с CD95 встречающимся повсеместно рецептором поверхности клетки, способным инициировать гибель клетки (см. также Nagata and Goldstein, 1995); и такая гибель клетки,опосредованная мононуклеарными фагоцитами, включает участие пары лиганд и рецептор - TNF и его рецептора CD120 а, родственной по строению паре CD95 и его лиганду (см. также Vandenabeele et al.,1995). Как и в случае других индуцируемых рецепторами воздействий, индукция гибели клеток рецепторами TNF и CD95 происходит через ряд белок-белковых взаимодействий, ведущих от связывания рецептора с лигандом к возможной активации эффекторных функций ферментов, которые при исследованиях разъяснили неферментные белок-белковые взаимодействия, инициирующие передачу сигналов гибели клеток: связывание тримерного TNF или молекул лиганда CD95 с рецепторами, итоговые взаимодействия их внутриклеточных доменов (Brakebush et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata,1993), усиленные склонностью мотивов доменов гибели к самоагрегации (Boldin et al., 1995 а), и индуцированное связывание двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - MORT-1 (или FADD) с CD95 (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) и TRADD с CD120a (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Три белка, связывающиеся с внутриклеточным доменом CD95 и CD120a в области "домена гибели", вовлеченные в индукцию гибели клетки рецепторами через гетероассоциацию гомологичных областей, и которые, независимо, способны также инициировать гибель клетки, идентифицированы с помощью метода скрининга с двумя гибридами дрожжей. Одним из них является белок MORT-1 (Boldin et al., 1995b), известный также как FADD (Chinnaiyan et al., 1995), который специфически связывается с CD95. Второй белокTRADD (см. также Hsu et al., 1995, 1996) связывается с CD120a, и третий RIP (см. также Stanger et al.,1995) связывается как с CD95, так и с CD120a. Кроме связывания с CD95 и с CD120a эти белки также способны связываться друг с другом, что обеспечивает функциональное "кросс-общение" между CD95 иCD120a. Такое связывание осуществляется через консервативный мотив последовательности - "модуль домена гибели", обычный для рецепторов и ассоциированных с ними белков. Кроме того, хотя при испытании с двумя гибридами дрожжей показано, что MORT-1 в клетках млекопитающих спонтанно связывается с CD95, такое связывание происходит только после стимуляции рецептора, причем предполагается,что MORT-1 участвует в инициации событий передачи сигнала CD95. MORT-1 не содержит какого-либо мотива последовательности, характеризующегося ферментативной активностью, и, следовательно, представляется, что его способность инициировать гибель клетки не вызывает истинной активности самогоMORT-1, а скорее активирует какой-либо другой белок или белки, связывающиеся с MORT-1, и действует далее в каскаде передачи сигнала. Показано, что экспрессия в клетках мутантов MORT-1, лишенныхN-концевой части молекулы, блокирует индукцию цитотоксичности CD95 или CD120a (Hsu et al., 1996;Chinnaiyan et al., 1996), что указывает на то, что эта N-концевая область передает сигнал вызывающего гибель клетки действия обоих рецепторов через белок-белковые взаимодействия. Выполненные в последнее время исследования охватывают группу цитоплазматических тиолпротеаз, родственных по строению протеазе Caenorhabditis elegans CED3 и конвертирующему ферменту интерлейкина-1-бета млекопитающих (ICE), в начале различных физиологических процессов гибели клеток (обзор в работах Kumar, 1995, и Henkart, 1996). Имеется также ряд показаний, что протеаза(ы) этого семейства могут принимать участие в индуцированной CD95 и TNF-R цитотоксичности в клетке. Обнаружено, что специфические пептидные ингибиторы протеаз и блокирующие их функции белки, кодированные двумя вирусами - белок вируса коровьей оспы crmA и белок бакуловируса р 35, обеспечивают защиту клеток от такой цитотоксичности в клетке (Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995;Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфических клеточных белков,явно опосредованное протеазой(ами) семейства CED3/ICE, можно показать в клетках вскоре после стимуляции CD95 или TNF-R. Одна из таких протеаз и ее различные изоформы (включая ингибирующие формы), известная как МАСН (теперь каспаза-8), являющаяся белком, связывающим MORT-1, и служащая для модуляции активности MORT-1 и, следовательно, CD95 и CD120a, и которая также может действовать независимо отMORT-1, недавно выделена, клонирована, охарактеризована, и также описаны ее возможные применения, как подробно указано во включенных в настоящее описание в качестве ссылок находящихся в со-3 005853 вместной собственности одновременно рассматриваемых заявках на патент ИзраиляIL 114 615,114986, 115319, 116588 и 117932, а также в соответствующем им аналоге PCT/US96/10521, и в последних публикациях авторов настоящего изобретения (Boldin et al., 1996). Авторами настоящего изобретения(неопубликованные данные) и другими (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996) также недавно выделена и охарактеризована еще одна такая протеаза и ее различные изоформы (включая ингибирующие формы), названная Mch4 (также называемая каспазой-10). Каспаза-10 также является белком,связывающим MORT-1, служащим для модуляции активности MORT-1 и, следовательно, также вероятно, CD95 и CD120a, и который также может действовать независимо от MORT-1. Итак, подробности относительно всех аспектов, особенностей, свойств и применения каспазы-10 приводятся в указанных выше публикациях, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок. Следует также отметить, что каспазы - каспаза-8 и каспаза-10, имеющие подобные продомены (см.Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent and Dixit, 1997), взаимодействуют через свои продомены с MORT-1, причем такое взаимодействие осуществляется через "мотив домена гибели" или "эффекторный домен гибели" DED, присутствующий в N-концевой части MORT-1 и присутствующий в двух копиях в каспазе-8 и каспазе-10 (см. Boldin et al., 1995b; Chinnalyan et al., 1995). Такие протеазы, известные в настоящее время как каспазы (цистеин-аспартатспецифические протеазы), относятся к семейству цистеинпротеаз, способствующих росту, имеющих общие признаки. Обнаружено, что большинство таких каспаз участвуют в инициации и осуществлении запрограммированной гибели клеток или апоптозе, в то время как оказывается, что другие участвуют в продуцировании провоспалительных цитокинов (Nicholson D.W. et al., 1997; Salvesen G.S. et al., 1997; Cohen G.M., 1997). Они синтезируются как каталитически неактивные предшественники и, как правило, активируются посредством расщепления после специфических внутренных аспартатовых остатков, присутствующих в междоменных линкерах. Сайты расщепления каспаз определяются тетрапептидной последовательностью (X-XX-D), и расщепление всегда происходит после аспарагиновой кислоты. В результате некоторые зрелые активные каспазы могут процессировать и активировать как свои собственные, так и другие, неактивные предшественники (Fernandes-Alnemri Т. et al., 1996; Srinivasula S.M. et al., 1996). Активация процесса запрограммированной гибели клеток, как правило, специфична и включает последовательный процессинг нижних каспаз, называемых "исполняющими" каспазами, верхними каспазами, называемых "инициирующими" каспазами. Функциональные характеристики двух классов каспаз также отражаются в их строении. Действительно, "инициирующие каспазы" содержат более длинную продоменную область, по сравнению с "исполняющими" каспазами (Salvesen G.S. et al., 1997; CohenG.M., 1997). Длинный продомен позволяет инициирующим или "апикальным" каспазам активироваться путем инициации рецепторов гибели семейства рецепторов для TNF. После индуцированной лигандом тримеризации рецепторов гибели, инициирующие каспазы набираются через их длинный N-концевой продомен для взаимодействия со специфическими адаптерными молекулами с образованием комплекса,передающего сигнал индуцирования гибели (Cohen G.M., 1997; Kischkel F.C., et al., 1995). Например,каспаза-8/МАСН и, вероятно, каспаза-10, которые содержат два эффекторных домена гибели (DED) илиFADD-домена, включаются в рецепторный комплекс с помощью адаптерных молекул FADD/MORT-1, в то время как каспаза-2 включается при помощи CRADD/RAIDD и RIP (Nagata S. et al., 1997; McFarlaneM. et al., 1997; Ahmad M. et al., 1997; Duan H. et al., 1997). Вследствие тримерной природы активированного рецепторного комплекса полагают, что по меньшей мере две молекулы каспазы приходят в непосредственную близость друг с другом, приводящую, таким образом, их к активации путем аутокаталитического процессирования (Yang et al., 1998; Muzio et al., 1998) . Каспазы синтезируются как проферменты, состоящие из трех основных субъединиц - N-концевого продомена и двух субъединиц, иногда разделенных линкерным пептидом. Эти две субъединицы названы "длинной" или субъединицей 1, содержащей активный участок фермента, и "короткой" или субъединицей 2. Для полной активации фермента продомен и две субъединицы расщепляются. Две отщепленные субъединицы образуют гетеродимер, в соответствии с чем длинный домен образуется из N-конца, а короткая субъединица образуется из С-концевой области предшественника каспазы. Исходя из установленной трехмерной структуры каспазы-3 оказывается, что С-конец длинного домена также, как и Nконец короткого субдомена, свободны, и С-конец короткой субъединицы приходит в непосредственную близость с N-концом длинной субъединицы для того, чтобы образовать правильно сложенный и активный фермент (Rotonda et al., 1996; Mittl et al., 1997; Srinivasula et al., 1998).N-Ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза является внутриклеточным ферментом, участвующим,как известно, во внутриклеточном метаболизме глюкозамина. Фрагмент геномной ДНК, содержащий Nацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу, клонирован из продуцирующей хитиназу бактерии Vibrio cholerae (Yamano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, p. 1349-53, 1997). Ген nagA, кодирующий N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу E. coli, также известен [см., например, Peri et al., January 1990, 68(1), pp. 123-137]. О клонировании и секвенировании Nацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека пока не сообщается. Краткое изложение сущности изобретения Изобретение относится к белку, взаимодействующему с каспазой-8, способным взаимодействовать-4 005853 с субъединицей 1 и/или субъединицей 2 каспазы-8. Изобретение также относится к N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазе человека или к ее вариантам. Изобретение также относится к белку, содержащему аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, 3, 5 В или 6. Также в объем изобретения входит белок, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную, в частности, клоном J2, как описано ниже. Изобретение также относится к описанному выше белку, который расщепляется каспазой-8 in vitro или in vivo. Изобретение также относится к выделенной последовательности ДНК, кодирующей белок изобретения. В объем изобретения входит последовательность ДНК, представленная на фиг. 2 и 3. В объем изобретения также входит выделенная ДНК, способная гибридизироваться с указанной последовательностью ДНК в умеренно строгих условиях. Изобретение также относится к вектору, содержащему последовательность ДНК, определение которой дано выше. Изобретение также относится к эукариотной или прокариотной клетке-хозяину, содержащей вектор изобретения. Изобретение также относится к способу получения белка, взаимодействующего с каспазой-8, включающему выращивание клетки-хозяина по изобретению в условиях, допускающих продуцирование указанного белка, воздействие на посттрансляционные модификации, необходимое для получения указанного белка, и выделение указанного белка. Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является прокариотическая клетка. Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является эукариотическая клетка. Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является клетка млекопитающего,насекомого или дрожжей. Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является клетка HeLa или 293 Т НЕК. Изобретение также относится к указанному способу, где в качестве промотора используют промотор CMV человека. Изобретение также относится к рибозиму, специфическому для нуклеотидной последовательности,соответствующей последовательности ДНК изобретения. Изобретение также относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере 9 нуклеотидов последовательности, соответствующей последовательности ДНК изобретения. Изобретение также относится к антителу против эпитопа белка изобретения. Изобретение также относится к набору для иммуноанализа, предназначенного для обнаружения белка, взаимодействующего с каспазой-8, с участием антитела изобретения. Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции активности каспазы-8. Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции действий,опосредованных рецептором для TNF или Fas. Изобретение также еще относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции апоптоза. Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения в качестве лечебного средства. Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения в качестве лечебного средства при лечении рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного HCV хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной болезни соединительной ткани (MCTD), болезни Крона или неспецифического язвенного колита. Изобретение также относится к N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазе человека, которая применяется для выделения, идентификации и клонировании другого белка того же класса. Термин "взаимодействующий" в контексте данного описания, относящийся к взаимодействию белка изобретения с каспазой-8, предназначен для обозначения форм прямого взаимодействия, таких как связывание и расщепление, и косвенного взаимодействия, например, через адаптерные белки. Взаимодействие может привести, необязательно, к модуляции сигнала, опосредуемого каспазой-8.-5 005853 Термин "связывание" в контексте данной заявки, когда относится к связыванию белков, взаимодействующих с каспазой-8, предназначен для обозначения физической связи белка, взаимодействующего с каспазой-8. Эту физическую связь можно измерить при иммуноанализах, таких как анализы ELISA или РИА, при двухгибридном испытании, анализах с иммунопреципитацией или анализах на основе разделения по размеру, таких как электрофорез в неденатурирующем геле или гель-хроматография, смеси каспазы-8 или ее субъединицы и белка изобретения. При использовании двухгибридного испытания имеется в виду, что каспаза-8 или ее субъединица экспрессируются в виде гибрида домена активации ДНК, а белок, взаимодействующий с каспазой-8, экспрессируется в виде гибрида домена связывания ДНК, или наоборот. Термин "двухгибридное испытание" относится к двухгибридному анализу, когда белок-белковые взаимодействия можно измерить посредством введения в дрожжевые клетки первого экспрессирующего вектора, кодирующего гибрид первого белка и домена связывания ДНК, и второго экспрессирующего вектора, кодирующего гибрид второго белка и домена активации ДНК. Дрожжевые клетки должны содержать по меньшей мере один репортерный ген, управляемый промотором, содержащим мотив последовательности ДНК, распознаваемый указанным доменом связывания ДНК. Как правило, используют два репортерных гена, например, гистидинсинтетазу и бета-галактозидазу. Это позволяет исследователям избежать ложных положительных результатов, которые могут появиться от мутации. Этот метод модифицирован и усовершенствован авторами настоящей заявки для применения при скрининге, выделении и испытании белков, опосредующих сигналы TNF-R и Fas, см., например, WO 97/03998 и приведенные там ссылки. Двухгибридное испытание опирается на локализацию обоих слитых белков в ядре клетки. Термин "двухгибридное испытание", используемый здесь, также включает модификацию двухгибридного метода, когда используют белки, подающие сигнал роста клетки, такие как ras и sos (Broder etal., Curr. Biol., 1998, 8, p. 1121-4; Aronheim et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25, p. 3373-4, и указанные в этих работах ссылки). Для того чтобы быть функциональными, этим белкам требуется перемещение в клеточную мембрану. Это достигается посредством экспрессии белка, подающего сигнал роста клетки, в виде гибрида с первым белком, и экспрессии сигнала локализации в клеточной мембране, такого как сигнальная последовательность миристилирования, в виде гибрида со вторым белком. Взаимодействие между первым и вторым белком будет перемещать белок, подающий сигнал роста клетки, в клеточную мембрану, и таким образом инициировать рост клетки. Затем отбирают агрессивно растущие клетки для дальнейшего исследования. Эта система отличается от описанной выше двухгибридной системы, поскольку не основана на локализации обоих гибридов в ядре клетки. Термин "наживка" относится к белку в вышеуказанном двухгибридном испытании, который экспрессируется в виде слитого белка с доменом связывания ДНК. Термин "добыча" относится к белку в вышеуказанном двухгибридном испытании, который экспрессируется в виде слитого белка с доменом активации ДНК. Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает схематическое изображение одноцепочечной конструкции каспазы-8, используемой в качестве наживки при двухгибридном скрининге, описанном в примере 1 В. Фиг. 2 представляет предварительный неполный нуклеотид (Послед.1) и расшифрованную аминокислотную последовательность (Послед.2) клона 32, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, полученный из клона кДНК. Фиг. 3 показывает предполагаемую полноразмерную последовательность нуклеотида человека (Послед.3) и расшифрованную аминокислотную последовательность (Послед.4) Nацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы, составленную из наращивания по 5' клона J2 клона EST AA4 60869 и клона ловушки экзона L48741. Фиг.4 А показывает функциональную активность экспрессированного клона J2 в виде процента апоптозных клеток после трансфекции клеток НЕК-293 Т или одним рецептором для TNF р 55 (обозначенным р 55 TNFR), или рецептором для TNF р 55 вместе с р 35-бакуловирусным ингибитором каспаз(р 55+р 35), или с клоном J2 (p55+J2), или рецептором для TNF р 55 вместе с нерасщепляемым мутантомJ2 (обозначенным J), содержащим замену Asp на Glu в позиции 346 на фиг. 3 (p55+J2). Этот мутант нельзя расщепить ни in vitro, ни in vivo. Фиг. 4 В показывает процент апоптозных клеток HeLa, одних или после трансфекции р 35, или J2,или J2, обработанных TNF и циклогексимидом. Фиг. 5 А показывает 1725 кодирующих пар оснований в 5'-конце клона Р 74 (Послед.5). Фиг. 5 В показывает последовательность 574 аминокислот (Послед.6), расшифрованную из последовательности клона Р 74, показанной на фиг. 5 А. Фиг. 6 показывает последовательность 1428 аминокислот (Послед.7) открытой рамки считывания, полученную из расшифрованной аминокислотной последовательности клона РАС, инвентарный номер RPCI5-1057I20. Фиг. 7 показывает расположенные в ряд 574 аминокислоты открытой рамки считывания, полученной из расшифрованной аминокислотной последовательности клона р 74 (обозначенной "клонирован-6 005853 ная"), в сравнении с 1428 аминокислотами открытой рамки считывания, полученной из расшифрованной аминокислотной последовательности клона РАС, RPCI5-1057I20 (обозначенной "расшифрованная"). Фиг. 8 показывает расположенную в ряд открытую рамку считывания расшифрованной аминокислотной последовательности клона RPCI5-1057I20 (верхняя последовательность) с последовательностью гистондеацетилазы А (нижняя последовательность, инвентарный номер Genbank NP-006028.1) (Послед.9). Фиг. 9 А показывает ауторадиографию Bid-белка и белков, кодированных клонами кДНК J2, или Р 16, или Р 43, или Р 70, или Р 74, или Р 79, полученных в лизате ретикулоцитов в присутствии 35Sметионина, разделенных методом SDS-PAGE. Фиг. 9 В показывает ауторадиографию Bid-белка и белков, кодированных клонами кДНК J2, или Р 16, или Р 43, или Р 70, или Р 74, или Р 79, полученных так же, как в случае фиг. 9 А, при анализе на связывание с каспазой-8, экспрессированной в бактериях в виде слитого белка двух ее субъединиц, гибридизированных с GST. Положение маркеров молекулярной массы показано на геле слева. Фиг. 10 показывает результаты расщепления белка, кодированного неполным клоном кДНК Р 43,каспазой-8 или каспазой-10, или каспазой-3, или каспазой-9, или мутантами каспазы-3, или каспазы-9,или каспазы-10. Объемы всех использованных бактериальных лизатов рекомбинантных каспаз, экспрессированных в Е.coli, показаны в относительных единицах (RU). Положение маркеров молекулярной массы показано на геле слева. Представляющие интерес белки помечены звездочками: стрелки с заштрихованными остриями показывают полноразмерный белок Р 43, а стрелки с незаштрихованными остриями показывают продукты расщепления. Фиг. 11 показывает функциональную активность белков, кодированных клонами кДНК, идентифицированными посредством двухгибридного скрининга, выраженную в виде процента клеток, претерпевающих апоптоз, после котрансфекции клеток НЕК-293 Т рецептором для TNF р 55 и белком зеленой флуоресценции (помеченным PC), без или с вставками кДНК клонов J2, или Р 16, или Р 27, или Р 43, или Р 79, или Р 74, или Р 70. Фиг. 12 показывает ингибирующую активность в отношении гибели клеток дикого типа и нерасщеплямого мутанта Tip60 в клетках НЕК-293 Т, котрансфицированных рецептором для TNF р 55 и белком зеленой флуоресценции, а также действие D32-Tip60, лишенного первых 32 N-концевых аминокислот. Контрольные клетки трансфицированы одним вектором pCGN. Подробное описание изобретения Многие методы молекулярной биологии здесь подробно не описываются, так как они хорошо известны специалистам в этой области техники. К таким методам относятся сайтнаправленный мутагенез,клонирование методом PCR, скрининг фаговой библиотеки с использованием олигонуклеотидных или кДНК-зондов, экспрессия кДНК, анализ рекомбинантных белков, трансформация бактериальных и дрожжевых клеток, трансфекция клеток млекопитающих и т.п. К литературе, где описываются такие методы, относятся, например, издания Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold SpringWileySons; ISBN: 0471137812, 1995. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок. Для того, чтобы методом двухгибридного скрининга идентифицировать белки, взаимодействующие с каспазой-8, можно использовать систему с двумя гибридами или тремя гибридами. Систему с двумя гибридами в способе изобретения используют, по существу, в том виде, в каком она описана Fields and Song (Nature, 340, p. 245, 1989). Предпочтительно, отдельные векторы, дрожжевые штаммы и библиотеки можно получить от Clontech (Пало-Альто, США), как компоненты двухгибридной системы Matchmaker (РТ 1265-1). Предпочтительный вариант системы с двумя дрожжевыми гибридами, используемой в способе изобретения, описан Boldin et al., Cell, 85, p. 803-15, 1996. Система с двумя дрожжевыми гибридами также описана в патенте США 5580736, Brent et al. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок. Трехгибридная система используется, по существу, так, как описано Tirode et al., J. Biol. Chem., 272,p. 22995-9, 1997. Для обнаружения соответствующих изобретению белков, взаимодействующих с каспазой-8, необходимо, чтобы две субъединицы каспазы-8 экспрессировались независимо. С этой целью две субъединицы каспазы-8 экспрессируют, предпочтительно по отдельности под контролем разных промоторов. В предпочтительном варианте воплощения изобретения субъединица каспазы-8 р 10 (от серина 375 до аспарагиновой кислоты 479) экспрессируется под контролем слабого промотора, операбельного в дрожжах, в рамке с доменом связывания ДНК. Предпочтительно, слабый промотор представляет собой промотор дрожжей ADH, а белком, связывающимся с ДНК, является домен связывания ДНК дрожжевого активатора транскрипции Gal-4 или бактериальный белок LexA. ADH-промотор и домен связывания ДНК Gal-4 имеются, например, в доступном коммерчески pGBD, Пало-Альто, США. Однако для специалистов в этой области техники будет очевидно, что можно использовать другие промоторы, до тех пор,пока промотор эффективен в дрожжевых клетках. По этому же признаку можно использовать другие-7 005853 домены связывания ДНК, до тех пор, пока такие домены связывания ДНК не имеют функции активатора транскрипции. Длинная активная субъединица каспазы-8 р 20 (от серина 217 до аспарагиновой кислоты 374) экспрессируется в виде отдельного белка под контролем индуцибельного промотора, операбельного в дрожжевых клетках. Предпочтительно, можно использовать репрессируемый промотор метионин Met25,как описано в указанной выше публикации Tirode et al. Использование индуцибильного промотора упрощает обнаружение комплекса р 10-р 20 посредством иммунопреципитации и электрофореза в полиакриламидном геле. Индуцибельный промотор имеет также преимущество в том, что он делает возможной экспрессию в дрожжах белка, который может быть токсичным для дрожжевых клеток, вследствие возможности ограничения периода, в пределах которого экспрессируется потенциально токсичный белок. Белки, скринируемые по способу изобретения, предпочтительно, представляют в форме библиотеки кДНК. Однако можно использовать также геномные библиотеки или комбинированные библиотеки. Библиотеку клонируют по С-концу домена активации транскрипции, операбельного в дрожжах. Предпочтительно используют дрожжевой домен активации транскрипции Gal-4, однако можно использовать многие другие активаторы транскрипции. Предпочтительно для клонирования библиотеки используют вектор pGAD GH, доступный от Clontech. Штамм дрожжей, используемый для скрининга, должен содержать селективный маркер, такой как гистидинсинтетаза, под контролем промотора, содержащего последовательность ДНК, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. Предпочтительно дрожжевая клетка также содержит репортерный ген под контролем промотора, содержащего последовательность ДНК, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. Штамм дрожжей HF7c, доступный от Clontech, можно использовать для скрининга с гибридами домена связывания Gal-4; штамм L40 можно использовать, когда используют домен связывания ДНК 1 ехА. После трансформации дрожжевые клетки помещают в условия, селективные для активного высевания в среды, лишенные некоторых аминокислот, что требуется для устойчивости введенных в них плазмид. Среда является селективной для дрожжевых клеток, в которых активируется ген для вышеуказанного селективного маркера. Предпочтительно селективный маркер представляет собой ген гистидинсинтетазы. Клетки дрожжей, экспрессирующие этот ген, можно отобрать для культивирования в среде,лишенной гистидина. Преимуществом такой системы является возможность добавления в среду для роста ингибитора гистидинсинтетазы 3-аминотриазола. Таким образом, возможно подавлять рост дрожжевых клеток, в которых гистидинсинтетаза экспрессируется в небольшом количестве, что вызвано утечкой промотора, содержащего последовательность, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. В некоторых клонах слабое неспецифическое взаимодействие между субъединицей каспазы-8 р 10 и/или р 20 и указанным клоном может вызвать кажущуюся активацию указанного промотора. Таким образом, повышая концентрацию указанного ингибитора в среде, используемой для селекции взаимодействующих клонов, можно отобрать только такие клоны, которые взаимодействуют с определенной минимальной силой. Концентрация 3-аминотриазола составляет, предпочтительно, 7,5 мМ. Клоны, идентифицированные по их способности расти в среде, лишенной гистидина, затем анализируют путем количественного определения активности их репортерного гена. Предпочтительно в качестве репортерного гена используют ген lacZ. Количественное определение активности lacZ осуществляют предпочтительно в жидкой культуре, как описано Boldin et al., J. Biol. Chem., 270, 7795-8, 1995. Описанный выше способ скрининга можно осуществить подобным образом с использованием двухгибридного испытания. Существенное отличие состоит в том, что две субъединицы каспазы-8 экспрессируются в виде единой пептидной цепи и представляют собой слитый белок с указанным выше доменом связывания ДНК. Субъединицу р 20 мутируют в ее активном сайте (цистеин 360 - серии 360) так,как описано ниже. Предпочтительно субъединицу р 10 отделяют от субъединицы р 20 с помощью линкера, который,предпочтительно, имеет длину от 10 до 50 аминокислот. Указанный линкер содержит, предпочтительно,небольшие незаряженные аминокислоты, такие как глицин, серии, треонин, аланин и валин. Предпочтительнее, линкер состоит из остатков серина и глицина. Наиболее предпочтительно, когда соотношение между остатками глицина и остатками серина в указанном линкере составляет примерно от 3:1 до 4:1. Получение клонов с использованием двухгибридной системы с описанной выше наживкой каспазы 8 подобно описанному выше применению трехгибридной системы, за исключением того, что клоны, связывающиеся только с одной из субъединиц, трудно отличить от клонов, связывающихся с обеими субъединицами или требующих для связывания комплекс из двух субъединиц. Однако любой клон, обнаруженный при двухгибридном способе, можно легко проверить на связывание с двумя субъединицами посредством оценки lacZ-активности двойных трансформантов, т.е. дрожжевых клеток, трансформированных вновь идентифицируемым клоном и субъединицей каспазы-8 - или р 10 или р 20, где указанная субъединица слита с доменом связывания ДНК. Связывание с комплексом субъединиц р 10 и р 20 также можно легко оценить посредством определения lacZ-активности тройных трансформантов, где-8 005853 одна из субъединиц каспазы-8 экспрессируется в виде слитого белка с доменом связывания ДНК, а другая является отдельным белком. Очевидно, что вышеуказанная трехгибридная система, следовательно,также полезна для определения характеристик связывания клонов, найденных с помощью двухгибридной системы, так как индуцибельный промотор, используемый в ней, дает возможность быстрой идентификации клонов, взаимодействующих только с субъединицей 10 или с комплексом субъединиц р 10 р 20. Клоны, способные расти в среде, лишенной гистидина, и экспрессирующие lacZ-активность, затем отбирают для дальнейшего исследования. Сначала белки, кодированные указанными клонами, проверяют на их способность связываться с нерелевантными белками, такими как ламин. Как правило, клоны,связывающиеся с ламином, отбрасывают. Клоны, найденные для специфического взаимодействия с каспазой-8, затем анализируют далее. Такой анализ проводят с неполными клонами, полученными непосредственно при описанных выше способах скрининга, а также с полноразмерными клонами, полученными на основе последовательности указанных неполных клонов. Для того, чтобы получить полноразмерные клоны, получают последовательность неполного клона посредством экстракции ДНК указанного клона из дрожжевых клеток способами,известными специалистам в этой области техники. Затем ДНК переносят в бактерии для того, чтобы получить большое количество очищенной ДНК, которое можно использовать для секвенирования. С другой стороны, для целей секвенирования вставку в векторе, представляющем собой, предпочтительно,вышеуказанный вектор pGBD, можно вырезать с использованием рестриктаз и клонировать в другой вектор, такой как pBluescript, доступный от Stratagene. Секвенирование осуществляют методом терминации цепи, предпочтительно, с использованием фермента секвеназы-2, доступной из набора для секвенирования от United States Biochemicals. Затем полученную таким образом последовательность можно ввести в базу данных программы поиска и посредством компьютерного поиска идентифицировать перекрывающиеся последовательности. Используемые программы хорошо известны специалистам в этой области техники и включают, например, пакет GCG (genetics computer group). Предпочтительно используют сервисную программу поиска,такую как Basic Local Aligment Search Tool (BLAST), доступную с сервера EMBL (например,http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/). Команды Blastn можно использовать для поиска нуклеотидных последовательностей, перекрывающих или схожих с идентифицированными клонами. Белок, идентифицированный по способу изобретения, представляют в виде слитого белка с доменом связывания ДНК. Следовательно, рамка, в которой должна транслироваться нуклеотидная последовательность, известна, так как она должна быть в рамке с кодирующей последовательностью домена связывания ДНК. Последовательность ДНК клона, идентифицированного по изобретению, можно, следовательно, однозначно транслировать в аминокислотную последовательность. Затем для идентификации перекрывающихся белковых последовательностей или подобных белков можно использовать программу Blastp, доступную на вышеуказанном сервере EMBL. С другой стороны, или кроме вышеуказанных способов поиска в базе данных, для того, чтобы идентифицировать полные клоны, можно скринировать библиотеку, такую как геномная библиотека или библиотека кДНК. Такие способы скрининга описаны в указанных выше изданиях Sambrook et al. и Ausubel et al. С другой стороны, или, кроме того, можно использовать методы клонирования на основе PCR,такие как быстрая амплификация концов кДНК (5' and 3' RACE, Graham et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 177, p. 8-16, 1991, и указанные в этой работе ссылки). Неполные клоны, идентифицированные при скрининг-анализе по изобретению, или полноразмерные клоны, полученные любым из описанных выше способов, затем исследуют далее. Это осуществляют, например, путем испытания чувствительности этих клонов к протеолитическому расщеплению активной каспазой-8. Этот анализ можно проводить in vivo. Для этой цели линию клеток млекопитающего трансфицируют экспрессирующим вектором, который продуцирует белок, кодированный испытываемым клоном, и экспрессирующим вектором, кодирующим второй белок, экспрессия которого будет индуцировать активность каспазы-8. Экспрессирующие векторы предпочтительно содержат сильный промотор для экспрессии клона и второго белка, такой как вирус саркомы Рауса (RSV, Yamamoto et al., Cell, 22, p. 787-97, 1980), вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV, Artelt P. et al., Gene, 68, p. 213-9, 1988),цитомегаловирус (CMV, Thomsen et al., PNAS, 81, p. 659-63, 1984), или подобные промоторы вирусного или клеточного происхождения. Второй белок, экспрессия которого индуцирует активность каспазы-8, выбирают среди внутриклеточного домена Fas, внутриклеточного домена CD120a, MORT-1, каспазы-8, или эквивалента белка, способного индуцировать активность каспазы-8. С другой стороны, активность каспазы-8 можно индуцировать в клетках посредством обработки TNF или лигандом CD95. Подробности эксперимента, возможный механизм и другие технические подробности анализа такого типа описаны в указанной выше работеBoldin et al Cell, 1996. После введения в клетку млекопитающего указанного выше экспрессирующего вектора, кодирующего второй белок, и испытываемого белка, выращивают культуру клеток в течение времени, достаточного для осуществления экспрессии белков, активации или экспрессии каспазы-8 и расщепления испы-9 005853 тываемого белка. Указанный период времени обычно составляет от 4 до 72 ч, предпочтительно от 16 до 30 ч, и наиболее предпочтительно от 20 до 24 ч. Для того, чтобы определить степень расщепления, получают лизат целых клеток. С другой стороны, можно очистить меченый белок с использованием антител против метки или хроматографии с никелем и нитрилоуксусной кислотой, реагенты и подробные протоколы которых доступны от Qiagen GmbH, Хилден, Германия. Метод иммунопреципитации описан в указанной выше работе Boldin et al., Cell, 1996. Реагенты и указания по иммунопреципитации также доступны в форме набора от Boehringer Mannheim, Маннгейм, Германия. Затем лизат целых клеток очищенного белка разделяют по размеру посредством электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением SDS. Испытываемый белок или его меченые фрагменты теперь можно визуализировать методом вестернблоттинга с использованием антител против метки. Предпочтительной меткой является гистидиновая метка в сочетании с антителом против полигистидина. Однако можно использовать другие сочетания последовательности-метки и антитела, специфического к ней, до тех пор, пока антитело остается специфическим к последовательности-метке, т.е. не узнает другие белки в лизате целых клеток. Специфичность расщепления можно проверить путем проведения контрольных реакций, при которых к культуре клеток млекопитающего в указанный выше период времени добавляют специфический ингибитор каспазы. Предпочтительный ингибитор представляет собой ингибитор, выбранный среди zVAD-fmk, zDEVDfmk, zIETD-fmk (см. Keppler-Hafkemeyer et al., Biochemistry, 37, p. 16934-42, 1998). Более предпочтительным ингибитором является zVAD-fmk. Другие ингибиторы, которые можно использовать, представляют собой белки, такие как Bclx или белок р 35, действующие как клеточные ингибиторы каспаз. Подавление расщепления, когда в ходе анализа коэкспрессируются такие белки, показывает, что расщепление специфично для каспаз. Другим анализом с целью испытания, может ли испытываемый белок расщепляться каспазой-8, является анализ in vitro, при котором рекомбинантно продуцированная каспаза-8 используется в ферментативной реакции вместе с меченым испытываемым белком. Испытываемый белок можно получить, как описано выше, посредством клонирования его кодирующей последовательности в экспрессирующий вектор, содержащий сильный промотор, и трансфекции в клетку млекопитающего. Выгодно метить испытываемый белок, как описано выше, с тем, чтобы его можно было выделить в чистом виде из экстракта клеток млекопитающего с помощью антител против метки или других агентов, способных специфически связываться с последовательностью-меткой. С другой стороны, испытываемый белок можно получить in vitro с использованием системы трансляции in vitro. Метод трансляции in vitro хорошо известен специалистам в этой области техники, и все реагенты для него и подробные протоколы доступны, например, от Stratagene, La Jolla, USA. С другой стороны, испытываемый белок можно пометить, например, с использованием радиоизотопа. Выгодно, при мечении изотопами, экспрессировать испытываемый белок in vitro, и во время реакции трансляции in vitro меченную изотопами аминокислоту добавлять вместе с немеченой кислотой. Предпочтительно изотоп представляет собой S35. Также предпочтительно, чтобы меченая аминокислота представляла собой S35-метионин, и соотношение между меченой и немеченой аминокислотой составляло от 1:1 до примерно 1:1000. Затем полученный рекомбинантно испытываемый белок и полученный рекомбинантно активный белок каспазу-8 соединяют в подходящем буфере и дают проходить реакции расщепления в течение достаточного для этого времени. Предпочтительный буфер и другие предпочтительные параметры анализа описаны в указанной выше работе Boldin et al., Cell, 1996. Предпочтительный период времени, как правило, составляет от 10 мин до нескольких часов, предпочтительно от 30 мин до 1 ч. После осуществления расщепления реакционную смесь разделяют по размеру молекул методом электорофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Если использовано мечение изотопами,гель можно высушить, и обнаружить изотоп с помощью фотопленки или люминофоров (Fuji). Испытываемый белок метят, и обнаружить его можно с использованием специфических к метке антител при вестерн-блоттинге. Появление дополнительных низкомолекулярных полос в реакционных смесях, в которые добавлен белок каспаза-8, по сравнению с контрольными реакционными смесями без каспазы-8, указывает на расщепление испытываемого белка каспазой-8. Кроме того, размер низкомолекулярных полос указывает приблизительное расположение сайта расщепления. Настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белки, взаимодействующие с каспазой-8. Кроме того, настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически активные изоформу, аллельный вариант, функциональный аналог, мутант или производное белка, взаимодействующего с каспазой-8, и к кодированным ими белку, изоформе, аллельному варианту,функциональному аналогу, мутанту или производному. Получение таких аналогов, фрагментов, мутантов и производных является стандартной процедурой (см., например, Sambrook et al., 1989), при которой в последовательностях ДНК, кодирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, один или несколько кодонов можно делетировать, добавить или заменить другими и получить аналоги, имеющие по меньшей- 10005853 мере одну замену аминокислотного остатка относительно нативного белка. Среди последовательностей ДНК по изобретению, кодирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, изоформу, аллельный вариант, функциональный аналог, мутант или производное, также имеются, как вариант воплощения изобретения, последовательности ДНК, способные к гибридизации с последовательностью кДНК, полученной из кодирующей области нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, и такая гибридизация осуществляется в умеренно строгих условиях, и способные к гибридизации последовательности ДНК кодируют биологически активный белок, взаимодействующий с каспазой-8. Следовательно, к таким способным к гибридизации последовательностям ДНК относятся последовательности ДНК, имеющие относительно высокую гомологию с последовательностью кДНК нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, и, как таковые, представляют последовательности, похожие на белок, взаимодействующий с каспазой-8, которые могут представлять собой, например, последовательности природного происхождения, кодирующие различные изоформы белка, взаимодействующего с каспазой-8, или встречающиеся в природе последовательности, кодирующие белки, принадлежащие к группе последовательностей, похожих на белок, взаимодействующий с каспазой-8, кодирующих белок, обладающий активностью белка, взаимодействующего с каспазой-8. Кроме того, к таким последовательностям также могут относиться, например, последовательности, не встречающиеся в природе, полученные синтетически, подобные последовательности кДНК нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8,но включающие ряд требуемых модификаций. Следовательно, такие синтетические последовательности включают все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные белка,взаимодействующего с каспазой-8, которые все обладают активностью белка, взаимодействующего с каспазой-8. Используемые здесь строгие условия являются функцией температуры, используемой при экспериментах по гибридизации, молярности одновалентных катионов и процентного содержания формамида в растворе для гибридизации. Для того чтобы определить степень строгости для любого данного набора условий, используют, в первую очередь, уравнение Мейнкота (Meinkoth) et al. (1984) для определения устойчивости гибридов 100% идентичности, выраженное в виде температуры плавления Тm гибрида ДНК-ДНК: Тm = 81,5 С + 16,6(LogM) + 0,41(%GC) - 0,61(%form) - 500/L, где M представляет собой молярность одновалентных катионов, %GC представляет собой % нуклеотидов G и С в ДНК, %form представляет собой процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. На каждый 1 С, когда Тm снижается, исходя из величины, вычисленной для 100% идентичного гибрида, количество допускаемых ошибочных спариваний возрастает примерно на 1%. Таким образом, если Тm, используемая для любого данного эксперимента по гибридизации с определенной солью и концентрациями формамида, на 10 С ниже Тm, вычисленной для 100% гибрида в соответствии с уравнением Мейнкота, гибридизация будет происходить, даже если имеются примерно до 10% ошибочных спариваний."Умеренно строгими условиями" являются условия, обеспечивающие Тm, которая не более, чем на 20 С ниже Тm, которая должна быть для совершенного дуплекса с намеченной последовательностью,вычислена ли она по указанной выше формуле или измерена фактически. Без ограничений, в умеренно строгих (на 15-20 С ниже вычисленной или измеренной Тm гибрида) условиях используют раствор для промывки 2 X SSC (стандартный солевой раствор цитрата) и 0,5% SDS (натрийдодецилсульфат) при соответствующей температуре ниже вычисленной Тm гибрида. Окончательная строгость условий обусловлена в первую очередь условиями промывки, особенно, если используемые условия гибридизации таковы, при которых наряду с устойчивыми гибридами образуются менее устойчивые гибриды. В таком случае более строгие условия промывки позволяют удалить менее устойчивые гибриды. Обычным условием гибридизации, которое можно использовать с умеренно строгими условиями промывки, описанными выше, является гибридизация в растворе 6 х SSC (или 6 X SSPE (стандартный солевой фосфат-ЭДТК раствор, 5 X раствор Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре приблизительно на 20-25 С ниже Tm. Если используют смешанные зонды, предпочтительно использовать тетраметиламмонийхлорид (ТМАС) вместо SSC (Ausubel, 1987,1999). Для того чтобы получить указанные выше встречающиеся в природе последовательности, подобные белку, взаимодействующему с каспазой-8, можно использовать стандартные процедуры скрининга и выделения образцов ДНК или РНК природного присхождения из различных тканей с использованием в качестве зонда кДНК природного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или ее части (см., например,стандартные процедуры, описанные в Sambrook et al., 1989). Изобретение относится к белку, взаимодействующему с каспазой-8, который можно идентифицировать с помощью описанного выше скрининг-анализа. Изобретение также относится к полипептиду или белку, по существу, соответствующему белку, взаимодействующему с каспазой-8. Термин "по существу,соответствующий" включает не только белок, взаимодействующий с каспазой-8, но также полипептиды или белки, являющиеся его аналогами. Аналоги, по существу, соответствующие белку, взаимодействующему с каспазой-8, представляют- 11005853 собой полипептиды, в которых одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8, заменены другими аминокислотами, делетированы и/или встроены, при условии, что полученный белок обнаруживает, по существу, такую же или более высокую биологическую активность, чем белок, взаимодействующий с каспазой-8, которому он соответствует. Для соответствия, по существу, белку, взаимодействующему с каспазой-8, изменения в последовательности белков, взаимодействующих с каспазой-8, такие как изоформы, являются, как правило, незначительными. Хотя число изменений может превышать 10, предпочтительно, чтобы изменений было не более 10, предпочтительнее не более 5, и наиболее предпочтительно - не более 3 таких изменений. Можно использовать многие методы для поиска потенциально биологически активных белков, которые, по существу, соответствуют белкам, взаимодействующим с каспазой-8, и одним из таких методов является применение обычного метода мутагенеза для ДНК, кодирующей белок, приводящего к нескольким модификациям. Затем белки, экспрессированные клонами, можно скринировать на их способность связываться с каспазой-8 и модулировать активность каспазы-8 при модуляции/посредничестве в указанных выше внутриклеточных каскадах реакций."Консервативными" изменениями являются изменения, в результате которых не ожидают изменения активности белка, и, как правило, сначала скринируются как изменения, в результате которых не ожидают изменений размера, заряда или конфигурации белка, и не ожидают изменения его биологических свойств. К консервативным заменам белков, взаимодействующих с каспазой-8, относится аналог,где по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде консервативно заменен другой аминокислотой. Такие замены предпочтительно осуществляют в соответствии со списком, представленным в табл. 1 А, и такие замены можно определить путем обычного эксперимента и обеспечить модификацию структурных и функциональных свойств молекулы синтезированного полипептида при сохранении свойств биологической активности белка, взаимодействующего с каспазой-8. Таблица 1A С другой стороны, другую группу замен белка, взаимодействующего с каспазой-8, составляют замены, при которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде удаляют и на его место встраивают другой остаток в соответствии с приведенной далее табл. 1B. Типы замен, которые можно сделать в полипептиде, могут основываться на анализе частоты встречаемости аминокислотных замен в гомологичных белках разного вида, таких как замены, представленные в табл. 1-2 в работе Schulz et al.,G.E., "Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, New York, NY, 1978, и на фиг. 3-9 в работе Creighton, Т.Е. "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. FreemanCo., San Francisco, CA, 1983. На основании такого анализа альтернативные консервативные замены определены здесь как замены в пределах одной из указанных далее групп.- 12005853 Таблица IB 1. Небольшие алифатические неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly) 2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln 3. Полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys 4. Большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val (Cys) 5. Большие ароматические остатки: Phe, Туr, Trp Три аминокислотных остатка, указанные выше в скобках, играют особую роль в строении белка.Gly является единственным остатком, лишенным какой-либо боковой цепи, и, таким образом, придает цепи гибкость. Однако это обстоятельство вызывает тенденцию промотирования образования вторичной структуры иного типа, чем а-спираль. Pro, в силу своей необычной геометрии, жестко сдерживает цепь и,как правило, имеет склонность промотировать структуры, подобные бета-повороту, хотя в некоторых случаях Cys может быть способен принимать участие в образовании дисульфидной связи, которая важна для структуры белка. Schulz et al., цит. выше, смогли соединить указанные выше группы 1 и 2. Следует также отметить, что Туr, в силу его возможности образования водородной связи, имеет существенное сходство с Ser и Thr и т.п. Консервативные замены аминокислот в соответствии с настоящим изобретением, например, такие,какие указаны выше, известны в технике, и можно ожидать, что после замены аминокислот биологические и структурные свойства полипептида сохраняются. Большинство делеций и замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не вызывают радикальных изменений в характеристиках белковой или пептидной молекулы. "Характеристики" не являются исключительным определением как замен во вторичной структуре, например, а-спирали на бета-складку, а также изменений биологической активности, например, связывания с каспазой-8, так и/или опосредования действия каспазы-8 на гибель клеток. Примеры получения замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения аналогов белков, взаимодействующих с каспазой-8, для использования в настоящем изобретении включают стадии любых известных способов, например, представленные в патентах США RE 33653, 4959314,4588585 и 4737462, Mark et al.; 5116943, Koths et al.; 4965195, Namen et al.; 4879111, Chong et al.; и 5017691, Lee et al; а в патенте США 4904584 (Show et al.) представлены лизинзамещеные белки. Подразумевается, что в объем изобретения, кроме описанных выше консервативных замен, которые, по существу, не изменяют активность белка, взаимодействующего с каспазой-8, входят или консервативные изменения или менее консервативные и более случайные замены, приводящие к возрастанию биологической активности аналогов белков, взаимодействующих с каспазой-8. Когда специалист в данной области техники подтверждает точное воздействие замены или делеции,следует иметь в виду, что действие замены(замен), делеции(ий) и т.п. будет оцениваться с помощью обычных анализов связывания и гибели клеток. Скрининг с использованием такого стандартного испытания не включает уникальных экспериментов. Приемлемыми аналогами, взаимодействующими с каспазой-8, являются аналоги, сохраняющие, по меньшей мере, способность взаимодействовать с каспазой-8 и, в силу этого, опосредовать активность каспазы-8 во внутриклеточном метаболизме, или модулировать активность самой каспазы-8. При этом можно получить аналоги, которые имеют так называемое доминантотрицательное действие, а именно,аналог, который дефектен в отношении связывания с каспазой-8 или последующей передачи сигнала,или в отношении другой активности после такого связывания. Такие аналоги можно использовать, например, для ингибирования цитотоксического действия каспазы-8 или для его усиления, в зависимости от того, требуется усилить гибель клеток или их выживаемость, и в зависимости от того, какая из этих активностей является главной, модулируемой взаимодействием белка, взаимодействующего с каспазой 8, и каспазой-8 (см. выше), и это с помощью таких аналогов, конкурирующих с природным белком,взаимодействующим с каспазой-8, за связывание или взаимодействие с каспазой-8. На генетическом уровне такие аналоги получают, как правило, посредством сайтнаправленного мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок, взаимодействующий с каспазой-8, причем посредством этого продуцируется ДНК, кодирующая аналог, и затем в рекомбинантной клеточной культуре синтезируется ДНК и экспрессируется полипептид. Аналоги, как правило, обнаруживают такую же или качественно повышенную биологическую активность по сравнению с встречающимся в природе белком, Ausubel et ai., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publications and Viley Interscience, New York,NY, 1987-1995; Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY, 1989. Получение таким образом белка, взаимодействующего с каспазой-8, или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же полипептид, но отличающейся от природной последовательности вследствие замен, дозволенных известным вырождением генетического кода, можно достичь с помощью сайтнаправленного мутагенеза ДНК, кодирующей полученный ранее аналог или нативный вариант белка, взаимодействующего с каспазой-8. Сайтспецифический мутагенез позволяет получить аналоги посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательность ДНК нужной мутации, а также достаточное число соседних нуклеотидов,- 13005853 чтобы получить последовательность-затравку достаточного размера и сложности последовательности для образования устойчивого дуплекса по обеим сторонам пересекающейся области делеции. Как правило, предпочтителен праймер длиной примерно в 20-25 нуклеотидов, примерно с 5-10 комплементирующими нуклеотидами с каждой стороны изменяемой последовательности. Вообще, метод сайтспецифического мутагенеза хорошо известен в технике, например, из таких публикаций, как Adelman et al, DNA,2:183 (1983), включенной в настоящее описание в качествке ссылки. Как будет понятно, в методе сайтспецифического мутагенеза, как правило, используется фаговый вектор, существующий как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Типичные векторы, полезные при сайтнаправленном мутагенезе, включают такие векторы, как фаг М 13, например, как описано в работе Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A.Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Такие фаги доступны коммерчески, и их применение хорошо известно специалистам в этой области техники. С другой стороны, для получения одноцепочечной ДНК можно использовать плазмидные векторы, содержащие одноцепочечный фаговый ориджин репликации (Veria et al., Meth. Enzymol., 153:3, 1987). Вообще, сайтнаправленный мутагенез в соответствии с описанным выше осуществляют посредством получения сначала одноцепочечного вектора, включающего в свою последовательность последовательность ДНК, кодирующую релевантный полипептид. Олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную мутированную последовательность, получают синтетически посредством автоматизированного синтеза ДНК/олигонуклеотидов. Затем этот праймер отжигают с одноцепочечным вектором, содержащим последовательность белка, и подвергают воздействию ферментов, полимеризующих ДНК, таких как фрагмент Кленова полимеразы I E. coli, для завершения синтеза цепи, содержащей мутацию. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь содержат нужную мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки Е.coli JM101, и отбирают клоны, которые включают рекомбинантные векторы, содержащие порядок мутированной последовательности. После того, как такой клон отобрали, последовательность белка, взаимодействующего с каспазой-8,можно извлечь и поместить в соответствующий вектор, как правило, вектор переноса или экспрессирующий вектор типа, который можно использовать для трансфекции соответствующего хозяина. Соответственно, ген или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, также можно обнаружить, получен он и/или модифицирован in vitro, in situ и/или in vivo, путем использования известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как PCR и химический синтез олигонуклеотидов. PCR дает возможность амплификации последовательностей ДНК посредством повторяющихся полимеразных реакций ДНК. Такую реакцию можно использовать как замену клонирования; все, что требуется, - это знание нуклеотидной последовательности. Для того чтобы осуществить PCR,создают праймеры, комплементарные к последовательности, представляющей интерес. Затем праймеры получают посредством автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку можно создать праймеры для гибридизации любой части гена, условия можно создать такие, что можно допустить ошибки при спаривании комплементарных оснований. Амплификация таких ошибочных областей может привести к синтезу мутагенного продукта, и причем результатом является генерация пептида с новыми свойствами (т.е. сайтнаправленный мутагенез). См. также Ausubel, цит. выше, гл.16. Кроме того, посредством сочетания синтеза комплементарных ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы с PCR можно использовать РНК в качестве исходного вещества для синтеза внеклеточного домена рецептора пролактина без клонирования. Кроме того, можно создать праймеры PCR для внесения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как кодоны терминации, в концы амплифицируемого сегмента гена. Такое размещение сайтов рестрикции по 5' и 3'-концам амплифицированной последовательности гена позволяет создать сегменты гена, кодирующие белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его фрагмент, для лигирования других последовательностей и/или сайтов клонирования с векторами.PCR и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в технике и могут применяться в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования на основе положений и указаний, приведенных здесь. К известным способам амплификации ДНК или РНК относятся,но не ограничиваются перечисленным, полимеразная цепная реакция (PCR) и родственные способы амплификации (см., например, патенты США 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Mullis et al.; 4795699 и 4921794, Tabor et al.; 5142033, Innis; 5122464, Wilson et al.; 5091310, Innis; 5066584, Gyllensten et al.; 4889818, Gelfand et al.; 4994370, Silver et al.; 4766067, Biswas; 4656134, Ringold; и Innis et al., eds. , PCRProtocols: A Guide to Method and Applications), и амплификация, опосредуемая РНК, при которой в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК используется антисмысловая РНК к последовательности-мишени (патент США 5130238, Malek et al., торговое название NASBA); и иммуно-PCR, соединяющая применение амплификации ДНК с мечением антител (Ruzicka et al., Science, 260:487 (1993); Sano et- 14005853 Аналогичным образом биологически активные фрагменты белков, взаимодействующих с каспазой 8 (т.е. фрагменты любых белков, взаимодействующих с каспазой-8, или их изоформ), можно получить так,как указано выше в отношении аналогов белка, взаимодействующего с каспазой-8. Подходящими фрагментами белка, взаимодействующего с каспазой-8, являются фрагменты, которые сохраняют способность белка, взаимодействующего с каспазой-8, и могут опосредовать биологическую активность каспазы-8 или других белков, непосредственно или косвенно связанных с каспазой-8. Соответственно, можно получить фрагменты белка, взаимодействующего с каспазой-8, которые обладают доминантотрицательным или доминантположительным действием, как указывалось выше в отношении аналогов. Следует отметить, что такие фрагменты представляют особый класс аналогов по изобретению, а именно, они определяются как части белков, взаимодействующих с каспазой-8, образованные от полной последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8 (например, от последовательности любого из белков, взаимодействующих с каспазой-8, или их изоформ), причем каждая такая часть или фрагмент обладает любой из указанных выше активностей. Такой фрагмент может представлять собой, например, пептид. Подобным образом производные можно получить путем стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов или фрагментов, или посредством конъюгации белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов или фрагментов, с другой молекулой, например антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в технике. Соответственно, используемый здесь термин "производные" охватывает производные, которые можно получить из функциональных групп, встречающихся в боковых цепях остатков, илиN- или С-концевых групп, способами, известными в технике, и все они входят в объем изобретения. Производные могут иметь химические группы, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция обладает такой же или более высокой биологической активностью, как белки,взаимодействующие с каспазой-8. Например, производными могут являться алифатические эфиры, полученные по карбоксильным группам, амиды, полученные по карбоксильным группам посредством взаимодействия с аммиаком или первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с помощью ацильных групп (например, алканоильных или карбоциклических ароильных групп), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, серильных или треонильных остатков), образованные с помощью ацильных групп. Термин "производные" предназначен для обозначения только таких производных, в которых нет замены одной аминокислоты на другую из числа двадцати обычно встречающихся в природе аминокислот. Как описано выше, анализы с расщеплением можно использовать для определения того, расщепляется ли белок, взаимодействующий с каспазой-8, каспазой-8. Разделение по размеру расщепленных фрагментов приблизительно указывает местоположение сайта расщепления. Сайт расщепления также можно определить посредством получения делеционных мутантов испытываемого белка и испытанием кажого делеционного мутанта на его подверженность расщеплению каспазой-8, как описано выше. Делеционные мутанты можно сконструировать посредством PCRклонирования нужных фрагментов испытываемого белка с использованием в качестве матрицы последовательности ДНК клона, кодирующего указанный испытываемый белок. Фрагменты, амплифицированные методом PCR, затем можно клонировать в экспрессирующие векторы, за счет чего должны обеспечиваться стартовый кодон ATG и предпочтительно последовательность Козак (Kozak, М.,Nucleic Acids Res., 12, p. 857-72, 1984). Другие подробности экспрессирования белков можно найти в указанных выше сведениях от Qiagen, относящихся к меченным гистидином белкам, а также вообще к экспрессии белков. Другой ссылкой, содержащей сведения об экспрессии белков, являются указанные выше Current Protocols, и особенно глава 16 в них. Таким образом, сайт расщепления испытываемого белка можно определить посредством получения его делеционных мутантов и определения наименьшего такого делеционного мутанта, отщеплямого каспазой-8. При другом способе идентификации сайта расщепления используют пептиды, которые образуются в соответствии с предсказанной белковой последовательностью испытываемого клона. Пептиды можно синтезировать химическим способом, например, так, как подробно описано в Bodanszky and Bodanszky, "The practice of peptidesynthesis", Springer, New York, ISBN 0-387-13471-9, и в Bodanszky, "The principles of peptide synthesis" Springer,New York, ISBN 0-387-12359-4. Синтез нужного пептида также доступен от некоторых коммерческих компаний,например, SynPep Corp., Dublin, CA, USA, и California Peptide Research, Inc., Napa, CA, USA. Пептиды также можно получить или в виде гибридов с другими белками или отдельно посредством экспрессии рекомбинантной ДНК, кодирующей их, что подробно описано в цитированной выше главе 16 Current Protocols. Для того чтобы использовать пептиды для картирования сайта расщепления испытываемого белка, предсказанную аминокислотную последовательность указанного белка разделяют на зоны, и синтезируют пептид,соответствующий каждой зоне. Кроме того, синтезируют пептиды, содержащие примерно половину аминокислот одной из зон и содержащие в соприкосновении также примерно половину аминокислот непосредственно прилегающей области, для того,чтобы перекрыть границу между двумя зонами.- 15005853 Зоны содержат от 5 до 100 аминокислот, предпочтительно от 9 до 40 аминокислот, и наиболее предпочтительно - от 20 до 30 аминокислот. Затем полный набор пептидов испытывают так, как описано выше, на подверженность расщеплению каспазой-8. Полученные пептиды можно очистить и получить в большом количестве. После реакции расщепления их можно затем проанализировать непосредственно методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS и УФ-детекции или визуализации посредством окрашивания, например, с использованием кумасси синего. С другой стороны, для более легкого обнаружения пептиды можно пометить, например, путем изотопного мечения концов (см., например, Shevchenko A. et al., Rapid Commun. Mass Spectrum, 11, p. 1015-24, 1997). После завершения скрининга пептидов, описанного выше, пептид, который, как теперь известно,содержит сайт расщепления каспазой-8, затем можно исследовать, повторив те же приемы, но отбирая более мелкие зоны, выбранные из последовательности идентифицированного пептида. Фактический сайт расщепления пептидов должен соответствовать последовательности расщепления каспазой XXXD (см. Boldin et al., Cell, 1996, и Nicholson et al., Killer caspases, Trends in Biochem. Sci.,22, 299-306, 1997). Вклад каждой аминокислоты в пептид можно оценить посредством получения пептидов, мутированных по одной из аминокислот, и испытанием таких мутированных пептидов на подверженность расщеплению каспазой-8. Мутированную аминокислоту предпочтительно заменяют аминокислотой, выбранной из группы заряженных неполярных аминокислот (см. Lehninger, Biochemistry, Worth,NY, 1979, chapter 4), и наиболее предпочтительно выбранных среди глицина или аланина. Путем мутации критических аминокислот можно получить пептиды, связывающиеся с каспазой-8,но невосприимчивые к расщеплению ею. Связывание можно проверить посредством разделения по размеру комплексов пептида и каспазы-8 в условиях без денатурации с использованием электрофореза в акриламидном геле. Также можно сконструировать модифицированные пептиды, способные к взаимодействию с активным цистеином каспазы-8, при этом они ковалентно связываются с указанным цистеином. Для этой цели можно использовать реагенты, взаимодействующие с тиольными группами, известные специалистам в области химии. Например, с SH-группой активного цистеина каспазы-8 могут реагировать реагенты, содержащие тиольную группу. Образовавшуюся ковалентную связь S-S можно расщепить посредством восстановления, например, в физиологических условиях в цитозоле или с использованием реагента, восстанавливающего S-S-группы, такого как дитиотреитол (DTT). Реагенты, взаимодействующие с тиольными группами, можно также необратимо присоединить к каспазе-8. Такие реагенты можно легко найти среди кросс-линкеров, способных взаимодействовать с тиольными группами, известных в технике, таких как описанные на с. О-90 и далее в каталоге PIERCE Life Sciences (PIERCE, Rockford, IL, USA) . Подходящими группами, реагирующими с тиольными группами, являются, например, пиридилдитио-, иодацетамидо- или малеимидогруппы. Эти группы можно присоединить к пептиду через линкеры,содержащие цепи необязательно ненасыщенных алифатических углеводородов, -О-, -S-, -NH- или ароматические группы. Линкеры, необязательно, могут содержать заместители. Тиолреактивные группы можно присоединить к пептиду путем химического синтеза, как известно в технике; функциональные группы пептида можно ввести во взаимодействие с подходящими функциональными группами молекул линкера с тиолреагирующей группой. Например, остаток лизина, присутствующий в пептидной последовательности или введенный в нее с целью создания подходящей функциональной группы,которой, в случае лизина, является эпсилонаминогруппа, можно ввести во взаимодействие с гетеробифункциональным кросс-линкером, таким как N-гамма-малеимидобутирилоксисукцинимидэфир, и создать пептид,где указанная эпсилонаминогруппа реагирует с N-гидроксисукцинимидной группой кросс-линкера, в то время как малеимидогруппа кросс-линкера не вступает в реакцию и может после контакта с цистеином каспазы 8, который встречается, когда указанный пептид специфически связывается с указанной каспазой-8, реагировать с тиольной группой указанного цистеина и посредством этого инактивировать указанную каспазу-8. Позицию в пептиде, используемую для взаимодействия с ним тиолреактивного реагента, можно выбрать так, чтобы она была вблизи аминокислоты (как правило, аспарагиновой кислоты), где происходит расщепление каспазой-8. Линкер, с помощью которого тиолреактивная группа связывается с пептидом, может изменяться по своей длине, наличию полярных групп, таких как гидрокси, заряженных групп, таких как нитро- и сульфогруппы, и ароматических групп, таких как фениленовый или фенильный остаток. Такие вариации в строении линкера позволят получить реагент, содержащий пептид и связанную с ним ковалентно тиолреактивную группу, которая специфически связывается с каспазой-8 и эффективно реагирует с тиольной группой ее активного цистеина. Испытываемый белок или его пептидный фрагмент можно также охарактеризовать посредством введения указанного белка или пептида в клетку млекопитающего и измерения его действия на реагенты,вызывающие апоптоз в указанной клетке. Экспрессию белка или пептида в клетке млекопитающего можно осуществить путем встраивания ДНК, кодирующей испытываемый белок, в вектор, содержащий промотор, необязательно, интронную последовательность и донорные/акцепторные сигналы сплайсинга, и также, необязательно, содержащий последовательность терминации. Эти методы в целом описаны в указанных выше Current Protocols, глава 16.- 16005853 Вышеуказанные промоторная, интронная и терминационная последовательности операбельны в клетках млекопитающего. Промотор, предпочтительно, является сильным промотором, таким как указанные выше промоторы RSV, CMV или MPSV. Промотор также может представлять собой ранний промотор SV40 (Everett et al., Nucleic Acids Res., 11, p. 2447-64, 1983, и указанные там ссылки) или клеточный промотор, такой как промотор бета-актин или промотор ELF-1 (Tokushige et al., J. Virol. Methods, 64,p. 73-80, 1997). Можно также использовать гибридный промотор, такой как гибрид lac-оператора и ELF-1 альфа-промотора человека, описанный Edamatsu et al. (Gene, 187, p. 289-94, 1997), гибридный промоторCMV-бета-актин, описанный Akagi et al., Kidney Int., 51, p. 1265-9, 1997, или гибрид tet-операторных последовательностей и промотора CMV (Furth et al., PNAS, 91, 9302-6, 1994, и указанные там ссылки). Интронные последовательности, которые можно встраивать в виде полных последовательностей,т.е. включающие сайты донора и акцептора сплайсирования, можно встраивать в кодирующую последовательность белка, который нужно экспрессировать. Встраивание таких интронных последовательностей может усилить устойчивость РНК и, таким образом, увеличить продуцирование нужного белка. Несмотря на то, что, в принципе, подходящие интронные последовательности можно выбрать среди любых интронов, содержащих ген, предпочтительными интронными последовательностями являются интрон бетаактина, интрон SV40 и интрон рецептора к TNF р 55. Интронная последовательность может содержать энхансерные элементы, которые могут усилить транскрипцию от вышеуказанных промоторов. Часто интронные последовательности также содержат транскрипционные или транскрипционные контрольные последовательности, которые придают экспрессии тканеспецифичность. Следовательно,когда белок изобретения нужно экспрессировать тканеспецифически, может быть выгодным использование таких интронных последовательностей. Примером интрона, содержащего тканеспецифические энхансерные элементы, является эритроидспецифический энхансер, расположенный в интроне 8 гена 5 аминолевулинатсинтазы 2 человека (Surinya et al., J. Biol. Chera., 273, p. 16798-809, 1998), а обсуждение принципов усиления продуцирования белков с использованием интронных последовательностей, наряду с примерами интронных последовательностей, описаны Huang et al., Nucleic Acids Res., 18, p. 937-47,1990). Транскрипционные терминационные последовательности и сигналы полиаденилирования можно добавить к 3'-концу ДНК, кодирующей белок, который нужно экспрессировать. Такие последовательности можно найти во многих или даже в большинстве генов. Выгодно использовать сигнал полиаденилирования SV40 (Schek et al., Mol. Cell. Biol., p. 5386-93, и приведенные там ссылки). Предпочтительным вектором экспрессии белка в клетке млекопитающего является вектор pcDNAHis (Invitrogen), содержащий промотор CMV для управления экспрессией гена, кодирующего нужный белок. Другими векторами, которые можно использовать, являются векторы pCDNA3 или pMPSVEH. Эти векторы содержат промоторы CMV и MPSV соответственно. Используя рекомбинантную экспрессию испытываемого белка, указанный белок теперь можно оценить по его действию на сигнал апоптоза, опосредуемый каспазой-8. С этой целью можно индуцировать апоптоз или путем сверхэкспрессии индуцирующего апоптоз белка, такого как внутриклеточный домен CD120a, внутриклеточный домен CD95, белок MORT-1, каспаза-8 или их эквиваленты, или путем активации сигнала апоптоза посредством инициации CD120a, CD95, TRAMP/DR3 или эквивалентного рецептора. Активации рецептора можно добиться или посредством приведения рецепторов в контакт с лигандом, или посредством поперечного сшивания рецепторов с антителами, предпочтительно - поликлональными антителами (см. Engelmann et al., J. Biol. Chem., 265, p. 14497-504, 1990). Несмотря на то, что, вообще, инициация рецептора, подобного CD120a, требует добавления ингибитора синтеза белка, подобного циклогексимиду, для того, чтобы добиться сильного сигнала для апоптоза, сверхэкспрессии рецепторных внутриклеточных доменов или белков, вовлеченных в трансдукцию сигнала апоптоза, не происходит (см. Boldin et al., Cell, 85, p.803, 1996). Детекция апоптоза, время инкубации и другие подробности и параметры этого анализа описаны в цитированной выше работе Boldin etal. Гибель клеток, экспрессирующих испытываемый белок, по сравнению с клетками, белок не экспрессирующими, можно оценить любым из многих способов, таким как способ на основе фрагментации ДНК или обнаружении апоптозспецифических антигенов и эпитопов, а реагенты и протоколы для обнаружения апоптоза в форме набора доступны от вышуказанной компании Boehringer Mannheim и от других компаний. Гибель клеток можно также определить путем оценки морфологического состояния клеток. Гибель клеток вследствие апоптоза характеризуется волнистой мембраной у клеток и сморщиванием клеток при отсутствии лизиса. Выгодно экспрессировать в клетке млекопитающего репортерный ген для того, чтобы обеспечить маркер для успешной трансфекции. Так как сама процедура трансфекции приводит к гибели некоторых клеток, в том числе клеток, которые не трансфицированы, выгодно оценивать только те клетки, которые трансфицированы. Предпочтительным репортерным геном для этой цели является ген lacZ, который легко обнаруживается путем инкубации трансфицированных клеток с Xgal или подобным реагентом, ука- 17005853 зывающим на активную бета-галактозидазу. Однако можно использовать любой другой репортерный ген, предпочтительно ген, продукты которого легко обнаруживаются с использованием простой реакции окрашивания, результаты которой можно оценить с использованием микроскопа. Например, для непосредственной детекции без реакции окрашивания можно использовать белок зеленой флуоресценции. Этот репортерный ген требует применения флуоресцентного микроскопа. Таким образом, рассматривая только клетки, которые трнсфицированы, т.е. которые экспрессируют репортерный ген, и подсчитывая процент клеток, демонстрирующих морфологию, характерную для апоптоза, можно оценить действие определенного трансфицированного клона и экспрессированного им белка на апоптоз. Клетки млекопитающего представляют собой, предпочтительно, HeLa или эмбриональные клетки почки человека (НЕК) 293-Т. Трансфекцию предпочтительно осуществляют кальцийфосфатным способом, как описано в цитированных выше Current Protocols. Морфологию клеток оценивают через 1-150 ч после трансфекции, предпочтительно через 4-35 ч, и наиболее предпочтительно через 20 ч после трансфекции. Получение антител Поликлональные антитела можно получить в кроликах, курах, мышах, крысах, овцах или подобных млекопитающих. Для получения антител против белка или пептида изобретения в клетках млекопитающего получают белок или пептид, как описано выше, с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Белок также можно получить в клетках бактерий или насекомых, как подробно описано в цитированных выше Current Protocols, глава 16. Белок или пептид очищают от клеток, в которых он продуцирован. Способы очистки белков известны специалистам в этой области техники и описаны подробно, например, в цитированных выше Current Protocols in Molecular Biology, глава 16, и в Current Protocols in Protein Science,Wiley and Sons Inc.,главы 5 и 6. Белок можно выгодно получить в виде гибрида с другим белком, таким как глутатион-Sтрансфераза, или подобным белком, или последовательностью-меткой, такой как последовательность гистидиновой метки. Использование гибридных или меченых белков упрощает процедуру очистки, что подробно описано в цитированных выше Current Protocols in Molecular Biology, глава 16, и в инструкциях для указанного выше набора для экспрессии и очистки белков с гистидиновой меткой от Qiaqen. Если белок или пептид экспрессирован в виде слитого белка, желательно отщепить партнера по гибридизации перед применением белка для получения антител против партнера по гибридизации. Расщепление партнеров по гибридизации и выделение нужного белка описано в цитированных выше CurrentProtocols in Molecular Biology, глава 16. Векторы, протоколы и реагенты для экспрессии и очистки рекомбинантных белков, слитых с белком связывания мальтозы, также доступны коммерчески. При получении пептида изобретения может быть желательно не удалять партнера по гибридизации,так как слитый белок может стимулировать продуцирование антител против пептида. Как правило, это соображение будет уместно, когда получают антитела из пептидов, длина которых менее 50 аминокислот. Как отмечено также выше, пептид также можно синтезировать химическими способами, известными в химии. Получение поликлональных антител против белков описано в главе 2 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. При получении антител против пептидов могут потребоваться некоторые изменения в протоколе, как правило, вследствие более низкой антигенности пептидов по сравнению с белками. Получение поликлональных антител против пептидов описано в цитированных выше Current Protocols in Immunology, глава 9. Моноклональные антитела можно получить из В-клеток, взятых из селезенки или лимфоузлов иммунизированных животных, в частности, крыс или мышей, путем слияния с иммортализованными Вклетками в условиях, благоприятных для роста гибридных клеток. Для слияния с В-клетками мышей предпочтительна клеточная линия Аg-8. Методы получения моноклональных антител описаны во многих статьях и книгах, таких как цитированные выше Current Protocols in Immunology. В главе 9 этого издания описывается иммунизация животных с помощью пептидов. Клетки селезенки или лимфоузлов этих животных можно использовать для получения моноклональных антител так же, как клетки селезенки или лимфоузлов животных, иммунизированных белками, как это описано в этом издании в главе 2. Методы, используемые при получении моноклональных антител, также описаны в Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, и в USP 4376110. Для получения антител из банка генов антител человека гипервариабельные области генов заменяют почти случайными последовательностями, как описано в USP 5840479. Такие антитела предпочтительны, если иммунизация животного данным пептидом или белком затруднительна. Некоторые структуры являются слабоиммуногенными и могут оставаться такими, несмотря на добавление адъювантов и связь с другими белками в гибридные конструкции. Антитела, описанные в USP 5840479, также предпочтительны, если требуется использование антител со структурой, подобной антителам человека, например, когда нужны антитела с низкой иммуногенностью у людей.- 18005853 Как только подходящие антитела идентифицированы, может потребоваться изменение их свойств. Например, при получении можно достичь более высоких выходов с химерными антителами. Химерные антитела, где константные области заменены на константные области антител человека, также могут потребоваться, когда желательно, чтобы антитела имели низкую иммуногенность у людей. Получение химерных антител описано во многих публикациях, например, в Cabilly et al., PNAS, 81, p. 3273, 1984; Morrison et al., PNAS, 81, p.6851, 1984; Boulianne et al., Nature, 312, p. 643, 1984; EP 125023, EP 171496, EP 173494, EP 184187, WO 86/01533, WO 87/02671 и в Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Другим типом антител являются антиидиотипические антитела. Антиидиотипические (анти-Id) антитела являются антителами, распознающими уникальные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Антитела против Id можно получить посредством иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, штамма мышей), что и источник mАb, к которому получают анти-Id. Иммунизированное животное будет узнавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антител к этим идиотипическим детерминантам (анти-Id антитела). См., например, патент США 4699880, включенный в настоящее описание в качестве ссылки. Анти-Id антитела также можно использовать в качестве "иммуногена" для индукции иммунной реакции еще и у другого животного, продуцируя так называемые анти-анти-Id антитела. Анти-анти-Id могут быть эпитопно идентичны исходным mAb, которые индуцировали анти-Id. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам mAb, возможно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Соответственно, mAb, полученные против белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов,фрагментов или производных настоящего изобретения можно использовать для индукции анти-Id антител у подходящих животных, таких как мыши BALB/c. Клетки селезенки таких иммунизированных мышей используют для получения анти-Id гибридом, секретирующих анти-Id mAb, Далее, анти-Id mAb можно сочетать с носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH) и использовать для иммунизации других мышей BALB/c. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-анти-Id антитела, обладающие свойством связываться с исходными mAb, специфичными для эпитопа вышеуказанного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его аналогов, фрагментов или производных. Таким образом, анти-Id mAb имеют свои собственные идиотипические эпитопы или "идиотопы",схожие по строению с оцениваемым эпитопом. Термин "антитело" также обозначает как интактные молекулы, и их фрагменты, такие, как, например, Fab и F(ab')2, способные связываться с антигеном. Фрагменты Fab и F(ab')2, лишенные Fcфрагмента интактного антитела, быстро выводятся из кровообращения и могут иметь меньше нетканеспецифического связывания, чем интактное антитело (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983. Следует иметь в виду, что Fab и F(ab')2 и другие фрагменты антител, полезные в настоящем изобретении, можно использовать для детекции и количественного определения белка, взаимодействующего с каспазой-8, в соответствии со способами, описанными здесь для молекул интактных антител. Такие фрагменты, как правило, получают посредством протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2 фрагментов). Об антителе говорят, что оно "способно к связыванию" с молекулой, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, и посредством этого молекула связывается с антителом. Термин"эпитоп" относится к той части любой молекулы, способной связываться антителом, которую это антитело может узнать. Эпитопы или "антигенные детерминанты", как правило, состоят из химически активных групп молекул на поверхности, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, так же как и специфические характеристики по заряду."Антиген" представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться антителом,которое также способно индуцировать животное к продуцированию антител, способных к связыванию с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Специфическое взаимодействие, упомянутое выше, означает, что антиген будет взаимодействовать с высокой селективностью со своим соответствующим антителом, а не со многими другими антителами, которые могут вызываться другими антигенами. Антитела, в том числе, фрагменты антител, полезные в настоящем изобретении, можно использовать для качественной и количественной детекции белка настоящего изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Это можно осуществить иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно помеченных антител (см. ниже) вместе с детекцией оптическими методами, методом поточной цитометрии или флуорометрическими методами. Антитела (или их фрагменты), полезные в настоящем изобретении, можно использовать для гистологии с методами иммунофлуоресценции или иммуноэлектронной микроскопии для детекции in situ белка настоящего изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Детекцию in situ можно выполнить по- 19005853 средством взятия гистологического образца у пациента и предоставления меченого антитела настоящего изобретения к такому образцу. Антитела (или их фрагменты) предпочтительно предоставляют посредством нанесения или наслоения меченых антител (или фрагментов) на биологический образец. Применяя такую процедуру, можно определить не только наличие белка, взаимодействующего с каспазой-8, но также его распределение в проверяемой ткани. Применяя настоящее изобретение, специалисты легко представят, что любой из многочисленных гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать для того, чтобы добиться такой детекции in situ. Такие анализы на белок настоящего изобретения, взаимодействующий с каспазой-8, как правило,включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт,свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, инкубированные в культуре ткани, в присутствии обнаруживаемых меченых антител, способных идентифицировать белок, взаимодействующий с каспазой-8, и детекцию антител любым из многих способов, известных в технике. Биологический образец можно обработать с помощью твердофазной подложки или носителя, таких как нитроцеллюлоза, или других твердой подложки или носителя, способных иммобилизовать клетки,частицы клеток или растворимые белки. Затем подложку или носитель можно промыть подходящими буферами с последующей обработкой детектируемыми мечеными антителами в соответствии с настоящим изобретением, как указано выше. Затем твердофазную подложку или носитель можно промыть буфером во второй раз и удалить несвязанные антитела. Затем обычными способами можно определить количество связанной метки на указанной подложке или носителе. Под "твердофазной подложкой", "твердофазным носителем", "твердой подложкой", "твердым носителем", "подложкой" или "носителем" подразумеваются любые подложки или носители, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлонамилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Носитель для целей настоящего изобретения по природе может быть или растворимым до некоторой степени или нерастворимым. Материал подложки фактически может иметь любую возможную структурную конфигурацию до тех пор, пока присоединенная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Так, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, как у гранул, цилиндрической, как внутренняя поверхность пробирки или как наружная поверхность стержня. С другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как лист, тестпластина и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистирольные гранулы. Специалистам в этой области техники известны многие другие подходящие носители для связывания антител или антигенов, или в этом можно удостовериться с помощью простых экспериментов. Связывающую активность полученных антител, по изобретению, как указано выше, можно определить с соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в этой области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа в случае каждого определения, используя обычныеэксперименты. Другие стадии, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрация и т.п., можно включить в анализы как обычные или необходимые в данной ситуации. Одним из способов, которым антитела в соответствии с настоящим изобретением можно пометить для обнаружения, является связывание их с ферментом и применение иммуноферментного анализа(EIA). Фермент, в свою очередь, при дальнейшем воздействии соответствующего субстрата будет реагировать с субстратом таким образом, что получится химическая группа, которую можно обнаружить, например, спектрофотометрическим, флуорометрическим или визуальным способом. Ферменты, которые можно использовать для детектируемого мечения антител, включают, но не ограничиваются перечисленным, малатдегидрогеназу, стафилококкоковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Детекцию можно осуществить колориметрическими методами, при которых используют хромогенный субстрат для фермента. Детекцию также можно осуществить посредством визуального сравнения с полученными таким же способом стандартами. Детекцию можно осуществить с использованием многих других иммуноанализов. Например, с помощью мечения антител или фрагментов антител радиоизотопами можно обнаружить R-РТРазу, применяя радиоиммуноанализ (RIA). Хорошее описание RIA можно найти в "Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology", Work, T.S., et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), особенно в главе под названием "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", Chard, Т., включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Радиоактивные изотопы можно обнаружить с помощью таких средств, как счетчик гамма-квантов или сцинтилляционный счетчик, или методом ауторадиографии. Антитела в соответствии с настоящим изобретением также можно пометить флуоресцентным соединением. Когда на антитела с флуоресцентными метками действует свет с подходящей длиной волны,их присутствие можно обнаружить вследствие флуоресценции. Среди наиболее часто используемых со- 20005853 единений для флуоресцентного мечения находятся изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин,аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин. Антитела также можно пометить для детекции с использованием флуресциирующих металлов, таких как 152 Е, или других металлов ряда лантанидов. Эти металлы можно присоединить к антителам с использованием таких образующих комплексы с металлами групп, как остаток диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ЕТРА). Антитела также можно пометить для детекции посредством сочетания их с хемилюминесцентным соединением. Присутствие меченных хемилюминесцентным соединением антител затем определяют путем детекции наличия люминесценции, которая появляется в ходе химической реакции. Примерами соединений, особенно полезных для хемилюминесцентного мечения, являются люминол, изолюминол,theromatic эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и эфир щавелевой кислоты. Подобным образом, для мечения антител настоящего изобретения можно использовать биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция является видом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок повышает эффективность хемилюминесцентной реакции. Наличие биолюминесцентного белка определяют посредством детекции наличия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и аэкорин. Молекулу антитела настоящего изобретения можно адаптировать для применения в иммунометрическом анализе, известном также как "двухслойный" или "сэндвич"-анализ. При типичном иммунометрическом анализе некоторое количество помеченных антител (или фрагментов антител) связывается с твердой подложкой или носителем, и добавляют некоторое количество меченных для детекции растворимых антител, чтобы создать возможность детекции и/или количественного определения тройного комплекса, образуемого антителами твердой фазы, антигеном и мечеными антителами. Типичными и предпочтительными иммунометрическими анализами являются "прямые" анализы,при которых антитела, связанные с твердой фазой, сначала вводят в контакт с бинарным твердофазным комплексом антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрорегировавший антиген, если таковой есть, и затем вводят в контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как "репортерная молекула"). После второго периода инкубации для создания комплекса меченого антитела с антигеном, связанным с твердой подложкой или носителем с помощью немеченого антитела, твердую подложку или носитель промывают во второй раз для удаления непрореагировавших меченых антител. В другом типе "сэндвич"-анализа, который также можно применять с антигенами настоящего изобретения, используют так называемые "одновременные" и "обратные" анализы. Одновременный анализ включает одну стадию инкубации, так как антитела, связанные с твердой подложкой или носителем, и меченые антитела добавляют к испытываемому образцу одновременно. После завершения инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца и не вступивших в комплекс меченых антител. Затем определяют наличие меченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, так, как это обычно делают при "прямом" сэндвич-анализе. При "обратном" анализе используют постадийное добавление к жидкому образцу сначала раствора меченых антител, а затем немеченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают обычным способом для освобожения ее от остатков испытываемого образца и раствора непрореагировавших меченых антител. Затем осуществляют определение меченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, как при "одновременном" и "прямом" анализах. Иммуноанализы Осуществление иммуноанализов, таких как RIA или ELISA, описано во многих статьях, книгах и других публикациях. Дается ссылка на WO 97/03998, со с. 48, строка 4, по с. 52, строка 27. Иммуноанализы изобретения могут быть двух общих типов: во-первых, можно использовать иммуноанализы с использованием иммобилизованного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его эквивалента для количественного определения каспазы-8; во-вторых, можно использовать иммуноанализы с использованием иммобилизованных антител, направленных против эпитопа белка, взаимодействующего с каспазой 8, для количественного определения белков, взаимодействующих с каспазой-8. Такие анализы могут найти применение в диагностике, когда нужно оценить содержание каспазы-8 и других белков, вовлеченных в апоптозный каскад реакций, при многих нарушениях или синдромах, где возможно участие таких каскадов. Нуклеиновые кислоты Ожидается, что клоны, полученные при скрининге по изобретению, будут неполными клонами. Получение полных клонов, когда это необходимо, также описано выше. Последовательность ДНК полного клона и неполного клона, найденная сначала при скрининге по изобретению, может найти разные применения. Например, для того, чтобы управлять экспрессией белка, взаимодействующего с каспазой-8, может- 21005853 потребоваться получение в клетке антисмысловой РНК. Для этой цели полную или неполную кДНК, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, встраивают в экспрессирующий вектор, содержащий промотор, что также указано выше. Посредством этого 3'-конец кДНК встраивают по соседству с 3'концом промотора, причем 5'-конец кДНК отделяется от 3'-конца промотора указанной кДНК. Поэтому,после экспрессии кДНК в клетке продуцируется антисмысловая РНК, неспособная кодировать белок. Наличие антисмысловой РНК в клетке снижает экспрессию клеточной (геномной) копии гена, взаимодействующего с каспазой-8. Для получения антисмысловой РНК можно использовать полную кДНК. С другой стороны, можно использовать ее фрагмент, который предпочтительно имеет длину от 9 до 2000 нуклеотидов, предпочтительнее от 15 до 500 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно от 30 до 150 нуклеотидов. Фрагмент предпочтительно соответствует области в пределах 5'-половины кДНК, предпочтительнее 5'-области, содержащей 5'-нетранслируемую область и/или первую экзонную область, и наиболее предпочтительно - содержащей сайт начала трансляции ATG. С другой стороны, фрагмент может соответствовать последовательности ДНК только 5'-нетранслируемой области. В качестве антисмыслового олигонуклеотида можно использовать синтетический олигонуклеотид. Олигонуклеотид, предпочтительно, представляет собой олигонуклеотид ДНК. Длина антисмыслового олигонуклеотида составляет предпочтительно от 9 до 150, предпочтительнее от 12 до 60, и наиболее предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов. Область, перекрываемая антисмысловым олигонукле-отидом,содержит предпочтительно 3'-нетранслируемую область кДНК, предпочтительнее она содержит сигнал полиаденилирования или стоп-кодон трансляции, или то и другое. Обзор механизма действия антисмысловой РНК и сегодняшнее состояние техники использования антисмысловых инструментов приведен в Kumar et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, p. 1415-1434, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов при ингибировании синтеза рецептора BMP описано Yenet al., J. Bone Miner. Res., 13, p. 1870-9, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза гена вольтзависимого калиевого канала Kvq.4 описано Meiri et al., PNAS, 95, p. 150371042, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза Bcl-х описаноKondo et al., Oncogene, 17, p. 2585-91, 1998. Лечебное применение антисмысловых лекарственных средств описывают Stix. Sci. Am., 279, p. 46,50, 1998; Flanagan, Cancer Metastasis Rev., 17, p. 169-76, 1998; Guinot and Temsamani, Pathol. Bioi. (Paris),46, p. 347-54, 1998; и в приведенных в этих работах ссылках. Когда создают антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, используют модификации олигонуклеотидов, усиливающие нужные свойства. Например, вместо фосфоэфирных связей, встречающихся в природных ДНК, используют фосфоротиоатные связи, главным образом, вследствие того, что такие фосфоротиоатсодержащие олигонуклеотиды менее расположены к разрушению клеточными ферментами. Peng et al. сообщают, что нежелательные in vivo побочные действия фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов можно ослабить при использовании смешанного фосфодиэфирфосфоротиоатного скелета. Предпочтительно 2'-метоксирибонуклеотидные модификации используют в 60% нуклеотида. Такие модифицированные олигонуклеотиды способны выявлять антисмысловое действие, сравнимое с действием,наблюдаемым в случае фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов. Peng et al. также сообщают, что аналоги олигонуклеотидов, не способные к поддержанию активности рибонуклеазы Н, являются неактивными. Следовательно, предпочтительный антисмысловой олигонуклеотид изобретения имеет смешанный фосфодиэфирфосфоротиоатный скелет. Наиболее предпочтительно, 2'-метоксирибонуклеотидные модификации используют в примерно 30-80%, наиболее предпочтительно в примерно 60% олигонуклеотида. В антисмысловой олигонуклеотид можно ввести другие модификации. Например, молекулу олигонуклеотида можно соединить с группой, содержащей необязательно частично ненасыщенную углеводородную цепь и одну или несколько полярных или заряженных групп, таких как карбоксильная кислотная группа, сложноэфирные группы и спиртовые группы. С другой стороны, олигонуклеотиды можно соединить с пептидными структурами, которые, предпочтительно, являются мембранотропными пептидами. Такие модифицированные олигонуклеотиды проникают через мембраны легче, что является критическим для их функционирования, и, следовательно, можно существенно усилить их активность. Проникновение сквозь мембраны особенно желательно для антисмысловых лекарственных средств, которым нужно достичь головного мозга. Олигонуклеотиды, соединенные с пальмитилом, описаны Gerster et al.,Anal. Biochem., 262, p. 177-84, 1998. Олигонуклеотиды, соединенные с гераниолом, описаны Shoji et al., J.Drug Target, 5, p. 261-73, 1998. Олигонуклеотиды, соединенные с пептидами, например, мембранотропными пептидами, и их получение описаны Soukchareun et al., Bioconjug. Chem., 9, p. 466-75, 1998. Модификации антисмысловых молекул или других лекарственных средств, которые направляют молекулу в определенные клетки и усиливают поглощение олигонуклеотида указанными клетками, описаны Wang,J. Controlled Realease, 53, p. 39-48, 1998. Рибозимы Получив известную последовательность мРНК гена, можно создать рибозимы, представляющие собой молекулы РНК, которые специфически связываются и расщепляются указанной последовательно- 22005853 стью мРНК (см., например, Chen et al., Ann. NY Acad. Sci., 660, 271-3, 1992; Zhao and Pick, Nature, 365,p.448, 1993; Shore et al., Oncogene, 8, 3183, 1993; Joseph and Burke, J. Biol. Chem., 24515, 1993; Shimayamaet al., Nucleic Acids Symp., Ser. 29 p.177, 1993; Cantor et al., PNAS, 90, p.10932, 1993). Соответственно, можно создать последовательность РНК, кодирующую рибозим, которая расщепляет мРНК белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Место расщепления располагается предпочтительно в кодирующей области или в 5'-нетранслируемой области, предпочтительнее в 5'-части кодирующей области, примыкающей к стартовому кодону трансляции AUG. ДНК, кодирующую рибозим по изобретению, можно ввести в клетки путем поглощения ДНК, поглощения модифицированной ДНК (см. модификации олигонуклеотидов и белков, приводящие к усиленной мембранной проницаемости, как описано ниже) или переносу гена, опосредованному вирусным вектором, что подробно описано ниже. Введение в клетки белков, взаимодействующих с каспазой-8, пептидов и ДНК Настоящее изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8, полученным из них пептидам, антисмысловым молекулам ДНК и олигонуклеотидам. Применение для лечения или исследований таких инструментов требует введения их в клетки живого организма. Для этой цели нужно усилить мембранную проницаемость для пептидов, белков и олигонуклеотидов. Способы улучшения мембранной проницаемости для олигонуклеотидов описаны выше. Те же принципы, а именно, дериватизацию лиофильными структурами, можно также использовать при создании белков и пептидов с усиленной способностью проходить через мембрану. Например, к последовательности пептида или белка можно добавить последовательность известного мембранотропного пептида, как указано выше. Кроме того,пептид или белок можно дериватизировать с помощью частично лиофильных структур, таких как вышеуказанные углеводородные цепи, которые замещены по меньшей мере одной полярной или заряженной группой. Например, лауроилпроизводные пептидов описаны Muranishi et al., Pharm. Research., 8, 649,1991. Другие модификации пептидов и белков включают окисление метиониновых остатков, посредством чего создаются сульфоксидные группы, как описано Zacharia et al., Eur. J. Pharmacol., 203, p.353,1991. Zacharia с сотрудниками также описывают пептид или производные, где относительно гидрофобная пептидная связь заменяется ее кето-метиленовым изоэфиром (СОСН 2). Такие и другие модификации,известные специалистам в области химии белков и пептидов, усиливают способность проникать через мембрану. Другим способом усиления мембранной проницаемости является использование рецепторов, таких как вирусные рецепторы, на поверхности клетки для индукции поглощения клеткой пептида или белка. Этот механизм часто используется вирусами, специфически связывающимися с некоторыми молекулами поверхности клетки. После связывания клетка пропускает вирус вовнутрь. Такая молекула поверхности клетки называется вирусным рецептором. Например, молекулы интегрина CAR и AdV описаны как вирусные рецепторы для аденовируса, см. Hemmi et al., Hum. Gene Ther., 9, p. 2363-73, 1998, и приведенные там ссылки. Молекулы CD4, GPR1, GPR15 и STRL33 идентифицированы как рецепторы/корецепторы для ВИЧ, см. Edinger et al., Virology, 249, p. 367-78, 1998, и приведенные там ссылки. Таким образом, конъюгирование пептидов, белков и олигонуклеотидов с молекулами, известными как рецепторы для связывания с поверхностью клетки, будет усиливать мембранную проницаемость для указанных пептидов, белков или олигонуклеотидов. Примерами подходящих групп для образования конъюгатов являются сахара, витамины, гормоны, цитокины, трансферрин, азиалогликопротеин и подобные молекулы. В патенте США 5108921, Low et al., описывается применение таких молекул для целей усиления мембранной проницаемости для пептидов, белков и олигонуклеотидов, и получение указанных конъюгатов.Low с сотрудниками также указывают, что молекулы, такие как фолат или биотин, можно использовать для направленной доставки конъюгата ко многим клеткам организма, в силу обильной и неспецифической экспрессии рецепторов для этих молекул. Описанное выше применение белков поверхности клетки для усиления мембранной проницаемости для пептида, белка или олигонуклеотида изобретения можно также использовать при направленной доставке указанного пептида, белка или олигонуклеотида изобретения к клеткам или тканям определенного типа. Например, если необходимо попасть в раковые клетки, предпочтительно использовать белок поверхности клетки, который экспрессируется обильнее на поверхности таких клеток. Примерами являются фолатные рецепторы, антигены к муцину MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B и MUC7,гликопротеиновые антигены KSA, карциномоэмбриональный антиген, специфический для предстательной железы мембранный антиген (PSMA) HER-2/neu и хорионный гонадотропин-бета человека. В цитированной выше работе Wang et al., 1998, описывается применение фолата для направленной доставки в раковые клетки, а в Zhang et al., Clin. Cancer Res., 4, p. 2669-76, 1998, указывается на относительное обилие каждого из других антигенов, указанных выше, в раковых и здоровых клетках разного типа. Следовательно, белок, пептид или олигонуклеотид изобретения можно, с использованием описанного выше метода конъюгации, направленно доставить в определенный, какой требуется, тип клеток. Например, если нужно усилить апоптоз в клетках лимфоцитарной линии, в эти клетки можно направить белок или пептид изобретения, положительно модулирующие каспазу-8, например, используя молекулы- 23005853 КГС класса II, которые экспрессируются на этих клетках. Этого можно достичь посредством сочетания антитела, или его антигенсвязывающего сайта, направленного против константной области указанной молекулы КГС класса II, с белком или пептидом изобретения. Далее описаны многие рецепторы клеточной поверхности для разных цитокинов и других молекул клеточной коммуникации, и многие из этих молекул экспрессируются более или менее ткане- или клеточноспецифически. Так, когда нужна направленная доставка подгруппы Т-клеток, для получения конъюгата изобретения можно использовать молекулу поверхности клетки CD4. Молекулы, связывающие CD4, предоставляются вирусом ВИЧ, чей поверхностный антиген gp42 способен связываться с молекулой CD4. Белок изобретения, взаимодействующий с каспазой-8, или пептид изобретения, усиливающие апоптоз, можно направленно доставить преимущественно в Т-клетки при лечении пациента, страдающего от аутоиммунных реакций на основе Т-клеток, таких как пациенты с красной волчанкой. Направленная доставка в клетки, опосредованная вирусами Белки, пептиды и антисмысловые последовательности изобретения можно ввести в клетки, используя вирусный вектор. Применение вакцинного вектора для таких целей подробно описано в цитированной выше главе 16 Current Protocols in Molecular Biology. Применение аденовирусного вектора описано,например, Teoh et al., Blood, 92, p. 4591-4601, 1998; Narumi et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 19, p. 936941, 1998; Pederson et al., J. Gastrointest. Surg., 2, p. 283-91, 1998; Guang-Lin et al., Transplant. Proc, 30, p. 2923-4, 1998, и в цитированных в этой работе ссылках; Nishida et al., Spine, 23, p. 2437-42, 1998; Schwarzenberger et al., J. Immunol., 161, p. 6383-9, 1998; и Сао et al., J. Immunol., 161, p. 6238-44, 1998. Ретровирусный перенос антисмысловых последовательностей описан Daniel et al., J. Biomed. Sci., 5, 383-94, 1998. Когда в качестве векторов используют вирусы, для направленной доставки вируса обычно используют белки вирусной поверхности. Так как многие вирусы, такие как вышеуказанный аденовирус, скорее неспецифичны в своем клеточном тропизме, может потребоваться придание большей специфичности посредством использования промотора клеточного типа или тканеспецифического промотора. Griscelli etal., Hum. Gene Ther., 9, p. 1919-28, 1998, описывают применение промотора легкой цепи 2 кардиального миозина, специфического для желудочка, для специфической направленной доставки в сердце гена, перенос которого опосредуется аденовирусом. С другой стороны, можно создать методами генной инженерии вирусный вектор для экспрессии другого белка на его поверхности, или белок поверхности вирусного вектора можно заменить для введения нужной пептидной последовательности. Таким образом, можно создать вирусный вектор для экспрессии одного или нескольких дополнительных эпитопов, пептидов, связывающихся с КГС класса II или можно использовать эпитопы, образованные от "хоминг"-молекул, для направления вирусного вектора в соответствии с указаниями изобретения. Применения описанных выше инструментов Белки изобретения, взаимодействующие с каспазой-8, взаимодействуют специфически с субъединицами каспазы-8, вовлеченными в протеолитическую активность каспазы-8. Не углубляясь в теорию,авторы изобретения полагают, что белки изобретения, взаимодействующие с каспазой-8, являются "последующими" элементами в каскаде передачи сигнала с участием каспазы-8. Оказывается, что "предыдущие" агенты связываются через продомен каспазы-8, опосредующий домен взаимодействия белокбелок. Оказывается, что экстенсивное "кросс-общение" со многими средствами, организующими апоптозную реакцию, может быть опосредовано взаимодействиями белок-белок с участием эффекторного домена гибели (DED) и родственных доменов, таких как домены, локализованные в продомене каспазы 8. В противоположность таким белкам, белки настоящего изобретения, взаимодействующие с каспазой 8, могут находиться среди непосредственных исполнителей процесса гибели клеток. Например, один из белков изобретения, взаимодействующих с каспазой-8, Tip-60 является ферментом гистондеацетилазой. Следовательно, указанный белок может непосредственно участвовать в изменениях структуры хроматина. Взаимодействие белков изобретения с каспазой-8 имеет ряд смежных последствий. Во-первых,происходит модуляция активности каспазы-8. Это показано здесь при анализе in vivo, где клон J2 изобретения ингибирует апоптоз, опосредуемый каспазой-8. Во-вторых, белок, взаимодействующий с каспазой-8, может повысить активность каспазы-8 посредством предупреждения разрушения каспазы-8, или снизить ее активность, действуя как ингибитор. В-третьих, активность белка, взаимодействующего с каспазой-8, можно модулировать. Это показано здесь через способность каспазы-8 расщеплять белки, взаимодействующие с каспазой-8. Возможно,что некоторые из таких белков инактивируются путем расщепления. Однако также возможно, что активность белков изменяется, индуцируются новые активности, или что белок, взаимодействующий с каспазой-8, активируется путем расщепления, именно как сами каспазы. Следовательно, белки, взаимодействующие с каспазой-8, пептиды, олигонуклеотиды и антитела изобретения полезны при модуляции активности каспазы-8. Модуляция каспазы-8 по нисходящей желательна в ситуациях, где происходит избыточная гибель клеток вследствие апоптоза. Например, предполагается, что при рассеянном склерозе с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунном увеоретините, диабете, волчанке, аутоиммунном миокардите I, печеночной недостаточности, независимо от этиоло- 24005853 гии, опосредованном HCV хроническом гепатите, гастрите, например, гастрите типа А, смешанной болезни соединительной ткани (MCTD), болезни Крона и неспецифическом язвенном колите разрушение тканей организма вызывается сигналами апоптоза. Следовательно, для пациентов, страдающих от таких болезней, может быть благоприятной модуляция активности каспазы-8 по нисходящей в тех клетках,которые разрушаются путем апоптоза. Например, при указанной выше олигодендропатии нужно ингибировать активность каспазы-8 в олигодендроцитах. Рецептор фосфолипидлизофосфатидной кислоты в сочетании с G-протеином клеточной поверхности экспрессируется в олигодендроцитах и в различных других клетках головного мозга, но не в других тканях организма. Следовательно, пептид или белок изобретения направляют в эти клетки. Этого можно достичь или посредством сочетания указанного пептида или белка с фосфолипидлизофосфатидной кислотой или посредством введения последовательности антитела, специфически узнающего указанный рецептор фосфолипидлизофосфатидной кислоты, в вирусный вектор, так что указанный вирусный вектор специфически связывается с указанным рецептором фосфолипидлизофосфатидной кислоты. Подобным образом пептиды или белки изобретения можно направить в клетки другого типа, затрагиваемые при других заболеваниях, перечисленных выше, и других заболеваниях, при которых, как показано, избыток апоптозных клеток опосредует повреждение в наблюдаемой ткани организма. Подобным образом антисмысловую ДНК, антисмысловой олигонуклеотид и рибозим изобретения также можно направить в вышеуказанные олигодендроциты или в соответствующие клетки при других заболеваниях. В таком случае подавляется экспрессия белков, взаимодействующих с каспазой-8, а не экспрессия самой каспазы-8. Путем ингибирования экспрессии ряда белков, взаимодействующих с каспазой-8, можно снизить апоптозное действие каспазы-8. Однако снижение экспрессии определенных белков, взаимодействующих с каспазой-8, может фактически повысить действие каспазы-8, так как некоторые белки, взаимодействующие с каспазой-8, способны действовать как отрицательные регуляторы активности каспазы-8. Следовательно, сначала следует проверить эффект использования антисмысловых олигонуклеотидов и антисмысловой РНК и рибозимов, например, в описанном выше анализе in vivo,прежде чем обсуждать применение таких средств для лечения. С другой стороны, существуют определенные ситуации, когда может потребоваться повышение активности каспазы-8. Это может произойти в случае тех же заболеваний, указанных выше, например, при системной красной волчанке. Однако типы клеток, которые должны стать мишенями, другие. Например,при волчанке популяция Т-клеток может содержать аутореактивные клетки, которые не разрушаются в тимусе. Следовательно, к Т-клеткам следует направить средство изобретения, модулирующее активность каспазы-8 по восходящей. Предполагается, что при некоторых заболеваниях, таких как рассеянный склероз, некоторые клоны Т-клеток играют критическую роль в развитии заболевания. Следовательно, в такие клетки можно направить средство по изобретению, модулирующее активность каспазы-8 по восходящей, используя одно или несколько антител, специфически направленных на вариабельную область Тклеточного рецептора клонов аутореактивных Т-клеток, для направления средства изобретения, модулирующего активность каспазы-8 по восходящей, которое может представлять собой белок, взаимодействующий с каспазой-8, или пептид, соответствующие изобретению. Ввиду вышеуказанного, настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим активное вещество, состоящее из одного или нескольких белков, взаимодействующих с каспазой 8, пептидов, антител, рибозимов, антисмысловых РНК или антисмысловых олигонуклеотидов, соответствующих изобретению. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусный вектор, способный инфицировать клетки млекопитающего, где указанный вектор содержит операбельно связанный промотор и последовательность ДНК изобретения, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой 8, или пептид, рибозим, антисмысловую РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело, соответствующие изобретению. Вирусный вектор может содержать, необязательно, кодирующую последовательность, операбельно связанную с промотором, кодирующую пептид или белок, расположенные на поверхности вируса, которая способна к связыванию с белком поверхности клетки млекопитающего. Белок поверхности, предпочтительно, представляет собой белок, который может поглощать вирусный вектор,и, предпочтительно, экспрессируется тканеспецифически или специфически для типа клеток, так что создается возможность направленной доставки вирусного вектора. Белок, взаимодействующий с каспазой-8, его аналоги, фрагменты или производные также можно использовать для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е. белков,связывающихся с каспазой-8, или функционально родственных протеаз или белков, вовлеченных в процесс внутриклеточной передачи сигнала. При таком применении можно использовать указанную выше систему с двумя гибридами дрожжей, или можно использовать недавно разработанную систему с использованием гибридизации по Саузерну в нестрогих условиях с последующим клонированием методомPCR (Wilks et al., 1989). В публикации Wilks et al. описаны идентификация и клонирование двух предполагаемых протеинтирозинкиназ посредством применения гибридизации по Саузерну в нестрогих условиях с последующим клонированием методом PCR на основе известной последовательности мотива ки- 25005853 назы задуманной последовательности киназы. Такой подход можно применить в соответствии с настоящим изобретением, с использованием последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8, для идентификации и клонирования белков, родственных белкам, взаимодействующим с каспазой-8. Другой подход к применению белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его аналогов, фрагментов или производных по изобретению состоит в использовании их в методах аффинной хроматогра-фии для выделения и идентификации других белков или факторов, вовлеченных в процесс внутриклеточной передачи сигнала. При таком применении белок, взаимодействующий с каспазой-8, его аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения можно по отдельности присоединить к матрицам для аффинной хроматографии и затем привести в контакт с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, как предполагаются, вовлечены в процесс внутриклеточной передачи сигнала. Следуя процедуре аффинной хроматографии, можно элюировать, выделить и охарактеризовать другие белки или факторы, связывающиеся с белком, взаимодействующим с каспазой-8, или его аналогами, фрагментами или производными изобретения. Как указывалось выше, белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его аналоги, фрагменты или производные изобретения можно также использовать в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Такие антитела также можно использовать для целей очистки белка,взаимодействующего с каспазой-8 (например, N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека или ее любых изоформ), или от клеточных экстрактов или от трансформированных клеточных линий, продуцирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его аналоги или фрагменты. Далее эти антитела можно использовать для целей диагностики для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием опосредованных каспазой-8 лиганда FAS-R или системы TNF. Таким образом, если такие нарушения связаны с нарушениями в системе внутриклеточной передачи сигнала с участием белка каспазы-8 или белка, взаимодействующего с каспазой-8, такие антитела могли бы служить в качестве важного диагностического инструмента. Следует также отметить, что выделение, идентификацию и характеризацию белка изобретения,взаимодействующего с каспазой-8, можно осуществить с использованием любой из хорошо известных стандартных процедур скрининга. Например, одну из таких процедур скрининга - процедуру с двумя гибридами дрожжей, как указано ниже, использовали для идентификации белка, взаимодействующего с каспазой-8 (см. Stanger et al., 1995), и затем различных белков изобретения, взаимодействующих с каспазой-8 (кроме различных других новых белков, указанных выше и ниже, в совместных находящихся на рассмотрении заявках). Подобным образом, как указывается выше и ниже, для выделения, идентификации и характеризации белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8, или для выделения, идентификации и характеризации других белков, факторов, рецепторов и т.п., способных связываться с белками изобретения, взаимодействующими с каспазой-8, можно использовать другие процедуры, такие как аффинная хроматография, методы гибридизации ДНК и т.п., хорошо известные в технике. Пример 1A. Двухгибридный скрининг для идентификации белков, взаимодействующих с каспазой-8 Для скрининга белков, взаимодействующих с каспазой-8, и их потенциальных субстратов использовали модифицированную систему с двумя гибридами дрожжей, описанную как "Yeast-three Hybridsystem" (Tirode F. et al., 1997). Отдельные использованные векторы, штаммы дрожжей и библиотеки получали от Clontech (Palo Alto, USA) в виде компонентов двухгибридной системы Matchmaker (РТ 12651). Две субъединицы каспазы-8 экспрессировали по отдельности под контролем разных промоторов. Короткую субъедининцу р 10 (от серина 375 до аспарагиновой кислоты 479) клонировали в векторpGBT9 (Clontech) в рамке с доменом связывания ДНК дрожжевого белка Gal4 (аминокислоты 1-147, числа в последовательностях в соответствии с Laughon et al., Molecular and Cellular Biology, 4, 260-267,1984). Длинную активную субъединицу р 20 (от серина 217 до аспарагиновой кислоты 374) мутировали в позиции 360, т.е. цистеин, находящийся в этой позиции, заменяли на серин (C360S), придавая протеазную активность неактивному ферменту. Мутированную субъединицу C360S р 20 экспрессировали в виде неслитого белка под контролем промотора Met25, который положительно регулируется в среде, лишенной метионина (Sangsoda, Mol. Gen. Genet., 200, p. 407-14, 1985). Возможность регулирования активности промотора, управляющего экспрессией субъединицы р 20, посредством подбора концентрации метионина в среде для роста дрожжевых клеток делает возможным (1) использование субъединиц токсичного белка в качестве наживки и (2) регулирование зависимости взаимодействия белок-белок от третьего партнера, т.е. субъединицы р 20. Экспрессирующие единицы р 10 и р 20 можно локализовать в разных векторах. Их можно локализовать также в одном и том же векторе. В описываемом примере использовали модифицированный рСВТ 9-вектор pGBT9-ЗН (см. выше Tirode et al.). Субъединицу р 20, предпочтительно, экспрессируют в виде гибрида с сигналом ядерной локализации. После экспрессии в отсутствие метионина две субъединицы ассоциируют друг с другом в дрожжевой клетке. Ассоциация двух субъединиц показана с помощью экспериментов по коиммунопреципитации и вестерн-блоттинга. Библиотеку кДНК В-клетки, клонированную в вектор pGAD GH (Durfee et al., Genes Dev., 7, 555- 26005853 569), получили в дар от д-ра S. Elledge. Вектор содержит домен активации Gal4 (аминокислоты 768-881). Этого домена активации GAL4 достаточно, когда слит с доменом связывания ДНК GAL4, для индукции существенной транскрипционной активности гена GAL4, см. Ma and Ptashne, Cell, 48, 847-853 (1987). Вышерасположенный сайт активации GAL (UAS.sub.G), как описано Keegan et al., (1986), цит. выше, присутствует в вышерасположенной области репортерного гена (lacZ) и гена, допускающего селекцию (His) в штамме дрожжей HF7c, полученном от Clontech. Культуру HF7c трансформировали вышеуказанной каспазой-8, содержащей плазмиды, и трансформанты дрожжевых клеток отбирали посредством выращивания в среде для селекции, как описано в протоколах Clontech для дрожжей, т.е. лишенной триптофана, лейцина, метионина, тирозина. Необязательно добавляли гомосерин в количестве 80 мг/л. Затем культуру указанных трансформантов трансформировали далее библиотекой В-клеток, содержащей вектор, с последующим высеванием на вышеуказанную среду, лишенную гистидина (среда для селекции). Необязательно, к среде для селекции добавляли 3-аминотриазол, который является ингибитором фермента гистаминсинтетазы. Добавление ингибитора служит для регуляции утечки из промотора,управляющего his-геном в дрожжевых клетках, не содержащих белков, взаимодействующих с каспазой 8. В некоторых случаях слабое неспецифическое взаимодействие может привести к ложной транскрипции от промотора Gal4-UAG-his, что ведет к дрожжевым клонам, растущим в среде для селекции. Трансформанты, растущие в среде для селекции, отбирали и экстрагировали ДНК-плазмиды. Затем ДНК трансформировали в бактерии НВ 101, которые допускают селекцию в среде, лишенной лейцина. После выращивания бактерий и экстракции и очистки от них плазмидной ДНК затем трансформировали плазмидную ДНК в дрожжевые клетки SFY526. Затем проводили испытания lacZ-активности трансформантов SFY526 посредством высевания на среду для селекции, включающую гистидин и содержащую Xgal. Затем колонии дрожжей снимали с использованием фильтровальной бумаги 50,Whatmann 3 мм (описание съема колоний см. в цит. выше, Sambrook et al.), затем помещали примерно на 20 с на алюминиевую фольгу, переносили примерно на 25 с в жидкий азот для того, чтобы заморозить дрожжевые клетки, выдерживали примерно 1 мин при комнатной температуре для того, чтобы дрожжевые клетки оттаяли, помещали в чашку Петри на фильтровальную бумагу 1, Whatmann 3 мм, которую предварительно смачивали в Z-буфере (буфер для реакции с бета-галактозидазой, см., например, протоколы Clontech, цит. выше, Sambrook et al. или цит. выше Current Protocols in Molecular Biology), содержащем Xgal и бета-меркаптоэтанол. Появление синего окрашивания в колониях указывает на активную бета-галактозидазу. Белки, взаимодействующие с каспазой-8, как правило, дают синюю окраску при этом анализе в интервале от минут до нескольких часов, предпочтительно - от 5 мин до 3 ч, и наиболее предпочтительно - в интервале от 5 мин до 1 ч. С другой стороны, проводили количественную оценку бетагалактозидазной активности путем выращивания жидкойкультуры в среде, содержащей Xgal, удаления клеток посредством центрифугирования и измерения поглощения среды с использованием спектрофотометра. Клоны кДНК, идентифицированные в описанной выше процедуре скрининга, затем испытывали далее на взаимодействие с другими белками. Это испытание осуществляли посредством трансформации испытываемых клонов вместе с нерелевантным белком, экспрессированным в виде гибрида с доменом активации ДНК в векторе pGAD GH. Двойные трансформанты, способные расти в среде, лишенной гистидина, или показывающие lacZактивность, указывали, что библиотечный клон связывался неспецифически. В качестве нерелевантных белков использовали белки, известные как "прилипающие", т.е. взаимодействующие неспецифически с другими белками, так же, как другие нерелевантные белки. Например,белки испытывали на связывание с ламином, RIP, RAIDD, TRAF2 и MORT1. Вообще, ламинсвязывающие белки отбрасывали. Указанное выше трехгибридное испытание также осуществляли с субъединицей каспазы-8 р 10,слитой с доменом связывания ДНК 1 ехА. Предпочтительным вектором является вектор pLexA, доступный от Clontech. Когда в качестве домена связывания ДНК используют 1 ехА, следует использовать штамм дрожжей L40 или эквивалентный штамм. Белки, взаимодействующие с каспазой-8, идентифицировали с помощью описанного выше метода скрининга и затем анализировали с использованием анализов на расщепление in vivo и in vitro и анализов на трансдукцию сигналов, как описано далее. Пример 1B. Модифицированная наживка для двухгибридного скрининга для идентификации белков, взаимодействующих с каспазой-8 Модифицированную каспазу-8 использовали для другого скрининга белков, взаимодействующих с каспазой-8, с системой с двумя гибридами дрожжей (Fields and Song, 1989). Каспазу-8 экспрессировали из вектора-наживки pGBT9 (Clontech) в виде одноцепочечного белка. Для того чтобы создать белокнаживку, который имел бы сходство с конформацией активной каспазы, удаляли предомен, и малую субъединицу 2 (начинающуюся от серина 375 и заканчивающуюся аспарагиновой кислотой 479) гибридизировали с доменом связывания ДНК Gal4. С-Конец малой субъединицы отделяли от N-конца боль- 27005853 шой субъединицы 1 (начинающейся от серина 217 и заканчивающейся аспарагиновой кислотой 374) 16 аминокислотным глицинсериновым линкером (GGGGSGGGGSGGGGSG). Таким образом, две субъединицы активной каспазы образуются при спонтанном образовании складчатой структуры одной молекулы. Цистеин активного сайта в субъединице 1 мутировали на серии (sub 1 C360S). Показано, что сверхэкспрессия такой одноцепочечной каспазы-8 функционально схожа со сверхэкспрессией каспазы-8 дикого типа, что определяется по ее способности индуцировать апоптоз в клетках НЕК 293 Т при сверхэкспрессии из вектора pcDNAHis, подобно каспазе-8. Активность одноцепочечной каспазы-8 можно блокировать посредством коэкспрессии р 35, являющегося ингибитором каспаз. Двухгибридный скрининг осуществляли так, как описано выше, за исключением того, что одноцепочечную каспазу-8, как описано выше, экспрессировали из вектора pGBT9 (Clontech). Пример 2. Идентификация белков, взаимодействующих с каспазой-8 Используя модифицированную двухгибридную систему скрининга, описанную в примере 1A, идентифицировали несколько клонов, кодирующих белки, связывающиеся с каспазой-8. Специфичность связывания клонов подтверждали при двухгибридном испытании с дрожжами, в то время как обнаруживалось отсутствие связывания с контрольными белками. Отобранные клоны кДНК выделяли и секвенировали, и нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, найденными в Genbank,как описано ниже. Пример 2.1. Обнаружено, что клон L1 содержит неполную последовательность кДНК, идентичную аминокислотам 690-750 Stat 1. Stat 1 идентифицировали как фактор транскрипции, который связывается с интерферон-стимулированным восприимчивым элементом (ISRE) и с элементом гамма-активированной последовательности (GAS) (обзор см. в Iffic S.N., 1998). Недавно показано, что Stat 1 вовлекается в регуляцию содержания конститутивной каспазы (Kuiner et al., 1997) и служит субстратом in vitro для каспазы-8(King P. et al., 1998). Сделано предположение, что Stat 1 может играть некую роль в регуляции самой апоптозной реакции. Пример 2.2. Обнаружено, что клон L7 кодирует неполную кДНК, которая почти полностью соответствует Сконцевой части клона EST, найденного в Genbank, которому функционирование не приписывается (инвентарный номер АА 608733). Пример 2.3. Обнаружено, что клон L20 идентичен аминокислотам 104-420 NEFA (инвентарный номер 462693).NEFA является новым белком, содержащим домен связывания основных аминокислот предполагаемой ДНК с потенциальным ядерным сигналом направления доставки, две области мотива спираль-петляспираль (HLH), действующие совместно мотивы EF-hand, кислотную богатую аминокислотами область между EF-hand, и лейциновый мотив-молнию (Barnikol-Watanabe et al., 1994). Также обнаружено, чтоNEFA является кальцийсвязывающим белком, и обнаружено, что он локализуется как в цитоплазме, так и на поверхности клетки, и его также можно обнаружить в культуральной среде. NEFA принадлежит к субсемейству нуклеобиндина. Однако биологическая роль NEFA пока не выяснена. Клон L20 расщепляется каспазой-8 как in vitro, так и in vivo. Пример 2.4. Обнаружено, что клон L12 кодирует кДНК, которая почти полностью соответствует клону EST человека, найденному в базе данных (инвентарный номер М 62097) . Клон L12 расщепляется каспазой-8 invitro, как показано при анализе in vitro с протеазами. Коротко, синтезированный in vitro меченный 35S белок инкубировали в течение 30-60 мин в протеазном буфере в присутствии каспазы-8, продуцированной бактериями. Белки и их фрагменты разделяли методом SDS-PAGE, и результаты визуализировали с помощью ауторадиографии или люминофоров. Активность белка можно было блокировать специфическим ингибитором панкаспазы z-VAD-фторметилкетоном. Пример 2.5. Обнаружено, что клон L5 кодирует кДНК, идентичную белку Tip60 (инвентарный номер 3024755).Tip60 (взаимодействующий с Tat белок в 60 кД) впервые описан как белок, взаимодействующий с клеточным трансактиватором HIV-Tat (Kamine et al., Virology, 216, 357-366, 1996), а позднее показано, что он обладает гистон-ацетил-трансферазной активностью (Yamamoto and Horikoshi, 1997). Биологическую роль Tip60, кроме его способности усиливать Tat-опосредуемую активацию промотора HIV, остается определить. При двухгибридном испытании в дрожжах обнаружено, что клон L5 связывается с одной субъедининцей 2 каспазы-8, а также с комплексом р 10-р 20. Клон L5 расщеплялся каспазой-8 in vitro при анализеin vitro с протеазами, описанном в примере 2.4. Tip60 также расщеплялся зависимо от каспазы после коверхэкспрессии вместе с рецептором для TNF р 55 в клетках HeLa и НЕК 293-Т. Он также расщеплялся в клетках HeLa после обработки TNF даже в отсутствие ингибиторов синтеза белка. Коротко, белок клонировали в вектор pcDNAHis (Invitrogen) и экспрессировали в клетках НЕК 293-Т или HeLa вместе с белком, индуцирующим апоптоз (например, p55TNF-R или каспазой-8). Через 20 ч после трансфекции клетки собирали и к лизатам 0,5-1 х 106 целых клеток применяли SDS-PAGE и затем вестерн-блоттинг с- 28005853 антителами против поли-His (Sigma). Результаты визуализировали с помощью ECL. Выделили несколько клонов кДНК, кодирующих вставки, соответствующие белку Tip60. Обнаружено, все клоны, включая"полноразмерный, дикого типа" клон Tip60, лишены сегмента на протяжении от аминокислоты 94 (пролин) до 145 (треонин). Эта часть белка не является частью ацетилазактивного сайта и не считается существенной для функционирования белка. Обнаружено, что мутант Tip60, где остатки аспарагиновой кислоты в позициях 200 и 203 заменены остатками аланина, не поддается расщеплению. Пример 2.6. Обнаружено, что клон М 26 кодирует неполную кДНК, которая почти полностью соответствует клону EST человека, найденному в Genbank (инвентарный номер С 18037). При испытании с 2 гибридами в дрожжах обнаружено, что клон М 26 связывается с одной субъединицей 2 каспазы-8. Пример 3. Выделение белков, взаимодействующих с каспазой-8. С использованием двухгибридного скрининга, описанного в примере 1 В, идентифицировали несколько других клонов, кодирующих специфические белки, связывающиеся с каспазой-8. Отобранные клоны кДНК выделяли и секвенировали, и нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, найденными в Genbank, как описано ниже. Скринировали библиотеку В-клеток (Durfee Т. et al., 1993) и библиотеку Т-клеток юрката. В табл.2 приводится начальная характеризация первой группы клонов. Таблица 2 Неполные клоны, кодирующие части NEFA, так же, как и клон В 8.1, выделяли также методом с двумя гибридами дрожжей, описанным в примере 1 А. Пример 3.1. Клоны В 4 (инвентарный номер 3327044), В 17 (инвентарный номер Н 23509), В 27 (инвентарный номер АА 936350) и J40 (инвентарный номер 2887413), кодируют вставки кДНК, гомологичные терминальному концу соответствующих EST. Пример 3.2. Клон В 11 кодирует кДНК-вставку,гомологичную С-концу СТР-фосфоэтаноламинцитидилилтрансферазы (ЕТ, инвентарный номер D84307). ЕТ является ферментом, вовлеченным в метаболизм фосфолипидов, и катализирует конверсию фосфоэтаноламина в CDP-этаноламин (Nakashima et al.,1997). Клон В 11 расщеплялся in vitro каспазой-8, что показано при анализе, описанном выше в примере 2.4. Пример 3.3. Клоны В 13 и В 37 кодируют кДНК-вставку, гомологичную С-концу клона, кодирующего часть ге- 29005853 нома EBV (инвентарный номер Y01555). Пример 3.4. Клон В 22 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу Т-клеточного циклофилина (инвентарный номер Y00052). Т-Клеточный циклофилин идентифицирован как внутриклеточный рецептор для циклоспорина А и FK506 и обладает активностью подлинной пептидилпролил-цис-транс-изомеразы(Haendler В. et al., 1987). Пример 3.5. Клон В 33 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу нуклеобиндина (инвентарный номер 2506255). Нуклеобиндин является секретируемым белком со свойствами связывания ДНК и Са 2+, который весьма схож с белком NEFA, описанным в примере 3.3. Нуклеобиндин первоначально описан как белок в 55 кД, усиливающий продуцирование антител против ДНК в культурах аутоиммунных клеток lpr селезенки мыши (Miura К. et al., 1992). Клон В 33 расщеплялся каспазой-8 как in vitro, так и in vivo, как показали анализы, указанные выше в примерах 2.4 и 2.5. Пример 3.6. Клон J2 содержит вставку в 600 п.о., кодирующую неполную белковую последовательность, которая вырастает в полипептид в 20 кД, когда экспрессируется in vitro в бесклеточной системе, а также в клетках. Полипептид, кодированный клоном J2, расщепляется in vitro каспазой-8 и in vivo в клетках НЕК 293-Т и клетках HeLa после коэкспрессии с p55TNF-R или каспазой-8 при анализах, указанных выше в примерах 2.4 и 2.5. Нуклеотидная последовательность и расшифрованная аминокислотная последовательность клона J2 приводятся на фиг. 2. Сравнение и выстраивание в ряд 5'-наращивания клона J2 с помощью PCR с последовательностями,опубликованными в базе данных, показали гомологию клона J2 с EST человека (инвентарный номер АА 4 60869), что соответствует предполагаемой N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазе человека, а также другому клону (L48741), и дало состав предполагаемой полноразмерной N-ацетилглюкозамин-6 фосфатдеацетилазы человека, приведенный на фиг. 3. Пример 4. Функциональная характеризация клона J2 Первоначальная функциональная характеризация клона J2 показала, что клон обладает ингибирующей активностью в отношении каспазы-8 и апоптоза, индуцируемого p55TNF-R человека в клетках НЕК 293-Т и HeLa. Экспрессия J2 подавляла/замедляла апоптоз клеток НЕК 293-Т, котрансфицированных рецептором для TNF р 55, или клеток HeLa, обработанных TNF и циклогексимидом, на 25-50%, что иллюстрируется фигурой 3. Количественное определение гибели вследствие апоптоза осуществляли путем определения части экспрессирующих бета-галактозидазу клеток, показывающих апоптозную морфологию через 20 ч после трансфекции указанных конструкций. Результаты выражены в виде среднего процента синих клеток, показывающих признаки апоптоза, как части общего числа подсчитанных синих клеток (примерно 500 клеток на образец). С другой стороны, использовали белок зеленой флуоресценции в качестве маркера, и проводили определение с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа. Пример 5. Клонирование белков, взаимодействующих с каспазой-8. Библиотеку кДНК плаценты человека, экспрессированную из вектора рАСТ 2 (доступного от Clontech, Palo Alto, USA), скринировали методом двухгибридного скрининга с использованием наживки,описанной выше в примере 1 В. Используя такую процедуру скрининга, идентифицировали несколько клонов, кодирующих специфические белки, взаимодействующие с каспазой-8. Также исследовали клоны Р 16, Р 27, Р 43, Р 70, Р 74 и Р 79. Секвенирование кДНК-вставок клонов кДНК Р 43, Р 16 и Р 74 показало, что они участвуют в некоторых гомологичных последовательностях. Клон Р 74 имел самую длинную кДНК-вставку примерно в 3000 п.о. и, как оказалось, кодирует белок с расшифрованной открытой рамкой считывания из 574 аминокислот и с ожидаемой молекулярной массой примерно 68-70 кД. Последовательности трех вышеуказанных кДНК-вставок сравнивали с последовательностями, найденными в опубликованных базах данных. Обнаружено, что кДНК-вставки клонов Р 43, Р 16 и Р 74 имеют некоторую гомологию с последовательностью двух клонов EST, найденных в Genbank (W04418 и N64095). Оказалось, что последовательность всех трех кДНК-вставок составляет 3'-концы различных сплайсинг-изоформ того же белка. Выстраивание в ряд последовательностей трех кДНК-вставок подтвердило открытую рамку считывания из 574 аминокислот в последовательности Р 74 (показана на фиг. 5). Подобную последовательность также нашли в геномном клоне, идентифицированном в другой опубликованной базе данных (RPCI5-1057I20; библиотека Roswell Park Cancer Institute Human РАС), которая локализуется на хромосоме человека 12q31. Открытая рамка считывания, расшифрованная из последовательности этого клона РАС, имела 1428 аминокислот (показана на фиг. 6), и она содержит указанную выше открытую рамку считывания, имеющую 574 аминокислоты. Фиг. 7 показывает выстроенную в ряд последовательность открытой рамки считывания расшифрованной аминокислотной последовательности кДНК-вставки клона Р 74 (обозначенной"клонированная") с открытой рамкой считывания, расшифрованной из последовательности клона РАС(обозначенной "расшифрованная"). При сравнении расшифрованной аминокислотной последовательности клона Р 74 и последователь- 30